Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Lebres PDF
Lebres PDF
THESE DOCTORALE
THEME
Devant le jury
Pr R. OUZROUT : Président
Pr D. GUETARNI : Directeur de Thèse
Pr N. DEKKAR : Examinateur
Pr A. SOUKEHAL : Examinateur
Pr M. BELKAID : Invité
Le 05 Mars 2006
1
Je remercie vivement…
Le Professeur Miloud BELKAID, Directeur Général
de l’Institut Pasteur d’Algérie, pour avoir guidé et
encouragé mes timides avancées vers la voie Doctorale et
pour avoir soutenu l’ensemble de ce travail par des moyens
matériels.
Le Professeur Rachid OUZROUT, Recteur du Centre
Universitaire d’El-Tarf pour avoir accepté de m’inscrire en
Thèse Doctorale et pour avoir accepté de présider le jury.
Le Professeur Djamal GUETARNI, enseignant à
l’institut de Biologie, Université de Blida, pour avoir
accepté de diriger ce travail, pour ses judicieux conseils, ses
chaleureux encouragements et plus particulièrement pour
sa patience durant ces trois années.
Le Professeur Nourreddine DEKKAR, Chef du
Service Epidémiologie au CHU BEO – Alger et Officier de
liaison de l’OMS en Algérie, pour avoir accepté de juger ce
travail.
Le Professeur Abdelkrim SOUKEHAL, Chef de Service
d’Epidémiologie au CHU – Béni Messous – Alger, pour
avoir accepté de juger ce travail.
Que chacun d’entre vous soit ici vivement remercié de
m’avoir fait l’honneur d’accepter de participer à ce jury et
le plaisir d’assister à ma soutenance, ainsi que pour
l’attention et l’intérêt particuliers que vous avez apporté à
ce travail.
2
Je remercie également…
Le Docteur Jocelyne ROCOURT, Responsable du
Laboratoire National de Référence des Listeria à l’Institut
Pasteur de Paris, Chef du Programme Food Safety OMS-
Genève puis Directrice de l’institut Pasteur de Yaoundé –
Cameroun, pour ses précieux conseils et ses multiples
orientations tout au long de ce travail.
3
Je dédie cette thèse…
Avec une attention particulière à la mémoire de mon
Père et à celle de mon Frère Smain, Que Dieu le tout
puissant les accueille en son vaste paradis.
A ma Mère, pour sa gentillesse, son affection, sa
douceur, sa tendresse, ses encouragements éternels et qui
sans elle rien n’aurait été possible.
A ma Femme, pour son attachement, ses chaleureux
encouragements, sa vive compassion à ma réussite et
surtout pour sa compréhension et sa patience.
A mes Adorables Enfants, Nassiba et Lamine, à qui je
souhaite pleins succès.
A mon Frère Farouk, qui a toujours représenté à nos
yeux, l’image d’un père attentif et respectueux, un exemple
à suivre.
A mon Frère Rachid, pour sa gentillesse et sa
disponibilité.
A mes Sœurs.
A mes Beaux Parents.
A mes Amis.
A tous les Miens.
Enfin, à tous ceux qui de près ou de loin, ont collaboré
à la réalisation de ce travail, en guise de reconnaissance.
4
TABLE DES MATIERES
RESUME 1
PARTIE I : GENERALITES. 2
Chapitre I : Introduction. 3
Chapitre II : Historique. 5
Chapitre III : Taxonomie 8
Chapitre IV : Clinique de la listériose. 9
IV.1.En médecine vétérinaire : 9
IV.1.1.L’avortement, 10
IV.1.2.L’encéphalite à Listeria. 11
IV.2.En médecine humaine : 14
IV.2.1.Formes foeto-maternelles et du nouveau-né. 14
IV.2.2.Formes de l'adulte. 15
IV.3.Immunité. 17
IV.4.Portage. 17
IV.5.Durée d'incubation. 17
Chapitre V : Epidémiologie de la listériose. 18
V.1.En médecine vétérinaire, 18
V.2.En médecine humaine. 19
Chapitre VI : Mode de transmission. 22
V.1.En médecine vétérinaire, 22
V.2.En médecine humaine. 23
Chapitre VII : Dose infectante. 24
Chapitre VIII : Ecologie des Listeria. 26
VIII.1.Le lait cru, 28
VIII.2.Le troupeau laitier, 28
VIII.3.L’ensilage, 29
VIII.4.La terre et le sol, 32
VIII.5.les autres alimentations animales. 32
Chapitre IX : Bactériologie. 33
IX.1.Structure et morphologie. 33
IX.2.Culture et croissance. 35
IX.3.Caractères biochimiques. 36
IX.4.Evolution des techniques de recherche des Listeria : 39
IX.4.1.Méthodes bactériologiques. 40
5
IX.4.2.Méthodes immunochimiques. 44
IX.4.3.Méthodes immunophysiques. 45
IX.4.4.Méthodes physiques. 46
IX.4.5.Méthodes de biologie moléculaire. 47
IX.5.Sérotypie. 49
IX.6. Conservation des souches 51
Chapitre X : Pouvoir pathogène des Listeria. 52
X.1.L’infection par Listeria monocytogenes : 52
X.1.1.Pouvoir pathogène expérimental : in vivo. 52
X.1.2.Physiopathologie de la listériose. 52
X.1.3.Description du cycle infectieux au niveau cellulaire
in vitro, 55
X.2.Les déterminants génétiques et moléculaires du pouvoir
pathogène de Listeria monocytogenes. 57
X.2.1.Entrée dans les cellules. 57
X.2.2.Le mouvement intracellulaire de Listeria monocytogenes
et le passage de cellule à cellule. 59
Chapitre XI : Traitement de la listériose. 60
XI.1.En médecine vétérinaire, 60
XI.2.En médecine humaine. 61
Chapitre XII : Sensibilité des Listeria aux antibiotiques. 62
Chapitre XIII : Prophylaxie et recommandations. 63
XIII.1.Prophylaxie dans les élevages, 63
XIII.2.Prophylaxie dans les industries, 64
XIII.4.Prophylaxie chez l'homme. 65
6
PARTIE III : RESULTATS. 93
Chapitre I : Résultats 94
Chapitre II : Analyse qualitative 97
Chapitre III : Analyse quantitative. 99
ANNEXES 151
7
Liste des Abréviations
8
RESUME
Les maladies d’origine alimentaire ont un impact direct non seulement sur la
santé du consommateur mais aussi sur le développement. Par conséquent, le
renforcement des capacités en matière de sécurité sanitaire des aliments est
indispensable dans la plupart des pays, notamment dans les pays en
développement.
9
10
Chapitre I Introduction
Chapitre I : Introduction.
11
Chapitre I Introduction
Chez l’animal, de nombreuses observations ont été faites et font état de cas
sporadiques, de foyers endémiques et/ou de portages asymptomatiques observés
sur diverses espèces animales (194).
Chez l’homme, la listériose invasive est une maladie qui atteint
préférentiellement la femme enceinte et l’enfant qu’elle porte, les
immunodéprimés et les personnes âgées. Elle se manifeste principalement sous
formes de cas sporadiques ou d’épidémies engendrant des méningites, des
méningo-encéphalites, des septicémies ou des avortements prématurés (164,
165, 166). Mais pour peu, qu’un de ces sujets soit en contact direct avec les
animaux d’élevage, qu’on n’est plus à l’abri d’une transmission directe ou
indirecte.
En industrie laitière, les Listeria peuvent contaminer directement ou
indirectement les produits et l’environnement par le biais des laits crus
contaminés, entraînant ainsi d'énormes pertes aussi bien sur le plan de la santé
publique que sur le plan économique.
De nos jours, le recours moderne passe nécessairement par l’analyse du risque
qui suppose l’existence d’une solide base scientifique, chargée d’une étude
profonde sur l’évaluation des risques et dont les résultats seront exploités par les
gestionnaires du risque dans le but d’asseoir de nouvelles dispositions
réglementaires adaptées. Les consommateurs seront quant à eux, sensibilisés par
un processus d’information appelé "communication sur les risques". Les coûts et
les avantages des réglementations en matière de sécurité sanitaire des aliments
sont souvent intangibles et difficiles à traduire en quantité monétaire. Il est
souvent difficile de confronter les risques, qui pourraient être exprimés en
termes subjectifs, aux avantages susceptibles d’être exprimés en termes
économiques (79). Autrement dit, comment pouvons-nous quantifier la qualité
de vie ou pire encore le coût d’une vie humaine ?
Enfin, quelque soit la politique adoptée en matière de sécurité sanitaire des
aliments, la difficulté est de la mettre en œuvre et de faire respecter les lois et
règlements y afférents. Il est donc nécessaire de combler le fossé entre la
politique et la pratique, ou mieux encore entre la théorie et la réalité avec
comme mot clé, la traçabilité, elle-même conçue sur des preuves tangibles.
12
Chapitre II Historique
Chapitre II : Historique.
13
Chapitre II Historique
Par ailleurs, ce n'est qu'en 1960 que les infections humaines à Listeria ont été
diagnostiquées, et qu'en 1981 qu'on a observé les premières flambées de
Listériose et démontré que la bactérie responsable de la maladie pouvait être
transmise par certains aliments, en plus des modes habituels de transmission. Le
CDC estime à 1850 cas d'infection causés annuellement aux USA, dont 425 cas
mortels soit 23 % (164, 178).
14
Chapitre II Historique
15
Chapitre III Taxonomie
Dés 1966, la recherche de plus en plus fréquente de Listeria dans des niches
écologiques variées a conduit à l’isolement de souches atypiques dont l’étude
taxonomique a montré qu’il s’agit bien de nouvelles espèces.
En 1988, et compte tenu des travaux de J. Rocourt (174), dans le but de réviser
la nomenclature des Listeria, on admet aujourd'hui, que le genre Listeria se
définit sur le plan de la taxonomie par :
- un G + C % DNA compris entre 36 et 46 %,
- un peptidoglycane branché en variation A1 Gamma associé à un type d’acide
teichoïque ( polyribitol – phosphate ),
- la présence d’acides lipoteichoïques,
- l’absence d’acide mycolique et MK7, comme principal isoprenoid quinone.
(37, 62).
Actuellement 6 espèces sont donc reconnues dans ce genre, en plus de Listeria
monocytogenes, il s’agit de :
Listeria grayi qui a été découverte en 1966 par Larsen et Seeliger à partir
d’une coproculture chez un chinchilla ; cette souche se caractérise par la
fermentation du mannitol (49, 172, 174).
16
Chapitre IV Clinique de la listériose
17
Chapitre IV Clinique de la listériose
Chez les bovins, la listériose n'est généralement pas très bien connue et un
diagnostic étiologique précis n'est pas dénué de difficultés. Elle se présente
habituellement et essentiellement sous deux formes cliniques:
- l'avortement,
- l'encéphalite ou méningo-encéphalite.
Cependant, on peut aussi observer des formes septicémiques chez le jeune veau
ou des mammites à Listeria chez la vache, mais celles ci sont
proportionnellement plus rares.
IV.1.1.L'avortement.
L'utérus paraît être l'organe de loin le plus sensible au point que c'est cette
localisation qu'on trouve chaque fois que l'infection s'installe chez un animal
gravide. La listériose affecte en premier lieu les enveloppes fœtales et se
transmet au veau par voie sanguine, secondairement les liquides amniotiques
suite à une élimination bacillaire par voie urinaire (55, 85).
La fécondation reste ultérieurement possible et il est rare que la mère avorte une
seconde fois.
Dans les quelques cas mortels, la vache sombre dans un état comateux, suite à
l'extension de la listériose au cerveau.
Dans 80 % des cas étudiés par Djikstra, les animaux étaient nourris aux
ensilages et l'avortement a lieu le plus souvent quatre semaines après l'ouverture
du silo, ce qui tend à faire croire que c'est là, la durée de l'incubation de
l'infection (50).
18
Chapitre IV Clinique de la listériose
IV.1.2.L'encéphalite à Listeria.
