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CahierTech1999 PDF
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Éd ition 1999
Table des matières
1. Introduction _____________________________________________________________ 5
2. Les phases de la micropropagation ___________________________________________6
2.1 Stade 0 : Conditionnement des plants mères__________________________________ 6
2.2 Stade 1 : Établissement d’une culture aseptique : Durée 6 à 8 semaines ___________6
2.3 Stade 2 : La multiplication des tiges : Durée 4 à 5 semaines._____________________ 7
2.4 Stade 3 : La rhizogénèse (enracinement ) : Durée 2 à 4 semaines ________________ 8
2.5 Stade 4 : L’acclimatation : Durée 3 à 4 semaines_______________________________8
3. La préparation d’un milieu de culture ________________________________________ 9
3.1 Solution-mères de macro et micro-éléments, fer et vitamines pour le milieu MS _____ 9
3.2 Régulateurs de croissance _______________________________________________11
3.3 Volume des solution-mères_______________________________________________12
3.4 Préparation du milieu MS pour un volume de 1 000 ml ________________________ 14
3.5 Préparation du milieu MS pour un volume de 500 ml __________________________14
3.6 Préparation du milieu MS avec sachet commercial ____________________________ 15
3.7 La stérilisation_________________________________________________________ 17
3.7.1 Stérilisation à l’autocuiseur_______________________________________________________18
1. Introduction
La culture in vitro est un terme très général pour désigner la culture de cellules ou de tissus
qui se développent dans un milieu nutritif en conditions d’asepsie pour une période de
temps indéfinie. Les trois principaux champs d’action de la culture in vitro concernent :
• la culture de cellules individuelles ou de protoplastes;
• la culture de tissus ou d’organes;
• la culture de plantes entières.
• Le choix du milieu de culture qu’il est parfois nécessaire d’ajuster légèrement par la
suite suivant la réponse de l’explant;
• La qualité du travail en asepsie de la technicienne ou du technicien.
Dans plus de 50 % des cas, les premiers essais de mise en culture sont très satisfaisants
et demandent très peu ou pas d’ajustements. Pour certains autres cas, la difficulté réside
dans la désinfection des végétaux, pour d’autres dans l’ajustement de l’équilibre hormonal.
Mais selon tous les auteurs, théoriquement tous les végétaux quels que soient leur espèce
ou leur cultivar, peuvent être cultivés in vitro.
Les explants les plus aptes à entreprendre une multiplication sont généralement riches en
bourgeons ou en zones méristématiques potentielles. Ils varient selon les espèces :
Le milieu nutritif utilisé est souvent identique à celui du premier, bien qu’une différence
parfois mineure s’observe dans la balance hormonale (équilibre auxine-cytokinine). Au
stade de la multiplication, les cytokinines sont généralement présentes en plus grande
concentration dans le milieu que les auxines. Ceci s’explique d’un point de vue
physiologique par le fait que les cytokinines s’opposent à la dominance apicale donc
stimulent la croissance de nouvelles tiges. Encore une fois, la littérature fournie
généralement les informations nécessaires nous permettant de fixer notre choix sur une
formulation appropriée.
La vitesse de croissance des plantes in vitro se module àcelle in situ. Si l’espèce mise en
culture est à croissance lente, on peut s’attendre à observer une croissance lente dans les
tubes.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.8
Certains composés comme les micro-éléments ou oligo-éléments (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co,
Mo, Al, I, Fe) , certaines vitamines et régulateurs de croissance sont requis en si petite
quantité qu’il est impossible de les peser. On doit donc les concentrer préalablement sous
forme de solutions-mères . Par la suite, on pourra puiser à même ces solutions-mères la
quantité requise d’agent actif pour chacune des formulations de milieu recommandé.
Comme il peut être long et fastidieux de peser les produits nécessaires à chaque fois que
l’on fait un milieu, on utilise couramment des solutions où tous les ingrédients sont
incorporés.
NOTE : En raison de leur sensibilité à la chaleur, les vitamines peuvent être ajoutées au
reste du milieu MS autoclavé. Dans ce cas, les 10 ml de solution-mère de vitamines
seront stérilisés mécaniquement àl’aide de filtres micropores puis ajouté, en conditions
aseptiques, au litre de milieu MS avant gélification.
Tableau 1 : Milieu MS
Constituant Solution mère Volume à ajouter Concentration
(mg par litre) (ml par litre) finale (mg par litre)
Macro-éléments 20X 50 ml
NH4NO3 33 000 1 650
KNO 3 38 000 1 900
CaCl2 - 2 H2O 8 800 440
MgSO4 - 7 H2O 7 400 370
KH2PO4 3 400 170
Micro-éléments 100X 10 ml
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.11
Fer 100 X 10 ml
Na2EDTA 3 730 37.3
FeSO4 - 7 H2O 2 780 27.8
Acides aminée et 10 ml
vitamines 10 X
Glycine 20 mg pour 100 L 2.0
Ac. Nicotinique 5 mg pour 100 L 0.5
Pyridoxine – HCl 5 mg pour 100 L 0.5
Thiamine – HCl 1 mg pour 100 L 0.1
Sucres
Myo-inositol 100
Sucrose 30 000
Agar 10 000
Si les quantités requises par litre de milieu à réaliser dépasse 2 mg, on peut simplement
peser et dissoudre le régulateur dans le solvant approprié et l’ajouter au reste du milieu.
