Quel avenir ~~LITlumlioration des plantes ? Ed. AUPELF-UREF. John Libbey Eurotext. Paris D 1994, pp, 251-261.

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Embryogense somatique chez la patate douce (Ipomoea batatas (L.) Lam.) : caractrisation et rgnration des plantes
D. SIHACHAKR > J.M. CAVALCANTE-ALVES > S. TIZROUTINE, M. ALLOT , 1. MUSSIO j> A. SERVAI?S j> D. NZOGN *, G. DUCREUX

La patkale douce (I~I~ YCL bututus (L.) Lam., Convolvulaces) est une plante dintrt conomique considrable dans les zones tropicales et mme dans certaines zones tenpres dEurope du Sud et des fitats-Unis dAm&ique 1221. La production mondiale de tubercules est estime 133,3 millions de tonnes pour lanne 1989, avec un rendement moyen de 14.4 t/ha 151. La Chine (114,O Mt), lIndonsie (2,l Mt), lOuganda (1,8,Mt), lInde (1,4 Mt), le Japon (1,3 Mt), le Rwanda (O,8 Mt), le Brsil (O,75 Mt) et les Etats-Unis dknrique sont parmi les plus grands producteurs (51. Le tubercule de patate douce est trs riche en calories et vitamines, ainsi quen protines dont la tenueur varie entre 2 o/oet 10 % selon les cultivars [Il, 251. La patate douce est originaire dAmrique du Sud (Colombie, quateur et Nord Prou) o existe encore une grande diversit dlpomoea bututus. Elle a t introduite en Europe par Christophe Colomb au XV sicle. La patate douce, ou @omoca bututus (L.) Lam., est une dicotyldone gamoptale, de lordre des polmoniales et de la famille des convolvulaces. Bien que des progrs aient t obtenus par les mthodes de slection classique pour lintroduction des caractres de rsistance aux maladies, aux nmatodes et aux insectes, ainsi que pour lamlioration de la teneur en protines et de la qualit du tubercule, le processus de slection est un travail de longue haleine, et ncessite la manipulation dun trs grand nombre dindividus et des techniques amliores de croisements. De 251

D. Sihuchakr et a1

plus, lincompatibilit sexue et la strilit de certains gnotypes et des hybrides rendent encore plus difficiles les mthodesde slection classique1221. Afin de mener le programme de slection de la patate douce avec efficacit, des nouvelles techniques, comprenant notamment la variation somaclonale, la fusion de protoplastes et la transformation, peuvent tre utilises en conjonction avec les mthodesclassiques de slection. Cependant, laccs ces nouvelles techniques ncessite la mise au point de protocoles reproductibles de rgnration de plantes partir de cultures de tissusde patate douce. Cette plante est considrecomme une espcercalcitrante en ce qui concerne la rgnration. Lobjet de cet article est de passeren revue divers systmesde rgnration chez la patate douce. Une attention particulire portera sur lembryogensesomatique qui constitue la voie la plus efficace concernant la rgnration chez cette plante. En effet, lembryogense somatique permet dobtenir un taux lev et ingalable de multiplication, et la capacit de rgnration peut tre effectivement maintenue pendant longtemps. En plus, le processusde lembryogense aboutit la production de structures bipolaires, cest--dire comprenant un axe apical et racinaire.

