La PHOTOSYNTHÈSE PAR DES

CHLOROPLASTES ISOLÉS
 Intoduction
Cette présentation se concentre sur le processus de la photosynthèse chez les plantes vertes, qui est essentiel pour leur
croissance et leur développement. Le processus complexe implique plusieurs réactions biochimiques, notamment le
transport des électrons, l'évolution de l'oxygène, la photophosphorylation et les réactions de synthèse. Les biochimistes
travaillent depuis des années pour parvenir à la photosynthèse complète avec des chloroplastes isolés, ce qui permettrait
une étude plus facile du contrôle métabolique dans les réactions de synthèse. La présentation couvrira les différentes
réactions biochimiques impliquées dans la photosynthèse, en mettant l'accent sur les réactions de synthèse et leur
importance dans la production de composés organiques essentiels à la croissance des plantes. Elle abordera également les
méthodes utilisées pour isoler les chloroplastes et les réactions photosynthétiques, ainsi que les avantages et les
limitations de ces approches. Dans l'ensemble, la présentation fournit une vue d'ensemble complète de la photosynthèse
chez les plantes vertes, en mettant l'accent sur les réactions de synthèse et leur étude à l'aide de chloroplastes isolés.

 Principe :
o Le transfert de photoélectrons de l'eau vers des accepteurs d'électrons artificiels par des particules subcellulaires
de cellules végétales vertes a été démontré pour la première fois par Hill et Scarisbrick.
o Des chloroplastes isolés et des particules de chloroplastes ont été trouvés capables de transporter des
photoélectrons vers le NADP et la photophosphorylation.
o Cependant, les taux de réduction du carbone pendant la photosynthèse par des chloroplastes isolés étaient
décevants.
o La capacité de fixer le CO2 était diminuée avec des chloroplastes brisés mais pouvait être restaurée par divers
cofacteurs tels que l'ATP et le NADPH.
o Les feuilles d'épinard étaient censées être capables de taux de fixation de CO2 dépassant 200 µmoles CO2/mg
Chl/heure.
o La fixation de CO2 a été stimulée en ajoutant certains intermédiaires du cycle de réduction du carbone à des
chloroplastes brisés ou intacts.
o Walker a constaté que le taux de fixation de CO2 était augmenté de 1,1 à 24,3 µmoles CO2/mg Chl/heure par
l'ajout de ribose-5-phosphate à des chloroplastes isolés.
o Heber et Tyszkiewicz ont ajouté une solution concentrée d'enzymes solubles du cycle de réduction du carbone à
des chloroplastes isolés, ce qui a entraîné des taux de fixation de CO2 de 4 à 12 µmoles CO2/mg Chl/heure.
o En utilisant des chloroplastes du chrysomonade marin Hymenomonas sp, Jeffrey et al. ont mesuré un taux de 15,3
µmoles CO2/mg Chl/heure.
o Des efforts ont été faits pour obtenir une préparation de chloroplastes bien définie et homogène avec des
membranes intactes capables de taux élevés de photosynthèse complète sans l'ajout de cofacteurs ou d'enzymes.

 Matériaux et méthodes :

o Les graines de Spinacia oleracea L. (var. Viroflay) obtenues auprès de Ferry Morse Seed Co. ont été cultivées en
plein soleil dans de la vermiculite de 5 pouces à l'extérieur. Les feuilles ont été récoltées à l'âge de 4-5 semaines et
utilisées pour l'expérience.
o L'expérience consistait à mesurer les taux de fixation du CO2 dans les feuilles intactes et les chloroplastes isolés.
o Pour les feuilles intactes, une feuille fraîchement cueillie a été placée dans un conteneur hermétique avec sa tige
dans un conteneur contenant une solution de Hoagland. La chambre était reliée à un système fermé de tubes et à
une pompe pour faire circuler le gaz à travers la chambre à feuilles et une chambre d'ionisation. Après
photosynthèse pendant 10 minutes avec de l'air, le système de traitement du gaz a été fermé et connecté à un
réservoir contenant de l'air et du C'4. La feuille a ensuite été incubée dans une chambre humide saturée d'air avec
de l'air contenant 0,08 % de CO2 et 200 micromoles de C'4.

