Chimie analytique instrumentale

Notions de spectrofluorimtrie
Etienne QUIVET 04 91 10 62 43
etienne.quivet@univ-provence.fr
Laboratoire Chimie Provence,
UMR 6264, Universit de Marseille

Spectrofluorimtrie
1. Principe
2. Spectres dexcitation
3. Spectres dmission
4. Quantification
5. Instrumentation

HO

COOH

Principe
Luminescence : mission dun rayonnement lectromagntique
Classement en fonction du mode dexcitation
Chimiluminescence raction chimique
Bioluminescence raction enzymatique
Thermoluminescence chaleur
Electroluminescence champ lectrique
Photoluminescence Photons

Phosphorescence

Fluorescence

Principe
Diagramme de Jablonski
Relaxation
vibrationnelle

S1

V0

V1

V2

V3

V4

S0

V0

V1

V2

Croisement
Inter-systme

Conversion
interne

ex

V3

Eex > Em ex < m

T1

V4

S0
Absorption
Fluorescence
Dsactivations
non radiatives

Phosphorescence

Les molcules qui se trouvent au repos dans le niveau vibrationnel V0 de ltat

lectronique fondamental S0 se trouvent porte un tat excit S1 sous leffet de
labsorption dun rayonnement lumineux (ex).

Principe

Diffrents types de dissipation de lnergie en excs peuvent

alors se produire. Ce sont des phnomnes de relaxation :
 Relaxation non rayonnante (non radiative)

conversion interne

relaxation vibrationnelle
 Relaxation rayonnante (radiative)
 Autres types de processus de fluorescence

Principe
Relaxation rayonnante : fluorescence
La fluorescence molculaire se produit par mission dun photon ( em)
dont lnergie correspond la transition entre ltat lectronique S1 et
lun des niveaux vibrationnels de ltat fondamental S0. Lexcs
dnergie vibrationnel par rapport S0 est nouveau perdu par un
processus de relaxation vibrationnelle.
Cest un phnomne rapide : il faut entre 10-9 et 10-7 seconde pour quune
molcule retourne ltat fondamental.
La fluorescence se traduit par des bandes de rayonnement car les
molcules excites peuvent revenir nimporte quel niveau vibrationnel
de ltat lectronique fondamental S0.

Principe
Relaxation rayonnante : fluorescence
Comme un peu dnergie se perd durant la relaxation vibrationnelle avant
que lmission ne se produise, lnergie mise est donc de plus grande
que celle de lnergie absorbe (dplacement de Stokes).
Des raies de rsonance sont aussi observables.

Principe
Relaxation rayonnante : phosphorescence
La phosphorescence traduit un type diffrent de retour au niveau
fondamental. Aprs la phase dabsorption (transfert dlectron S0 S1), si
la relaxation vibrationnelle est assez lente, on assiste au retournement de
spin de llectron pour conduire un tat triplet T1 un peu plus stable.
Le retour au niveau fondamental avec mission de photon est donc ralenti
et les dures de relaxation peuvent tre 108 fois plus grande que pour la
fluorescence (jusqu 10 secondes).

Principe
Relaxation non rayonnante :
 conversion interne
 relaxation vibrationnelle
Autres types de processus de fluorescence :
 fluorescence de Stokes
 diffusion de Rayleigh
 diffusion Raman
 fluorescence de rsonance

Principe

Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de Stokes

La fluorescence de Stokes sobserve normalement en solution avec
la rmission de photons ayant une longueur donde plus grande que
ceux observs.
Cependant, si de lnergie thermique est ajoute lorsque la molcule
est dans un tat excit, une mission plus courte longueur donde
peut se produire, cest ce quon appelle la fluorescence anti-Stokes.
Elle sobserve gnralement dans des gaz ports trs hautes
tempratures.

Principe
Autres types de processus de fluorescence : diffusion de Rayleigh
La diffusion Rayleigh est la rmission, la mme longueur donde,
dune petite fraction de la lumire excitatrice dans toutes les directions
par le solvant dans lequel se trouve le compos.
Son intensit dpend de la polarisabilit des molcules de ce solvant.
Diffusion Rayleigh
(raie excitatrice)
Diffusion
Raman

Fluorescence

Lumire diffracte
(2me ordre du rseau)

Principe
Autres types de processus de fluorescence : diffusion Raman
La diffusion Raman, de 100 1000 fois plus faible que la diffusion
Rayleigh, provient dune partie de lnergie de la lumire excitatrice
aux molcules de solvant sous forme dnergie de vibration. Les
molcules de solvant rmettent donc des photons de moindre
nergie que ceux ayant servi les exciter.
Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de rsonance

La fluorescence de rsonance, rmission de photons la mme

longueur donde, nest que rarement observe en solution du fait des
interactions avec le solvant, mais peut se produire dans les gaz.

Principe

Fluorophores :
 Molcules biologiques : Tryptophane (groupement aromatique), GFP
(Green Fluorescent Protein) protine verte extraite des mduses mutants
Avantage : insertion dans le gnome

 Molcules organiques attaches : Trs nombreuses plus ou moins

spcifiques (cystines SH, lysine-NH2). Liaison Biotine-avidine.

 Intercalants de lADN : BET, YOYO

 Indicateurs fluorescents : molcules organiques qui deviennent

fluorescentes en prsence dun cofacteur Ca2+, Na+, Cl-, O2, pH

 Nanocristaux : sondes inorganiques, spectre dmission troit, spectre

dabsorption large, photostables, visibles en microscopie lectronique.