Rgnration

de plantes partir

de cultures dexplants

Une mthode de propagation acclre par bouturages successifsde nmudsde tiges a t mise au point afin de disposerdun grand nombre dindividus sainsqui constituent un matriel de dpart physiologiquement homogneet juvnile pour des exprimentations in vitro [ 191. Des investigations concernant la rgnration partir de culture dorganes ou de fragments dorganes de patate douce ont t entreprisespar plusieursauteurs 12, 9, 18. 191. Ainsi des fragments de tiges repiqus sur du milieu MS additionn de 1 mg/1 dacide indole actique (AIA) peuvent donner naissance des rgnrationsde bourgeons1191.Des tudescomparatives plus dtaillesde milieux de culture ont permis de montrer que les meilleures rponsesconcernant la prcocit (2 semaines de culture) et la frquence de rgnration (22 5%) ont t obtenuesavec la combinaisonde 0,Ol mg/1 dacide 2,4-dichlorophnoxyactique (2,4-D) avec 0,Ol mg/1 de kintine [2]. Les bourgeons peuvent apparatre ((1) le plus frquemment au niveau de cals cicatriciels, (b) directement sur les explants ii proximit des zones traumatises,et enfin (c) la basedesracines noformes[ 191. La comparaisonde capacit organognede diffrents organesmis en culture a montr que les explants de tiges sont les plus aptes rgnrer par rapport aux explants foliaires [2, 191.Par ailleurs, les meilleures rponsesorganognessont obtenues partir des explants prlevs sur des plantes in vitro. Il est intressantde noter que le repiquage de fragments de cals organognes sur du milieu neuf aboutit a la rgnration de nouveaux bourgeons.En revanche, le repiquage de cals primaires non oganognes de patate douce, mme sur un milieu trs favorable, conduit toujours B une callogense abondantesansaucunemanifestation morphogntique121.

252

Rgnration

de plantes partir de protoplastes

Des protoplastes peuvent tre isols B partir de fragments de tiges, de ptioles ou de cals de patate douce, alors que le msophylle se montre trs rcalcitrant la digestion enzymatique. Les premiers travaux sur lisolement de protoplastes partir de cals de tige de patate douce remontent lanne 1979 1241. Ensuite, Bidney et Shepard [ 11 ont obtenu des bals partir de culture de protoplastes issus de germes de tubercules, en utilisant un systme de culture comportant un rservoir de milieu. Dautres chercheurs ont abouti galement lobtention de cals qui ne manifestent aucune organogense [ 13, 171, ou qui produisent seulement des racines [ZOl. Cependant, des noformations sporadiques de bourgeons partir dc culture de proloplastes de patate douce ont t signales pour le cultivar Chugoku N 25 [ 161. Des rsultats intressants concernant la rgnration de bourgeons partir de culture de protoplastes ont t obtenus chez la patate douce, grce des efforts qui ont port sur la recherche de combinaisons de rgulateurs de croissance, de squences de milieux de culture et en particulier sur le choix du matriel vgtal utilis comme source de protoplastes 1211. En effet, la comparaison de matriel vgtal prlev en serre et in vitro montre la nette supriorit de ce dernier concernant la viabilit et le taux de division de protoplastes qui en sont issus, ainsi que la capacit ultrieure rgnrer des bourgeons. Ces performances sont sans doute dues ltat physiologiquement juvnile et homogne du matriel vgtal qui caractrise les plantes in vitro. De plus, la grande dilution de la culture, combine avec le passage sur des milieux successifs riches en cytokinine, de la zatine cn particulier, stimule la croissance des cals et favorise la rgnration de bourgeons 1211. Ainsi, des plantes ont t rgnres partir de cals de protoplastes chez 2 cultivars de patate douce, cv. Duclos 11 et Ira. Les plantes rgnres prsentent une grande variabilit affectant la morphologie gnrale de la plante, celle des feuilles, la ramification ainsi que le systme racinaire (Figure 1). Lanalyse du contenu en ADN de 15 protoclones dapparence morphologique normale, par cytomtrie en flux, a montr des valeurs similaires ou trs proches de celles du clone tmoin 1221. Malgr la stabilit du contenu en ADN des clones analyss, leur valuation en conditions de champs, ralise au Gabon en collaboration avec Dr Nzogh, a rvl une variabilit dans la croissance et notamment dans la tubrisation. En effet, certains clones sont trs productifs, pouvant donner jusqu 2 fois plus de tubercules que le clone tmoin, alors que dautres ne tuhrisent pas.

Embryogense
Induction

somatique

Lembryogense somatique chez la patate douce est initie partir de cals de culture danthres [23], de feuilles, dapex, de fragments de tiges ou de racines [ 141, et de bourgeons axillaires notamment 13, 4, 121. Le milieu dinduction est compos du milieu de base MS [151 additionn de 30 g/l de saccharose, 10 pM dacide 2,4-dichlorophnoxyactique (2,4-D) et solidifi par 7 g/l dagar. Aprs 6 8 semaines dincubation lobscurit et 27C, un certain nombre de bourgeons axillaires, prlevs sur des plantes in vitro et mis en culture, produisent des cals mucilagineux blanchtres partir desquels mergent des cals compacts 253

Figure 1. Rgnration de protoplastes de patate douce. A. Cellules issues de divisions de protoplastes ; B. Cals orgmognes issus de culture de protoplastes ; C. Rgnration de plantes ; D. Rgnration A partir de cals orgmognes ; E. Plantes rgnres montrant une grande variabilit, DXI (clone tmoin), RI 2 R4 (clones rghrs) : F. Une plante rgnre plante en serre.