C’est la forme habituelle de listériose des bovins non gravides, et sans doute,
aujourd'hui la cause la plus fréquente d'encéphalite dans cette espèce. L'infection
cérébrale est généralement localisée aux régions de la base, aux pédoncules
cérébraux et au cervelet. Les lésions ne sont pas abondantes, il n'y a pas
d'atteinte des cellules nerveuses et les bacilles sont peu nombreux.
19
Chapitre IV Clinique de la listériose
20
Chapitre IV Clinique de la listériose
21
Chapitre IV Clinique de la listériose
22
Chapitre IV Clinique de la listériose
23
Chapitre IV Clinique de la listériose
Enfin, un résumé de 782 cas de listériose déclarés par vingt pays a montré que
43 % étaient des infections liées à la grossesse, et 57 % n’étaient pas liées à la
grossesse. Ces derniers ont été classées à leur tour en catégories: 29 % de
septicémies, 24 % d’infections du système nerveux central et 4 % de formes
atypiques (Rocourt, 1996).
Outre la gravité inhabituelle des signes cliniques, la listériose invasive est
caractérisée par un taux élevé de létalité estimé entre 20 à 30 % (Mead, 1999).
La listériose invasive peut laisser des séquelles (Mc Lauchlin, 1997), mais leur
incidence est rarement estimée ; jusqu’à 11 % des nouveaux-nés et 30 % de ceux
qui survivent à une infection du système nerveux central souffrent de
symptômes résiduels, parfois de séquelles psychiatriques (Rocourt, 1996).
La caractéristique épidémiologique courante de la listériose invasive est une
manifestation assez fréquente de cas sporadiques et la reconnaissance
occasionnelle de poussées épidémiques. La majorité des cas de listériose semble
être sporadique, mais une partie de ces cas sporadiques peuvent être des groupes
d’origine commune non reconnue.
Une étude assez récente a indiqué que 95 % de ces cas sporadiques sont
d’origine alimentaire (Mead, 1999).
Plusieurs poussées épidémiques d’origine alimentaire ont été décrites depuis
1981 et certaines ont touché un grand nombre de patients sur une longue
période : 122 patients en Suisse entre 1985-1987, environ 300 patients au
Royaume-Uni en 1987-1989 et 279 patients en France en 1992 (Rocourt et
Cossart 1997).
24
Chapitre IV Clinique de la listériose
IV.3. Immunité.
Après l’infection, Listeria monocytogenes déclenche une réponse immunitaire à
médiation cellulaire qui, sous l'effet de cytokines, provoque l'afflux de
macrophages vers les sites infectieux constituant des granulomes inflammatoires
où les bactéries sont détruites. Les lymphocytes T mémoire perpétuent un état de
résistance à l'infection. Autrement dit, les convalescents gardent une résistance
acquise de longue durée due à la présence de cellules T-mémoires (47, 105, 106,
107, 114, 166).
Chez la souris, il est démontré qu’après la phase de croissance initiale des
bactéries, apparaissent des lymphocytes T spécifiques. Ces derniers activent les
monocytes sanguins d’origine médullaire dans les foyers infectieux. L’afflux de
macrophages dans les tissus infectés, aboutit à la constitution de granulomes
inflammatoires où les bactéries sont détruites (166).
IV.4.Portage
L’homme tout comme l’animal reste fréquemment porteur sain pendant de longs
mois, même après traitement. Il s’agit d’un portage transitoire et sans
signification clinique, seulement tous les deux peuvent aisément véhiculer ce
germe (170).
Des animaux (bovins, ovins et poulets) ont également été trouvé porteurs sains
au niveau des sécrétions nasales et des matières fécales (185).
IV.5.Durée d’incubation.
La durée d’incubation de la maladie reste actuellement mal connue aussi bien
chez l’homme que l’animal ; néanmoins, elle est estimée entre 3 à 4 jours voire
3 à 4 semaines (77, 164, 168).
25
Chapitre V Epidémiologie de la listériose
26
Chapitre V Epidémiologie de la listériose
27
Chapitre V Epidémiologie de la listériose
Depuis quelques années, dans tous les pays développés, l'incidence des
listérioses humaines diminue. Cette baisse est due à un meilleur contrôle des
denrées alimentaires et à l'information des populations à risque.
En France, selon les chiffres du Centre National de Référence des Listeria :
801 cas de listériose ont été recensés en 1986,
301 cas ont été décrits en 1995,
alors que, pour les années 1996,1997 et 1998, le nombre de cas de listériose
est compris entre 220 et 230.
En 1998, seuls des cas sporadiques (20 % de formes périnatales et 80 % de
formes non périnatales) ont été notés. L'incidence de la listériose humaine
invasive a été de 3,8 cas par million d'habitants, variant, selon la région, de 1,4 à
8,4 cas par million d'habitants.
Selon Les Professeurs S. Robin et S. Roche du CHU de Lyon – France (2002),
la maladie humaine est observée à tous les âges avec cependant 3 pics :
avant 1 an : listériose néo-natale,
entre 20 et 40 ans : cas maternels d'infection materno-fœtale,
entre 60 et 80 ans : rôle du terrain.
Enfin, de nombreux problèmes subsistent en ce qui concerne la présence des
Listeria dans les aliments ; 70 à 90 % des souches isolées d'aliments
appartiennent au sérogroupe 1/2 a, alors que la majorité des souches isolées des
cas sporadiques appartiennent au sérogroupe 4b. L'analyse fine des souches
isolées d'une part, des entreprises de transformation et d'autre part des aliments,
suggère que certaines souches s'adaptent à l'environnement des entreprises, sont
capables d'y persister et sont fréquemment responsables de la contamination des
denrées. L'identification de l'aliment responsable d'infections est souvent
délicate car la période d'incubation, généralement comprise entre 3 et 4
semaines, peut parfois atteindre 70 jours. De plus, les aliments sont
fréquemment contaminés par différentes souches, les contaminations croisées
sont possibles chez les détaillants ou chez les consommateurs, un même lot de
produits peut être distribué sous des dénominations commerciales différentes
(79, 148).
Un aliment, même contaminé, n'est pas toujours dangereux. En effet, les
résultats des dénombrements dans les aliments montrent que les cas de listériose
humaine sont généralement dus à un aliment contaminé avec plus de 100
Listeria monocytogenes par gramme ou par millilitre. Ce fait suggère que seules
les denrées fortement contaminées présentent un risque réel. Toutefois, lors
d'une épidémie décrite en 1999 en Finlande, 12 des 13 échantillons de l'aliment
contaminé (beurre pasteurisé) contenaient moins de 100 Listeria monocytogenes
par gramme. Cette épidémie présentait également deux autres originalités : 1) la
souche appartenait au sérovar 3a qui n'avait encore jamais été impliqué dans des
28
Chapitre V Epidémiologie de la listériose
29
Chapitre VI Mode de transmission
Pour les animaux producteurs de lait; les litières, les trayons, les manchons
trayeurs et par conséquent le lait seront aisément contaminés (55, 77).
30
Chapitre VI Mode de transmission
Ce tableau illustre bien le fait qu’il s’agit de denrées alimentaires diverses d’une
part, et ne concerne que les pays industrialisés d’autre part. La question de
savoir si de telles épidémies sont passées inaperçues dans d’autres pays
(particulièrement dans les pays en développement), associée à un défaut de
diagnostic clair, reste toujours posée.
31
Chapitre VII Dose Infectante
32
Chapitre VII Dose Infectante
33
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
La filière laitière est particulièrement vigilante dans la production d’un lait cru
indemne de bactéries et plus particulièrement de Listeria monocytogenes.
34
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
LAIT CONTAMINE
Matériel de traite
Urines, Litières Air
Excréments à travers le trayon
Indirect Direct
Porteurs Sains
Excréteurs
Malades
Infections
Vaches
Stressées
Ensilage Contaminé
Amplificateur
Excrétions
Animaux
Rongeurs
Oiseaux
Sol
Eau
Végétaux
35
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
L’infection sévit chez les animaux de tous les âges, mais elle est plus grave pour
les nouveaux - nés et les jeunes animaux.
36
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
Le rôle de l’animal contaminé dans les infections humaines n’est pas à négliger :
des éleveurs et des vétérinaires ont contracté la listériose à l’occasion de
contacts directs avec des animaux, lorsque les mesures d’hygiène traditionnelles
n’avaient pas été respectées. Cette forme de la maladie se traduit le plus souvent
par une dermatose au niveau des bras et des avants bras (164, 170).
VIII.3.L’ensilage.
Les fourrages destinés aux vaches laitières sous forme d’ensilage, dans lesquels
la terre a été entraînée lors de la récolte, peuvent contaminer les silos en Listeria.
L’ensilage constitue donc, un milieu propice à la multiplication de la bactérie
pathogène, notamment dans les zones du silo où le pH est supérieur à 5. En
dessous de cette valeur, Listeria ne se multipliera plus aisément mais arrivera à
survivre pendant plus d’une année.
Une étude menée par Aerial (185) en 1990 – 1991, a mis en évidence une
importante contamination de l’ensilage de maïs par des bactéries du genre
2
Listeria. En effet, le nombre de Listeria présent dans les silos variait entre 10
6
UFC/g et 10 UFC/g.
37
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
Les sites sensibles dans les silos d’ensilage de maïs ont été identifiés et sont
indiqués sur le schéma n°2 ci - après.
B
C
D A
38
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
39
Chapitre VIII Ecologie des Listeria
40
Chapitre IX Bactériologie
Chapitre IX : Bactériologie.
IX.1.Structure et Morphologie.
Listeria monocytogenes est un petit bacille à Gram positif de 0,5 µm à 2 µm de
long sur 0,4 à 0,5 µm aux extrémités arrondies, asporulé et non capsulé.
Peu ou pas mobile à 37°C, Listeria monocytogenes est toujours mobile à 22-
25°C.
41
Chapitre IX Bactériologie
pendant 24 à 48 h
42
Chapitre IX Bactériologie
IX.2.Culture et croissance.
C'est un germe aéro- anaérobie facultatif qui pousse bien sur les milieux usuels.
L'adjonction de glucose au milieu à 0,5 % ou l'utilisation de milieux à base de
tryptose favorisent cette culture (34, 62, 114, 168).
Sur gélose nutritive, de petites colonies, moins de 1 mm de diamètre, lisses à
bords réguliers et transparents, apparaissent en 24 heures à 37°C.
Examinées en transillumination oblique selon la technique d'Henry, elles ont une
coloration bleu-vert très caractéristique (166, 168, 171).
Dans les vieilles cultures, les colonies s'élargissent et s'opacifient. Les colonies
"R" sont plus larges, plates et ternes.
En bouillon glucosé, un trouble intense et homogène apparaît en 18 heures.
Sur gélose au sang de cheval ou de mouton, on observe, après 24 h d'incubation
à 37°C, une zone étroite et diffuse d'hémolyse de type ß, comme le montre la
photo n° 3 ci-après.
Listeria monocytogenes est également hémolytique pour les globules rouges de
lapin et d'homme, ce caractère est intimement lié à la pathogénicité des souches
(77, 164, 168, 171).
43
Chapitre IX Bactériologie
Dans d'autres cas litigieux parfois, on aura recours au Camp-test, qui permet de
confirmer ou d'infirmer l'hémolyse.
Listeria monocytogenes cultive bien à un pH neutre ou légèrement alcalin
(optimum : 7,2 - 7,6) comme on vient de le voir dans la partie écologie.
La croissance à +4°C est une particularité exceptionnelle de Listeria
monocytogenes, elle était d'ailleurs utilisée autrefois, comme procédé
d'enrichissement.
La résistance de Listeria monocytogenes aux agents physiques et chimiques est
étonnante pour un germe non sporulé : les cultures restent viables plusieurs mois
à la température du laboratoire, et plusieurs années à +4°C (36, 77, 168).
Elles résistent à un chauffage de 55°C pendant 30 minutes, survivent à l'action
des milieux hostiles contenant 10% de Na Cl, 40% de bile, 0,5% de Téllurite de
potassium (36, 77, 168).
IX.3.Caractères biochimiques.