Spectres dexcitation et dmission

Chaque molcule fluorescente prsente deux spectres caractristiques :
 un spectre dexcitation qui permet de dterminer lefficacit
relative des diffrentes longueurs donde
des rayonnements incidents sur la fluorescence

 un spectre dmission qui

montre lintensit
relative des rayonnements
mis
diffrentes longueurs donde

Spectres dexcitation
Le spectre dexcitation (obtenu avec un fluorimtre) nest pas toujours
identique au spectre dabsorption (obtenu avec un spectrophotomtre) de
la molcule artefacts instrumentaux

Exemple : complexe alizarine - aluminium

Spectre dexcitation

Spectre dabsorption

350 nm

270 nm

430 nm

350 nm

470 nm

480 nm

Paramtres diffrents
entre les appareils :
largeur de bande du
monochromateur, intensit
de la source lumineuse,
largeur de fente

Le spectre dabsorption bonne approximation de ext

En gnral, on choisit la valeur de la longueur donde la plus
grande dans le spectre dexcitation pour exciter la molcule

Spectres dmission
Chaque bande observe dans le spectre dexcitation aura une
bande dmission (ou de fluorescence) correspondante. Ces
deux bandes seront approximativement des images miroirs lune
de lautre. Cependant, plus le compos est complexe, plus la
bande de fluorescence est large et moins la symtrie des spectres
sera avre.
Exemple : Iso-thiocyanate de fluorescine

Spectres dmission
Exemple : mlange anthracne - quinine
N
O

CH2

Bandes
dexcitation
superposes

OH

H3C
N

La quinine peut tre mesure

350 nm et lanthracne
300 nm environ
Rciproquement, si deux composs mettent une
fluorescence la mme longueur donde, ils peuvent
toujours tre mesurs ensemble dans la solution sils ont des
pics dexcitation diffrencis.
Avantage majeur de la fluorimtrie par rapport la
spectrophotomtrie

Quantification
Suivant lendroit de la solution o la fluorescence est mise, une
intensit lumineuse variable atteint le dtecteur.

I0

If1 If2 If3 If4

Il y a simultanment absorption
partielle de lintensit de la radiation
lumineuse excitatrice (bleu) et
absorption partielle de la lumire de
fluorescence (rose) avant datteindre
la sortie. Ce phnomne appel filtre
interne rend difficile le calcul de
lintensit de fluorescence.

If
(vers dtecteur)

Lintensit de fluorescence If est la somme des fluorescences

individuelles (If1, If2) des molcules prsentes dans le volume dlimit
par les fentres dentre et de sortie.

Quantification

Pour les solutions, on dfinit le rendement quantique

(ou rendement de fluorescence)

= If / Ia
reprsente le rapport entre le nombre de photons mis (If)
sur le nombre de photons absorbs (Ia).
est indpendant de lintensit lumineuse.
Plus la valeur de est leve, plus le compos est fluorescent.

Quantification
Quantification rendement quantique ne sert pas directement
= If / Ia

If = .(I0 It) = .I0.(1 (It /I0))

Ia = I0 - It
I0 intensit de la lumire incidente
It intensit de la lumire transmise

If = .(I0 It) = .I0.(1 (It /I0))

log (I0 / It) = A It / I0 = 10-A

If = .I0.(1 10-A)

Quantification
Si la solution est dilue, labsorbance (A = .l.C) est faible.
If = .I0.(1 10-A)
If = .I0.A = .I0..l.C
A = .l.C
Pour les mesures faites dans les mmes conditions, ..l peut tre
dans un mme facteur K.

If = K.I0.C
Si l'absorbance est trop importante, il y a une perte de la linarit lie
la forme de l'quation ci-dessus en 10-A, et au "self-quenching",
phnomne dans lequel les molcules absorbent la radiation de
fluorescence mise par d'autres molcules.

Instrumentation

Diffrents lments dun spectrofluorimtre :

 une source lumineuse (gnration dune large bande de radiation)
 un porte chantillon (ou porte cuve)
 deux units de dispersion (monochromateurs)
 un dtecteur (mesure de lintensit de la radiation)
 divers composants optiques (lentilles, miroirs, filtres)

Instrumentation
Source lumineuse :
Les lampes au xnon et au mercure ainsi que des lasers pulss
sont couramment employes
Lintensit de fluorescence semble proportionnelle lintensit
lumineuse excitatrice incidente (If = K.I0.C). Cependant, une
source trop intense peut provoquer une photodcomposition de
lchantillon ( effet inverse de celui recherch !).

Deux units de dispersion (monochromateurs) :

A linverse dun spectrophotomtre, il y a deux
monochromateurs : un pour lexcitation, un pour lmission.

Instrumentation
Source lumineuse :

Lampe vapeur de mercure (Hg)

Lampe vapeur de xnon (Xe)

Instrumentation

Dtecteur :
La majorit des spectrofluorimtres place le photodtecteur
perpendiculairement au faisceau dexcitation. Cet arrangement
permet de diminuer les contributions de diffusion Rayleigh et
Raman dans le signal dtect.
On peut galement mesurer la fluorescence suivant dautres angles
(22,5 ou 37 notamment) et plus rcemment des appareillages
permettant de mesurer une fluorescence angle variable ont t
dvelopps.

Instrumentation