Si la quantité désirée est inférieure à 2 mg, il est conseillé pour plus de précision de
procéder à la fabrication d’une solution-mère.
Ainsi, on peut concentrer 10, 100 ou 1 000 fois le composé requis dans un volume de 100
ml ou 1 000 ml.
q Étendre avec un peu d’eau, vérifier l’état de dissolution et ajouter un peu de solvant
au besoin.
Conservation : Pour l’AIA, c’est quelques jours et pour les autres 4 semaines au
maximum.
Rangement : Réfrigérateur (4 à 5 o C) ou congélateur.
Plusieurs régulateurs de croissance sont dégradés par la lumière en solution aqueuse.
Plusieurs sont dégradés par la chaleur, mais certains sont stables à120oC (ANA, 2-4-D,
Kin, BAP, Zéa). La gibbérelline et l’AIA sont trop instables pour être conservés de manière
routinière; ne préparer que la quantité requise au moment de l’utilisation.
- Solution-mère no.1
• Peser 1 gramme du produit (c’est-à-dire 1 000 mg);
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- Solution-mère no.2
• Prendre ensuite 1 ml de cette solution no.1 (10 mg) dans 99 ml d’eau distillée;
• Résultat : 10 mg / 100 ml donc chaque ml de cette solution contient 0.1 mg du produit;
• Il suffit d’ajouter 1 ml de cette dernière solution-mère no.2 afin d’obtenir le 0.1 mg du
produit désiré.
Problème 1 :
Vous voulez utiliser un total de 3 270 mg de sels pour fabriquer un litre de solution-mère
d’oligo-éléments MS. Pour une recette particulière, vous devez incorporer 32,7 mg (oligo-
éléments MS) au litre de milieu en préparation. Quelle volume de solution-mère devez-vous
utiliser ?
Solution :
3 270 mg = 32,7 mg (produit croisé)
1 000 ml ? ml
32 700 = ?
3 270
Réponse : 10 ml
Problème 2 :
Vous avez une solution-mère d’auxine dont la concentration est de 1 mg / 100 ml, combien
de millilitres de cette solution devez-vous utiliser, si la recette indique 0,1 mg / l d’auxine ?
Solution :
Il faut d’abord exprimer les concentrations en pourcentage. Ensuite, complétez l’équation
suivante à l’aide des données qui vous sont fournies dans l’énoncé du problème:
1 000 ml 1.00 %
1 000 ml X 0,01 % = 10 ml
1,00 %
Réponse :10ml
q Verser approximativement les deux tiers de la quantité d’eau requise (soit environ 600
ml) dans un bécher de 2 litres. L’eau utilisée doit avoir été déminéralisée et distillée
(DDH2O). Agiter.
q Un à la fois, les composés (mis à part le sucre et l’agar) sont ajoutés à l’eau dans l’ordre
prévu sur la feuille descriptive (macro-micro-fer-vitamines-régulateurs). NE PAS
CHAUFFER.
q Pour de meilleurs résultats, on attend la dissolution complète avant l’ajout du composé
suivant.
q Dans le cas d’une solution-mère, ne jamais pipetter dans le contenant
q Dans le cas de composés solides (2 mg et plus) , dissoudre dans le solvant approprié
et rincer les nacelles à l’eau afin de recueillir toutes traces de composés.
q Ajuster le pH du milieu avec du NaOH ou du HCl tout en agitant la solution.
q Si désiré, le milieu peut alors être entreposé au réfrigérateur pour une journée.
q Compléter le volume de la solution à 1 000 ml à l’aide d’un ballon volumétrique. La
solution doit être àla température de la pièce.
q Verser à nouveau le milieu dans le bécher de 2 litres recouvert d’un papier d’aluminium.
q Le déposer sur une plaque chauffante : CHAUFFER ET AGITER.
q Ajouter graduellement le sucrose, attendre qu’il soit complètement dissout.
q Ajouter graduellement l’agar en neige fine en prenant soin de ne pas saupoudrer les
parois internes du bécher. Continuer de chauffer la solution jusqu’à ébullition et
dissolution de toutes les particules d’agar. L’agar est complètement dissout lorsque la
solution redevient claire.
q Transférer le milieu chaud dans les contenants appropriés et identifier.
q Stériliser les contenants à l’autoclave (121oC ; 15 à 20 minutes selon le volume des
contenants).
q Garder le milieu au réfrigérateur jusqu’àson utilisation.
q Verser approximativement les deux tiers de la quantité d’eau requise (soit environ 300
ml) dans un bécher de 1 litres. L’eau utilisée doit avoir été déminéralisée et distillée
(DDH2O). Agiter.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.15
q Un à la fois, les composés (mis à part le sucre et l’agar) sont ajoutés à l’eau dans l’ordre
prévu sur la feuille descriptive (macro-micro-fer-vitamines-régulateurs). NE PAS
CHAUFFER.
q Pour de meilleurs résultats, on attend la dissolution complète avant l’ajout du composé
suivant.
q Dans le cas d’une solution mère, ne jamais prélever directement du contenant
q Dans le cas de composés solides (2 mg et plus) , dissoudre dans le solvant approprié
et rincer les nacelles à l’eau afin de recueillir toutes traces de composés.
q Ajuster le pH du milieu avec du NaOH ou du HCl tout en agitant la solution.
q Si désiré, le milieu peut alors être entreposé au réfrigérateur pour une journée.