Les principaux caractères biochimiques communs au genre Listeria sont
consignés dans le tableau IV, ci-après :
Tableau IV : Principaux caractères biochimiques du genre Listeria
(61, 105, 106, 107.
44
Chapitre IX Bactériologie
L. monocytogenes
L.welshimeri
denitrificans
L. seeligeri
L. ivanovii
L. murrayi
L. innocua
L. grayi
Jonesia
Caractéristiques
Bâtonntes irréguliers - - - - - - - +
ß-hémolyse + - + - - - - -
Camp-test
- Staphylococcus aureus + - + - - - - -
- Rhodococcus equi - - - - + - - -
Production d'acide à partir de :
Glucose + + + + + + + +
Listeria-arabinose - - - - - +
Dextrine ± - - + + +
Galactose ± - ± + + +
Gluconate - - - - - + +
Glycogène - - - - - +
Lactose ± + + + + +
D-Lyxose - - - + +
Mannitol - - - - - + + -
Mélézitose ± ± ± - - -
Mélibiose - - ± - - -
&-Méthyl-D-glucoside + + + + + -
&-Méthyl-D-mannoside + + - + -
Listeria-Rhamnose + ± - ± - - ± -
Sorbitol ± - - - - -
Amidon soluble - - - + +
Saccharose - ± ± - - +
D-xylose - - + + + - - +
Maltose + + + + + + + +
D-tagatose ± ± ± ± - - -
D-turanose ± ± ± ± ± - +
Voges-Proskauer + + + + + + + -
Hydrolyse de :
Urée - - - - - - - -
Cellulose - - - - - +
Hippurate + + + - - -
Amidon ± ± - - - +
Esculine + + + + + + + +
Lécithinase ± ± + - - -
Phosphatase acide ( APIZym ) + + + + + - - -
Phosphoamidase ( APIZym ) + + + + + - -
Réduction de NO3 en NO2 - - - - + +
Pathogénicité pour la souris + - - - + - - +
G + C ( % mol ) 37-39 36-38 36 36 37-38 41-42 41-42 56-58
45
Chapitre IX Bactériologie
Les caractères différentiels entre Listeria et les bactéries proches, figurent dans
le tableau VI .
Tableau VI : Caractères différentiels entre Listeria et les bactéries proches (104,
168).
46
Chapitre IX Bactériologie
Les caractères des sept genres composant le groupe des bacilles à Gram positif,
proches de Listeria figurent dans le tableau VII.
Tableau VII : caractères des sept genres composant le groupe des bacilles à
Gram positif, proches de Listeria (105, 106, 107).
Morphologie Genre Catalas Type Mobilit Habitat
e respiratoir é
e
Bacilles droits Lactobacillus - AAF* - Produits fermentés
Non pathogènes
Bacilles fins, souvent en Erysipelothrix - AAF* - Rouget de Porc :
filaments pathogène
Bacilles fins , souvent en Brochothrix + AAF* - Produits carnés :
filaments non pathogènes
Bacilles courts, souvent Listeria + AAF* + Saprophytes :
en courtes chaînettes et 20-25°C pathogènes chez
filaments l'homme et
l'animal
Bacilles en chaînettes , Kurthia + AS** + Intestin des
coccoïdes dans les animaux de la
cellules âgées ferme
Bacilles courts en Caryophanon + AS** + Intestin de la
chaînettes vache
Non pathogènes
Bacilles courts , souvent Renibacterium + AS** - Pathogènes du
par paires poisson.
* AAF : Aéro - anaérobie facultatif.
** AS : Aérobie strict.
47
Chapitre IX Bactériologie
IX.4.1.Méthodes bactériologiques.
En médecine humaine
La culture et l’isolement de Listeria monocytogenes se fera soit à partir du LCR
(Liquide Céphalo-rachidien) y compris les LCR clairs trompeurs soit à partir du
sang au lit du malade et au moment du pic thermique dans les cas de méningite,
méningo-encéphalite ou septicémie, soit encore à partir des avortons ou du
liquide amniotique dans les cas des avortements. L’isolement est pratiqué sur
gélose au sang frais (lecture utile de l'hémolyse) ou gélose chocolat enrichie,
même si la bactérie cultive sur gélose ordinaire ou sur des milieux hostiles (bile
esculine, hypersalé). Une gélose type Columbia au sang additionnée d’acide
nalidixique est le milieu préconisé par Bio Mérieux. Listeria peut, curieusement,
cultiver sur le milieu BEA (Bile Esculine Agar). La sérologie étant très peu
significative n’est généralement jamais demandée (45, 121, 146, 147).
En bactériologie alimentaire.
En effet, dès 1966, la première méthode bactériologique proposée, reposait sur
le caractère psychrophile des Listeria et supposait donc, un enrichissement
sélectif de trois à quatre semaines à + 4°C. Cette étape a été jugée très longue,
car elle ne répondait pas aux exigences des délais de réponse, déjà posés.
Depuis, beaucoup de progrès ont été réalisés de façon à optimiser la sélectivité
de la culture et le temps nécessaire à la détection de Listeria monocytogenes est
passé de trois à quatre semaines à 4 voire 7 jours. De plus, la connaissance de la
résistance de Listeria à de nombreux inhibiteurs a permis d'évoluer vers des
techniques d'enrichissement plus rapides de l'ordre de 2 à 3 jours à 30 et/ou
37°C.
Par contre, il faudrait signaler que la recherche de Listeria est relativement
simple lorsque celles ci sont abondantes dans le prélèvement à analyser. Or,
dans la majorité des cas, le problème ne se pose pas de la même façon : les
Listeria sont en général en petit nombre et elles sont accompagnées d'une flore
associée abondante : c'est le cas des laits crus.
C'est ainsi qu'en Décembre 1993, l'AFNOR a proposé une méthode
expérimentale portant la référence NF V 08-055, qu'elle a ensuite fait
homologuée et référencée en Août 1997 (133).
En 1998, l'ISO a proposé également une méthode de référence portant la
référence ISO 11290-1, homologuée et validée (131). Cette dernière repose sur
les mêmes principes que la méthode AFNOR.
Plus tard, en juin 1998, les Laboratoires Sanofi Diagnostic Pasteur font part
d'une nouvelle méthode bactériologique appelée : RapidL'mono. Cette méthode
a également été homologuée et validée par l'AFNOR comme méthode
alternative et est inscrite aujourd'hui sous le numéro SDP-07/04-09/98 (63, 106,
107).
48
Chapitre IX Bactériologie
49
Chapitre IX Bactériologie
La méthode ISO 11290 partie 2, par étalement direct de 0,1 ml sur gélose
Palcam ou Oxford, après la période de pré enrichissement (132).
50
Chapitre IX Bactériologie
Méthode RapidL'mono
Lait 25 ml 2,25 ml
Supplément
Enrichissement primaire
225 ml
30°C , 24 h
37°C , 24 h 37°C , 24 à 48 h
37°C , 24 à 48 h
Listeria monocytogenes :
Colonies bleues sans halo
51
Chapitre IX Bactériologie
IX.4.2.Méthodes immunochimiques.
Ces méthodes de détection sont fondées sur la reconnaissance d'antigènes de
Listeria à l'aide d'anticorps spécifiques de l'espèce ou plus récemment du groupe
génomique Listeria monocytogenes (9, 51, 53, 106, 107).
Cependant, il faut signaler que ces techniques peuvent induire des faux négatifs
liés aux bactéries stressées.
52
Chapitre IX Bactériologie
IX.4.3.Méthodes immunophysiques.
Ces méthodes sont basées sur la formation d'un complexe antigène / anticorps
révélé à l'aide d'une technique physique (9, 53).
Méthodes Cytomètrie
De flux Immuno-latex Immunocapture
Enrichissement 24 h 42 h Aucun 18 h
Rapidité 26 h 43 h 27 h 42 à 66 h
53
Chapitre IX Bactériologie
IX.4.4.Méthodes Physiques.
Une méthode physique a été utilisée pour la détection des Listeria : il s'agit de
l'impédancemétrie (53).
Cette technique permet de mesurer les variations électriques d'un milieu de
culture causées par le métabolisme microbien. Deux électrodes plongées dans le
bouillon de culture vont mesurer l'accroissement de la conductance ou de la
capacitance lors de la croissance bactérienne.
L'impédancemétrie peut être utilisée pour le dénombrement de micro-
organismes puisque le temps de détection dépend de la contamination initiale en
micro-organismes.
L'impédancemétrie offre plusieurs avantages tels que :
la rapidité de la détection, 24 heures environ,
l'automatisation,
la standardisation,
l'économie de milieux de culture.
Cependant, le développement d'un tel système de détection pour les Listeria,
souvent présentes en faible quantité dans un milieu poly contaminé, se heurte à
certaines difficultés.
Le milieu de culture utilisé doit être très sélectif et doit avoir une formulation
permettant de fortes variations de conductivité lors du métabolisme des Listeria.
Les difficultés concernant la spécificité du milieu de culture expliquent que
l'impédancemétrie est peu utilisée en routine pour détecter les Listeria.
54
Chapitre IX Bactériologie
55
Chapitre IX Bactériologie
56
Chapitre IX Bactériologie
IX.5.Sérotypie
Dans le genre Listeria on distingue :
15 antigènes somatiques (I à XV),
05 antigènes flagellaires (A à E).
La combinaison de ces différents facteurs dans une même bactérie permet de
reconnaître actuellement 17 sérovars (62, 105, 106, 107, 164, 168).
En France, l'utilisation de la sérotypie est d'intérêt limité puisque plus de 95 %
des souches isolées des infections cliniques appartiennent au sérovar 1/2a, 1/2b
ou 4b. Il n'y a pas de rapport entre un sérovar particulier et son origine
géographique et animale (77, 99, 105, 106, 107, 164, 168).
Actuellement, il est bien connu que le sérovar 4b de Listeria monocytogenes est
le plus impliqué dans les cas de listériose animale et humaine (99, 105, 106,
107).
Listeria monocytogenes sérovar 5, nommée depuis 1984 Listeria ivanovii, n'est
jamais isolée des aliments et elle est peu retrouvée en pathologie humaine, par
contre elle est surtout rencontrée chez les ruminants et plus particulièrement
chez le mouton (Broadent, 1972).
Le diagnostic sérologique par agglutination, fixation du complément ou
immunoprécipitation est peu sensible et peu spécifique.
La détection des anticorps anti-listériolysine O est plus prometteuse. Un test de
type Dotblot, utilisant comme antigène de la listériolysine O purifiée, nécessite
un traitement préalable des sérums pour éviter les réactions faussement positives
dues à la présence d'anticorps anti-streptolysine O. Un test de Western-Blot,
faisant appel à un polypeptide produit par des techniques de biologie
moléculaire et correspondant aux 411 premiers acides aminés de la listériolysine
O est beaucoup plus spécifique mais des réactions faussement positives sont
observées lors d'encéphalites herpétiques. La sensibilité de ces tests est toutefois
médiocre et n'est globalement que de 50 à 60 % (77).
Selon l'Institut de Veille Sanitaire, l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Aliments et le Centre National de Référence des Listeria, la sérologie est soit
trop peu sensible soit trop peu spécifique pour apporter à l'heure actuelle une
aide au diagnostic.
57
Chapitre IX Bactériologie
58
Chapitre IX Bactériologie
Les souches de Listeria peuvent être conservées dans un tube de gélose nutritive
profonde maintenu à 15°C. Elles pourront survivre tant que la gélose ne sera pas
desséchée, mais un repiquage trimestriel est recommandé en vue d’une
meilleure conservation (62, 77, 105, 106, 107, 164).
59
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
60
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
Quelques années, plus tard, deux études réalisées chez la souris (179) montraient
que Listeria monocytogenes est surtout retrouvée dans les plaques de Peyer et
non dans les cellules intestinales absorbantes, comme cela a été observé par
Racz. La contradiction apparente de ces travaux reflète :
d'une part, des conditions expérimentales très différentes,
d'autre part, l'existence de plusieurs sites d'entrée dans l'organisme,
d'autre part, encore, la difficulté de produire une infection expérimentale par
cette voie.