254

embryognes (Figure 2 A). Dautres bourgeons mis en culture donnent naissance soit des cals de plus petite taille (mais qui brunissent et meurent au bout de quelques semaines), soit des cals friables non embryognes et croissance rapide. Ce dernier type de cals est dun aspect translucide, dune couleur variant du blanc au brun. et ne devient jamais embryogne. Les cals compacts embryognes sont dune couleur jaune clair et comportent quelquefois des zones plus ou moins anthocyanes chez certains cultivars (Figure 2 B) 131. Lvaluation du potentiel embryogne chez 10 cultivars de patate douce montre un effet gnotype trs hautement significatif (Tableau 1 A). Parmi les gnotypes tests, les cultivars 90, Zho et 865 donnent les meilleures rponses embryognes avec respectivement 10 %, 15 % et 17 8 de cals embryognes (Tableau 1 A). Il est intressant de noter que le cultivar Duclos II na donn aucune rponse embryogne quelle que soit la concentration en 2,4-D utilise (2,s 15 pM), alors que ce gnotype a produit quelques rgnrations de bourgeons partir de culture de protoplastes 1211. 1. Rponses de Iembryogense somatique de 10 cultivars de patate douce. A) Pourcentage de cals embryognes obtenus aprs 6-8 semaines dincubation de bourgeons axillaires dans du milieu MS contenant 10 MM de 2,4-D ; effectif : 120-160 bourgeons axillaires/gnotype : leffet gnotype est trs hautement significatif pour P = 0,001 ; B) Pourcentage de rversion de cals embryognes en cals friables et non-embryognes aprs repiquage sur du milieu MS contenant 10 pM de 2.4-D ; effectif : 200 cals/gnotype ; leffet gnotype est trs hautement significatif pour P = 0,001,
Tableau

Gnutype
A) Rponse embryogbne (%) B) Rversion de cals (9%)

Dl1
0,o

Qu
1,3

Yul
1,s

Zho

90

132

209

530

865

953

15,O

10,o

5,o

x,0

3,6

17,o

7,0

1,o

1.0

3,0

12,o

2,s

7.0

1,5

10,5

0,5

Les cals embryognes sont multiplis par repiquages successifssur du milieu MS contenant 10 PM de 2,4-D et maintenus lobscurit. Cependant,aprs plusieurs repiquages,certains secteursdu cal deviennent friables et non embryognes (Figure 2 C). Ils ont tendance envahir compltement la culture car leur croissanceest 5 8 fois plus rapide que celle des cals embryognes.De plus, la rversion des cals emhryognes vers un tat friable non embryogne est irrversible, et saccompagnedune perte dfinitive de la capacit rgnrer des bourgeons 131.La comparaisondes frquences de reversion montre un effet gnotype trs hautement significatif avec une probabilit de P = 0,001 (Tableau 1 B). En effet, les cultivars Quangshu, Yulciboi et 953 sont parmi les gnotypes qui ont le taux (0,.5 % 1 %) le plus faible de rversion, alors que le cultivar 90 prsentele taux le plus lev (12 %) (Tableau 1 B). Les cals embryognes et non embryognes sont maintenus lobscurit sur du milieu MS contenant 10 pM de 2,4-D pour lanalyse ultrieure des isoenzymes.