q Compléter le volume de la solution à 500 ml àl’aide d’un ballon volumétrique. La solution
doit être à la température de la pièce.
q Verser à nouveau le milieu dans le bécher de 1 litre recouvert d’un papier d’aluminium.
q Le déposer sur une plaque chauffante : CHAUFFER ET AGITER.
q Ajouter graduellement le sucrose, attendre qu’il soit complètement dissout.
q Ajouter graduellement l’agar en neige fine en prenant soin de ne pas saupoudrer les
parois internes du bécher. Continuer de chauffer la solution jusqu’à ébullition et
dissolution de toutes les particules d’agar. L’agar est complètement dissout lorsque la
solution redevient claire.
q Transférer le milieu chaud dans les contenants appropriés et identifier.
q Stériliser les contenants à l’autoclave ( 121oC ; 15 à 20 minutes selon le volume des
contenants).
q Garder le milieu au réfrigérateur jusqu’àson utilisation.
Il s’agit d’un produit intéressant puisque ce milieu est très largement utilisé et
convient à de très nombreuses culture. Il permet l’ajout des produits organiques
(vitamines et régulateurs) spécifiques à la culture convoitée.
• Murashige et Skoog (MS) medium :
Dans le cas où la plante cultivée demande des vitamines de types MS, ce sachet
nous évite la préparation de solutions-mères de vitamines donc une économie de
temps.
• Anderson :
Ce type de milieu s’avère intéressant dans le cas de cultures de plantes
acidophylles. Les sachets contenants uniquement des sels sont disponibles. Aussi
trouve-t-on sur le marché des milieux pré-mélangés pour la culture du Rhododendron
(stades I, II, et III).
• Vacin et Went medium :
Ce mélange de sels minéraux est très utilisé dans la culture d’orchidée,
particulièrement pour le Cybidium.
• Knudson medium :
Utilisé pour la germination des orchidées in vitro
• WMP medium :
Ce milieu « Woody plant medium » (WPM) est plus fréquemment employé dans la
culture des plantes ligneuses mais aussi à l’occasion dans la culture des plantes
vivaces.
• White medium
Milieu de culture à faible concentration en sels minéraux.
3.7 La stérilisation
Le maintien des cultures en conditions aseptiques sous entend la stérilisation des milieux
de culture, d’instruments de manipulation et de dissection, d’eau de rinçage, etc.
L’acquisition d’un équipement permettant la stérilisation est donc indispensable au
laboratoire de micropropagation. L’équipement de stérilisation par excellence est sans
conteste l’autoclave. Cependant, compte tenu de son coût d’achat (jusqu’à $5 000), il
convenait ici de trouver un équipement de remplacement efficace à moindre coût. Trois
modes de stérilisation ont donc été testés afin de répondre à notre besoin et les résultats
sont détaillés au chapitre 4 :
• Utilisation d’un bain d’eau bouillante dans lequel les tubes (ou autres contenants)
sont plongés pendant 30 minutes;
• Utilisation d’un micro-ondes d’une puissance de 700W dans lequel les tubes (10 à la
fois) sont chauffés pendant 10 minutes;
• Utilisation d’une cocotte minute (autocuiseur; autoclave à conserve) pendant 15
minutes à 15 lb de pression.
Pour des raisons techniques et pratiques, nous avons retenu l’utilisation de l’autocuiseur
domestique. Son coût est d’environ 130$. Il permet la stérilisation de près d’un litre de
milieu à la fois et il s’utilise sur une cuisinière conventionnelle. De plus, il nous assure
l’atteinte d’une température de 121oC. L’eau bout à 100 oC sauf dans les régions
montagneuses, et ceci est normalement suffisant pour détruire la plupart des moisissures
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.18
et les levures. Toutefois, une température de 115 oC (240oF) est nécessaire pour détruire
les bactéries nuisibles. Durant la stérilisation sous pression, une portion de l’eau dans
l’autoclave ou l’autocuiseur est changée en vapeur et quand l’air est complètement sorti par
le tuyau d’échappement, on place le régulateur de pression. La vapeur qui se dilate créera
de la pression. Quand la pression augmente dans l’autoclave, la température augmente
aussi. Ainsi un régulateur assurant 5 lb de pression permettra à la température d’atteindre
110oC, à 10 lb de pression la température s’élèvera à 115oC et à 15 lb de pression la
température atteinte sera d’environ 121 oC. La technique de culture in vitro exige des
températures de stérilisation de 121 oC. Seule une température aussi élevée permettra la
destruction de bactéries résistantes. Une seule bactérie présente dans un tube à culture
donnera naissance en moins d’une ou deux semaines à une colonie de bactéries visible à
l’oeil nu. La qualité nutritive des milieux de culture permet un essor rapide de la croissance
des micro-organismes qui entre en compétition avec la croissance des végétaux. Il est
donc impératif d’éliminer par stérilisation des milieux tous les micro-organismes.