En effet, après la traversée de la barrière intestinale, les bactéries sont
phagocytées par les macrophages résidents de la lamina pro pria et circulent,
libres ou dans des macrophages via la lymphe, vers les ganglions mésentériques.
Elles sont ensuite véhiculées dans les canaux lymphatiques efférents qui se
déversent dans la circulation sanguine. Les bactéries se retrouvent alors dans le
foie et la rate, principaux organes filtres du système sanguin. Elles sont alors très
rapidement ingérées et détruites par les cellules phagocytaires du système
réticulo-endothélial et en particulier par les macrophages résidents du foie, les
cellules de Küpffer (179). Les bactéries survivantes peuvent se multiplier dans
les macrophages et/ou envahir les hépatocytes adjacents qui représentent un site
privilégié de multiplication intracellulaire bactérienne.
Au début de l'infection, les hépatocytes infectés sont lysés par les neutrophiles.
Les bactéries se retrouvent alors à l'extérieur des cellules et deviennent
accessibles à l'ingestion par les macrophages listéricides.
Si la multiplication bactérienne dans ces foyers infectieux n'est pas rapidement
contrôlée par le système immunitaire de l'hôte, les bactéries sont à nouveau
disséminées dans le courant sanguin et se dirigent vers le système nerveux et
l'unité foeto-placentaire.
61
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
62
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
63
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
64
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
65
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
Dans les macrophages non listéricides, des récepteurs différents du CR3 sont
utilisés. Leur nature moléculaire n'est pas encore établie (179).
L'entrée de Listeria monocytogenes dans les cellules non phagocytaires telles
que les cellules épithéliales et fibroblastiques fait intervenir un processus
apparenté à la phagocytose. Cette propriété à induire sa propre phagocytose au
niveau des cellules hôtes est spécifique des espèces pathogènes du genre
Listeria.
A ce jour, deux facteurs bactériens ont été impliqués dans l'invasion des cellules
non phagocytaires :
la protéine p60,
l'internaline.
La protéine p 60.
Elle a d'abord été décrite comme étant une protéine majeure de 60 KDa, sécrétée
par Listeria monocytogenes et nécessaire pour l'invasion in vitro des cellules
fibroblastiques de la lignée 3T6.
En réalité, le rôle de cette protéine dans l'invasion reste difficile à interpréter. Il
faut d'ailleurs noter que la plupart des espèces du genre Listeria, pathogènes ou
non, produisent des protéines immunologiquement apparentées à la p60 et
possèdent, au sein de leur chromosome, des séquences homologues au gène iap
(invasion associated protein ).(48, 67, 179).
L'internaline.
Cette protéine a d'abord été identifiée en étudiant des mutants non invasifs pour
les cellules épithéliales d'origine intestinale.
La nature du récepteur cellulaire reconnu par l'internaline n'est pas encore
établie (48, 67, 179).
66
Chapitre X Pouvoir pathogène des Listeria
67
Chapitre XI Traitement de la listériose
En ce qui concerne les animaux jeunes atteints d'une forme clinique aiguë,
l'injection intraveineuse de Chlortétracycline à raison de 12 mg par kg de poids
vif et par jour pendant 5 jours est assez efficace contre la méningo -encéphalite
bovine, mais moins chez le mouton (55).
Le taux de guérison dépend étroitement de la précocité du traitement. Si des
signes graves sont déjà visibles, la mort s'ensuit malgré la mise en place d'un
traitement.
Habituellement dans une enzootie, le premier sujet meurt, les cas subséquents
sont alors dépistés assez tôt pour que le traitement empêche la mortalité.
68
Chapitre XI Traitement de la listériose
69
Chapitre XII Sensibilité des Listeria aux antibiotiques
70
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations
71
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations
L’hygiène de l'abattage est également cruciale car les carcasses des animaux
de boucherie sont essentiellement contaminées en surface et, à l'abattoir, le
poste de dépouillage est un point critique de contamination. Ultérieurement,
les phases de découpe et de conditionnement accroissent les risques. Il est
donc nécessaire de veiller au strict respect des normes d'hygiène pour chacun
de ces postes à risque (145).
72
Chapitre XIII Prophylaxie et recommandations
73
Notre synthèse bibliographique, à partir des plus récents travaux, montre
que Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquiste et pathogène. Elle est
dépourvue de capsule, ne sporule pas mais résistante à de nombreux agents
physiques, chimiques, biologiques ainsi que dans le milieu extérieur. Elle est
responsable de la Listériose qui est considérée comme une maladie des pays
industrialisés, essentiellement animale et accidentellement humaine. La dose
minimale infectieuse n’est pas connue avec certitude jusqu’à ce jour car
tributaire des groupes à risque. La durée d’incubation reste improbable et est
estimée entre 3 à 4 jours, voire 3 à 4 semaines et parfois même un peu plus. Le
mode de transmission se fait essentiellement par le biais des ensilages chez
l’animal et surtout par les laits crus et les fromages à base de laits crus, chez
l’homme.
1. Recherche :
o qualitative des Listeria à partir du lait cru.
o quantitative de Listeria monocytogenes à partir du lait cru.
2. Analyse du risque Listeria monocytogenes, dans le lait cru.
74
75
Chapitre I Prélèvements
Chapitre I. Prélèvements.
Notre travail s’est effectué dans la région centre (Alger, Blida, Ain Defla,
Tipaza et Boumerdes) durant la période allant de Février 1998 à Août 2005.
La première période s’étend du mois de Février de l’année 1998 au mois de
décembre de l’année 2003. La seconde période s’étend du mois de Janvier 2004
au mois d’août de l’année 2005.
Entre 1998 et 2002, le travail s’est effectué au "Laboratoire de Bactériologie
Alimentaire" à l’institut Pasteur d’Algérie puis entre 2003 et 2005, la suite du
travail s’est effectuée au "Laboratoire National des Listeria" toujours à l’IPA.
Les prélèvements de laits crus de vache ont été effectués selon les règles des
bonnes pratiques d’échantillonnage et de transport au niveau des points de vente,
exceptés ceux de l’année 2000 et 783 laits sur 974 de l’année 2001.
La répartition des échantillons de laits crus par année, ainsi que leur nombre
total et leur pourcentage, figurent dans le tableau suivant.
Tableau XII : Distribution des échantillons de lait par année.
Première période Seconde
période
Années 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Nombre 79 102 649* 974** 533 121 286 251
Pourcentage 2,64 3,40 21,67 32,52 17,80 4,04 9,55 8,38
Total 2995
* : tous ces laits sont destinés au circuit de transformation. ** : Sur les 974
prélèvements, 783 laits sont destinés au circuit de transformation et 191 sont
destinés au circuit de vente directe.
Au total, nous avons réalisé 2995 échantillons de laits crus de vaches répartis
comme suit :
Première période :
79 échantillons de lait cru en 1998, soit 2,64 %,
102 échantillons de lait cru en 1999, soit 3,40 %,
649 échantillons de lait cru en 2000, soit 21,67 %,
974 échantillons de lait cru en 2001, soit 32,52 %,
533 échantillons de lait cru en 2002, soit 17,80 %,
121 échantillons de lait cru en 2003, soit 4,04 %,
Seconde période :
286 échantillons de lait cru en 2004, soit 9,55 %,
251 échantillons de lait cru en 2005, soit 8,38 %.
76
Chapitre I Prélèvements
1200
1050
974
900
Nbre de prélèvements
750
649
600
533
450
77
Chapitre II Méthodes d’analyse
78
Chapitre II Méthodes d’analyse
79
Chapitre II Méthodes d’analyse
Jour 1
25 ml dans
225 ml de
Fraser ½
Enrichissement primaire
30°C, 18 à 24 h
Jour : 2
0,1 ml
Isolement
P(1)
ou Fraser
O(1)
Enrichissement
Secondaire
37°C, 24 h
Jour : 3
P(2)
ou
O(2)
3 à 5 Colonies 37°C , 24 h
Jour : 4
Purification Purification
TSAYE TSAYE
80
Chapitre II Méthodes d’analyse
81
Chapitre II Méthodes d’analyse
Coloration de Gram.
Cette dernière donne des petits bacilles à Gram positifs, en forme de « V » ou de
« L », comme le montre la figure suivante.
Réaction Catalase.
Placer séparément deux gouttes d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 20
volumes sur une lame de microscope. Prélever une colonie avec une tige de
verre (pipette Pasteur) ou en plastique (surtout pas de fil métallique) et
l’émulsionner doucement dans une des deux gouttes.
Observer immédiatement et après 5 minutes s’il y a apparition (catalase
positive) ou absence (catalase négative) de bulles d’oxygène. Dans le cas où il y
a doute, recouvrir chacune des gouttes avec lamelle de microscope et comparer
l’apparition des bulles sous les deux lamelles. Les observations peuvent se faire
macroscopiquement ou à l’aide d’un microscope à faible grossissement.
Les Listeria sont catalase positive.
82
Chapitre II Méthodes d’analyse
Oxydase.
Cette réaction est aussi simple qu’instantanée. Il suffit de prendre une colonie
caractéristique puis la déposer sur un disque d’oxydase préalablement imbibé à
l’aide d’une goutte d’eau distillée stérile. Le virage spontané au violet indique
une réaction positive. En fait, les derniers stades de la respiration cellulaire font
intervenir une chaîne de métalloprotéines : les cytochromes dont le dernier
maillon, le cytochrome oxydase, réagit directement et instantanément avec
l’oxygène.
83
Chapitre II Méthodes d’analyse
Hémolyse.
L’hémolyse est normalement visible sur gélose au sang de mouton après
isolement à partir d'une colonie ayant poussé sur gélose TSAYE, qu'on incube à
37°C, pendant une nuit. Cette réaction nous permettra de voir si la souche testée
est hémolytique ou non. L'hémolyse se traduit par la formation d'une zone
étroite et claire autour des colonies, on parle alors d'hémolyse de type ß, comme
le montre la photo suivante.
Dans le cas où l’hémolyse n’est pas bien visible sur gélose au sang, ou encore
dans les cas litigieux, on peut avoir recours au Camp Test (Christie-Atkins-
Munch-Peterson-Test). Ce dernier a été proposé pour une meilleure distinction
entre souche hémolytique et non hémolytique, il s’effectue à l’aide de deux
souches de référence de la façon suivante.
- un Camp-test avec une souche de Staphylococcus aureus, réf : ATCC 25923,
- un Camp-test avec une souche de Rhodococcus equi, réf : ATCC 6939.
Le Camp-test est réalisé sur gélose TSA additionnée de 5 % de globules rouges
de mouton lavés et remis en suspension dans un volume de tampon PBS égal au
volume initial de sang (62, 77, 164, 168).
On réalise d'abord, une première strie à l'aide de souche de Staphylococcus
aureus sur la gélose TSA, puis une seconde strie parallèle à la première à l'aide
de la souche de Rhodococcus equi , puis une troisième strie à l'aide d'une souche
de Listeria monocytogenes réf : ATCC 19118 (témoin) perpendiculairement aux
deux premières, puis une quatrième à l’aide de la souche à tester, en veillant à ce
que les stries ne se touchent pas entre elles et restent donc distantes d’au moins 2
millimètres, comme l'indique le schéma n°9 ci-après.
84
Chapitre II Méthodes d’analyse
Listeria monocytogenes
Staphylococcus Rhodococcus
aureus equi
Souche à tester
Schéma n° 9: Camp-test avant incubation.
Après une période d'incubation de 36 à 48 heures à 37°C, on observe
l'accentuation de l'hémolyse autour de la zone adjacente perpendiculairement à
la strie de Staphylococcus aureus, sous forme d'une pelle ou d'une brèche,
comme l'indique le schéma n°10 ci-après.
L'identification de Listeria ivanovii peut également être confirmée par la mise en
évidence de l'hémolyse accentuée autour de la zone adjacente
perpendiculairement à la strie de Rhodococcus equi.
Staphylococcus Rhodococcu
aureus equi
85
Chapitre II Méthodes d’analyse
Réactions VP et RM.
