CHAPITRE III : LES HORMONES VEGETALES

III-A -LES FACTEURS QUI CONTROLENT LE DEVELOPPEMENT ET LEURS INTERACTIONS : Le dveloppement dune plante ne se droule pas au hasard mais la fois de faon :

Harmonieuse Coordonne Reproductible

Harmonieuse : une plante est gnralement quilibre dans ses proportions , la taille relative des diffrents organes est proportionne le rapport surface arienne / surfaces parties souterraine demeure relativement constant. Coordonne : apparition squentielle dorganes. Une semence lors de sa germination met dabord une radicule qui pntre dans le sol et fixe la jeune plantule qui va dvelopper sa partie arienne. (les fleurs apparaissent aprs les feuilles) Reproductible : pour une espce donne, si les conditions sont identiques les dimensions de lindividu arriv maturit sont comparables, les priodes de floraison ou de fructification se retrouvent des poques comparables. Le dveloppement comprend une srie dvnements au niveau cellulaire : division, longation, diffrenciation, mort cellulaire qui sont intgrs lchelle du tissu et de lorgane via des interactions cellulaires gnrant en particulier des gradients morphogntiques. Le dveloppement se droule donc selon un plan propre chaque espce qui dans les conditions normales correspond la mise en place squentielle de programmes gntiques de dveloppement se recouvrant partiellement. Par exemple, dans la floraison les gnes didentit du mristme floral comme leafy interviennent dans la conversion mristme vgtatif mristme floral mas activent galement lactivation des gnes didentit dorganes floraux intervenant plus rapidement. Dans le cas du dveloppement vgtal lenvironnement a un poids particulier, une trs forte influence sur le dveloppement. Il sagit des contrle externes. Contrles externes Les facteurs de lenvironnement peuvent agir selon des effets que nous qualifierons de trophiques en conditionnant lintensit du mtabolisme cellulaire (T, lumire,etc), parfois selon des effets mcaniques (exemple vent). Et enfin selon une 3me catgorie deffets beaucoup plus subtile que nous appellerons effets signaux, une modification du milieu extrieur correspondant pour la plante un signal qui va influencer son dveloppement. Ces effets signaux peuvent faire intervenir les hormones comme intermdiaires ou agir aprs avoir t enregistr au niveau de la plante par des rcepteurs capable de percevoir ces signaux et de les transformer en information utilisable par la plante.

Les photorcepteurs comme le phytochrome reprsentent un exemple typique de perception de lenvironnement lumineux et de contrle de dveloppement. Les contrles internes : Ils sont directement lis la constitution gntique des individus, leur gnome qui contient une information de base (protines enzymes facteur de transcription) et une information dorganisation susceptibles de percevoir, dintgrer les signaux externes et de coordonner leurs effets. III-B-GENERALITES SUR LHORMONOLOGIE VEGETALE : III-B- a - Notion dhormone et comparaison hormones vgtales hormones animales : La notion dhormone (du grec hormao : exciter le terme fait son apparition en 1905) sapplique des substances organiques biologiquement actives et fait intervenir 3 ides essentielles : 1. activit de trs faibles concentrations (aucun rle nergtique ni nutritif) 2. synthse par lorganisme lui-mme 3. transport du site de synthse au site daction o elle influence spcifiquement des cellules cibles. Hormones vgtales : composs organiques synthtis par la plante qui de trs faibles concentrations ont une action sur le mtabolisme et le dveloppement gnralement dans des tissus diffrents du lieu de production. Les hormones vgtales comme les hormones animales sont impliques dans les communications intercellulaires. Certaines substances qui ont des effets analogues ceux des hormones mais qui ne sont pas synthtises par les vgtaux sont appeles rgulateurs de croissance. Ce sont gnralement des substances chimiques de synthse qui sont abondamment utilises en agriculture et horticulture. Ltude des hormones, messagers chimiques agissant sur le mtabolisme et le dveloppement, est trs avance chez les animaux, o on a pu montrer que :
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des structures chimiques varies jouaient le rle dhormone : strodes, peptides comme : linsuline, protines comme lhormone de croissance, drivs dacides amins (adrnaline), gaz comme le monoxyde dazote les hormones agiraient par le biais de rcepteurs membranaires ou cytosoliques la production dhormones tait souvent cyclique (cycle dovulation chez la femme, hormone de croissance produite la nuit..) les avances du gnie gntique ont conduit la production dhormones (protines) recombinantes des fins thrapeutiques : insuline, hormone de croissance, rythropotine

Les hormones vgtales tout en prsentant un certain nombre de points communs avec les hormones animales (perception, voies de transduction) sen distinguent sous diffrents aspects.
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Molcules de faibles PM < 500 li aux difficults de translocation de cellules cellules Structures chimiques gnralement diffrentes lexception des brassinostrodes voisins des strodes animaux Produites dans diffrentes rgions de lorganisme (mme si une zone de production majoritaire est frquente) et active la fois au lieu de synthse et distance. Ceci la diffrence des hormones animale, o la distinction site de production (ex : glande endocrine) et site daction est plus claire. Enfin les hormones vgtales agissent frquemment de faon additive, antagoniste, ou en synergie sur divers phnomnes physiologiques (action moins cible que les hormones animales).