• S’assurer que l’autocuiseur est bien propre et en bonne condition (joint d’étanchéité,
valve…);
• S’assurer que les tubes ou les contenants ne sont pas craqués ou ébréchés et que les
bouchons sont en bonne condition;
• S’assurer que les contenants ne contiennent pas plus de la moitié de leur volume. Les
tubes contiennent généralement entre 12 et 14 ml de milieux;
• Ajuster les couvercles suivant les instructions du fabricant. On dévisse d’au moins ½tour
les couvercles sur les pots Mason;
• Verser 3.5 L d’eau bouillante (ou l’équivalent de 1 1/2 pouce) dans l’autocuiseur avec le
support en place. Placer l’autoclave sur un feu bas;
• Placer chaque contenant debout sur le support dans l’autocuiseur. Les tubes peuvent
être maintenus debout en les attachant par lots de 5 ou insérés debout dans des pots
vides. Toujours utiliser le support pour la stérilisation. Les bocaux ou les tubes peuvent
se briser s’ils sont en contact direct avec le fond de l’autoclave;
• Disposer sur un des contenants un ruban révélateur de stérilisation celui-ci permettra de
confirmer si les conditions de stérilisation ont été atteintes (121oC durant 15 minutes);
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.19
• S’assurer que le tuyau d’échappement est ouvert avant de mettre le couvercle sur
l’autocuiseur;
• Placer le couvercle sur l’autoclave et le fermer solidement. Les poignées du couvercle
doivent être au centre des poignées de la marmite. NE PAS laisser monter la pression
dans l’autoclave avant d’avoir fermé le couvercle solidement en place;
• Pour faire évacué l’air de l’autoclave et des contenants, mettre l’autoclave sur un feu
assez haut pour que la vapeur jaillisse librement par le tuyau d’échappement. Réduire la
chaleur pour maintenir un jaillissement de vapeur modéré. Laisser la vapeur sortir
durant 7 à 10 minutes;
• Déposer le régulateur de pression (15 lb) sur le tuyau d’échappement;
• Si votre autoclave est muni d’une valve de sécurité automatique, elle devrait se soulever
pour sceller la marmite. (Voir instruction du fabricant);
• Faire chauffer l’autoclave jusqu’à ce que le régulateur de pression commence à remuer
gentiment . Ajuster la chaleur afin d’obtenir un rythme lent et régulier. Un feu relativement
élevé est nécessaire pour la plupart des cuisinières. NE PAS toucher et NE PAS
enlever le régulateur de pression durant la période de stérilisation;
• A la fin de la durée de stérilisation, arrêter la chaleur et laisser la pression tomber par
elle même afin qu’il n’y est pas de débordement. La pression est tombée lorsque le
plongeur de la valve de sécurité est descendu et qu’il n’y a plus de vapeur qui
s’échappe lorsque le régulateur est penché;
• Enlever le régulateur de pression du tuyau d’échappement;
• Laisser l’autoclave refroidir 1 à2 minutes et lever le couvercle de l’autoclave de façon à
ce que la vapeur soit éloignée de vous;
• Sortir le matériel de l’autoclave et ajuster les couvercles si nécessaire.
q Plaque chauffante pourvue d’un agitateur (une cuisinière électrique ou au gaz ainsi
qu’un fouet tel qu’utilisé en cuisine);
q Bécher de 2 litres (chaudron 2 L en verre ou en stainless steel);
q Flacon laveur (distributeur à condiments (moutarde…) en plastique dont on perce le
bec d’un trou fin fait à l’aiguille);
q Dispensette ( récipient avec bec verseur pouvant contenir 1 litre de milieu chaud ou
bouteille d’un litre avec goulot pouvant recevoir une pompe en plastique souvent
retrouvée sur les format géant de shampoing );
q Gants isolants (mitaines ou autres pour la cuisine permettant de tenir des contenants
chauds);
q 80 tubes de culture (25 X 150 mm) pour 1 litre de milieu ou 40 tubes pour ½ litre
dans un ratelier (des pots Mason, des petits pots de verre pour la nourriture de bébé,
pot de plastiques autoclavables portant la mention pp);
q pH mètre ( un pH mètre portatif peut-être utilisé mais toutefois beaucoup moins fiable);
q NaOH 1N et HCl 1N (pour ajuster le pH du milieu);
q Autoclave (un autocuiseur domestique d’une capacité de 20 litres ou plus);
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.20
leur quantité est généralement guidé par la littérature. Si l’espèce végétale convoitée ne
figurent pas parmi vos lectures et qu’aucun milieu de culture ne semble disponible à titre de
référence, une première expérience pourrait être tentée en utilisant un milieu de culture
réputé convenable pour une espèce voisine ou pour une plante d’un même genre ou même
d’une même famille botanique.
Toutes les cytokinines sont peu solubles dans l’eau et doivent être préalablement dissoutes
dans quelques gouttes de NaOH 1N ou de HCl 1N. Elles sont dégradées par la lumière et
doivent être conservées au réfrigérateur à l’obscurité. Elles sont stables en solutions
aqueuses et à la chaleur (autoclave).
• Zéatine :
• Substance naturelle.
• Isopenthényladédine (2-i-P) :
• Substance naturelle;
• Cytokinine relativement faible.
• Kinétine :
Substance de synthèse.
Embryogénèse
Formation de racines
adventives sur le cal
Auxines Cytokinine
4.3.5 Nomenclature
Les tableaux suivants dressent la liste des abréviations courantes.
1
Source : Georges E.F. et P.D. Sherrington, « Plant propagation by tissue culture », Handbook and directories of
commercial laboratories, Exegetics Ltd, 1984 p. 307.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.25
Additifs
CH Hydrolysat de caséine
CW Coconut water
EDTA Acide éthylènedinitrilo-tétraacétique
ADE ou Ad Adénine
Formulations
MS Murashige et Skoog (1962)
B5 Gamborg et al. (1968)
ER Erikkson (1965)
WH White (1963)
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.26
4.5.1 Agar-agar
Il s’agit d’une substance naturelle extraite de différentes espèces d’algues marines. On la
classe parmi les sucres parce qu’elle est identifiée comme un polyoside (donc un glucide).