La mise en évidence des voies fermentaires est de grande utilité pour le
diagnostic des micro-organismes. Beaucoup de bactéries et particulièrement les
Listeria empruntent la voie dite des acides mixtes, abaissant ainsi le pH vers 4,5
à 5 et certaines bactéries VP(+) empruntent surtout la voie dite du butylène
glycol. Au cours de la fermentation butylène glucolique, avant de parvenir au
stade butylène–glycol, l’acide pyruvique est transformé en acéthyl-méthyl-
carbinol ou acetoïne. La formation d’acétoïne est favorisée par la présence
d’acétate. L’acétoïne est donc mise en évidence par une coloration rose obtenue
en milieu alcalin par action de la créatine sur le diacétyl formé par oxydation :
c’est la réaction de Voges Proskauer.
Deux réactifs sont ajoutés au milieu : d’abord la créatine ou (VP I), puis l’alpha-
naphtol ou (VP II).
Une culture sur milieu Clark et Lubs servira à la détermination des réactions de
Voges Proskauer (VP) et Rouge de Méthyl (RM). Ensemencer un tube contenant
le milieu Clark et Lubs à l'aide d'une colonie ayant poussé sur gélose TSAYE,
puis l'incuber à 37°C pendant une nuit. Le lendemain, verser la moitié du tube
dans un autre tube stérile :
l'un servira à la recherche de la réaction VP, après adjonction des réactifs VP
I, puis VP II, attendre environ 3 minutes puis noter la couleur ; si elle vire au
rouge orangé, il s'agit d'une réaction positive,
l'autre servira à la recherche de la réaction RM, après adjonction du réactif
RM ; s'il y a virage de la couleur au rouge, il s'agit d'une réaction positive.
86
Chapitre II Méthodes d’analyse
Photo n°11. Aspect d’une réaction Photo n°12. Aspect d’une réaction
VP positive RM positive
87
Chapitre II Méthodes d’analyse
Esculine.
La réaction à l’esculine est normalement visible sous forme d’une auréole noire
autour des colonies sur gélose Palcam. Dans le cas contraire, ensemencer par
piqûre centrale, un tube effilé de gélose esculine puis l’incuber à 37°C pendant
une nuit. L’hydrolyse de l’esculine se traduit par une coloration noirâtre tout au
long du tube.
88
Chapitre II Méthodes d’analyse
89
Chapitre II Méthodes d’analyse
90
Chapitre II Méthodes d’analyse
Lecture de la galerie.
Tout d'abord, ajouter 1 goutte de réactif ZYM B au test DYM, laisser agir
pendant 3 minutes, puis lire ; ce test sert de base essentielle pour la
différenciation entre Listeria monocytogenes pour laquelle il est négatif et
Listeria innocua pour laquelle il est au contraire positif.
Noter ensuite toutes les réactions positives par le signe (+) et les réactions
négatives par le signe (-) sur la fiche de résultats en se référant au tableau n°XII,
relatif à la liste des profil numériques.
Coder par la suite les réactions obtenues en un profil numérique, les tests sont
séparés par groupes de trois et une valeur de 1, 2 ou 4 est indiquée pour chacun
comme l'indique la photo 13 en page 80.
En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des
réactions positives, un profil de 4 chiffres est obtenu, exemple : 6510.
L'identification est obtenue en recherchant le profil numérique dans la liste des
profils qui figure ci après.
Tableau XII : Lecture et Interprétation des caractères portés sur la galerie API
Listeria.
Tests Réactions Résultats
Négatifs Positifs
DIM Différenciation Orange pâle
Listeria innocua / Listeria Rose beige Orange
monocytogenes Gris bleu
ESC Esculine ( hydrolyse ) Jaune pâle Noir
& MAN & MANnosidase Incolore Jaune
DARL D-Arabitol ( Acidification )
XYL D-XYlose ( Acidification )
RHA RHAmnose ( Acidification ) Rouge , Jaune ,
MDG &Méthyl-D-Glucoside (Acidification) Rouge - Jaune -
RIB RIBose (Acidification) Orangé Orangé
G1P Glucose - 1 - Phosphate (Acidification)
TAG D-TAGatose
91
Chapitre II Méthodes d’analyse
92
Chapitre II Méthodes d’analyse
93
Chapitre II Méthodes d’analyse
94
Chapitre II Méthodes d’analyse
95
Chapitre II Méthodes d’analyse
96
Chapitre II Méthodes d’analyse
Recherche de l’hémolyse.
Prélever une colonie isolée à partir de la gélose TSYEA et l’isoler sur une
plaque de gélose au sang à l’aide d’un fil droit.
Inoculer en parallèle, une culture témoin positive (Listeria monocytogenes) et
négative (Listeria innocua).
Utilisation des glucides.
A partir du bouillon TSYEB, inoculer des bouillons contenant les sucres à
étudier. Ces bouillons seront alors incubés à 35 ou à 37°C jusqu’à 5 jours.
Remarque. L’identification de Listeria monocytogenes peut se faire également à
l’aide de la galerie miniaturisée de type API – Listeria (Cf page 80).
III. 2. g. Expression des résultats.
Pour qu’un résultat soit valable, on estime en général qu’il est nécessaire de
calculer la valeur de a pour chacune des boites retenues selon la formule
suivante : en prenant en considération les boites contenant au minimum 15
colonies.
b
a= xC
A
où :
b: est le nombre de colonies répondant aux critères d’identification.
A: le nombre total de colonies repiquées en vue de l’identification.
C: le nombre total de colonies dénombrées sur la boite.
Arrondir à un nombre de colonies calculés à deux chiffres significatifs.
Exemple :
Le dénombrement des Listeria dans un produit liquide a donné les résultats
suivants :
à la première dilution retenue (10-1) : 44 et 60 colonies.
à la seconde dilution retenue (10-2) : 16 et 8 colonies.
Ont été repiquées :
pour 44 colonies, 5 colonies dont 3 ont répondu aux critères d’où : a = 27
pour 60 colonies, 5 colonies dont 2 ont répondu aux critères d’où : a = 24
pour 16 colonies, 5 colonies dont 4 ont répondu aux critères d’où : a = 13
pour 08 colonies, 5 colonies dont 2 ont répondu aux critères d’où : a = 3
97
Chapitre II Méthodes d’analyse
Σa
N=
V (n1 + 0,1 n2) d
où :
Σ a : est la somme des Listeria monocytogenes identifiées sur chaque boite
retenue et qui compte au moins 15 colonies.
V : est le volume de l’inoculum appliqué à chaque boite, en millilitre.
n1 : est le nombre des boites retenues à la première dilution.
n2: est le nombre des boites retenues à la seconde dilution.
d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.
Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs.
Pour cela, si le dernier chiffre est inférieur à 5, le chiffre précédent n’est pas
modifié ; si ce dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est
augmenté d’une unité. Procéder de proche ne proche jusqu’à ce que l’on ait deux
chiffres significatifs.
Retenir comme résultat le nombre de microorganismes par millilitre (produits
liquides) ou par gramme (autres produits), exprimé par un nombre compris entre
1,0 et 9,9 multiplié par la puissance appropriée de 10.
Exemple :
27 + 24 + 13 + 3 67
N= = = 3045,454
-1
0,1 (2 + 0,1 x 2) x 10 0,022
98
Chapitre II Méthodes d’analyse
25 ml dans
225 ml de
Fraser ½ ss
Additifs
-1
SM = 10
1 heure ± 5 minutes à 20°C
0,1 ml
-2 -3 -4
10 10 10
Transférer
0,1ml 0,1ml 0,1ml
Etalement
Attendre 5 minutes à température ambiante
Incuber à 35 ou à 37°C, pendant 24 à 48 heures,
en atmosphère aérobie ou en atmosphère micro aérobie
99
Chapitre II Méthodes d’analyse
p a th o g è n e
h ô te a lim e n t
L is te r ia m o n o c y to g e n e s
C o n s o m m a te u r L a it c r u
100
101
Chapitre I Résultats
Chapitre I. Résultats.
Les résultats de l’analyse bactériologique de l’ensemble des prélèvements de
laits crus analysés par les deux méthodes, sont rapportés dans le tableau XIII et
représentés dans le Logigramme n°3 ci après.
102
Chapitre I Résultats
103
Chapitre I Résultats
104
Chapitre II Analyse qualitative
105
Chapitre II Analyse qualitative
106
Chapitre III Analyse quantitative
Les résultats du dénombrement, exprimé par les valeurs «N», obtenues selon les
équations mathématiques dictées par la norme pour l’ensemble des cas positifs
et de l’identification biochimique sont rapportés au cas par cas et par année,
dans les tableaux suivants.
107
Tableau XII ; Résultats du dénombrement et de l’identification biochimique pour l’année 2004.
108
Chapitre III Analyse quantitative
109
Tableau XIII ; Résultats du dénombrement et de l’identification biochimique pour l’année 2005.
110
Chapitre III Analyse quantitative
N = 100 UFC 05 07 00 00 00 01
19 16 01
Total 3,54 2,98 0,18
(n = 537) 36
6,70
Au total, sur les 537 échantillons analysés, nous avons 36 souches de Listeria,
soit 6,70 % réparties comme suit :
19 Listeria monocytogenes, soit 3,54 %,
16 Listeria innocua, soit 2,98 %,
1 Listeria ivanovii, soit 0,18 %.
111
Chapitre III Analyse quantitative
112
Logigramme n°3 des résultats globaux
113
114
Chapitre I Discussion
Chapitre I. Discussion :
La présence des Listeria a été mise en évidence dans 96 laits sur 2995 analysés,
soit un taux de 3,20%. L’identification biochimique a montré la prédominance
de Listeria monocytogenes au taux de 1,90 %, suivie de Listeria innocua au taux
de 1,23 %, puis de Listeria ivanovii au taux de 0,07 %.
Le pourcentage de Listeria, obtenu par la méthode quantitative de 6,70 %, est
nettement supérieur à celui obtenu par la méthode qualitative qui n’est que de
2,44 %. Le pourcentage de Listeria monocytogenes, obtenu par la méthode
quantitative de 3,54 %, est nettement supérieur à celui obtenu par la méthode
qualitative qui n’est que de 1,55 %.
Ces deux pourcentages ont une valeur capitale, puisqu’ils ont un rapport direct
avec la méthode utilisée. Les travaux de C.Lahellec et B.Lombard (AFSSA,
2000) ont montré que lors de l'identification biochimique pour la méthode
qualitative, il est quelque fois impossible de faire la distinction entre les
différentes espèces de Listeria. Cela est d'autant plus marqué, que la compétition
existante entre la croissance de Listeria monocytogenes et Listeria innocua est
souvent à l'avantage de Listeria innocua. Cependant à nos jours, il n'existe pas
de meilleure alternative. Des améliorations pourraient être réalisées dans le
futur, en utilisant des géloses chromogènes permettant de faire d'emblée, la
distinction entre Listeria monocytogenes et les autres espèces (67, 111, 112,
164).
La méthode quantitative nous semble beaucoup plus performante pour les
raisons suivantes :
1. Tout d’abord, l’effet inoculum, plus riche dans la seconde méthode (0,1ml en
étalement), que dans la première (une ose en isolement), augmente forcément
la probabilité de retrouver d’avantage les Listeria éventuellement présentes,
2. Elle permet un seuil de détection égal à 10 UFC par ml,
3. sa performance relative à la sélection des Listeria et particulièrement les
Listeria stressés, à partir des prélèvements poly microbiens,
4. le développement et la généralisation des méthodes de dénombrement de
façon générale, au détriment des méthodes de recherche. En effet, les
organismes internationaux de normalisation proposent et préconisent de plus
en plus, l’utilisation de nouvelles méthodes basées sur le dénombrement pour
l’ensemble des pathogènes, particulièrement le genre Staphylococcus, le
genre Campylobacter et Campylobacters thermo tolérants et récemment
encore pour le genre Salmonella par la méthode du NPP (Juillet 2004),
115
Chapitre I Discussion
Nos résultats confirment bien la présence des Listeria en Algérie, mais aussi leur
rareté. Le taux de 1,90 %, de Listeria monocytogenes, obtenu lors de cette étude
est :
d’une part, similaire à ceux rapportés :
en France par J.P Larpent (1995), soit 1,90 %,
en Espagne par J.M Soriano (2000), soit 2,90%,
en République thèque par I.Holko et coll soit 2,56 %
en Algérie par Lebres et Guetarni (2002), soit 1,96 %.
d’autre part, inférieur à ceux rapportés :
en Turquie par Gülhan Vardar Ünlü et coll (2000), soit 4 %
aux USA par J. S. Van Kessel (2004), soit 6,5 %
116
Chapitre I Discussion
117
Chapitre I Discussion
pathogène. De ce fait, il est de plus en plus urgent pour nous, de s'intéresser aux
questions relatives à l'hygiène environnementale immédiate des animaux de
rente et aux éventuels accidents qu’ils peuvent engendrer.
