Biochimie structurale Glucides. Introduction. Glucides = Cn(H20)n "hydrates de carbone" ( 1 ) ou polysaccharides Trs rpandus dans la matire vivante : 5% poids sec animaux, 70% poids sec vgtaux ( importance des polymres) En alimentation : pain, sucre, crales, lait Oses : glucides simples, non hydrolysables en milieu acide Osides : glucides complexes, dont l'hydrolyse donne plusieurs produits : o holosides : constitus uniquement d'oses simples (amidon, glycogne, saccha- rose) o htrosides : constitus d'une partie glucidique importante et d'un aglycone = partie non glucidique (chane carbone autre). Oses. Composs les plus simples : chane carbone linaire (au moins en thorie)
1 Le terme hydrate de carbone correspond la traduction de lamricain carbohydrate mais na pas de sens en franais : seuls les termes glucide ou ose et leurs drivs doivent tre employs. Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 2 Tous les carbones portent une fonction alcool primaire ou secondaire sauf : un aldhyde sur C1 = aldoses une ctone sur C2 = ctoses Ces deux fonctions sont rductrices (cf. infra). A l d o s es . Le plus simple comporte 3 C : glycraldhyde = aldhyde glycrique la molcule possde 1 C asymtrique 2 nantiomres possibles : D = OH droite ou L = OH gauche On connat sa configuration absolue base pour la nomenclature de tous les autres glu- cides. On regarde l'avant dernier carbone. Les glucides naturels sont de la srie D. analyseur solution polariseur
Par ailleurs l'asymtrie du carbone confre la molcule un pouvoir rotatoire, c'est dire qu'une solution de glucide est susceptible de dvier le plan de vibration d'une lumire po- larise. L'angle de dviation dpend de plusieurs facteurs, notamment le pH, la concentra- tion et la longueur du trajet optique (conditions standardises), mais aussi de la nature du glucide. Les glucides qui dvient la lumire droite sont dits dextrogyres et nots (+), ceux qui la dvient gauche sont lvogyres (-). Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 3 []=1000A/(Cl) Il ne faut pas confondre les notations ni les notions d'nantiomres et de pouvoir rota- toire, malgr l'analogie possible. Par la synthse de Kiliani, on peut passer d'un glucide (n) carbones son homologue suprieur (n+1) carbones. Cette synthse n'est pas strospcifique mais fournit deux pimres (isomres se diffrenciant par la position d'un groupement hydroxyle). Aldoses remarquables : glycraldhyde ; rythrose ; ribose ; arabinose ; xylose ; glucose ; mannose ; galactose. C t o s es . On peut faire driver les ctoses de la dihydroxyactone : CH2OH-CO-CH2OH. Les ctoses portent une fonction ctone sur le deuxime carbone, ce qui fait qu'ils poss- dent un carbone asymtrique de moins que leur homologue aldose. Les autres proprits sont semblables celles des aldoses. Ctoses remarquables : dihydroxyactone ; ribulose ; fructose.
Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 4 C o mp o s s a p p ar en t s au x o s es . Osamines. L'hydroxyle du C2 est remplac par une amine : galactosamine, glucosa- mine, ou encore par NH-CO-CH2 : N- actyl-glucosamine Acides uroniques. Oxydation de la fonction alcool I en fonction carboxylique (et conservent fonction aldhyde) : acide glucuronique (forme de dtoxication), acide galacturonique (pectines).
Autres. Acide ascorbique = Vitamine C Polyalcools = polyols O H OH H OH H N H H OH CH 2 OH H C CH 3 O N-actyl-D-glucosamine H C C OH C C HO H C H OH H OH C O H O HO Acide D glucuronique
CH 2 OH OH CH 2 OH O H OH OH Sorbitol
Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 5 P r o p r i t s d es o s es . Cyclisation. Mise en vidence ; Nature. Le pouvoir rotatoire d'une solution de glucose volue au cours du temps, alors que c'est en thorie une constante, au mme titre que le point de fusion ou la masse molculaire. Par ailleurs, certaines ractions caractristiques des aldhydes ne se font pas complte- ment. Ces observations et d'autres ont conduit postuler l'existence d'un carbone asym- trique supplmentaire par rapport la forme linaire. Cette situation est possible par l'apparition d'un cycle form par l'limination d'une mol- cule d'eau entre la fonction aldhydique et l'hydroxyle port par le carbone 4 ou le carbone 5. Dans le cas du pont oxydique 1-5, on a un cycle hexagonal comportant 5 atomes de car- bone et 1 atome d'oxygne : c'est un noyau pyrannose 2 . Dans le cas du pont 1-4, on a un cycle pentagonal 4 atomes de carbone et 1 oxygne : c'est un noyau furannose. L'loignement des carbones 1 et 4/5 et faible lorsqu'on prend en considration non la re- prsentation linaire, mais la reprsentation spatiale des molcules.
2 pyranne = C H C H CH O H 2
C HC ; furanne = C H C H CH O HC
Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 6 Formes chaise et bateau. Les cycles peuvent prendre deux formes diffrentes dans l'espace : la forme chaise ou la forme bateau. Ceci est d principalement des problmes lis d'une part aux contraintes cres par les liaisons et leurs angles, et d'autre part par l'encombrement strique des atomes. Ces formes sont des tats d'quilibre. On admet que la configuration en chaise est la plus stable, et que c'est de cette faon que sont les oses en solution. Nomenclature. Lorsque le groupement hydroxyle port par le carbone 1 est en dessous du plan du cycle, c'est un -pyrannose, tandis que si elle est au-dessus, c'est un -pyrannose (ou furan- nose). Proprits chimiques des oses. Solubilit. Les oses sont de petites molcules, trs polarisables : ils sont donc trs solubles dans l'eau (jusqu' 3 M, c'est dire 540 g.l -1 !). Estrification. alcool + acide ester + eau La fonction alcool primaire des glucides peut facilement tre estrifie, notamment par de l'acide phosphorique : les oses impliqus dans le mtabolisme sont le plus souvent sous cette forme : glucose-6-P, fructose 1 ou 6 ou 1,6 P, etc., ce qui correspond en fait une nergisation de ces composs. Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 7 Oxydation des oses =caractre rducteur. La fonction aldhydique ou ctonique des oses est susceptible d'tre oxyde, les oses sont donc des composs rducteurs : glucide rducteur + 2 Cu 2+ glucide oxyd + 2 Cu +
Le cuivre prsent dans la liqueur de Felhing ragit ensuite avec la soude pour donner un prcipit rouge brique caractristique : 2 Cu + + 2 OH - 2 CuOH Cu2O + H2O Action des acides concentrs. Sous l'action d'un acide concentr chaud, les aldoses et les ctoses donnent naissance au furfural ou des drivs de furfural. Celui-ci peut ensuite ragir avec divers phnols et donner des colorations caractristiques et quantitatives. Par ailleurs, cest un des principes de la raction de Maillard (coloration de la crote du pain, caramlisation, etc.) Osides. Ho l o s i d es . La liaison osidique. Les fonctions hydroxyle de deux oses peuvent se condenser en librant une molcule d'eau et former une liaison entre les oses : R1-CH-OH + H-OCH-R2 R1-CH-O-CH-R2 + H2O Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 8 La fonction rductrice peut tre libre ou engage dans la liaison osidique, donc le polyho- loside ne sera pas forcment rducteur, mme si les osides qui le composent le sont. Diholosides. Composs forms de 2 oses lis par une liaison osidique : Maltose : D glucopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ; Cellobiose : D glucopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ; Lactose : D galactopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ; Saccharose : D glucopyrannosyl (1-2) D fructofurannose. O CH 2 OH OH OH O CH 2 OH O OH OH O H O CH 2 OH OH OH O H O O CH 2 OH OH OH O CH 2 OH OH OH CH 2 OH O CH 2 OH OH OH O H O O CH 2 OH OH OH O H O O CH 2 OH OH OH Maltose : Dglucopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose Cellobiose : Dglucopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose Lactose : Dgalactopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose Saccharose : Dglucopyrannosyl (1-2)Dfructofurannose