Elle se dissout dans l’eau entre 90 et 100oC. En refroidissant, elle demeure àl’état liqui de
jusque vers 55oC et elle se solidifie en un gel relativement clair au environ de 40oC. Le
milieu gélosé ne peut être porté à ébullition une seconde fois car cette sur-cuisson
entraînerait une dégradation de l’agar qui perdrait alors ses propriétés. De plus, la
solidification du milieu gélosé peut être compromise si le pH de la solution a été ajusté
sous les 4.8. En effet, il semble qu’à des pH aussi bas (plantes acidophiles), l’agar perd de
ses propriétés au moment de l’autoclavage.
On doit toutefois prendre note que la clarté du milieu réalisé avec ces gels synthétiques
peu faussement laisser croire à une contamination bactérienne autour de l’explant. En effet,
les exsudats produits en cours de culture seront maintenant plus visibles et ne devront pas
être confondus à une quelconque colonie bactérienne. Nos essais nous ont fait préférer le
Phytagel pour sa facilité de dissolution, son prix et le résultat de culture en tout point
comparable à l’utilisation de l’agar conventionnel. Lors de nos essais, nous avons incorporé
2 g de Phytagel par litre de milieu de culture. D’autres auteurs, comme Lydianne Kyte,
suggèrent de recourir à l’usage de l’agar et des gels synthétiques combinés. En effet, Mme
L. Kyte propose l’utilisation de 3 parties de Gelrite pour 1 partie d’agar. Pour satisfaire
cette demande des utilisateurs, la compagnie Sigma offre un nouveau produit, l’« Agar-
gel ». Il s’agit d’une combinaison des deux produits : agar et gel synthétique.
Entre autre application, le charbon activé serait bénéfique lors de l’enracinement. À cette
étape, la réalisation d’un milieu opaque et sombre grâce à l’ajout du charbon activé aurait
pour effet d’imiter ces conditions présentes dans le sol où évoluent normalement les
racines.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.28
D’autres produits (à composition mal définie) reconnus pour stimuler la croissance sont
parfois utilisés comme par exemple, des extraits de levure (0,5 à 1g/litre) qui sont une
riche source de vitamines du complexe B; le lait de coco ( 5 à 15 % ) retenue pour sa
teneur en hormones naturelles (auxines, cytokinines) et en vitamines; la peptone une riche
source de protéines. On peut se procurer de l’eau de coco chez les fournisseurs de
produits de laboratoires comme Sigma. Selon les auteurs du livre « La culture in vitro et
ses applications horticoles », on peut préparer du lait de coco en l’extrayant directement de
la noix que l’on achète à l’épicerie. On extrait l’albumen, liquide de la noix, que l’on
autoclave immédiatement et que l’on conserve au congélateur.
Des recherches sur Internet ont permis trouver d’autres moyens de lutte contre ces
bactéries endogènes. Nous avons fait l’essai d’hypochlorite de sodium (5.25%)
directement ajouté au milieu de culture avant l’autoclavage à raison de 2 ml/ litre de milieu. Il
s’agissait de la culture du lilas. Les 40 tubes à culture contenant du Javel sont demeurés
sans contamination tandis que des 40 tubes sans Javel, 5 ont été contaminés par des
bactéries ou des moisissures. Bien qu’il ne s’agisse que d’un seul essai, le Javel semble
démontrer une certaine capacité à contrôler le développement des micro-organismes.
Pourrait-il être efficace contre les bactéries endogènes proprement dites ? D’autres
essais devront en faire la démonstration.
Un autre produit, le PPM (Preservative Plant Mixture ) vient de faire son apparition aux
États-Unis. Il est vendu par la compagnie Plant Cell Technology, Inc. de Washington D.C..
Ce produit est vendu comme un préservatif/biocide stable à la chaleur (pouvant donc être
autoclavé). Les fabricants précisent qu’il ne s’agit pas d’un antibiotique mais qu’il prévient
la germination des spores de bactéries et de champignons et qu’il tue les cellules
bactériennes et mycéliennes. Il est spécialement conçu pour enrayer les contaminations
provenant de l’air ambiant, de l’eau, des contacts humains et même, à forte concentration il
peut enrayer les contaminations endogènes. Le produit est, dit-on, spécialement conçu
pour la culture in vitro de tissus végétaux et n’est pas phytotoxique.