Dans le circuit de vente directe, les laits contaminés par Listeria
monocytogenes constituent pour le consommateur et particulièrement pour les
immunodéprimés et les femmes enceintes, un danger potentiel voire un risque
réel de Listériose.
On entend par risque en général “la probabilité qu’il existe un écart entre les
données réelles concernant les variables à l’entrée et les résultats à la sortie,
d’une part, et les estimations initiales, d’autre part” (Remenyi, 1999).
Intrinsèquement, le risque peut donc être positif ou négatif. Prendre un risque ou
ne prendre aucun risque pose la question de l’équilibre à trouver entre risques et
opportunités, autrement dit entre les risques tels qu’ils sont perçus et les
avantages escomptés.
Il convient donc, d’établir une distinction entre risque et danger, ces deux
notions étant liées mais distinctes :
Un microorganisme représente un danger lorsqu’il est susceptible de nuire à
la santé, à l’économie, et à l’environnement. Heureusement, de nombreux
dangers peuvent être maîtrisés ou évités de sorte qu’un danger potentiel ne
constitue pas un risque réel. En termes de fréquence et d’ampleur, les vrais
dangers restent en grande partie inchangés si on considère l’activité humaine
dans le temps.
Le risque est la probabilité d’un effet préjudiciable dû à l’exposition à un
danger qui est déterminé par deux facteurs, la probabilité de l’exposition et la
gravité des conséquences.
La définition du risque implique la prise en compte d’au moins un des trois
éléments suivants : (137, 141, 161, 168).
la durée sur laquelle les risques sont examinés,
la probabilité qu’un ou plusieurs événements surviennent,
la mesure des conséquences de ces événements.
Ceci nous conduit irrémédiablement vers, une approche moderne qualifiée par le
comité mixte FAO/OMS et par le Codex Alimentarius comme "Analyse du
risque ".
118
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Le modèle d’interaction qui existe entre ces processus est décrit par l’OMS
comme suit.
Communication
sur les risques
119
Chapitre II Analyse du risque Listeria
L’évaluation des risques vise à aider les gestionnaires des risques à expliquer
comment certains des facteurs régissant la Listériose d’origine alimentaire
interagissent, favorisant ainsi l’élaboration de stratégies pour prévenir la
maladie.
120
Chapitre II Analyse du risque Listeria
(1).Identification (2).Caractérisation
des dangers des dangers
(3). Evaluation de
(4).Caractérisation
l’exposition
du risque
La listériose d’origine alimentaire est une maladie relativement rare mais grave
sur le plan clinique, avec des taux de létalité élevés (20-30%). Elle affecte des
segments spécifiques de la population avec une susceptibilité accrue parmi
lesquelles on distingue le plus souvent les personnes atteintes de pathologies
sous-jacentes (traitement immunosuppresseur, SIDA et conditions chroniques
telles que la cirrhose qui inhibent le système immunitaire), les femmes
enceintes, les fœtus, les nouveau-nés et les personnes âgées. La listériose affecte
le système sanguin, le système nerveux central ou l'utérus fécondé. Les
manifestations de la maladie comprennent, entre autres, les pathologies
suivantes: bactériémie/septicémie, méningite, méningo-encéphalite, encéphalite,
avortement, mortinatalité, accouchement précoce, maladies néonatales. La
période d'incubation avant l'apparition des symptômes peut s'étendre de
quelques jours à trois mois (137, 168). Le terme Listériose est employé ici, au
sens de Listériose invasive étant donné que l’impact de la Listériose non
invasive sur la santé publique est faible ou incertain (157, 158, 159).
121
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Les aliments le plus souvent associés à la listériose humaine sont les laits
crus, les laits caillés, les fromages à base de laits crus, les glaces et crèmes
glacées et certains produits de la mer (saumon). Certains d’entre eux favorisent
la croissance de Listeria monocytogenes. Ils ont une durée plus ou moins
prolongée de conservation au réfrigérateur et sont consommés sans aucun
traitement listéricide (par exemple, la cuisson). Une grande diversité d’aliments
peut être contaminée par Listeria monocytogenes, mais les flambées et les cas
sporadiques de listériose semblent être associés surtout avec les produits prêts à
consommer. Ces derniers constituent une catégorie vaste et hétérogène
d’aliments qui peut être divisée de différentes manières. Selon la définition du
Codex (CAC/GL 22-1997), il s’agit de toute denrée alimentaire qui est
normalement consommée à l’état cru, ou toute denrée alimentaire manipulée,
transformée, mélangée, cuite ou soumise à toute autre préparation à la suite de
laquelle elle est normalement consommée sans subir de transformation. Par
ailleurs, les aliments prêts à consommer diffèrent selon les pays, les habitudes
alimentaires locales, la disponibilité et l’intégrité de la chaîne du froid et les
règlements concernant par exemple la température maximale au niveau du point
de vente.
122
Chapitre II Analyse du risque Listeria
P = 1 - e-RN
où,
P est la probabilité de maladie grave,
N est le nombre de Listeria monocytogenes consommées,
R est le paramètre qui définit la relation dose-réponse pour la population
considérée.
124
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Dans notre étude, les informations ciblées ont fait l’objet d’une enquête par
questionnaire (Cf. annexe 3) auprès de la population de la région centre,
couvrant ainsi les wilayas d’Alger, de Blida, de Tipaza, de Boumerdes, d’Ain
Defla et de Tizi Ouzou, durant la période de Janvier 2004 à Juin 2005 (période
correspondante à l’échantillonnage pour l’analyse quantitative).
Au total, sur les mil (1000) exemplaires distribués de ce questionnaire, nous
avons collecté 926 résultats exploitables, soit 92,6 %.
125
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Le traitement combiné des réponses aux questions est d’une importance capitale
puisqu’il permet d’aborder de façon plus rationnelle, l’évaluation de l’exposition
au risque Listeria comme suit.
1. Identification des conditions permettant ou empêchant la croissance de
Listeria monocytogenes entre le point de vente et la consommation, du
produit, autrement dit, le potentiel de croissance ou d’inactivation de
Listeria monocytogenes.
Le potentiel de croissance est un paramètre très significatif en matière
d’évaluation de l’exposition au risque car, d’une part, il permet de faire
d’emblée la différenciation entre les aliments qui permettent la croissance de
Listeria monocytogenes (ex : lait cru) et ceux qui ne le permettent pas (ex :
crème glacée) et d’autre part, il est étroitement lié au mode de consommation (a),
à la durée de stockage(b) et surtout à l’intégrité ou non de la chaîne de froid (c).
(a). Le mode de consommation se définit sur deux types de produits : le lait
ayant subi un traitement thermique (bouilli) et le lait cru englobant le lait caillé
(lait cru maintenu tel quel à température ambiante pendant 1 à 2 jours).
600
400
200
0
1 2 3
Nombre 178 204 544
Pourcentage 19% 22% 59%
126
Chapitre II Analyse du risque Listeria
1000
500
0
1 2
1000
500
0
1 2
127
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Il en ressort que, près de 100 % des consommateurs conservent le lait sous froid,
ce qui se traduit par une parfaite intégrité de la chaîne de froid, favorisant
inévitablement le potentiel de croissance de Listeria monocytogenes. Ce qui,
rappelons-le, a été un des principaux facteurs déclenchants de la Listériose en
Europe en fin d’année 1999, début d’année 2000.
Dans le sens de cette modélisation, mode de consommation, durée de stockage
et intégrité de la chaîne de froid constituent de véritables facteurs de risques
supplémentaires et non négligeables, favorisant inévitablement le potentiel de
croissance de Listeria monocytogenes et exposant ainsi les consommateurs à des
doses minimales infectieuses susceptibles d’être à l’origine de la maladie.
Dans notre enquête, nous avons considéré deux groupes de population, à savoir :
La population susceptible, représentée par les femmes enceintes, les
personnes en état de convalescence, les enfants ainsi que les personnes âgées de
plus de 60 ans, frange de population globale présentant une augmentation
significative du risque de développer des affections graves avec un taux de
létalité élevé par rapport à la population non susceptible.
La population non susceptible, représentée par les adultes sains dans
laquelle, on n’observe qu’occasionnellement des infections graves à Listeria
monocytogenes.
128
Chapitre II Analyse du risque Listeria
160
140
120
100 Femmes enceintes
80
60 Convalescents
40 Enfants
20 60 ans et plus
0
Nombre Nombre
1 Portion / J 2 Portions / J
800
600
400
200
0
1 2
Nombre 218 708
Pourcentage 23,5% 76,5%
1 P/ J 2 P/ J
129
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Notre enquête n’a pas révélé de relation directe entre la consommation du lait et
le sexe des consommateurs puisque le pourcentage des consommatrices (51 %)
est sensiblement égal à celui des consommateurs (49 %).
600
400
200
0
1 2
Nombre 452 474
Pourcentage 49% 51%
Masculin Féminin
Notre enquête a montré que l’achat du lait est apparemment partagé entre les
acheteurs réguliers (34 %), les acheteurs non réguliers (27 %) et les acheteurs
occasionnels (39 %).
400
300
200
100
0
1 2 3
Nombre 320 248 358
Pourcentage 34% 27% 39%
Rég N.Rég Occas
130
Chapitre II Analyse du risque Listeria
Notre enquête a montré que la consommation du lait est partagée entre les
consommateurs réguliers (49 %) et les consommateurs non réguliers (51 %).
600
400
200
0
1 2
Nombre 450 476
Pourcentage 49% 51%
Cs.Réf Cs.N.Rég
131
Chapitre II Analyse du risque Listeria
En conclusion, tous les cas de Listériose décrits sont dans leur grande majorité
associés à la consommation d’aliments (laits et autres) qui ne répondent pas aux
normes en vigueur, à savoir zéro Listeria monocytogenes dans 1 millilitre. Par
conséquent, relever la norme de tolérance zéro jusqu’à une valeur plus élevée
(par exemple, 100 UFC/25ml ou 1 UFC/ml) devrait se traduire par une
incidence accrue de la Listériose à partir d’aliments permettant la croissance de
Listeria monocytogenes.
132
Chapitre II Analyse du risque Listeria
(3). Exécution de la
(4). Suivi et
décision de gestion
Contrôle
Dans notre cas, la description du problème et de son contexte, ont été largement
discutés, particulièrement dans le chapitre relatif à "l’évaluation des risques".
133
Chapitre II Analyse du risque Listeria
La démarche de suivi et de contrôle doit être mise en place et évaluée une fois
que la gestion est décidée et est en état d’exécution.
134
Chapitre II Analyse du risque Listeria
135
Conclusion
136
Conclusion
137
Recommandations
138
Recommandations
ALIMENTS A EVITER
139
Recommandations
140
Recommandations
141
Partie VII Références Bibliographiques
142
Partie VII Références Bibliographiques
A
1. Amgar (a) La méthode HACCP et la sécurité alimentaire : un outil-clé de la
prévention dans les entreprises alimentaires. Face au risque. n°388,
Décembre 2002,
2. Amgar (a) BenEmbarek (p), Buchanan (r), Cahill (s), Cerf (o), Doyle (m),
Farber (j), Goulet (v), Lammerding, (a), Martin (p), Meyer-Broseta (s),
Nørrung (b), Pierre (o), Rocourt (j), Swaminathan (b), Tenailleau (s).