255

Rgnration

de plantes

Il est intressant de noter que linduction et la diffrenciation dembryons somatiques chez la patate douce, ainsi que leur maturation ncessite la prsence dun niveau lev dauxinc, du 2,4-D en particulier. En effet, la diffrenciation dembryons somatiques de patate douce est obtenue par repiquage de cals embryognes dans du milieu MS additionn de 10 pM de 2,4-D et de I pM de benzylaminopurine (BAP). La culture est dabord maintenue lobscurit pendant une semaine puis expose la lumire. Les embryons globulaires apparaissent aprs 4 semaines de culture (Figure 2 D). Des exigences nutritionnelles similaires, comprenant notamment des concentrations leves en auxines, sont requises pour linduction et la formation dembryons somatiques chez laubergine. Seule la phase de dveloppement dembryons matures en plantules ne ncessite pas la prsence dauxines [7]. Chez dautres espces, telles que la carotte [ 101 ou le mas 181, la formation dembryons somatiques comprend une courte phase dinduction sur un milieu riche en auxines, suivie dun transfert sur un milieu qui en est dpourvu, ou en contient, mais faibles concentrations. Dans cette tude, moins de 5 % dembryons globulaires de patate douce sont capables de se dvelopper cn plantules la suite de leur transfert dans un milieu dpourvu dhormones. Cette observation semble indiquer que la plupart des embryons globulaires nont pas suffisamment volu vers des stades plus dvelopps, y compris en particulier les stades cotyldonnaires qui sont plus aptes h germer sur le milieu sans rgulateur de croissance. Ainsi, le repiquage des embryons globulaires sur du tnilieu MS additionn dune combinaison de 0,Ol PM de 2,4-D avec 0,Ol pM de kintinc pendant 3 semaines, suivi dun transfert dans un milieu sans hormones amliore effcacement leur dveloppement en embryons cotyldonnaires (Figure 2 E). Mais la rponse dpend du gnotype test. En effet, pour le cultivar 953, la frquence de dveloppcment dembryons globulaires en embryons cotyldonnaires est de 95 % ; elle nest que de 24 % pour le cultivar 90. Les embryons somatiques au stade cotyldonnaire verdissent ?t la lumire. Ils sont plus aptes a former des plantules a raison de 3-5 plantules par cal comportant des embryons mis en culture (Figure 2 F). Les cals embryognes ainsi obtenus chez plusieurs cultivars de patate douce, et leur capacit rgnrer des plantes sont constamment maintenus depuis plus de 3 ans de culture. Caractrisation par lanalyse des isoenzymes

Les isoenzymes sont facilement dtectables et la variation de leurs activits est souvent associe des diffrences gntiques et des modifications morphogntiques, alors que lvaluation du potentiel embryogne par observations morphologiques est toujours subjective. Cest pourquoi, dans cette tude, nous avons utilis 4 systmes disoenLymes pour caractriser les diffrents vnements morphogntiques survenus au cours de Iembryogense somatique chez la patate douce. Ce sont les estrases (Est, E.C.3.1.1.2), les peroxydases (Prx, E.C. 1.11.1.7), les phosphatases acides (Acp, E.C.3.1.3.2) et les glutamates oxaloactates transaminases (Got, E.C.2.6.1.1). Quatre types de matriel vgtal (la feuille, les cals embryognes et non embryognes, et les embryons somatiques au stade globulaire) issus de 3 gnotypes (les cultivars 90, 953 et Quangshu) ont t caractriss laide des isoenzymes. Chacun des 4 systmes disoenzymes analyss permet de distinguer les 3 gnotypes tudis. De plus, ils montrent des diffirences dans leurs activits entre les diffrents types dorganisation, et en particulier entre les cals embryognes et non embryognes.
256

Figure 2. Embryogense somatique cher 121 palate douce. A. Cal mucilagineux Si partir duquel mergent des cals compacts emhryognes ; K. Cal compact emhryogne ; C. Cal tiiiahle nonembryogne ; D. Embryons somatiques plobulaircs ; E. Embryons somatiques cotyldonnaires ; F. Germination des embryons somatiques.