Biochimie structurale Glucides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 9 Polyholosides. Amidon : rserve glucidique des vgtaux amylose : liaisons 1-4, MM 150 000 600 000 amylopectine : liaisons 1-4 et 1-6 : ramifications possibles Glycogne : rserve chez les animaux mme structure que l'amylopectine, mais plus ramifie Cellulose : constituant des parois vgtales liaisons 1-4 ; structure fibreuse Autres : dextranes (bactries) chitine : polymre de N-actyl glucosa- mine pectine : polymre dacides galacturoni- ques
Ht r o s i d es . Partie non osidique = aglycone strols, phnols, O O O O O O O O O Amylopectine (1-4) (1-6)
O O O O O O O O OH O OMe OMe O O CH 2 OH O ... ... Galactose Acides galacturoniques Pectine
Ph. Collas UCO Bretagne Nord 10 Lipides. Introduction. Les lipides sont des substances insolubles en milieu aqueux, mais solubles dans les sol- vants organiques : thanol, chloroforme, ther, Ce sont les huiles (liquides) et les grais- ses (glifies ou solides). Il existe plusieurs classifications anciennes, bases sur les produits d'hydrolyse (lipides simples ou complexes), mais elles sont abandonnes au profit d'une classification base sur la structure. Acides gras. En petite quantit l'tat libre, mais en grande quantit engags dans des liaisons ester ou amide. En gnral, acides monocarboxyliques chane linaire non ramifie contenant un nombre pair d'atomes de carbone (4 - 30). Par convention, on numrote les atomes de carbone partir de celui qui porte la fonction carboxyle. A c i d es g r a s s a t u r s . Formule. CH 3 -(CH 2 ) n -COOH = C n H 2n O 2
Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 11 Les plus frquents sont l'acide palmitique (C16, n = 14) et l'acide starique (C18 ; n = 16). En moins grande quantit, on trouve des acides soit 14, soit 20 carbones. Les autres sont plus rares et ne se rencontrent que dans des tissus spcialiss. Les acides gras nombre impair de carbones sont trs rares, mais ils existent. La chane carbone forme un zigzag. H 3 C H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 COOH Acide starique: C 18
H 3 C H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H C H H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C C H 2 H 2
C COOH Acide olique: C 18:1
Nomenclature. acide myristique = C14 = acide n ttradcanoque acide palmitique = C16 = acide n hexadcanoque acide starique = C18 = acide n octadcanoque A c i d es g r a s i n s a t u r s . Dits aussi dsaturs, ils comportent au moins une double liaison C = C, c'est dire qu'ils ne sont pas saturs en hydrogne. Acides gras monoinsaturs. Ils ne comportent qu'une seule double liaison acide olique= C18 :1 = acide 9-ne octadcanoque CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 12 Acides gras polyinsaturs. Ils comportent plusieurs doubles liaisons : C18 :2 acide linolique CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH C18 :3 acide linolnique CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH Les doubles liaisons ne sont gnralement pas conjugues (elles sont spares par un mthylne -CH2-), mais on rencontre des cas de conjugaison chez certains vgtaux. A c i d es g r a s s p c i au x . Certaines structures particulires peuvent se rencontrer : ramification nombre impair de carbones les deux : ramification et nombre impair de C triple liaison cyclisation P r o p r i t s d es a c i d es g r as . Proprits physiques. solubilit dans les solvants organiques point de fusion : dpend de 2 facteurs : - nombre de carbones : le point de fusion augmente avec le nombre de carbones, pour une srie homologue. - le degr d'insaturation : le point de fusion diminue avec l'insaturation, pour un nombre constant d'atomes de C. Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 13 Les lipides prsents en milieu aqueux s'asso- cient d'une faon stable thermodynamique- ment : structure feuillete ou structure en micelles. De toute faon, les ples hydropho- bes (apolaires) se font face, tandis que les ples hydrophiles (polaires) font face au mi- lieu aqueux. Les micelles peuvent tre ren- verss lorsque les lipides sont en plus grande quantit que l'eau : celle-ci se trouve alors pige dans des gouttelettes au sein de la phase lipidique. Proprits chimiques. Saponification. R-COOH + NaOH R-COO - , Na + + H2O Un acide gras en prsence d'une base forte, chaud, donne un sel ou savon, et de l'eau. Le savon est soluble dans l'eau, et prsente des proprits dtergentes et un pouvoir moussant. On peut doser les acides gras l'aide d'une solution de potasse (KOH) alcoolique, en prsence de phnolphtaline. Ceci permet d'valuer la quantit globale d'acides gras li- bres. On obtient un indice d'acide, correspondant aux mg de potasse ncessaires pour neutraliser l'acidit libre contenue dans 1 g de matire grasse. Acide gras Point de fusion (C) C18 :0 69 C18 :1 16 C18 :2 -5 C18 :3 -11
Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 14 Glycrolipides. On distingue deux grands groupes : les glycrides et les phospholipides. Leur structure est commune : un glycrol est estrifi par plusieurs acides gras. G l y c r i d es . Nature. Neutres, ils ne contiennent que C,H et O. Ce sont des esters d'acide gras et de glycrol : CH2OH R1-COOH CH2-O-C=O-R1 CHOH + R2-COOH CH-O-C=O-R2 CH2OH R3-COOH CH2-O-C=O-R3 Une ou plusieurs des trois fonctions alcool du glycrol peuvent tre estrifies, et ceci par le mme acide gras ou par des acides gras diffrents. Les Triglycrides sont les consti- tuants majeurs du tissu adipeux des animaux, et des huiles et graisses vgtales. R1 = R2 = R3 = C17H33 homogne : triolate de glycryle (olique = C18 :1) ; R1 = R3 = C17H33 ; R2 = C17H35 htrogne : olate-1 starate-2 olate-3 de glycryle. Proprits physiques. Le point de fusion dpend des acides gras estrifiant le glycrol. Mmes rgles. Les glycrides sont insolubles dans l'eau. Proprits chimiques. Hydrolyse - Saponification. Hydrolyse enzymatique (lipases) glycrol + acides gras ; Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 15 ou en milieu alcalin chaud glycrol + savons (sels d'acides gras). indice d'estrification = mg de NaOH ncessaires pour estrifier 1 g de matire grasse. Indice de saponification = indice d'acidit + indice d'estrification Ractions lies l'insaturation. hydrognation = ajout de H des acides insaturs : sous pression, avec un catalyseur ; addition d'halognes : l'iode se fixe uniquement sur les doubles liaisons. L'indice d'iode correspond aux mg d'I2 que peuvent fixer 100 g de matires grasses. L'indice d'iode permet de calculer l'insaturation des lipides. oxygnation : donne le got rance aux matires grasses. P h o s p h o l i p i d es ( Gl y c r o p h o s p h o l i p i d es ) . Nature. Ce sont des glycrolipides dont un des carbones du glycrol porte non un acide gras, mais un acide phosphorique, ce qui donne un acide phosphatydique. CH2-O-C=O-R1 CH2-O-C=O-R2 CH2-O-PO3H2
Le groupement phosphoryle peut tre port soit par le carbone , soit par le carbone . H 2 C CH C H 2 O C R 1 O C R 2 O P O C H 2 C H 2 N+ CH 3 CH 3 CH 3 Choline Phosphatidyl choline (Les flches indiquent les liaisons susceptibles d'tre hydrolyses par des enzymes.)
Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 16 La fonction acide du phosphoryle peut tre elle-mme estrifie, par diverses molcules alcooliques : choline, thanolamine, srine. Les phospholipides sont des intermdiaires importants du mtabolisme. Rles. Une molcule ayant deux charges opposes des proprits tensioactives, c'est dire qu'elle permet de stabiliser des mulsions. Ce sont les phospholipides de la membrane plasmique. Alors que les acides gras consti- tuent la partie hydrophobe, l'acide phosphorique constitue la partie hydrophile. Ces acides gras s'arrangent naturellement en structure feuillete bicouche lipidique. Si on agite, la structure feuillete est dsordonne et les lipides peuvent se rarranger en micelles. Action des enzymes sur les phospholipides. L'action des enzymes permet, par les produits qu'elle libre, de dterminer prcisment la composition de lipides inconnus. Autres types de lipides. S p h i n g o l i p i d es . Les acides gras ne sont plus lis une molcule de glycrol, mais une sphingosine : Comme dans le cas des phospholipides, l'acide phosphorique peut tre estrifi (par la choline sphingomyline). Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 17 L'un des H de la fonction amine est substitu et porte donc un radical li par une amide (ce n'est plus un ester). Importants C r i d es . Esters d'acide gras et d'alcool chane non ramifie ayant un nombre pair d'atomes de carbone. Constituants majeurs de la cire des abeilles. S t r i d es et c o mp o s s i s o p r n i q u es . La structure isoprne se rpte un certain nombre de fois, ven- tuellement en formant des cycles. carotne : pigment important des vgtaux, inclus dans les membranes des thylakodes du fait de son caractre hydrophobe fort. Strides : esters d'acides gras et de strol. Entrent dans le mtabolisme des strodes (hormones). HO C C H CH 2 H 2 C H 3 C isoprne Cholestrol
Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 18 Mthodes d'analyse. E x t r a c t i o n . L'extraction des lipides se fait au moyen de solvants organiques, tels que le chloroforme, le mthanol, etc. Aprs broyage du matriel biologique, on ajoute le solvant, et agite et on laisse reposer. Les phases aqueuses (contenue dans le matriel) et organique se sparent par dcanta- tion. On recueille la phase organique. S p a r at i o n et d o s ag e. La sparation des lipides du solvant de dpart ainsi qu'entre eux se fait par des techni- ques chromatographiques. Le principe est que chaque molcule possde une affinit propre pour une certaine autre molcule (solide, liquide ou gazeuse). Si on fait passer un mlange complexe sur cette molcule, les constituants du mlange seront d'autant plus retenus que leur affinit sera grande. En utilisant des jeux de colonnes et de solvants adapts, on peut donc sparer les diffrents lments du mlange. Grce un systme de dtection appropri, on peut ensuite quantifier chaque espce molculaire sortant de l'appareillage. Chromatographie basse pression sur colonne Chromatographie liquide haute pression Chromatographie sur couche mince Biochimie structurale Lipides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 19 Chromatographie en phase gazeuse (demandant une drivation pralable, mais de loin la mieux adapte aux lipides). Ph. Collas UCO Bretagne Nord 20 Peptides. Acides amins. F o r mu l e g n r a l e. Le carbone portant la fonction carboxylique acide est dit "0", donc le car- bone suivant est le carbone . Il porte la fonction amine NH2. Ce sont donc des acides amins. On trouve en gros 20 AA naturels protinognes, combins ou non soit entre eux, soit avec d'autres molcules. P r i n c i p au x a c i d es a mi n s n a t u r el s . Acides amins aliphatiques. Le radical R est une chane carbone, ramifie ou non : Acides amins chane hydrocarbone: H CH COOH NH 2 H 3 C CH COOH NH 2 Glycine (Gly; G) Alanine (Ala; A) CH CH COOH NH 2 H 3 C H 3 C Valine (Val; V) C H 2 CH COOH NH 2 CH H 3 C H 3 C Leucine (Leu; L) CH CH COOH NH 2 C H 2 CH 3 H 3 C Isoleucine (Ile; I)
Acides amins hydroxyls / Acides amins soufrs H 2 C CH COOH NH 2 OH Srine (Ser; S) CH CH COOH NH 2 OH H 3 C Thronine (Thr; T) C H 2 CH COOH NH 2 HS Cystine (Cys; C) C H 2 CH COOH NH 2 H 2
C S CH 2 Mthionine (Met; M)
Acides amins dicarboxyliques et leurs amides: CH COOH NH 2 C H 2 HOOC Ac. aspartique (Asp; D) CH COOH NH 2 C H 2 OC NH 2 Asparagine (Asn; N) COOH CH C H 2 C H 2 HOOC NH 2 Ac. glutamique (Glu; E) Glutamine (Gln; Q) COOH CH C H 2 C H 2 OC NH 2 NH 2
COOH HC R NH 2
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 21 Acides amins basiques H 2 C C H 2 C H 2 C H 2 CH COOH NH 2 NH 2 Lysine (Lys; K) H 2 N C N H NH C H 2 C H 2 C H 2 CH COOH NH 2 Arginine (Arg; R) N H C C H NH C C H 2 CH COOH NH 2 Histidine (His; H)
Acides amins cycliques. L'atome d'azote des acides htrocycliques est en fait une imine : acides imins. Acides amins aromatiques: C H 2 CH COOH NH 2 Phnylalanine (Phe; F) C H 2 CH COOH NH 2 HO Tyrosine (Tyr; Y) N H H 2
C CH COOH NH 2 Tryptophane (Trp; W)
Acides amins htrocycliques: N H COOH N H COOH HO N H COOH Proline (Pro; P) Hydroxyproline Ac. pipcolique
P r o p r i t s . Carbone asymtrique. CHO C CH 2 OH OH H CHO C CH 2 OH HO H COOH C CH 3 NH 2 H COOH C CH 3 H 2 N H Glycraldhyde Alanine D L D L
A l'exception de la glycine, tous les acides amins comportent au moins un carbone asy- mtrique. Comme dans le cas des glucides, on distinguera les deux sries, D et L, mais les acides amins naturels sont de la srie L (glucides de la srie D). Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 22 Pour les mmes raisons, ces molcules sont dotes d'un pouvoir rotatoire. Dissociation. En fonction du pH du milieu, les fonctions acides ou basiques se dissocient. Par exemple, en milieu acide, un excs de protons bloque la fonction carboxyle, qui ne se dissocie pas, tandis que la fonction amine peut accepter un proton supplmentaire : acide R-CH-NH2-COOH + H + R-CH-NH3 (+) -COOH (1) neutre R-CH-NH2-COOH + OH - R-CH-NH2-COO -
basique R-CH-NH2-COOH R-CH-NH3 (+) -COO - (2) Les constantes de dissociation des deux fonctions sont elles aussi caractristiques de l'acide amin : K 1 = [ R COO
] [ H + ] R COOH et K 2 = [ R NH 2 ] [ H + ] [ R NH 3 + ]
Bien que les valeurs exactes varient d'un compos l'autre, on peut considrer que K1 10 -4 10 -6 et K2 10 -8 10 -10 . A pH = 7, pour des valeurs moyennes de K1 = 10 -5 et K2 = 10 -9 , on a : 10 5 = [ R COO
] 10 7 [ R COOH ]
[ R COO
] [ R COOH ] = 10 2
Ce qui revient dire qu' pH = 7, il y a une molcule non dissocie pour 100 molcules ionises. De la mme faon, on calcule :
1 0,5 0 0,5 1 + H+ + OH- 3 6 9 12 pH
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 23 Il y a l aussi 1% de formes non dissocies. Lorsque la concentration en H + est gale K1, c'est dire quand pK1 = pH, il y a autant de molcules non dissocies que d'anions. Le pK correspond au pH de demi-dissociation. Les acides amins sont donc des composs amphotres, les deux fonctions sont ionisa- bles. On dfinit le point isolectrique ou pHi comme la valeur du pH pour laquelle on obtient une forme comportant les deux fonctions ionise et appele amphiion. Le pHi est une valeur caractristique de l'acide amin. La prsence de plusieurs groupes carboxyles ou amins sur une mme molcule entrane une modification du pHi par rapport une molcule n'ayant qu'un seul de chaque groupement. Le pHi est alors calcul sur l'ensemble des groupements. En fonction de l'ionisation de l'acide amin, il se dplacera dans un champ lectrique soit vers la cathode (s'il est charg positivement), soit vers l'anode (charge ngative). Solubilit. Les acides amins sont solubles dans l'eau, pas dans les solvants organiques (la nature du radical peut cependant modifier cette solubilit). Ractivit. Liaison peptidique. Elle est lie la prsence des deux groupements qui peuvent ragir ensemble pour for- mer une liaison peptidique : 10 9 = [ R NH 2 ] 10 7 [ R NH 3 + ]