o Après 10 minutes de photosynthèse, la feuille a été rapidement congelée et broyée en poudre congelée. La
teneur en chlorophylle de la feuille a été déterminée, et la poudre congelée restante a été mélangée à 80 % de
méthanol. Un échantillon acidifié de ce matériau a été séché sur un filtre pour déterminer le taux d'assimilation
photosynthétique de C'4 en composés acides stables.
o Les chloroplastes ont été préparés à partir des feuilles utilisées pour mesurer le taux d'assimilation du CO2 des
feuilles intactes. Une suspension de 0,50 ml de ces chloroplastes contenant 0,085 mg de chlorophylle a été pré-
illuminée pendant 3 minutes, puis exposée à du bicarbonate radioactif pour permettre la photosynthèse pendant
6 minutes avant d'être tuée avec 80 % de méthanol. La teneur en chlorophylle et la quantité de C'4 fixé ont
permis de déterminer le taux de fixation du CO2 par les chloroplastes isolés.
o La méthode implique l'isolement et l'analyse des chloroplastes pour l'étude de la photosynthèse.
o La préparation implique une version modifiée d'une méthode précédemment décrite.
o La solution utilisée dans l'isolement et l'analyse contient du sorbitol, du NaNO3, de l'EDTA, du Na isoascorbate, du
MnCl2, du MgCl2 et du K2HPO4.
o Les feuilles fraîchement coupées sont homogénéisées dans cette solution, et le mélange résultant est filtré et
centrifugé pour obtenir des chloroplastes.
o La photosynthèse est étudiée en plaçant les chloroplastes dans une fiole ronde avec un mouvement circulaire
pour les répartir uniformément sans agitation excessive.
o La fiole est illuminée par des lumières fluorescentes depuis le dessous.
o Après la pré-illumination, une solution contenant HC1403 est ajoutée pour stimuler la photosynthèse.
o Après 6 minutes, les réactions sont arrêtées, et les produits sont analysés par chromatographie et
radioautographie.

o Cette méthode fournit un moyen fiable d'étudier la photosynthèse dans les chloroplastes
 1. Test de pyrophosphate pour le métabolisme :
o Le pyrophosphate a été constaté comme un possible tampon pour stimuler la fixation du CO2.
o Des expériences avec Chlorella ont montré que le pyrophosphate était formé à partir d'orthophosphate
marqué.
o L'étude a été réalisée en utilisant du pyrophosphate marqué au P32 lors de la photosynthèse.
o Très peu de pyrophosphate marqué a été converti, probablement via l'orthophosphate, qui est formé
lentement par hydrolyse du pyrophosphate.
  2.Saturation de la lumière :
o L'effet de l'intensité lumineuse a été testé en utilisant des écrans de densité neutre.
o Les conditions décrites précédemment ont été utilisées, sauf que l'éclairage était fourni par deux lampes à
incandescence (G.E. DXB Photospot).

 3. Effet de la concentration en bicarbonate :

o L'effet de la concentration en bicarbonate sur le taux a été testé en modifiant la concentration en bicarbonate.
o Les conditions décrites précédemment ont été utilisées, sauf que la concentration en bicarbonate a été modifiée.
o La concentration de chloroplastes a été réduite pour minimiser l'effet de l'épuisement du bicarbonate sur sa
concentration effective pendant la mesure.

 4. Microscopie électronique et microscopie optique :

o Une micrographie électronique de chloroplastes préparée dans les conditions décrites a été réalisée en utilisant la
technique de congélation-incision.
o Les micrographies optiques ont été préparées en utilisant le photomicroscope Zeiss en contraste de phase.

 Résultats et discussions :
o Des chloroplastes isolés à partir de feuilles d'épinards saines ont été utilisés dans l'expérience
o Les chloroplastes ont montré une capacité limitée mais significative à assimiler le CO2, à un taux de 63% par rapport à la
photosynthèse in vivo
o Le taux de photosynthèse a diminué au fil du temps et a atteint un maximum à une concentration de bicarbonate de 3
mAI
o Les chloroplastes utilisés dans l'expérience ont montré une ressemblance avec la photosynthèse in vivo, contrairement à
l'enzyme isolée et purifiée
o La saturation du taux de fixation de CO2 avec l'intensité lumineuse a été observée
o L'apparence des chloroplastes sous microscopie en contraste de phase a été notée
o Les micrographies électroniques ont montré une configuration typique des chloroplastes in vivo
o Les résultats de la fixation de CO2 dans les feuilles entières et les chloroplastes isolés ont montré des tailles de pool
d'intermédiaires de réduction de carbone relativement petites et des quantités élevées de radiocarbone dans les
intermédiaires de réduction de carbone dans les chloroplastes isolés.

 conclusion :
o Les chloroplastes isolés peuvent assimiler le dioxyde de carbone à un taux qui est environ 63% du taux de photosynthèse
in vivo.
o Le taux de photosynthèse diminue avec le temps et est maximal avec une concentration de bicarbonate d'environ 3 mAI.
o Les chloroplastes biochimiquement actifs utilisés dans l'étude sont plus proches de la photosynthèse in vivo que l'enzyme
isolée et purifiée qui catalyse la réaction de carboxylation primaire de la photosynthèse.
o Les micrographies électroniques montrent que les chloroplastes utilisés dans l'étude conservent une membrane intacte et
n'ont pas perdu de protéines solubles.
o Les intermédiaires du cycle de réduction du carbone sont rapidement transportés des chloroplastes isolés dans le milieu
de suspension, tandis que les hexoses monophosphates et le ribulose-1,5-diphosphate sont principalement retenus dans
les chloroplastes.
o Il y a une quantité significative de synthèse de macromolécules à partir du dioxyde de carbone assimilé par les
chloroplastes isolés
o Cette presentation fut presentation par :
- Elia Fadel
- Mahmoud Issa