M’henni Mohamed Wassim

Fatouma Saalah
Omou Salamata

Product ion , extraction et purification de Cellulase par

différents espèces
Matériel et
Méthodes
Isolement, criblage et identification
de champignons cellulolytiques:
 Les champignons ont été isolés à partir de copeaux de bois collectés sur le
campus de Gandhi Krishi Vigyan Kendra (GKVK).du campus de Gandhi
Krishi Vigyan Kendra (GKVK), Bangalore . Les copeaux de bois ont été
immergés dans de l'eau distillée pendant 1 h et 0,1 ml de liquide a été
inoculé.pendant 1 h et 0,1 ml du liquide a été inoculé sur un milieu desur
un milieu carboxy-méthyl-cellulose (CMC) composé de 1% de CMC, 0,5 g
de tartrate d'ammonium, 0,1 g deKH2PO4, 0,005 g MgSO4.7H2O, 0,1 g
d'extrait de levure,0,0001 g CaCl2.2H2O, 1,6 g d'agar et 100 ml d'eau
distillée.distillée. Les champignons capables de produire de la cellulase ont
été sélectionnés par la méthode du colorant rouge Congo.par la méthode
du colorant rouge Congo et les isolats ont été sélectionnés sur la base de la
largeur de la zone de détection.ont été sélectionnés sur la base de la
largeur de la zone de dégagementautour des colonies sur les plaques
fongiques. Le champignonproduisant la zone de dégagement la plus large a
été sélectionnépour le présent travail. L'identification morphologique et
moléculairemoléculaire de l'isolat sélectionné a été réaliséeà l'aide du
séquençage de l'ITS 1. La séquence a été soumise à laGen Bank et le
Pour la coloration de l'activité, 1% de CMC
Caractérisation des enzymes
Coloration de l'activité

(w/v) a été ajouté à 1% d'agarose (w/v)

dissous dans 25 ml de tampon phosphate 0,05
M (pH 7.0)et versé sur les boîtes de Pétri après
avoir été chauffé. Des puits ont été perforés et
0,05 ml de solution enzymatique a été
transféré dans chaque puits et incubé dans
une chambre humide à 25 C pendant 24h. Le
gel est coloré avec 1% de colorant rouge
Congo et la formation d’une zone jaune
Le pH le plus approprié requis pour une cellulase
maximale,l’activité a été déterminée en faisant varier le
Effet du pHe t de l a te mpéra ture sur l a production d’e nz ymes

pH de 3 à 9 en utilisant différentes solutions tampons.

La température optimale a été déterminée en vérifiant
l’activité enzymatique à des températures allant de 5 à
50 °C.
 Effet de divers ions métalliques et de
réactifs sur l'activité enzymatique
Le rôle des ions métalliques, le cas échéant, sur
l’activité enzymatique a également été vérifiée. Ions
métalliques tels que Ca2+, Mg2+, Fe2+,Na+, K+, Mn2+,
Co2+, Hg2+, Cu2+, Fe3+ et Zn2+ étaientessayé à une
concentration de 5 mM. Les mesures ont été réalisée en
présence de différents groupes spécifiques des réactifs
comme l’EDTA, la FDS, le béta-mercaptoéthanol, le
PMSF,DTT, azoture de sodium et Triton X-100, pré-
incubés dansles échantillons pendant une demi-heure.
L’activité a été analyséepar des méthodes de dosage
standard.
Détermination des paramètres
cinétiques
Purified enzyme was incubated with various concentrations
of soluble pure CMC substrate in 4.8 mM sodium citrate
buffer pH 4.8, at temperature 45 C. Kinetic parameters KM
and Vmax were calculated by Linewea