Analyse des risques et Listeria monocytogenes. Cinquième Conférence
Internationale ASEPT. Laval, France. 17-18 mars 2004. Evaluation des
risques, Epidémiologie de la Listériose humaine et relations dose-réponse,
Listeria dans les aliments consommés en l'état et appréciation de l'exposition,
Revue générale sur la gestion des risques, Options de gestion du risque et
stratégies de réduction, Mise en place d'options de gestion du risque,
Communication à propos du risque.
3. Andre (p), Devleeschouwer (d) et Dony (j). Contamination des aliments par
Listeria monocytogenes : évaluation de la situation et étude d'améliorations
techniques dans la fabrication. File://A:\Risques pour la santé liés à
l'alimentation .1995, pp 1-3
4. Andre (p), Roose (h) et Van Noyen (r). Listériose neuro-méningée associée à
la consommation de crème glacée. Médecine et maladies infectieuses. vol 20,
1990, pp 570–572.
5. Anonyme. CHROMagar® Listeria Method for Detecting Listeria
monocytogenes. CHROMagar® Listeria Method.htm. par Muriel Coignard.
6. Anonyme. Chronique Prévention en pratique médicale - Information aux
médecins. Direction de santé publique de Montréal, Canada. 2003.
www.Chronique PPM - Listériose en cours de grossesse.htm
7. Anonyme. Cours de bactériologie médicale : Listeria monocytogenes. Pr
Berche.P. Faculté de médecine Necker – Enfants Malades. 2002. Paris V.
France. www.Cours-L.mono.htm
8. Anonyme. Croissance microbienne et froid. Étude du cas particulier de
Listeria monocytogenes, par Roland ROSSET. www.Croissance microbienne
et froid.htm
9. Anonyme. Detection of Listeria monocytogenes. .http//www.detection_
of_listeria_monocytogenes.htm. 2000, pp 1-2.
10.Anonyme. Fiches techniques Santé-Sécurité, Matières infectieuses / Listeria
monocytogenes. www.Listeria monocytogenes - Fiches techniques santé-
sécurité (FTSS).htm . Santé - Canada. 2001.
143
Références Bibliographiques
145
Références Bibliographiques
B
38.Balaka (b), Bonkoungou (p), Sqalli (m), Bambara (m), Millogo(a) et Agbèrè
(ad). Analyse comparative des méningites bactériennes néonatales à Lomé,
Bobo-Dioulasso, Casablanca et Lyon. Epidémiologie. Bull Soc Pathologie
Exotique. vol 97-2, 2004, pp.131-134.
39.Baylon(h). Recrudescence des Listérioses. Médecine et nutrition. vol 6,
Tome : XXIII, 1987, pp 399-401.
40.Barnier(e), Vincent (jp), Catteau(m). Survie de Listeria monocytogenes dans
les saumures et le sérum de fromagerie. Sciences Alimentaires. vol 8, 1988,
pp. 175-178.
41.Barnier(e), Vincent (jp) et Catteau(m). Listeria et environnement industriel.
Sciences Alimentaires. vol 8, 1988, pp 239-242.
42.Bazin(c). Méningites et méningo–encéphalites à Listeria. Revue du Praticien.
vol 31, 1981, pp 2387-2402.
43.Bellouni(r). Listeria monocytogenes. Thèse de Doctorat en médecine -
DESM, INESSM - Alger. 1990, pp 1-165.
44.Bellouni (r) et Rahal (k). La listériose en Algérie. Le Journal du Praticien.
vol 4, n°6, 1997. pp 246-250
45.Bellouni (r).Diagnostic bactériologique des méningites purulentes en Algérie.
Relevé Epidémiologique Mensuel. INSP. vol XI n°2. 2000, pp 29-33.
46.Benallègue (a), Benhassine (m), Hadji (a), Grangaud (jp) et Mazouni (m).
Méningite à Listeria monocytogenes. Algérie Médicale. Vol 5 n°1. 1968. pp
29-32.
47.Berche (p), Gaillard (jl) et Simonet(m). Listeria monocytogenes. Précis de
bactériologie. Les bactéries des infections cliniques. vol 3, 1988, pp 312-320.
48.Berche (p). Physiopathologie des infections à Listeria monocytogenes.
Médecine et Maladies Infectieuses. n°25 Spécial, 1995, pp 197-209.,
49.Berche (p). Physiopathologie et diagnostic bactériologique des infections
matérno-infantiles à Listeria monocytogenes. Infections Néonatales II. vol 2,
n°1, 1999, pp 33-39.
50.Bienfet (v), Lomba (f), et Binot(h). Une affection en recrudescence ou trop
souvent méconnue ? L'encéphalite à Listeria monocytogenes. Annales de
médecine vétérinaire. fascicule VI, Tome 113, 1969, pp 345-357.
146
Références Bibliographiques
147
Références Bibliographiques
63.Carles (b), Jacquet (c), Duthoit (l), Facon (jl) et Rocourt (j). Evaluation d'un
nouveau milieu de culture pour la détection rapide de Listeria monocytogenes
dans les produits alimentaires : Rapid'L.mono. Recueil SANOFI-Diagnostic-
Pasteur. 1998, pp 1-22.
64.Cornu Marie. Dynamique des populations bactériennes en cultures mixtes.
Thèse de Doctorat d’état. Université Claude Bernard Lyon 1. 2000, pp.1-199.
65.Corpet (o). TIAC, Risques Sanitaires des aliments. Cours d’Hygiène et
Inspection des Denrées Animales et d’Origine Animales. Ecole Nationale
Vétérinaire de Toulouse. France 2005, pp 1-28.
66.CSHF. Conseil Supérieur d’Hygiène de France. 2002. Proposition de Critères
Microbiologiques pour Listeria monocytogenes dans les aliments. 2002.
67.Cossart (p). Bases génétiques et moléculaires du pouvoir pathogène de
Listeria monocytogenes. Médecine et maladies infectieuses. n°25 spécial,
1995, pp 210-218.
68.Cox (lj). Les microorganismes contaminants dans les industries agro-
alimentaires : colonisation, détection et maîtrise. Colloque de la Société
Française de Microbiologie. 1991, pp 19-34.
69.Daniel (l) and Engeljohn (m) Food Safety and Inspection Service, USDA.
Listeria Guidelines for Industry. Department of Agriculture.Washington,
D.C. 20250-3700. 1999, pp 1-9.
70.David (j). The role of science in international food standards. Food Control.
vol 11, 2000, pp 181-194.
71.Elmer (h). Standard Methods for the examination. Americain Office Health
Association. Quatorzième edition, 1972, pp 1-416.
72.El Marrakchi (a) et Hamama (a). Aspects hygiéniques du fromage frais de
chèvre : perspectives d’amélioration de la qualité. Actes Institut
Agronomique et Vétérinaire Hassan II. Rabat, Maroc. vol 21. 2002, pp 2-12.
73.Espaze (ep), Rocourt (j) et Courtieu (al). La listériose en France en 1988.
Etude à partir des souches adressées au Centre National de Référence.
Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire. n°1, 1990, pp 1-2.
74.Espaze (ep), Rocourt (j) et Courtieu (al). La listériose en France en 1988.
Etude à partir des souches adressées au Centre National de Référence.
Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire. n°3, 1991, pp 9-10.
75.Espinasse (j). Pathologie liée à l’alimentation par l’ensilage de maïs chez les
ruminants. Recueil de Médecine Vétérinaire. vol 143, 1973, pp 1271-1282.
148
Références Bibliographiques
150
Références Bibliographiques
114. Lucht (f), Ducreux (jc), Gutmann (l), Lenoir (g), Page (y). Les méningites
purulentes communautaires. Médecine et maladies infectieuses. Février 1996.
numéro spécial.
M, N
115. Martin (p). Rapport d’activités du Laboratoire National de Référence –
Listeria. Institut Pasteur de Paris. 2001.
116. Mc Kellar (rc). Use of the Camp test for identification of Listeria
monocytogenes. Applied and environmental microbiology. vol 60, n°12,
1994, pp 4219-4225.
117. Montel (mc), Beuvier(e) et Hauwuy (a). Pratiques d'élevage, microflore
du lait et qualités des produits laitiers. Revue INRA Production Animale.
France. vol.16, 2003, pp.279-282.
118. Muraoka (w), Gay (c), Knowles (d) et Borukci (m). Prevalence of Listeria
monocytogenes in bulk milk of the Pacific Northwest. J Food Prot. vol 66 (8).
2003, pp 1413-1419.
119. Monnet (p). Place de la listériose en matière d’état septique néo-nataux.
Médecine et maladies infectieuses. vol n° 6, 1976, pp 471-473.
120. Naim (m). A propos d’un cas de listériose chez un immuno-déprimé.
Journées médico-chirurgicales. Hôpital Central de l’Armée. Alger. 1987.
121. Nicolas (ja). La listériose animale. Revue de médecine vétérinaire. vol
137, 1986, pp 645-650.
122. Nicolas (ja), Vidaud (n). Contribution à l’étude de Listeria dans les
denrées d’origine animale destinées à l’alimentation humaine. Recueil de
médecine vétérinaire. vol 163, 1987, pp 283-285.
123. Nicolas (ja), Espaze (ep), Rocourt (j) et Cornuejols (mp). Listériose
animale et ensilage, intérêt de la sérotypie dans l’approche épidémiologique.
Recueil de Médecine Vétérinaire. vol 164, 1988, pp 203-206.
124. Norme Française AFNOR. NF V 08-010 : Règles générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
125. Norme Internationale. NF EN ISO 6887-1 : Suspension mère et dilutions
décimales ; 1. règles générales.
126. Norme Française AFNOR. NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire –
Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
microbiologique.
152
Références Bibliographiques
142. Pierre (o), Veit (p). Plan de surveillance de la contamination par Listeria
monocytogenes des aliments distribués : Résultats des plans 1993 - 1994.
Bulletin épidémiologique hebdomadaire n°45, 1996.
143. Pierre (p), Zundel (e), Marly (j), Velge (p) et Phan Thanh (l), Listeria et
risques alimentaires. Point d’actualité INRA Tours. 1999.
144. Pierre (v), Le Quellec Nathan (m), et Coquin (y).La prophylaxie des
listérioses. Bulletin de l’Académie nationale de médecine. vol 184, n°2,
2000, pp 295-303.
R
145. Rahal (k). Méningites purulentes et résistance aux antibiotiques. Relevé
Epidémiologique Mensuel. INSP. vol XI n°2. 2000, pp 33-36.
146. Ramdani – Bouguessa (n), Rahal (k). Neonatal listeriosis in Algeria: the
first two cases. Clinical microbiology and infection. vol 6, n°3, 2000, pp 108-
111.
147. Rapport de la consultation mixte FAO / OMS d’experts sur l’évaluation
du risque microbiologique dans les aliments. Rome, Italie du 17 au 21 Juillet
2000, pp 1-57.
148. Rapport de la consultation mixte FAO / OMS d’experts sur la
caractérisation des risques liés à Salmonella spp dans les oeufs et les poulets
de chair et à Listeria monocytogenes dans les aliments prêts à consommer.
Rome, Italie. Du 30 Avril au 4 Mai 2001, pp 1-47.
149. Rapport de la Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation
et de la Répression des Fraudes- France. La surveillance de la contamination
par Listeria monocytogenes des aliments à la distribution de 1997 à 2001.
2002, pp 1-15.
150. Rapport de la Trente Sixième session du comité du CODEX sur l’hygiène
alimentaire. Washington, USA, du 29 Mars au 3 Avril 2005, pp 1-39.
151. Rapport de Trente Sixième session du comité mixte FAO/OMS sur
l’analyse du risque. Rome, Italie. Mai 2004
152. Rapport de la Trente Septième session du comité du CODEX sur
l’hygiène alimentaire. Buenos-Aires, Argentine. 14 au 19 Mars 2005, pp. 1-
127.