[ R NH 2 ] [ R NH 3 + ] = 10 2
pH i = pK 1 + pK 2 2
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 24 R 1 CH NH 2 COOH HOOC CH NH 2 R 2 R 1 CH N H C O C H R 2 COOH NH 2 +
Les atomes engags dans la liaison peptidique sont tous placs dans le mme plan. Grce cette liaison peptidique, des polymres de taille parfois trs grande peuvent tre forms : acide amin = 1 < oligopeptide < 4 - 5 < polypeptide < 100 < protine sujet des chapitres suivants. Ractions lies au carboxyle. A pH trs lev, il peut donner un sel. La dcarboxylation peut tre ralise chimiquement ou par une enzyme. Elle conduit la formation d'une amine simple (R-CH2-NH2), et elle intervient frquemment dans le mta- bolisme (interconversion de composs). Ractions lies l'amine. Les hydrognes de l'amine peuvent tre substitu par d'autres radicaux, aliphatiques, aromatiques, etc. Les acides dicarboxyliques et leurs amines sont importants pour le transfert des groupe- ments amins : intervention de transaminases : R1-CO-NH2 + R2-CO-COOH R1-CO-COOH + R2-CO-NH2 Glu + AOA KG + Asp Glu + Pyr KG + Ala Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 25 Le formol agit sur la fonction amine primaire pour conduire la formation d'une amine ter- tiaire : Raction la ninhydrine. Les acides amins ragissent avec la ninhydrine oxyde pour former un com- plexe de deux molcules de ninhydrine (rduites) lies par l'azote de l'AA. Ce complexe absorbe fortement 570 nm environ et la raction sert au dosage des acides amins. Mthodes d'analyse. L'extraction des acides amins libres peut se faire simplement l'eau, puisqu'ils sont so- lubles. On les spare sur des colonnes changeuses d'anions ou de cations, c'est dire en fonc- tion de leur caractre acide ou basique un pH donn : on recueille ainsi trois fractions, acide, basique et neutre. La fraction neutre contient en plus les glucides solubles. La sparation fine se fait gnralement par chromatographie (papier, basse ou haute pression, CCM,). On utilise frquemment l'lectrophorse (sur papier ou sur gel) pour analyser les acides amins. Le support est plac dans une solution tamponne ( pH choisi convenablement) et soumis un champ lectrique. En fonction du pH et du champ, les AA migrent dans un sens, dans l'autre, ou restent au niveau du dpt. L'analyse et la quantification se font gnralement soit par raction colore (ninhydrine), soit par dtection dans l'UV des longueurs d'onde gnralement infrieures 230 nm (les glucides, par exemple, n'absorbent pas dans l'UV et donc n'interfrent pas dans le dosage). R CH COO - NH 2 + 2 H C O H R CH COO - N CH 2 OH CH 2 OH
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 26 Peptides et protines. Les peptides sont de petits polymres d'acides amins, lis entre eux par des liaisons peptidiques. La raction du biuret permet le dosage des peptides en milieu alcalin : les liaisons peptidiques forment un complexe violet en prsence d'ions cuivriques. Leurs proprits sont intermdiaires entre celles des acides amins et celles des proti- nes. Ils sont plus ou moins solubles dans l'eau, et prsentent un caractre amphotre, li leur pHi G n r al i t s . Polymres d'acides amins relis par des liaisons peptidiques. Il existe 20 AA majeurs entrant dans la composition des protines (plus quelques autres, un peu originaux). Les conventions d'criture placent la fonction N terminale gauche, et la fonction C termi- nale droite. Les protines jouent diffrents rles dans l'organisme : structure (maintien de la mem- brane plasmique) ou mtabolisme (enzymes ; protines porteuses,) S t r u c t u r e p r i mai r e. C'est la squence en acides amins. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 27 Composition en acides amins. Hydrolyse. La composition brute en AA peut tre dtermine par hydrolyse chimique (HCl 6N, 105C, 24 h, ampoule scelle). Le mlange obtenu est ensuite analys par chromatographie (pa- pier 2 dimensions, HPLC, ). Cette mthode pose problme car elle conduit la destruc- tion de certains AA, l'isomrisation D - L d'autres, etc. L'hydrolyse peut aussi tre ralise par voie enzymatique (protases), mais on n'obtient gnralement que des polypeptides, et non les AA eux-mmes. Nombre d'acides amins - Titration au formol. Une protine ne contient thoriquement qu'une seule fonction acide libre et une seule fonction amine libre, les autres tant engages dans les liaisons peptidiques. Cependant les acides dicarboxyliques ou diamins ventuels prsentent une fonction libre chacun. On prend l'exemple d'une protine n'ayant ni acide dicarboxylique, ni acide diamin. On bloque la fonction amine terminale par raction au formol. Il ne reste que la fonction acide libre. Un dosage acide - base donne un certain volume de base ncessaire la neutralisa- tion de la fonction acide. On refait la mme exprience avec la protine hydrolyse. Cette fois, toutes les fonctions acides sont disponibles, et il faut d'autant plus de base pour les neutraliser. Le rapport entre les deux volumes donne une approximation du nombre d'aci- des amins composant la protine. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 28 Dtermination de la squence propre en AA. Mthodes chimiques. Mthode de Sanger : Rsidu N terminal. Le dinitrofluorobenzne (NDFB) forme, avec la fonction N terminale, un driv avec libration d'acide fluorhydrique. L'hydrolyse de la pro- tine libre ensuite le compos driv, qui prsente des caractristiques propres de colo- ration et de migration en chromatographie ou en lectrophorse. En comparant le rsultat de l'analyse aux standards connue et l'hydrolyse "simple" pratique plus haut, on peut connatre l'acide amin N terminal. Dansylation : Rsidu N terminal. Le chlorure de 1-dinthyl-amino-naphtalne-5-sulfonyle (DANS) ragit avec le NH2 termi- nal et donne un driv (dansyl-amino-acide) dcelable par sa fluorescence jaune. La m- thodologie est la mme que dans le cas de la mthode de Sanger, mais la raction est 100 fois plus sensible. La dansylation est utilise pour doser les acides amins par HPLC car elle permet une meilleure dtection et une meilleure quantification. F O 2 N NO 2 H 2 N CH COOH R HN O 2 N NO 2 CH COOH R + HF +
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 29 Mthode d'Edman : Rsidu N terminal. Le phnylthioi- socyanate donne une ph- nylthiodantoine avec l'acide N terminal. Il libre un nouveau polypeptide, ayant un AA de moins que le prcdent, avec lequel il peut alors ragir. Cette dtermination est donc dite rcurrente. En l'arrtant temps, ou en utilisant diverses mthodes mathmatiques, on peut ainsi connatre de pro- che en proche la composition complte de la molcule. Cette technique a t utilise dans un appareil automatis. Raction l'hydrazine : Rsidu C terminal. HN CH R C O N H CH R 1 COOH H 2 N NH 2 H 2 N CH R C O N H NH 2 H 2 N CH COOH R 1 n n + + n
Un traitement l'hydrazine 100C hydrolyse toutes les liaisons peptidiques, et libre des hydrazides de tous les AA sauf le C terminal, qui se prsente comme un AA libre normal. Il est alors facile isoler et identifier. Mthodes enzymatiques. Pour chacune des extrmits, il existe une enzyme particulire qui hydrolyse les acides terminaux. Il s'agit de la carboxypeptidase et de l'aminopeptidase, qui librent respecti- vement l'acide C-terminal et l'acide N-terminal. Il s'agit de mthodes rcurrentes, qui d- C O C H N H C O C H NH 2 R 2 R 1 N C S + C O C H N H C O R 2 CH H N R 1 C N S CH OC N C H N R 1 S C O C H N H C O C H NH 2 R 3 R 2 + Peptide 1 Phnylthioisocyanate Phnylthiodantoine Peptide 2 = peptide 1 (-) AA 1
Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 30 gradent le polypeptide dans toute sa longueur. On parvient connatre la squence grce la vitesse de libration des acides amins. S t r u c t u r e s ec o n d a i r e. L'encombrement strique des acides amins et les angles des liaisons font que l'encha- nement n'est pas linaire, mais prsente un certain nombre de replis. En outre, les diff- rentes portions des replis peuvent tablir entre elles des liaisons qui vont contribuer consolider la structure. Liaisons intervenant dans la structure spatiale. Liaison disulfure. C'est une liaison covalente forte tablie entre deux rsidus cystine appartenant une seule chane ou deux chanes diffrentes. Liaison ionique (ou saline). C'est une liaison lectrovalente (plus faible) tablie entre deux charges de signe oppos : NH3 + et COO - . Ce type d'interaction permet la liaison de deux molcules de type diffrent dans les htroprotines. Liaison hydrogne. Ce type de liaison non covalente se forme lorsque sont proximit l'un de l'autre d'une part un atome d'hydrogne li un azote ou un oxygne, et d'autre part un doublet lec- tronique non partag d'un autre azote ou d'un autre oxygne. Ces liaisons peuvent s'tablir entre : les C=O et les N-H des liaisons peptidiques ; Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 31 les radicaux des rsidus d'acides amins, impliquant par exemple les noyaux phnoli- ques, le carboxyle du glutamate, etc. Liaison hydrophobe. Les chanes latrales hydrophobes de certains acides amins (Ala ; Val ; Leu ; Ile ; Phe) sont repousses par l'eau et ont donc tendance se rapprocher les unes des autres (inte- ractions de type Van der Waals). 2. Proprits spatiales de la liaison peptidique. C C N H C O C C -O N+ H C
C C N C R 2 R 1 H H H H H O
La liaison peptidique peut s'crire sous deux formes : elle possde donc un caractre de double liaison, ce qui implique que les atomes soient tous dans le mme plan. Il existe une possibilit d'isomrie cis - trans pour les rsidus de part et d'autre de la liaison. Ces proprits entranent trois possibilits de conformation spatiale : les plans successifs alternent de part et d'autre selon deux orientations privilgies, et on parlera de structure en feuillet pliss ; les plans successifs tournent rgulirement dans le mme sens, et on parlera de struc- ture hlicodale ; il n'y a pas de direction privilgie, et on parlera de pelote statistique. Feuillets plisss. Protines fibreuses. Liaisons hydrognes inter-chanes Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 32 Hlices . Protines globulaires. Liaisons hydrogne intra-chane. S t r u c t u r e t er t i a i r e. Dfinition. Une protine peut en fait adopter les diffrents types de structure secondaire en diffrents endroits de sa structure primaire, ou selon les conditions extrieures. Il s'ensuit que la mo- lcule acquiert un encombrement strique particulier : la conformation de la protine. Notion de site actif. Le volume est rempli par les acides amins. Des acides loigns dans la structure pri- maire peuvent se placer proximit les uns des autres, voire tablir de nouvelles liaisons. L'environnement lectronique des acides est donc modifi. Des cryptes peuvent se for- mer : en fonction de la nature des acides amins et de l'espace vide qu'ils entourent, cer- taines molcules extrieures pourront venir s'y placer, mais pas d'autres. Parmi les mol- cules pouvant se fixer, certaines subiront des modifications : site de fixation et site actif des enzymes. S t r u c t u r e q u at er n a i r e. Il arrive qu'une protine seule ne soit pas fonctionnelle. Il faut que plusieurs molcules de la mme protine s'associent pour que la fonction soit assure. On parle alors de mono- mres s'associant en oligomres ou en polymres. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 33 Dans certains cas, l'association concerne plusieurs oligomres d'une mme protine, mais parfois il s'agit de monomres de molcules diffrentes : cas des porines (8 fois la mme protine, formant canal) ou de la RubisCO (2 x 4 protines) La dnaturation d'une protine peut correspondre la rupture des liaisons entre les cha- nes. Sans atteinte aux liaisons peptidiques, la protine perd alors ses proprits fonction- nelles. P r i n c i p al es p r o p r i t s d es p r o t i n es . Solubilit. Elle est trs variable, et dpend de plusieurs facteurs : Electrolytes. Les sels neutres faible concentration ont un effet dissolvant, tandis qu' forte concentra- tion, ils provoquent la prcipitation des protines. On peut alors sparer les diffrentes classes de protines en fonction de la concentration laquelle elles prcipitent. On ajoute progressivement du sel (ex. sulfate d'ammonium) dans le milieu. Entre chaque ajout, on centrifuge et on recueille la fraction ayant prcipit. pH. La solubilit d'une protine est minimale au voisinage de son pHi. Dans certains cas, on peut obtenir la cristallisation d'une protine en augmentant progressivement sa concentra- tion tout en la maintenant son pHi. Solvant organiques. L'thanol, le mthanol et l'actone peuvent tre utiliss pour faire prcipiter les protines. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 34 Dtermination de la masse molculaire. Les masses molculaires peuvent varier de 10 000 plus de 1 000 000. Filtration sur gel de dextrane. Les gels utiliss sont de type Sephadex. Ce sont des polymres glucidiques synthtiques ayant des liaisons croises. Ces liaisons dterminent une certaine porosit. On parle de tamisage molculaire : les plus grosses molcules, exclues du gel, passent rapidement, tandis que les plus petites sont retenues par le rseau. On commence par talonner le gel en faisant passer des molcules de masse connues et en mesurant leur temps de rten- tion, puis on fait passer des chantillons de masse inconnue, et on compare leur temps de rtention ceux mesurs. Ultracentrifugation. Sdimentation. La centrifugation haute vitesse d'une solution de protine provoque sa sdimentation en fonction de sa densit (qui est ncessairement suprieure celle du solvant). Grce des systmes optiques, on peut suivre cette sdimentation au cours du temps. On parvient sparer les diffrentes protines de la solution, et les comparer des tmoins. On peut aussi utiliser un solvant de densit variable, et les protines vont alors se placer dans la zone correspondant leur densit. Cette mthode est aussi applique la spa- ration des organites cellulaires. Electrophorse. L'lectrophorse, notamment sur gel de polyacrylamide (PAGE), utilise le caractre am- photre des protines. Places dans un champ lectrique, elles se dplacent vers l'lec- trode qui les attire. Comme dans les autres cas, la comparaison des protines de rf- rence permet de savoir leur masse molculaire. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 35 C l as s i f i c at i o n d es p r o t i n es . Classification selon la forme des molcules. Protines fibreuses ou sclroprotines. Pratiquement insolubles. Fibrones de la soie ; collagnes (tissus conjonctifs transfor- mables par la chaleur en glatines) ; kratines. Protines globulaires ou sphroprotines. Forme gnrale sphrique ou ovode. Classification selon la solubilit. Albumines. Solubles dans l'eau distille. Prcipitent par addition de sulfate d'ammonium entre 70 et 100% de la saturation. pHi < 7 (caractre acide). Globulines. insolubles dans l'eau pure, mais solubles dans les solutions salines dilues (NaCl 5%), prcipitent par addition de sulfate d'ammonium 50% de la saturation. Souvent des gly- coprotines ou lipoprotines. Protamines et histones. Solubles, taille petite (plutt polypeptides que protines) ; trs basiques (lysine et arginine) pHi lev. Globines. solubles dans l'eau. Biochimie structurale Peptides Ph. Collas UCO Bretagne Nord 36 Prolamines et glutlines Protines vgtales insolubles dans l'eau, mais solubles dans les acides et les bases di- lus. Classification selon la composition. Holoprotines. Elles ne sont constitues que d'acides amins. Htroprotines. Elles comportent une ou plusieurs chanes peptidiques associes (homoprotine) lies par covalence un groupement prosthtique de nature non glucidique. La nature de ce groupement est extrmement varie : glucide glycoprotines lipide lipoprotines phosphate phosphoprotines ion mtallique chromoprotines (hmoglobines, cytochromes)