251

D. Sihachakr et al

Le profil de bandesdes estrases est complexe. II comprend un trs grand nombre de bandes, sans doute li ltat allohexaplode de la patate douce (Figure 3 A). La feuille est caractriseessentiellementpar des bandessituesdansla zone de migration lente, cest--dire les plus proches de la cathode. Les cals friables non embryognes, croissancerapide se distinguent des cals embryognespar labsencedactivit des estrases.Cependant, des activits sont observesau niveau de la zone de migration rapide chez les cals non embryognesdu cultivar 953. Elles sont toutefois diffrentes de celles des cals embryognesdu mme gnotype (Figure 3 A) par un nombre moins lev de bandes. Peu de diffrence existe entre les cals embryognes et les embryons globulaires, sauf pour le cultivar Quangshudont le profil des estrases des cals embryognes se distingue de celui des embryons globulaires par la prsencede plus de bandes au niveau de la zone de migration rapide. Pour les peroxydases, les cals friables non embryognes se distinguent des cals embryognesessentiellement par la prsencedactivits au niveau de la zone de migration lente (Figure 3 B). Ii y a peu de diffrence entre les cals embryognes et les embryons globulaires. Ils sont essentiellement caractrisspar des bandesde migration rapide (Figure 3 B). Pour les glutamatesoxaloactatestransaminases (Got), la feuille est caractrisepar des bandessituesdans la zone de migration rapide. Les cals friables non embryognes du cuitivar Quangshu ne prsentent aucune activit. En revanche, les gnotypes 90 et 953 ont respectivement une faible et une intense activit au niveau de la zone de migration lente (Figure 3 C). Par ailleurs, les cals embryogneset les embryons globulaires ont le mmeprofil isozymique pour les 3 gnotypes tudis (Figure 3 C). En ce qui concerne tes phosphatases acides, les cals non embryognessont caractriss parlabsencedactivits notamment chez les cultivars 90 et Quangshu,ou par une trs faible activit chez le cultivar 953. 11y a peu de diffrence entre les cals embryogneset les embryons globulaires. Les feuilles ont des activits intensesdans la zone de migration lente. Dans cette tude, lanalyse des isozymes montre de grandes diffrences dans leurs activits entre les cals embryogneset non embryognes.En revanche, peu de changements ou aucune modification spcifique nont t observsentre les cals embryognes et les embryons globulaires. Cela semble indiquer que les isozymes tudies sont probablement impliquesdans lorganisation de cals plutt que dans le processus de diftrenciation desembryons somatiques. II est galementintressantde noter que les activits des isozymes sont plus faibles ou absentes chez les cals friables non-embryognes, compares celles des cals embryognes.Cette situation est non seulementdue la diffrence de quantit de protines qui est de 20 % 30 % plus faible dans les cals friables non-embryognes (Tableau II), mais elle peut tre aussi lie une activit faible ou nulle des isozymcs dans les cals non embryognes. Des rsultats similaires ont t constatschez les cals embryogneset non embryognesde mas 161,

258

lMzygen,sc

somatique

chez la patate

douce

90

953

QU A

Est

Prx

259

D. Sihrrchakr et al.

Tableau II. Teneuren protines (mg/ 100 mgde MF) dansla feuille (F), lescalsembryognes (CE), non embryognes (NE), et les embryonsglobulaires (EG) chez les cultivars 90, 953 et Quangshu. Gnotype ~
90 953

Quangshu EG NE F CE EG NI?

organes F CE EG NE TeMXr C lSiO,2 l,5~0,3 1,31to,?l,Ml,2 protines

CE

1.3+0,2 1,4+0,2 1,6iO,3 1,2i-0,l

1,3iO.2 l,ht0,3 1,5+0.4 l.OiO.2

Conclusion
Cette tude prsente divers systmesde rgnration chez la patate douce. Bien que la micropropagation soit trs bien matrise, la rgnration chez cette plante montre encore des difficults affectant la culture des cals secondairesou des protoplastes.La voie de Iembryogense somatiqueparat alors la plus reproductible et efficace pour la rgnration chez la patate douce, car elle permet dassurer en permanence un taux lev et in6galable de multiplication dindividus sains, juvniles et homognes. En plus, les tissusembryognes constituent sans doute un matriel comptent, possdant un potentiel organognelev pour la rgnration des protoplastes.Cette potentialit morphogntique devrait faciliter laccs B de nouvelles techniques, notamment la fusion cellulaire et la transformation, qui doivent tre dsormaisinclusesdans les programmesde slection de patate douce. : I.es auteurs remercient la Communaut Europenne et IAUPELF pour lintrt port ce travail et le soutien financier.
Kemerrirments

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260

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RI.

(IY75).

Plant

regeneration

from

tissue

cultww

of mai/.

Crop

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