153. Rapport de la Cinquante Cinquième session du comité exécutif de la
commission du Codex Alimentarius. Rome, Italie. 9 au 11 Février 2005, pp
1-28.
154
Références Bibliographiques
155
Références Bibliographiques
165. Rocourt (j), Renaud (f) et Freney (j). Les Listeria. Manuel de
bactériologie clinique. vol III, 1994, pp 833-847.
166. Rocourt (j), Cossart (p). Listeria monocytogenes. Foodborne pathogenic
bacteria. Editions Michael P.Doyle. vol 5, 1998, pp 337-352.
167. Rocourt (j). Le Genre Listeria et Listeria monocytogenes. Cours National
d’Hygiène et de Microbiologie des Aliments. IPA. Alger 2002, pp 1-62.
168. Rocourt (j). Analyse du risque Listeria monocytogenes dans les aliments
prêts à consommer. Cours National d’Hygiène et de Microbiologie des
Aliments. IPA. Alger 2002, pp 1-62.
169. Rocourt (j). Listériose humaine : Aspects cliniques et épidémiologiques,
rôle de l'alimentation. Recueil des Journées internationales de l'APDILA,
session contrôle des aliments. 1998, pp 29-40.
170. Rocourt (j). The recongnition and identification of Listeria species by
classics methods. Turkish Journal of infection. vol 2, n°4, 1998, pp 471-485.
171. Rocourt (j). Listeria et listériose : Position phylogénétique et classification
du genre Listeria. Précis de bactériologie clinique. vol 46, 2000, pp 943-952.
172. Rocourt (j), BenEmbarek (p), Toyofuku (h) et Schlundt (j). Quantitative
risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods: the
FAO/WHO approach. FEMS Immunol Med Microbiol. vol. 35(3). 2003, pp.
263-237.
173. Rocourt (j).Taxonomie du genre Listeria et typage de Listeria
monocytogenes. Pathologie biologie. vol 44, n°9, 1996, pp 749-756.
174. Rocourt (j). Rapport d'activités du centre national de référence des
Listeria, Institut Pasteur de Paris. 1999.
175. Rocourt (j). Rapport d'activités du centre national de référence des
Listeria, Institut Pasteur de Paris. 2000.
176. Rocourt (j). Virulence de Listeria monocytogenes. Bulletin de l'Académie
nationale de médecine. vol 184, n°2, 2000, pp 305-307.
S
177. Schlech (wf). Pathogenesis and immunology of Listeria monocytogenes.
Pathologie biologie. vol 44, n° 9, 1996, pp 775-782.
178. Shaynoor (d), Cossart (p). Le pouvoir pathogène de Listeria
monocytogenes. Annales de l’Institut Pasteur de Paris. vol 5, n°3, 1994, pp
202-211.
156
Références Bibliographiques
Milk in Farm Bulk Tanks and in Dairy Plant Receiving Tanks. Applied and
Environmental Microbiology, vol. 68, n°7, July 2002, pp 3366-3370.
192. Vallée (a), Guillon(jc) et Levaditi (j). Aspect actuel de la listériose
cérébrale bovine en France. Bulletin de l'Académie vétérinaire. Tome
CXLVIII, 1972, pp 277-282.
193. Vaissaire (j). Epidémiologie des Listérioses animales en France. Bulletin
de l’Académie nationale de médecine. vol 184, n°2, 2000, pp 275-286.
194. West (hj), Obwolo (m). Bilateral facial paralysis in a cow with listeriosis.
The veterinary record. vol 120, 1987, pp 204-205.
195. William (c), Rebhum (dmv) and DeLahunta (a). Diagnosis and treatment
of bovine listeriosis. Journal of the americain veterinary medical association.
vol 180, n°4, 1982, pp 396-398.
196. William(c), Rebhum(dmv). Listeriosis: Bovine neurologic disease.
Veterinary clinics of North America: Food animal practice. vol 3, n°1, 1987,
pp 75-83.
197. Willis (m), Schoonderwoerd (m). A case bovine mastitis caused by
Listeria monocytogenes. Canadien veterinary journal. vol 31,1990, pp773-
775.
198. Zebboudj (k). Les méningites purulentes en Algérie. Situation
épidémiologique de 1994 à 1998. Relevé Epidémiologique Mensuel. INSP.
vol XI n°2, 2000, pp 38-40.
158
159
Annexes
Annexe : 1
Matériel de travail
Equipements de laboratoire
Il s'agit en somme, des équipements classiques d'un laboratoire de microbiologie
alimentaire à savoir :
Etuves bactériennes réglées à différentes températures : 30 et 37°C,
Bain-marie réglé à 44°C,
Hotte à flux laminaire,
Autoclave : 120°C,
Balance électronique : environ 100 gr
Combiné : Réfrigérateur - Congélateur,
Microscope optique binoculaire, grossissement : 40 et 100,
Bec bunsen.
Consommable
Milieux de culture (dont les formules figurent en annexe 2),
Bouillon Fraser avec supplément,
Gélose Palcam avec supplément,
Gélose Oxford et Oxford modifiée,
Gélose au Sang,
Gélose TSAYE,
Gélose mobilité,
Gélose TSA,
Gélose de conservation,
API - Listeria,
Huile de cèdre.
Réactifs :
Eau oxygénée,
Disque d'oxydase,
Colorants de Gram,
Huile à immersion,
Réactif de Kowacs,
VP I et VP II,
Rouge de méthyl,
Nitrate I et Nitrate II,
Ampoules de suspension Medium de 2 ml,
Ampoule de réactif ZYM. B,
Suspension d'une opacité égale à 0,5 Mac Farland.
160
Annexe
161
Annexe
Annexe : 2
Composition :
Principes :
La forte teneur en chlorure de sodium permet d’accroître la sélectivité du milieu.
Les phosphates agissent comme système tampon pour le maintien du pH.
Le chlorure de lithium inhibe la plupart des Entérocoques susceptibles
d’hydrolyser l’esculine.
Préparation :
Faire dissoudre les composants dans de l’eau, puis chauffer modérément jusqu’à
dissolution complète. Ajuster le pH à 7,2.
Répartir ensuite le milieu à raison de :
225 ml par flacon qui serviront aux enrichissements primaires,
10 ml par tubes qui serviront aux enrichissements secondaires.
Stériliser ensuite le milieu à 121°C pendant 15 minutes.
Supplément sélectif pour Bouillon Fraser.
Au moment de l’utilisation du bouillon Fraser au demi tout comme le bouillon
Fraser, ils doivent être additionnés de leur supplément dont la formule est la
suivante :
Constituants Quantité
Acide nalidixique 22,5 mg
Acriflavine 28,125 mg
Citrate de Fer (III) ammoniacal 1,125 g
162
Annexe
2. Gélose PALCAM
Composition :
163
Annexe
Principes :
La peptone favorise la croissance des Listeria.
L'extrait de levure est une source du complexe vitaminique B.
Le glucose et l'amidon représentent les sources énergétiques du développement.
Le chlorure de sodium maintien l'équilibre osmotique.
La fermentation du mannitol par les germes contaminants qui pourraient
cultiver, est mise en évidence par le virage au jaune du rouge de phénol,
permettant ainsi d'orienter le diagnostic.
Préparation :
Faire fondre le milieu puis le refroidir à une température de l'ordre de 48°C.
Ajouter par la suite 2,25 ml du supplément Palcam reconstitué.
Homogénéiser et couler en boites de Pétri stériles.
Laisser solidifier sur paillasse puis les sécher à l'étuve.
Les boites ainsi préparées peuvent également être conservées à +4°C pendant 4
à 5 jours.
Supplément sélectif pour gélose Palcam
Constituants Quantité
Sulfate de Polymyxine B 5,0 mg
Ceftazidime 10,0 mg
Acriflavine 2,5 mg
Il s'agit d'un mélange de deux antibiotiques (Polymyxine et Ceftazidime ) et d'un
colorant antiseptique ( l'acriflavine ).
La Polymyxine B inhibe les Gram négatifs, y compris Pseudomonas
aeruginosa , ainsi que quelques Gram positifs.
La Ceftazidime est un antibiotique à large spectre auquel Listeria est
résistante.
Mode d'emploi.
On reconstitue le supplément en y ajoutant aséptiquement 5 ml d'eau distillée
stérile.
Mélanger doucement et soigneusement, puis répartir en boites de Pétri, qu'on
laisse refroidir et sécher sur paillasse.
Les boites ainsi préparées peuvent être gardées à +4°C, pendant au plus 48 à 72
heures.
164
Annexe
3. Gélose OXFORD.
Constituants Quantité
Colombia agar base 39 g
Esculine 1g
Ferrique ammonium citrate 0,5 g
Chlorure de sodium 15 g
Cycloheximide 400 mg
Colistine sulfate 20 mg
Acriflavine 5 mg
Céfotétan 2 mg
Fosfomycine 10 mg
Eau Distillée QSP 1000 ml
Préparation
Dissoudre 34 g du milieu déshydraté dans l’eau, en portant à ébullition. Ajuster
le pH à 7,0 à 25°C, puis répartir dans des flacons à raison de 225 ml.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Constituants Quantité
Colombia sang agar base 39 g
Esculine 1g
Ferrique ammonium citrate 0,5 g
Chlorure de sodium 15 g
1 % Colistine solution 1 ml
1 % Moxalactame solution 1 ml
Agar 2g
Eau Distillée QSP 1000 ml
Préparation
Dissoudre 34 g du milieu déshydraté dans l’eau, en portant à ébullition. Ajuster
le pH à 7,0 à 25°C, puis répartir dans des flacons à raison de 225 ml.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
165
Annexe
5. Gélose TSAYE
Composants Quantité
Bouillon tryptone soja (1) 30,0 g
Extrait de levure 6,0 g
Agar Agar 9 à 18,0 g (2)
Eau 1000 ml
(1)Digestat enzymatique de caseïne 17,0 g
Digestat enzymatique de farine de soja 3,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Hydrogénophosphate dipotassique 2,5 g
Glucose 2,5 g
(2) selon le pouvoir gélifiant de l’Agar-Agar
Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons ou dans
des tubes, selon les préférences. Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15
minutes.
Les tubes seront refroidis en position inclinée. Les flacons seront refroidis en
position debout ; au moment de leur utilisation, ils seront fondus, puis refroidis à
environ 45°C, puis coulés en boîtes de Pétri.
Composants Quantité
Digestat enzymatique de tissus animaux 15,0 g
Digestat enzymatique de foie 2,5 g
Extrait de levure 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Agar Agar 9 à 18,0 g
Eau 1000 ml
Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons. Stériliser
à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Les flacons seront ensuite refroidis ; au moment de leur utilisation, ils seront
fondus, puis refroidis à environ 45°C, puis on leur ajoute aséptiquement deux
ampoules de sang de mouton défibriné. Mélanger soigneusement, puis répartir
en boites de Pétri. Ce milieu est utilisé pour la mise en évidence de l’hémolyse.
166
Annexe
7. Gélose TSA
Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des flacons. Stériliser
à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Les flacons seront ensuite refroidis ; au moment de leur utilisation, ils seront
fondus, puis refroidis à environ 45°C, puis on leur ajoute aséptiquement deux
ampoules de sang de mouton défibriné. Mélanger soigneusement, puis répartir
en boites de Pétri. Ce milieu est utilisé pour la mise en évidence de l’hémolyse
dans le Camp-test.
8. Gélose Mobilité.
Composants Quantité
Digestat enzymatique de caseïne 20,0 g
Digestat enzymatique de tissus animaux 6,1 g
Agar Agar 3à6g
Eau 1000 ml
Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant
à ébullition. Ajuster le pH à 7,3 à 25°C, puis répartir dans des tubes à raison de 5
ml par tube. Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Il s’agit d’un milieu semi-solide qui favorise la mobilité des germes. Il doit donc
être régénéré au bain-marie avant utilisation et l’ensemencement se fera alors
par piqûre centrale.
167
Annexe
Annexe : 3
Questionnaire sur l’évaluation de l’exposition au risque Listeria du lait cru
Wilaya : ……………
Grossesse Convalescence
Masculin Féminin
168