Ph. Collas UCO Bretagne Nord 37 Acides nucliques Introduction Constituants universels de la matire vivante, reprsentant 10 20 % de la masse sche. Caractre acide Regroups en deux classes : acides dsoxyribonucliques = ADN acides ribonucliques = ARN Composition Os es Deux pentoses peuvent entrer dans la composition des acides nucli- ques : le ribose ou sa forme 2 d- soxy. B a s es a z o t es Les constituants de base des acides nucliques sont des composs portant plusieurs fonctions amines, ce qui leur confre un caractre basique. On distingue deux groupes : les bases puriques et les bases pyrimidiques. O HOH 2 C OH OH HO O HOH 2 C OH H HO D ribose 2 dsoxy D ribose
Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 38 Bases puriques Deux bases puriques principales sont trouves dans les acides nucliques : la guanine et l'adnine. N N N H N Purine N N N H N NH 2 Adnine = 6 amino-purine N N N H N H 2 N O Guanine = 2-amino-6-oxy-purine
Il existe d'autres bases naturelles, que l'on trouve par exemple dans certains ARNt, ainsi que des drivs ayant des fonctions particulires, notamment des hormones vgtales (cytokinines, impliques dans la division cellulaire). Bases pyrimidiques Elles drivent de la pyrimidine. N N H N N H NH 2 O Pyrimidine Cytosine (2-oxy-4-amino-pyrimidine) HN N H O O Uracile (2,4-dioxy-pyrimidine) HN N H O O CH 3 Thymine (2,4 dioxy-5-mthyl pyrimidine ou 5-mthyl-uracile)
Comme dans le cas des bases puriques, il en existe d'autres, par exemple dans l'ADN de certains bactriophages (virus infectant des bactries). La cytosine et l'uracile se trouvent dans les ARN, mais la thymine remplace l'uracile dans les ADN. Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 39 Nu c l o s i d es La liaison d'une base et d'un pentose forme un nucloside. On numrote les atomes de la base de 1 9 (bases puriques) ou de 1 6 (bases pyrimidique). Pour ne pas les confondre, les atomes du pentose sont nu- mrots de 1' 5'. Nu c l o t i d es . Nuclotides monophosphate. La fonction alcool primaire du carbone 5' du pentose peut tre estrifie par un acide phosphorique. On obtient alors un nuclotide. Il peut tre monophosphate s'il n'y a qu'un seul phosphore.
Base Ribonucloside Ribonuclotide Adnine Adnosine Adnylate Adnosine monophosphate (AMP) Guanine Guanosine Guanylate Guanosine monophosphate (GMP) Uracile Uridine Uridylate Uridine monophosphate (UMP) Cyto- sine Cytidine Cytidylate Cytosine monophosphate (CMP) N 1 2 N 3 4 5 6 N 9 8 N 7 1 ' O 4 ' 3 ' 2 ' NH 2 HOH 2 C 5 ' Adnosine N N 1 NH 2 O 1 ' O 4 ' 3 ' 2 ' H H H OH H HOH 2 C 5 ' H dCytosine
Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 40 Base Dsoxyribo- nucloside Dsoxyribonuclotide Adnine Dsoxyadnosine Dsoxyadny- late Dsoxyadnosine monophosphate (dAMP) Guanine Dsoxyguanosine Dsoxyguany- late Dsoxyguanosine monophosphate (dGMP) Uracile Dsoxyuridine Dsoxyuridylate Dsoxyuridine monophosphate (dUMP) Thy- mine Thymidine Thymidylate Thymidine monophosphate (TMP) Nuclotides diphosphate et triphosphate. Les molcules d'acide phosphorique portes par le pentose peuvent se lier d'autres mo- lcules du mme acide par une liaison dite phosphodiester. Ces liaisons demandent une grande nergie pour leur formation, mais peuvent restituer cette nergie lors de leur hy- drolyse. N N N N H O OH OH CH 2 O P O P O P OH OH O OH O OH O NH 2 Adnine Ribose ATP
N H O OH OH CH 2 O P O P O P OH OH O OH O OH O Uracile Ribose UTP NH O O
Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 41 Structure S t r u c t u r e p r i mai r e L'alternance pentose - phosphate cre le sque- lette de l'acide nuclique (ADN et ARN). S t r u c t u r e s ec o n d a i r e d e l ' A DN Watson et Crick, 1953.
A T = G C = 1 et A + G T + C = 1 ou A + G = T + C , c'est dire qu'il y a autant de bases puriques que de bases pyrimidiques. En revanche, A + T G + C est trs variable et spci- fique. Les tudes en Rx (aprs cristallisation) mon- trent qu'il s'agit d'une hlice. Il existe des liaisons hydrogne. La structure est celle d'une double hlice. ; il y a appariement des bases homologues. La molcule hlicodale est dextrogyre. Le pas de l'hlice est de 30, le diamtre de 20. Il y a toujours la mme quantit d'ADN dans un noyau, et une composition fixe en bases azotes pour tous les types cellulaires d'un espce donne. HN N O H 2
C O P HO O O O O O P HO O H 2
C O N N N N O P HO O O H 2
C O N N O O O NH 2 NH 2
Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 42 La complmentarit des bases st essentielle la stabilit de la double hlice. Les deux chanes sont opposes, ou anti-parallles. P r o p r i t s d e l ' A DN L'ADN est soluble dans l'eau sous forme de sels de sodium (en donnant une solution vis- queuse). Il prcipite dans l'thanol ( moyen efficace pour l'isoler puis l'tudier). La prsence des bases provoque une absorption caractristique dans l'UV 260 nm. Cette absorption est de 30% infrieure celle d'un mlange comportant la mme quantit de bases et les mmes proportions que l'ADN tudi : c'est l'effet hypochrome, d aux liaisons hydrognes entre les bases des deux brins. Dnaturation thermique. A partir d'une solution d'ADN natif, lorsqu'on augmente progres- sivement la temprature, on constate une lvation de la DO 260 courbe de fusion de l'ADN. Cette augmentation brusque de la DO est appe- le effet hyperchrome. En mme temps, on note une diminution de la viscosit de la solution. La courbe de fusion correspond la sparation des deux brins qui forment l'hlice. La rupture des liaisons hydrogne provoque une dspirali- sation de la molcule. L'ADN devient monoca- tnaire, il est dnatur. DO 260 T
Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 43 Les courbes de fusion de deux molcules d'ADN prsentent des valeurs diffrentes de temprature de demi-dissociation cause d'une composition diffrente en bases : lorsque la teneur en G+C augmente, la temprature augmente aussi. Le phnomne est rversible par simple refroidissement progressif de la solution. L'ADN reforme la double hlice et redevient donc bicatnaire. Si le refroidissement est brusque, les chanes restent monocatnaires. La reformation de la double hlice est d'autant meilleure que la complmentarit entre les brins est plus grande. En consquence, si on place dans la solution deux brins bicatnai- res diffrents, et qu'on chauffe, les deux donnent chacun deux brins. Lors du refroidisse- ment, les sections ayant des bases homologues pourront s'apparier, tandis que les sec- tions non homologues ne le pourront pas. Il y a formation de portions bicatnaires, et de portions en boucles non apparies. C'est l'hybridation des acides nucliques. S t r u c t u r e s ec o n d a i r e d es A R N Structure et proprits gnrales Leur masse molculaire est plus faible que celle des ADN : ils sont plus petits. Ce sont des chanes monocatnaires de nuclotides : A, G, C, U. Il peut y avoir des portions com- plmentaires de parties diffrentes de la chane crant des replis : zones bicatnaires, stabilises par des liaisons hydrognes. Leur solubilit et leur absorption dans l'UV sont proches de celles de l'ADN. On n'obtient pas dans leur cas de courbe de fusion directement comparable celle de l'ADN, mais en revanche, on peut provoquer l'hybridation d'un ADN et d'un ARN. IL n'y a pas d'effet hy- perchrome ni d'effet hypochrome. Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 44 Diffrents types d'ARN A part dans le cas des Virus, le cellules prsentent trois types diffrent d'ARN au moins. ARN messagers =ARNm Il s'agit de la squence complmentaire d'une portion de l'ADN de la cellule. Il est obtenu par transcription partir de l'ADN. Transcription : on garde le mme langage (c'est dire le code gntique), mais on change d'alphabet (T -> U). Traduction : on change de langage du code gntique en codon, on passe aux proti- nes constitues d'acides amins. Moyen mnmotechnique : les oprations se font dans l'ordre alphabtique inverse. Les ARN messagers sont "linaires". Leur masse molculaire est trs leve, en liaison avec la taille de la protine qu'ils codent. Elle volue au cours de leur maturation (matura- tion post transcriptionnelle) : une partie de ce qui a t transcrit est limin. En particulier, ils sont souvent prcds, leur extrmit 3' d'une chane de plusieurs adnosines (30 200) : ARNm poly A. Cette squence une rle signal intervenant dans la reconnaissance avec les ribosomes. Les ARNm ont une dure de vie courte (demi-vie de quelques heures pour la plupart), sauf dans des cas particuliers, par exemple dans les formes de vie ralentie comme les graines des vgtaux. ARN de transfert =ARNt Les ARNt ont gnralement une configuration en feuille de trfle. Ils prsentent des replis et des zones apparies. Une des boucle porte l'anti-codon, c'est dire le triplet de bases Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 45 complmentaires du triplet codant de l'ARN messager. L'extrmit 3' porte l'acide amin pour lequel code le codon. ARN ribosomiaux =ARNr Ils reprsentent 80% de l'ARN total de la cellule. Leur masse molculaire est trs impor- tante. On les distingue sur la base de leur coefficient de sdimentation. Un ribosome est form de plusieurs chanes d'acide nuclique. L es a c i d es n u c l i q u es p a r t i c u l i er s Les bactries et les virus (procaryotes), d'une part, ainsi que les chloroplastes et les mito- chondries ont des acides nucliques comparables ceux des autres cellules d'un point de vue gnral, mais prsentant un certain nombre de particularits connatre. L'ADN n'est par organis en chromatine ni en chromosome ; il n'est pas enferm dans une enveloppe nuclaire. Le code gntique est lgrement diffrent. C'est chez ces organismes qu'on rencontre le plus de bases rares. Les ribosomes ont des coefficients de sdimentation diffrents. Les rtrovirus prsentent la particularit de possder uniquement une molcule d'ARN, mais pas d'ADN. Cet ARN doit d'abord tre transcrit en ADN par la cellule hte. L'enzyme implique est la transcriptase reverse. Mt h o d es d ' t u d e L'extraction se fait partir d'un matriel riche en acide nuclique : de prfrence des cel- lules jeunes, en division. Aprs broyage (fort, de faon faire clater les noyaux) et sou- Biochimie structurale Acides nucliques Ph. Collas UCO Bretagne Nord 46 vent dlipidation, l'extraction se fait dans une solution saline. L'extrait contient alors g- nralement un mlange de protines et d'acides nucliques. Les protines sont limines par centrifugation, puis les acides nucliques sont prcipits par l'thanol. On peut effectuer un dosage colorimtrique portant soit sur le phosphore, soit sur le pen- tose. La sparation des diffrentes classes d'acides se fait gnralement par lectrophorse sur gel, avec des techniques varie (biologie molculaire). On parvient caractriser des groupes d'ARN, par exemple, caractristiques de telle ou telle phase du dveloppement de l'organisme, c'est dire que les protines correspondantes ne sont synthtises qu' certaines priodes de la vie. La localisation cellulaire peut tre faite par diverses mthodes. Une coloration de type Feulgen colore spcifiquement l'ADN en rose. Aprs l'ajout d'une molcule marque (par exemple thymine tricie), certaines molcules d'ADN seront marques. La prparation cellulaire est fixe, puis on la place sous une pla- que photographique. Les grains d'argent de l'mulsion photographique sont impression- ns par l'mission radioactive, ce qui permet de localiser les compartiments cellulaires dans lesquels s'est fait l'incorporation. Ph. Collas UCO Bretagne Nord 47 Mthodes d'tude Prparation de l'chantillon : Fractionnement cellulaire C o n s t i t u t i o n g n r al e d es t i s s u s et d es c el l u l es De l'extrieur vers l'intrieur : Tissu = de cellules, entre lesquelles il n'y a pas de vide, mais des parois vgtales, des constituants interstitiels animaux, le tout baignant dans un liquide complexe on peut avoir besoin d'analyser les constituants en question. Cellule : membrane plasmique : lipides, protines cytoplasme / cytosol : gel de protines, de sels minraux, de toutes sortes de molcules organites : enveloppe de 2 membranes + matrice (stroma) propres. F r ac t i o n n emen t Lorsque le compartiment cellulaire n'est pas abordable directement, il faut commencer par le sparer des autres parties du tissu ou de la cellule (le sang est directement isolable, par exemple). Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 48 Broyage fin, mais trop long = pertes / polytron, Moulinex, mortier - pilon, sable de Fontainebleau, poudre fine de prfrence pH fix / tampon anti-oxydant (pb phnols) froid (enzymes en gnral) BSA : protases osmoticum : organites qualitatif / quantitatif : les impratifs ne sont pas les mmes Sparation Solubilisation selon le compos isoler : solvant organique lipides et composs apolaires solvant aqueux composs polaires : glucides, acides amins, peptides, ARN de pe- tite taille, insolubles nombreuses substances de composition particulire, ou encore de taille importante Mlanges ou successions de solvants : Un premier passage d'un solvant organique peut par exemple liminer les lipides (dlipi- dation), et laisser les autres composs. Une limination spcifique d'un compos est par- fois plus efficace qu'une tentative de purification directe du compos cherch. Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 49 Filtration La mthode la plus simple de sparer un lment soluble des lments insolubles (exem- ple type : la percolation du caf!) Aprs fractionnement, il reste : des dbris cellulaires, des cellules, des organites de taille variable, qui resteront sur le papier filtre. Centrifugation L'application d'une force centrifuge un chantillon (liquide ou pteux) quivaut l'appli- cation d'une force gravitationnelle contrle. On spare donc les composs en fonction de leur masse et de leur densit. Milieu de sparation : tous les composs de densit suprieure celle du milieu surnage- ront, tandis que tous les composs de densit infrieure sdimenteront. Le rsultat est le mme que celui de la filtration. Centrifugation sur gradient : il est possible de crer un gradient de densit le long du tube centrifuger. Les composs / organites se placent dans la zone correspondant leur densit. Exemple : fractionnement du foie de Rat Homognat 10 min. 600 g