Les doses proposées sont de 1 à 2 ml par litre de milieu pour une utilisation routinière; et
de 5 à 20 ml pour l’élimination des bactéries endogènes. Son prix est de $1.00 / ml. Nous
avons fait l’essai du produit à raison de 12 ml / litre pour la culture du lilas qui présentait une
contamination endogène. Tous les explants ayant été cultivés dans le milieu de culture
contenant du PPM ont en effet été exempts de contamination bactérienne ou fongique,
tandis que tous les autres explants ont été contaminés. Les explants traités n’ont pas
montré de signe de toxicité. Nous avons donc tenté un autre essai cette fois avec une
culture de Saintpaulia en stade de multiplication. Le milieu a été additionné de 10 et 16
ml / litre de PPM et un lot témoin sans PPM. Le transfert des plants a été réalisé par des
gens non initiés à la technique et dans un laboratoire de classe sans utilisation de la hotte à
flux laminaire. Voilà pourquoi nous avions augmenté les doses de PPM. Les milieux
enrichis de 10 et de 16 ml de PPM ont été exempts de toute contamination à l’exception
des spores de champignon qui ont germé àla surface des explants. Mais la surface de la
gélose n’a permis aucun développement. Cependant tous les explants sans exception ont
montré une forte toxicité à de telles doses. Les tissus ont nécrosé (du moins la partie au
contact de l’agar) en 24 à48 heures. Les milieux sans PPM ont été contaminés dans une
proportion de 70 % mais leurs explants se sont développés normalement. Des doses aussi
fortes pour les espèces herbacées comme le Saintpaulia seraient peut-être à proscrire.
Mais à la lumière de ces résultats, ce nouveau produit se montre très efficace pour lutter
contre les contaminations mais à quelle dose, avec quelle culture, de manière routinière, au
stade de l’établissement de la culture seulement?
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.30
5. Les contenants
Une variété de contenants peuvent être utilisés pour réaliser la culture in vitro. Le choix du
type de contenant dépend de plusieurs facteurs :
• Il doit être autoclavable;
• Il doit laisser passer la lumière;
• Il doit s’ajuster à la taille et au nombre d’explants;
• Son obturation doit assurer l’asepsie;
• Il doit se nettoyer et se manipuler facilement;
• Si possible, il doit être réutilisable;
• Il doit être peu coûteux.
De manière générale les tubes à culture (25mm x 150mm) sont largement utilisés au stade
de l’initiation d’une culture aseptique (stade I). Les désinfection de surface des végétaux
avant leur première introduction in vitro est souvent difficile à réussir. Aussi, ont-ils
avantage à être mis en culture individuellement pour ne pas faire chuter le taux de réussite
par une contamination secondaire, car un explant contaminé nous forcerait à jeter tous les
autres du même récipient. Une fois l’asepsie réussie, les explants peuvent être transférer
dans des récipients plus grands.
Selon Bhojwani et Razdan2, certains contenants en plastique peuvent en effet être stérilisés
par la chaleur. Ils font mention des matières suivantes :
• Polypropylène;
• Polyméthylpentène;
• Polyallomère;
• Tfzel ETFE;
• Teflon FEP;
• Produits de marque « Nalgene » et « Thermolyne apparatus ».
Tous ces produits plastiques résistent àdes autoclavages répétés mais seuls les produits
faits de Teflon FEP résistent à la chaleur sèche. Les auteurs précisent en outre que les
contenants faits de polycarbone perdent peu à peu leurs propriétés élastiques et que par
conséquent, les cycles d’autoclavage doivent être limités à une durée de 20 minutes. On
retrouve sous les pots et les couvercles un code de 2 à 4 lettres moulées. Elles
correspondent au type de plastique composant le contenant. Le tableau suivant liste les
caractéristiques propres à quelques-uns de ces plastiques. Rappelons ici que la
température de l’autoclave doit atteindre 121oC afin d’assurer l’asepsie.
2
Bhojwani S .S., et Razdan M.K., « Plant tissue culture :theory and practice », Elsevier,
New-York, 1983, 502 pp.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.32
Nos essais de pots de plastique ont été effectués avec des contenants codés « PP ».
Nous les avons utilisés pour la stérilisation d’eau de rinçage pour des volumes de 250 ml.
De tels volumes nécessites une durée de stérilisation plus longue, soit 30 minutes. Tel que
décrit par Bhojwani et Razdan pour les contenants de polycarbone, une telle durée de
stérilisation a entraîné la déformation des pots. Nous suggérons donc, pour de meilleurs
résultats d’utiliser des pots de verre (de type Mason) pour stériliser des volumes de 150 ml
et plus par contenant.
Toutefois, ce type de contenant (pot de boucher) étant facilement accessible et très peu
coûteux, il demeure très avantageux pour la culture in vitro à l’échelle commerciale. D’autant
plus que les volumes de milieux nutritifs par contenant ne dépasse guerre 100 ml, et
peuvent donc être adéquatement stérilisés à 121oC pour une durée de 20 minutes.
Règle générale, les dimensions des récipients seront choisies en fonction du nombre et de
la taille des explants. Un méristème d’un millimètre de diamètre pourrait rapidement de se
dessécher dans un contenant trop grand. Idéalement les méristèmes sont disposés dans
de petits tubes ( 4 ml de milieu) dits à hémolyse. Suite à leur croissance, on pourra
transférer les nouvelles plantules dans des tubes plus grands (25 X 150 mm) ou dans des
contenants de plus grande capacité (jusqu82’à 20 plantules par pot). Le plus souvent les
tubes à culture sont fermés au moyen de bouchons en matière plastique résistant à
l’autoclave qui permettent cependant un minimum d’échanges gazeux avec l’air ambiant.
Des fermetures trop étanches sont parfois àl’origine de troubles de culture, par exemple si
l’espèce en croissance est réputée dégager naturellement un fort taux d’éthylène. En effet,
l’éthylène est une substance naturelle à caractère hormonal, inhibiteur de la croissance.