L’enzyme purifiée a été incubée avec diverses

concentrations de substrat CMC pur soluble dans 4,8 mM
tampon de citrate de sodium pH 4,8, à la température 45 C.
Les paramètres cinétiques KM et Vmax ont été calculés par
Parcelles Lineweaver-Burk.ver-Burk plots.
Les cellulases sont connues pour décomposer la
cellulose en structures monomères, c’est-à-dire sous-
unités de glucose. Pour tester l’activité de l’enzyme
isolée du champignon, pure la carboxyméthylcellulose
(CMC, 1 %) a été utilisée dans les tôles fortes test. Dans
le milieu complété par le colorant Congo red et l’iode,
une zone de clairance a été produite autour de la
colonie fongique à cause de l’enzyme dégagé.
La largeur de la zone de dégagement indique la
capacité de l’enzyme à hydrolyser la cellulose. Travail
fait par Gohel et al. [17] suggère que l’enzyme dégrade
la CMC pure et est connue pour montrer une zone de
dégradation. L’enzyme décompose le polysaccharide à
cause de laquelle la zone entourée par l’enzyme se
réduit à des monosaccharides plus petits. Le colorant
ne peut pas se lier efficacement au monosaccharideet
qui aboutit à la formation d’une zone dégagée. Ila été
suggéré par Gomashe et al. [13] que les colonies
fongiques présentant une zone de dégradation plus large
sontproducteurs de cellulase.
 Dans la présente étude, Trichodermalongibrachiatum (KM274866) s'est
avéré être le meilleur dégradeur de cellulose parmi tous les champignons
testés, avec une zone de dégagement maximale comme le montre la figure
1.
 La relation phylogénétique de l'isolat fongiquea montré une similarité de
99 % avec Trichoderma longibrachiatum. Il a donc été considéré comme
un nouvel isolat local de l'espèce T. longibrachiatum.l'espèce T.
longibrachiatum. Lorsque la quantité de cellulase produite par l'isolat de
Trichoderma longibrachiatum sur le substrat naturel, c'est-à-dire la
bagasse de canne à sucre, a été comparée à la quantité produite par
d'autres isolats de Trichoderma longibrachiatum,de canne à sucre, a été
comparée à la quantité produite dans d'autresrésidus agricoles, la quantité
produite dans la bagasseétait la plus élevée parmi tous les substrats
testés(Figure 2). Ce résultat est conforme aux conclusions de Singhania et
al [18] et de Cunha et al [19] qui ont rapporté que la bagasse de canne à
sucre était le substrat le plus productif que la bagasse de canne à sucre est
le meilleur inducteur de cellulase dans les champignons.dans les
champignons. Ojumu et al [20] ont signalé que l'activité de la cellulase
variait en fonction du substrat utilisé pour la culture du champignon.Le
Le profil d'élution de la cellulase de Trichoderma
longibrachiatum par la méthode FPLC est présentée à la
figure 3. L'échantillon a montré un pic majeur à 23,8 ml/min
et un pic de conductance à 24,69 ml/min.La pureté de la
cellulase des fractions d'élution a été vérifiée par SDS-PAGE
(figure 4) et le poids moléculaire de l'enzyme s'est avéré être
de 67 § 1 KDa. L'apparition d'une seule bande sur le gel
prouve la pureté L'apparition d'une seule bande sur le gel
prouve la pureté de la cellulase. Yasmin et al [21] ont rapporté
un poids moléculaire de 87 KDa pour la cellulase isolée de
Trichoderma viride, ce qui est très élevé et prouve que les
champignons produisent également des enzymes ayant un
poids moléculaire élevé. Le poids moléculaire obtenu dans la
présente étude se compare bien aux valeurs rapportées dans la
littérature pour la cellulase de plusieurs bactéries et
champignons cultivés sur différents substrats[22].
La figure 5a montre que l'enzyme est stable dans une
large gamme de pH, avec une activité maximale à un pH
de 4,8. Les résultats de la présente étude sont conformes
à ceux de Li et al. les résultats de Li et al. [23], qui ont
constaté qu'un pH compris entre4,8 et 5,0 convenait aux
champignons pour la production de cellulase. En ce qui
concerne l'effet de la température, l'enzyme actuelle a
exprimé une activité maximale à une température de 45
C (figure 5b). Les conclusions de Fayyaz et al.[24] qui
ont rapporté une température optimale de 40-50 C pour
l'enzyme de Planococcus citri sont conformes à nos
résultats. L'enzyme était stable à 30-55 C, ce qui pourrait
être un facteur positif du point de vue de sa production
commerciale.
Le tableau 2 montre les effets des réactifs spécifiques au
groupe sur l'activité enzymatique. En présence de Triton X 100,
l'activité enzymatique s'est accrue de 5,131 U/ml d'enzyme. Le
Triton X100 a pu augmenter la perméabilité de la membrane
cellulaire, ce qui a permis d'améliorer le transport
membranaire et, par conséquent, d'augmenter l'activité de la
cellulase. Toutefois, le réactif EDTA a eu un effet négatif sur
l'activité de la cellulase, L'EDTA est un agent chélateur de
métaux et la réduction de l'activité enzymatique suggère que
l'activité peut dépendre de certains chélateurs métalliques
nécessaires à des réactions chimiques spécifiques. Il est
possible que cela des groupes inorganiques qui sont inactivés
par l'EDTA.EDTA. Le SDS, le b-mercaptoéthanol, le PMSF, le
DTT et l'azoture de sodium n'ont pas eu d'effet significatif sur
les cellules.Des observations similaires ont été faites par
Callow et al. etDanmek et al [27,28] .
Les constantes cinétiques obtenues à partir d'un tracé
de Lineweaver-Burk (figure 6) pour la cellulase de
Trichoderma longibrachiatum suggèrent une forte
affinité de l'enzyme pour le substrat. Les valeurs KM et
Vmax de l'enzyme sont les suivantesde l'enzyme
étaient de 0,121 mg/ml et de 0,421 mmol/min.
 Conclusion
Dépistage des copeaux de bois pour les champignons producteurs de cellulase
a donné lieu à un isolat de champignon très efficace, identifié comme
Trichoderma longibrachiatum, qui est un nouvel isolat de
l’espèce disponible localement. La recherche d’un Substrat naturel et peu coûteux pour la culture
de
le champignon parmi les sources agricoles disponibles localement,
aux fins de la production de cellulase, nous a conduits àsugarcane bagasse which is a
lignocellulosic agricultural residue. In the present study, sugarcane bagasse was used as the sole
carbon source for the cultivation of the fungus. Cellulase produced from this new fungal isolate
showed all the characteristics of an efficient enzyme with high substrate affinity and high
cellulolytic activity. The enzyme had an optimum pH of 4.8, with enzyme stability over the range
3–6. The optimum temperature was 45 C, with a tolerance range of 30– 55 C. The optimum pH
and temperature are most suitable for the industry to mass produce the fungus. Metal ions and
the detergent Triton 100 improved the enzyme activity. The purified enzyme had a molecular
weight of 67 § 1, KM 0.121 mg/ml, and Vmax 0.421 mmol/min. Its specific activity was 30 U/mg of
protein. The above characteristics of the enzyme make it very useful in commercial production of
bioethanol (biofuel) from an inexpensive starting material (sugarcane bagasse). Disclosure
statemen