Détermination de la masse molaire par

ultracentrifugation
Présenté par : BERBER Kadia Nesrine
Responsable du module :Mme.Merine
Plan de travail:

Introduction
Principe de
l’ultracentrifugation
Les différentes Les méthodes utilisées pour mesurer
méthodes la densité de chaque couche

Vitesse de
sédimentation Conclusion
Introduction :
 La détermination de la masse molaire est une étape
importante dans la caractérisation des molécules
biologiques et des polymères. Elle permet de mieux
comprendre leur structure, leur comportement et leurs
interactions avec d'autres molécules. L’ultracentrifugation
est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour
déterminer la masse molaire des macromolécules. Cette
méthode permet de séparer les molécules en fonction de
leur taille et de leur densité, et d'obtenir ainsi des
informations précieuses sur leur composition et leur
structure.
Exemple:

Ultracentrifuges
Principe de l’ultracentrifugation:
 Cette méthode repose sur l'utilisation de forces centrifuges
très élevées, générées par des rotors qui tournent à des
vitesses extrêmement élevées. Les molécules sont placées
dans des tubes de centrifugation et soumises à une force
centrifuge qui les fait se déplacer vers le bas du tube en
fonction de leur densité. Les molécules les plus lourdes se
déplacent plus rapidement que les plus légères, ce qui
permet de les séparer.
LES DIFFÉRENTES
MÉTHODES
D’ULTRACENTRIFUGATION
L’ultracentrifugation analytique:
 L’ultracentrifugation analytique est utilisée pour
déterminer la masse molaire des macromolécules en
solution. Cette méthode consiste à mesurer la distribution
des molécules dans la solution en fonction de leur position
dans le tube de centrifugation. La mesure est effectuée à
l'aide d'un détecteur qui mesure la densité optique de la
solution à différents niveaux de profondeur dans le tube. La
masse molaire est ensuite déterminée en comparant la
distribution des molécules dans la solution à celle d'un
standard de référence.
L’ultracentrifugation préparative:
 L' ultracentrifugation préparative est utilisée pour isoler
des molécules en fonction de leur taille et de leur densité.
Cette méthode est utilisée pour séparer les différents
constituants d'un mélange complexe, tels que les virus, les
protéines, les acides nucléiques, etc. Les molécules sont
séparées en fonction de leur vitesse de sédimentation, qui
dépend de leur masse molaire et de leur forme. Cette
méthode permet d'obtenir des fractions de différentes
tailles et de les isoler pour une analyse ultérieure.
Méthode de détermination de la masse molaire par
ultracentrifugation:

Tout d'abord, la protéine d'intérêt doit être purifiée

pour éliminer les autres composants qui pourraient
interférer avec les résultats de l'expérience. Ensuite, la
protéine est placée dans une solution tampon
appropriée qui permet de maintenir un pH constant et
des conditions physiologiques. Cette solution est
placée dans une cellule de centrifugation adaptée pour
l'ultracentrifugation.
Plusieurs gradients de densité peuvent être
utilisés pour séparer les molécules selon
leur taille et leur forme. Les gradients les
plus couramment utilisés sont les
gradients de saccharose et de glycérol. Ces
gradients permettent de créer un gradient
de densité continu qui permet une
séparation plus précise des différentes
molécules.
Une fois la centrifugation terminée, la densité de
la solution à chaque position dans la cellule est
mesurée. Cette densité est ensuite utilisée pour
calculer la distribution des molécules en
fonction de leur taille et de leur forme. La masse
molaire de la protéine peut être déterminée à
partir de la relation entre la vitesse de
sédimentation et la masse molaire.
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées
pour mesurer la densité de chaque couche:
 la mesure optique de l'absorbance.
 la mesure de la viscosité de chaque couche.
 la diffusion de la lumière
 Ils existent deux types
d’expériences :
équilibre de sédimentation:
qui permet de mesurer M directement , avec une très
grande précision.
Quand les macromolécules sédimentent les processus
de diffusion s'opposent aux forces gravitationnelles. Au
bout d'un certain temps un équilibre est atteint.
Vitesse de sédimentation:

La vitesse de sédimentation peut être mesurée en utilisant des

détecteurs optiques, qui enregistrent l'absorption de la lumière
par les particules dans les différents intervalles de temps

La relation entre la vitesse de sédimentation et la masse molaire peut

être décrite par l'équation de Svedberg. Cette équation relie la vitesse
de sédimentation d'une particule à sa masse et à son coefficient de
friction dans le solvant. Le coefficient de friction dépend de la forme
et de la densité de la particule, ainsi que des propriétés du solvant. La
masse molaire peut être déterminée en utilisant l'équation de
Svedberg et en connaissant le coefficient de friction et la vitesse de
sédimentation.
V: volume spécifique de la solution de
polymère
P: densité de la solution
D:diffusion constante
un coefficient de sédimentation exprimé en
Svedberg (S) qui correspond à 10-13 s
déterminer la masse molaire du lysozyme:
nous allons préparer une solution de lysozyme à une
concentration connue et la placer dans une cuve de
centrifugation analytique
Au fur et à mesure que la solution est centrifugée, les
protéines vont se sédimenter en fonction de leur taille
et de leur masse molaire. Les protéines plus grandes et
plus lourdes vont se sédimenter plus rapidement et se
retrouveront dans les fractions de sédimentation
inférieures, tandis que les protéines plus petites et plus
légères resteront dans les fractions supérieures.
•Pour déterminer la masse molaire du lysozyme, nous allons tracer le
profil de sédimentation obtenu lors de l'ultracentrifugation. Ce profil
sera représenté graphiquement sous forme de courbe où l'axe des x
représente la position de la cellule de sédimentation et l'axe des y
représente la densité optique de la solution.

•À partir de cette courbe, nous pouvons déterminer le coefficient

de sédimentation du lysozyme, qui est une mesure de la vitesse à
laquelle la protéine se sédimente en solution.

•Ensuite, nous allons utiliser une formule mathématique appelée

équation de Svedberg pour calculer la masse molaire du lysozyme à
partir du coefficient de sédimentation mesuré. Cette équation relie le
coefficient de sédimentation à la masse molaire, au rayon de la
particule et à la viscosité du solvant
En utilisant cette méthode, les chercheurs ont
mesuré une masse molaire de 14 300 g/mol pour le
lysozyme, ce qui correspond à la masse molaire
théorique de la protéine. Cette méthode est souvent
utilisée dans les études de protéines pour déterminer
la masse molaire de protéines en solution.
Interprétation des résultats expérimentaux:
 Les résultats de l'ultracentrifugation peuvent être interprétés de
plusieurs façons. La courbe de distribution de la densité peut être
utilisée pour identifier les différentes espèces de molécules présentes
dans la solution. Les pics dans la courbe représentent les différentes
espèces de molécules, et leur position et leur forme indiquent leur
taille et leur forme
 Il est important de noter que la détermination de la masse molaire par
ultracentrifugation peut être affectée par plusieurs facteurs, tels que la
température, le pH, la concentration de la protéine et la force
centrifuge utilisée. Par conséquent, il est important de prendre en
compte ces facteurs lors de l'interprétation des résultats
expérimentaux.
 Conclusion :

• L’ultracentrifugation a été et restera probablement une source

d'informations précises dans le domaine du poids moléculaire, ainsi que
dans le domaine des études hydrodynamiques. la mesure des propriétés
thermodynamiques est très prometteuse et mérite plus d'attention
expérimentale.
•il est important de prendre en compte les effets de la forme des particules,
de leur interaction avec le solvant et de leur agrégation sur la mesure de la
masse molaire.
• Enfin, il est important de souligner que l'ultracentrifugation est une
technique coûteuse et complexe, nécessitant une expertise technique pour
obtenir des résultats fiables et reproductibles
Merci pour
votre attention