Afin d’obtenir une culture aseptique, les tissus végétaux à mettre en culture doivent être
« stérilisés » en surface, c’est-à-dire débarrassés des bactéries ou spores de champignon
(moisissures) qui adhèrent à leur surface. Il s’agit de la partie la plus difficile de
l’établissement d’une culture in vitro. Le défit est de désinfecter le végétal sans
compromettre sa survie.
• La concentration la plus faible de solution de javel qui assure l’asepsie, devrait être
celle qu’on utilise, puisque le matériel végétal peut être brûlé si la concentration es
trop forte.
La littérature fournie souvent les concentrations adéquates à utiliser mais ce n’est pas le
cas, seule l’expérimentation à différentes concentrations vous procurera l’information. Les
explants sont le plus souvent désinfectés par immersion dans une solution de javel
commercial (hypochlorite de sodium Na OCl) dont la teneur varie selon la marque de
commerce entre 4 et 6 %. La concentration finale de la solution de javel se situe
généralement à 0.5%.
• Mesurer 100 ml de javel à l’aide d’un cylindre gradué (ou d’une tasse à mesurer)
• Ajouter 900 ml d’eau afin de compléter le volume à 1 000 ml.(l’eau du robinet peut
faire l’affaire)
• Bien mélanger (les deux liquides n’ont pas la même densité)
• Préparer cette solution juste au moment de l’utiliser puisqu’elle perd rapidement de
l’efficacité.
L’alcool éthylique est généralement vendu à une concentration de 96%. Ses propriétés
antiseptiques sont optimales à une concentration de 65 à 70% soit une dilution de 7 parties
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.34
d’alcool dans trois parties d’eau. Donc pour fabriquer 1 litre d’une solution d’alcool 70 % ,
on mélange 700 ml d’alcool 96% à300 ml d’eau (distillée ou non). En pharmacie, on peut
aussi trouver de l’alcool à friction qui est l’isopropanol à 70% mais qui est moins
recommandable que l’alcool éthylique.
7. Stérilisation de la hotte
La hotte à flux laminaire doit être préparée de préférence 30 minutes avant son
utilisation.
Pendant l’attente ….
On maintient les cheveux longs attachés et on enlève montre et bracelet. Au moment de
travailler sous la hotte, on porte des gants de plastique que l’on vaporisera fréquemment à
l’alcool 70% et systématiquement après avoir été en contact avec du matériel non stérile
(cheveux, vêtements, verrerie…). On stérilise tous les instruments par trempage dans
l’alcool 96% puis passage à la flamme. Les instruments ainsi stérilisés repose sur une
scopule (support métallique) qui a préalablement été flambée à ses deux extrémités. Les
instruments sont toujours doublés pour permettre le refroidissement de l’un tandis que
l’autre est en usage. Un instrument chaud peut endommager les tissus vivants. On ne
trempe jamais un instrument chaud dans l’alcool, celui-ci pourrait prendre en feu.
Manipulations de l’explant…
• Le récipient contenant les explants est ensuite amené sous la hotte après avoir été
vaporisé à l’alcool 70%.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.36
• En évitant toute contamination, les explants sont transférés dans un premier pot d’eau
stérile pour une durée de 5 minutes; puis dans un deuxième et un troisième pot d’eau
stérile pour une durée de 5 minutes chacun.
• Les transferts s’effectuent à l’aide d’une pince longue tenue entre le pouce, l’index et le
majeur. Les pots sont placés en diagonale l’un par rapport à l’autre, et le transfert
s’effectue du premier (que l’on maintient à angle) au deuxième pot, sans que la main ne
passe au-dessus de l’ouverture des pots.
• Après le troisième et dernier rinçage en eau stérile, les explants sont transférés un àla
fois sur une surface de travail stérile (pétri ou autre), découpé de la façon décrite (apex
de tige, nœud,…)
• Transfert de l’explant sur la gélose :
• La pince longue tenue entre le pouce, l’index et le majeur, permet au petit doigt de
cette même main de prendre le bouchon du tube de façon à ne pas le déposer sur la
table, ce qui risque de l’infecter.
• De l’autre main, on chauffe le col du tube à inoculer
• À l’aide de la pince, on dépose l’explant sur le milieu en prenant le minimum de
temps; la rapidité est une des conditions de la réussite des cultures
• Tout explant qui sera tombé sur la table, ou qui aura touché autre chose que le
papier ou le pétri stérile, sera éliminé
• Si l’on devait poser un bouchon sur la table, il devrait être déposé à l’envers
• Avant de remettre le bouchon, on flambe à nouveau l’ouverture du tube (on ne flambe
pas l’embouchure des pots seulement des tubes)
• On veillera àchanger la surface de travail stérile (pétri ou autre) tous les 3 ou 4 explants
environ et à stériliser les instruments encore plus fréquemment.
• Une fois le travail terminé, on identifie la culture, on inscrit la date de l’inoculation et on
place les explants en chambre de culture.
• Les papiers de boucher (cirés d’un seul côté) et découpés en carré en guise de surface
de travail seront stérilisés à l’avance à la condition d’être généreusement emballés dans
le papier d’aluminium
• Tout matériel introduit sous la hotte devrait être vaporisé à l’alcool 70% (si possible plus
de 15 minutes avant le début du travail)
• Les vêtements ne devrait pas pendre au-dessus de la surface de travail dans la hotte :
les fibres textiles transportent de nombreux germes
• On évite les grands gestes et l’entrée du corps dans l’enceinte de la hotte : risques
élevés de transporter des germes
• On vaporise nos gants chaque fois que l’on désire réintégrer notre place sous la hotte
• On nettoie régulièrement la table de travail à l‘alcool 70% à l’aide du chiffon coton
fromage en commençant par le fond de la hotte et en finissant vers soi.