culot 10 min. 600 g surnageant culot : noyaux et dbris cellulaires 10 min. 8 000 g culot : mitochondries Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 50 10 min. 15 000 g culot : lysosomes 60 min. 100 000 g culot : microsomes surnageant : molcules Purification S o l u b i l i t d i f f r en t i el l e Exemple : purification des chlorophylles partir de feuilles d'orties : Broyage, extraction dans l'actone 85% : solubilisation de tous les composs apolaires, plus une partie des composs polaires. Filtration sur papier Chlorure d'ammonium 10% : prcipitation des protines Ether : les chlorophylles passent prfrentiellement dans l'ther, la phase actone - eau devient limpide limination Lavages l'eau : certaines impurets peuvent rester dans la phase thre, les lavages permettent de les reprendre et de les liminer Mthanol : la chlorophylle b est plus soluble dans l'thanol que dans l'ther, inverse pour la chlorophylle a les deux chlorophylles sont spares et peuvent tre (thoriquement) tudies sparment. Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 51 T ec h n i q u es c h r o ma t o g r a p h i q u es Lorsque plusieurs composs prsentent les mmes caractristiques de solubilit, on peut les sparer par chromatographie : exemple de mlange de composs polaires : broyage, extraction l'eau, filtration : les lipides et les grosses protines restent sur le fil- tre, les glucides et les acides amins passent dans le filtrat. Chromatographie d'exclusion : les plus grosses molcules (polypeptides, polyosides) pas- sent rapidement et sont exclues, les petites (acides amins et glucides simples) sont re- cueillies ensuite. Chromatographie d'change ionique : une colonne changeuse d'anions retient tous les composs cationiques (chargs posi- tivement) : acides amins dibasiques notamment une colonne changeuse de cations retient tous les composs chargs ngativement : acides diacides notamment l'utilisation conscutive des deux colonnes permet de sparer le mlange en trois clas- ses : acide, basique et neutre, la dernire correspondant aux glucides et aux acides amins neutres. Caractrisation T ec h n i q u es c h r o ma t o g r a p h i q u es Les chromatographies d'adsorption (sur papier, sur couche mince de cellulose ou d'alumi- nium), en phase gazeuse, d'change d'ions ou d'exclusion permettent soit de faire une Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 52 sparation grossire, soit de faire une sparation fine, en fonction des conditions d'utilisa- tion. Exemple : chromatographie bidimensionnelle sur papier d'un mlange de composs polai- res dpt d'un chantillon dans un des coins de la feuille migration dans un premier solvant, volatil ; vaporation du solvant (une nuit 40C) migration dans un second solvant, aprs retournement de la feuille 90 schage, rvlation E l ec t r o p h o r s e L'lectrophorse permet de sparer et de caractriser diverses classes de molcules : glucides simples ou composs, acides amins, peptides et protines. Elle convient un peu moins aux lipides. T ec h n i q u es c o l o r i mt r i q u es Rvlation par coloration Aprs une chromatographie ou une lectrophorse, les composs n'tant gnralement pas colors, on cherche leur emplacement sur la feuille grce une coloration : rvlation la ninhydrine pour les acides amins, au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent pour les protines, l'anthrone pour les glucides, etc. Dosages par colorimtrie Lorsque la raction est quantitative, on peut appliquer la loi de Beer-Lambert : Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 53 I = I 0 e - c l log(I/I 0 ) = D. O. = c l avec = coefficient d'extinction molaire, dpendant - de la longueur d'onde ; - de la na- ture des liaisons du compos tudi c = concentration de la solution l = longueur du trajet optique, fixe 1 cm Puisque l, et sont fixs, on a la relation simple : D. O. = f([c]). On choisit une gamme de concentrations, laquelle on fait subir la raction, et on trace la courbe obtenue : Il ne faut pas oublier de faire un blanc : il corres- pond la valeur zro de la concentration, et il permet de savoir quelle est l'ab- sorption due spcifique- ment au ractif, et non au produit doser. L' blanc doit accompagner toute srie de dterminations, car les conditions peuvent varier (par exemple dure de passage et temprature du bain-marie). S p ec t r o mt r i e Une autre application de la loi de Beer-Lambert est l'obtention de spectres. Dans ce cas, la concentration est fixe, mais on fait varier la longueur d'onde. La disparition des rayon- DO [C] saturation bruit de fond
Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 54 nements d'une longueur d'onde correspond l'absorption de l'nergie des photons concerns par une liaison particulire. Un pic d'absorption caractrise donc la prsence d'une liaison dans la solution tudie. Si la prparation est pure, on est donc mme de caractriser parfaitement le compos, en fonction des pics obtenus. T ec h n i q u es i mmu n o l o g i q u es La facult de reconnaissance antigne - anticorps est de plus en plus utilise. La spcifici- t de la raction est gnralement totale, mais dans le mme temps, elle ne donne pas de rponse d'une grande ampleur. A la dtection est alors associe une amplification, sous forme d'une raction enzymatique dont le produit est color. Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 55 Index acide amin, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 36, 44, 45, 48, 51, 52 acide gras, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 acide linolique, 12 acide linolnique, 12 acide olique, 11 acide palmitique, 11 acide phosphatydique, 15 acide phosphorique, 6, 15, 16, 39, 40 acide starique, 11 adnine, 38 ADN, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46 aglycone, 1, 9 Ala, 24, 31 alcool, 4, 6, 14, 17 alcool primaire, 2, 6, 39 alcool secondaire, 2 polyol, 4 aldhyde glycrique, 2 aldose, 2, 3, 7 amidon, 1, 9 amphiion, 23 amylopectine, 9 amylose, 9 AOA, 24 arabinose, 3 ARN, 37, 38, 41, 43, 44, 45, 46, 48 ARNm, 44 ARNt, 38, 44 Asp, 24 bactries, 9, 38, 45 bateau, 6 carotne, 17 Cellobiose, 8 Cellulose, 9 ctose, 2, 3, 7 chaise, 6 chlorophylle, 50 chloroplastes, 45 choline, 16 Chromatographie, 18, 19, 51 cystine, 30 cytochromes, 36 cytokinines, 38 cytosine, 38 cytosol, 47 dextrogyres, 2 dihydroxyactone, 3 dissociation, 22, 23, 43 disulfure, 30 eau, 5, 6, 7, 13, 14, 23, 25, 26, 31, 35, 36, 42, 50, 51 nantiomres, 2, 3 encombrement strique, 6, 30, 32 nergisation, 6 pimres, 3 thanolamine, 16 vaporation, 52 fluorescence, 28 fonction amine, 17, 20, 22, 25, 27 fonction carboxyle, 10, 22 fructose, 3 furannose, 5, 6 furfural, 7 galactosamine, 4 galactose, 3 galacturonique, 4 Glu, 24 glucide, 1, 2, 3, 6, 7, 21, 25, 36, 48, 51, 52 glucosamine, 4, 9 glucose, 3, 5 glucose-6-phosphate, 6 glucuronique, 4 glutamate, 31 glycraldhyde, 2, 3 glycrides, 14 Glycrides, 14 glycrol, 14, 15, 16 glycine, 21 Glycogne, 9 graines, 44 graisses, 10, 14 guanine, 38 htrosides, 1 holosides, 1 huiles, 10, 14 isomres, 3 Kiliani, 3 Lactose, 8 lvogyres, 2 liaison osidique, 7, 8 liaison peptidique, 23, 24, 31 Liaison peptidique, 23 liaisons peptidiques, 26, 27, 29, 30, 33 lipases, 14 lipides, 10, 13, 15, 16, 18, 19, 47, 48, 51, 52 longueur d'onde, 53 lumire, 2 Maltose, 8 mannose, 3 membrane, 16, 26, 47 membrane plasmique, 16, 26, 47 membranes, 17, 47 mitochondries, 45, 49 oligopeptide, 24 Osamines, 4 ose, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 37 Index Ph. Collas UCO Bretagne Nord 56 oside, 1 osides, 7, 8 oxygne, 5, 30 parois, 9, 47 pectine, 9 pectines, 4 pH, 2, 22, 23, 24, 25, 33, 48 pHi, 23, 26, 33, 35 phospholipides, 14, 16 Phospholipides, 15 phosphoryle, 15, 16 photons, 54 pigment, 17 polypeptide, 24, 29, 30 pouvoir rotatoire, 2, 3, 5, 22 procaryotes, 45 protine, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 44 protines, 26, 33, 34, 35, 44, 46, 47, 50, 51, 52 proton, 22 protons, 22 Pyr, 24 pyrannose, 5, 6 raction de Maillard, 7 ribose, 3, 37 ribosomes, 44, 45 ribulose, 3 RubisCO, 33 saccharose, 1 Saccharose, 8 savon, 13 srine, 16 site actif, 32 stroma, 47 techniques chromatographiques, 18 temprature, 42, 43, 53 thylakodes, 17 thymine, 38, 46 traduction, 1 transcription, 44 Triglycrides, 14 uracile, 38 virus, 38, 45 xylose, 3 KG, 24