• On ne vaporise pas dans la hotte si le brûleur est allumé. DANGER
• On prend l’habitude dès le début de déplacer les mains parallèlement l’une par rapport à
l’autre afin d’éviter le passage au-dessus des instruments stériles, de la surface de
travail dans laquelle on découpe les végétaux, ou les embouchures des pots d’eau
stérile : bien que les gants soient vaporisés à l’alcool ceci ne garanti aucunement leur
stérilisation. La peau morte est aussi porteuse de germes ne l’oublions pas !
• Changer fréquemment la surface de travail (tous les 3 ou 4 explants) contribue aussi au
succès de la technique, particulièrement pour les débutants.
S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du
milieu et à la surface. Ce voile est quelquefois coloré (rose, jaune, orangé …). On regardera
ensuite si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, et si oui, ce sont
les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part d’un point
quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise
stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de
condensation au niveau du couvercle. Dans certains cas, rares heureusement, des spores
de certaines bactéries peuvent résister à l’autoclave; il faudra alors stériliser la verrerie à
l’eau de Javel. Lorsque l’on voit un développement de mycélium de Penicillium, cela
provient de l’air et indique une mauvaise manipulation. Les exemples de mauvaises
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Auger et al. « La culture in vitro et ses applications horticoles », technique et
documentation-Lavoisier, 1989, Paris p.61.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.38
manipulations sont nombreux : bavardage pendant le travail sous la hotte à flux laminaire,
contact des tissus végétaux avec des doigts, mauvaise stérilisation des instruments qui
portent alors les micro-organismes de l’explant infecté sur les autres.
En cours de culture, on peut ne voir apparaître aucune trace de voile bactérien, alors que
les bactéries sont présentes dans les tissus. Dans ce cas, le milieu de culture utilisé ne
permet pas le développement de la bactérie; toutefois, on peut permettre son expression
en ajoutant de la peptone à 2 g/L dans le milieu (la peptone est un constituant classique des
milieux de culture des bactéries). On fera ensuite le tri en éliminant les tubes infectés, et on
obtiendra ainsi une collection de tissus indemnes de bactéries.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.39
L’inventaire de la verrerie, du petit matériel et des plus gros équipements peut varier d’un
laboratoire à l’autre suivant sa capacité d’achat, le nombre d’utilisateurs ainsi que
l’importance que prend la micropropagation dans l’entreprise.
Le développement du laboratoire peut s’effectuer par étapes. Des acha ts minimum sont
prévus au début, les premières expérimentations sont faites avec une ou deux espèces
végétales tout au plus. Bien que la culture des espèces choisies déjà expérimentées
ailleurs, comme toute technique, elle devra être éprouvée sur place, dans l’entreprise, avec
les équipements choisis dans l’environnement (chambre àculture) prévu. La mise au point
du nouveau laboratoire demande quelques mois d’utilisation.
Le tableau qui suit présente une gamme de matériel, produits et équipements parmi
lesquels on choisi ce qui se prête le mieux à notre entreprise.
Micropropagation en entreprise – Cahier de références techniques Édition 1999 p.40
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Produits chimiques Format Quantité Fournisseur No. Catalogue Prix 1999 Utilisation
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• Adénine : Composé azoté constituant des acides nucléiques et utilisé sous forme de
sulfate dans les milieux de culture.
• Adventif : Adjectif utilisé pour décrire les racines, tiges ou autres organes qui se
développent à des endroits inusités sur la plante, par exemple, des tiges se développant
sur des racines, des feuilles ou des cals ou un embryon se développant à partir d’une
cellule autre qu’un zygote.
• Apex de tige : Méristème apical en plus des primordium foliaires sous-jacents.
• Apical, ale : Qui se porte au sommet, àl’apex, à l’extrémité.
• Aseptique : Adjectif signifiant exempt de microorganismes.
• Autoclave : Appareil permettant de faire la stérilisation avec de la vapeur sous
pression.
• Axillaire : Placé àl’aisselle d’une feuille, d’un rameau, par exemple, d’un bourgeon.
• Cal, callus : Tissu issu de la prolifération désorganisée de cellules in vivo ou in vitro.
• Chimères : Plantes dont les tissus n’ont pas tous la même composition génétique.
• Clones : Plants produits de façon asexuée à partir d’un seul plant.
• Déionisée : Dépourvue d’ions.
• Dominance apicale : Phénomène par lequel la croissance des bourgeons axillaires
est inhibée en présence d’un bourgeon apicale sur le rameau.
• EDTA : Agent chélateur, l’acide éthylenediamine tétraacétique. Prévient la
précipitation.
• Exciser : Enlever en coupant.
• Explant ou Explantat : Partie de la plante-mère utilisée pour initier une culture.
• Hormones : Composé organique (naturel) qui à faible concentration commande une
réponse physiologique chez la plante. Ex. Auxines, cytokinines, gibberellines.
• Hybride : Plante issue d’un croisement entre deux cultivars différents
habituellement par reproduction sexuée.
• Indexage : Méthode par laquelle on peut tester des plantes en regard de pathogènes
ou de contaminants.
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