Ce dernier point met laccent sur la difficult des tudes dhormonologie vgtale. Une hormone nagit gnralement pas seule sur un phnomne mais en prsence dautres hormone qui agissent dans le mme sens ou en sens contraire. III-B b- Les diffrents types dhormones vgtales : La vritable mise en vidence dune hormone vgtale remonte 1926 il sagit des travaux de WENT sur lauxine. Jusquen 1950 on considra que lauxine reprsentait la seule phytohormone mais aprs cette date dautres hormones vgtales ont t dcouvertes, dont limportance sest confirme avec les annes. Chronologiquement il sagit des gibberellines (1950), des cytokinines (1955), de lthylne (1960), de lacide abcissique (1965) et des brassinostrodes (1995). A lheure actuelle on connat donc 6 types dhormones vgtales pour lesquels on peut distinguer : Des hormones physiologique) :
-

stimulatrices

(qui

induisent

ou

stimulent

un

phnomne

Auxines Gibberellines Cytokinines Brassinostrodes pour ces hormones on observe des familles de molcules actives

En parallle on distingue des hormones effets mixtes comme

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lthylne lacide abcissique dans ce cas une seule structure active a t identifie.

Dautres molcules rle de mdiateur chimiques chez les vgtaux comme les polyamines, le jasmonate, le salicylate, les oligosaccharides nont pas encore obtenu le statut dhormone vgtale vraie.

III-B c- Mthodes dtudes des hormones vgtales et de leurs mcanismes daction : a Approches biochimiques Elles sont utilises pour le dosage des hormones, la mesure dactivit des enzymes des voies de synthse, caractrisation biochimique des rcepteurs Examen du cas particulier du dosage des hormones. Historiquement 3 mthodes ont t retenues 1. les tests biologiques sensibles, peu spcifiques parfois complexes mettre en uvre 2. les mthodes physico-chimiques sensibles et spcifiques mais demandant une instrumentation lourde (HPLC GC spectro de masse) 3. les test immunochimiques ou radioimmunoessais ultrasensibles et trs spcifiques exigeant des anticorps vis--vis des hormones et une hormone sous forme radioactive (expriences de comptition). b Approches de biologie molculaire et de gnie gntique, elles sont utiles pour la :
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Caractrisation des gnes impliqus dans les voies de biosynthse des hormones, des gnes qui rpondent lapplication dhormones (Northern blot, RT PCR, hybridation in situ) Analyse des promoteurs des gnes rpondant aux hormones : lments cis / facteurs trans Recherche de gnes par la technique de promoteur trapping Modulation des taux dhormones par gnie gntique aspects fondamentaux et appliqus, y compris lutilisation de promoteurs spcifiques

Approche gntique Caractrisation de mutants de sensibilit aux hormone de mutants de production dhormones

d Approche pharmacologique Base sur lapport de drogues, inhibiteurs y compris par microinjection pour dissquer les tapes des voies de transduction du signal hormonal. III-B d- Notion de rcepteur hormonal : La reconnaissance dun signal chimique (hormone) par une cellule et sa transformation en information utilisable ne peuvent se raliser que si la cellule contient au moins un constituant qui est capable de se lier initialement lhormone : le rcepteur doit ainsi avoir une forte affinit et une forte spcificit vis--vis de lhormone.

Les seules molcules qui prsentent assez de variations dans leur composition et leur structure pour rpondre ces exigences de spcificit sont les protines il est donc admis que les rcepteurs hormonaux sont gnralement des protines . La liaison hormone-rcepteur activerait le rcepteur de faon ce quil puisse assurer la transduction du signal hormonal. Cette activation correspond gnralement un changement de conformation qui stimule une activit enzymatique sur la molcule de rcepteur (ex : protine kinase) ou induit une capacit nouvelle dinteraction avec une autre protine. Cette premire tape est suivie dune srie dvnements molculaires, la chane de transduction, qui aboutit finalement des modifications dcisionnelles
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Transcription de nouveaux gnes Degr douverture de canaux ioniques etc

Le rcepteur (son abondance) peut se rvler un facteur limitant dans laction hormonale. On a parl dtat de comptence dun tissu selon la plus ou moins grande abondance de rcepteurs. Enfin tant donn les effets pliotropiques des hormones vgtales (effets diversifis) il a t envisag une pluralit de rcepteurs affects des effets cibles spcifiques ( ex : cas de lthylne). III-B- e- Un exemple dapproche biochimique pour la caractrisation de rcepteur hormonal : le marquage par photoaffinit Technique utilise pour la caractrisation de protines fixatrices de lacide abscissique (ABA) sur le plasmalemme des cellules de garde au niveau des stomates de Vicia Faba. Les stomates jouent le rle fondamental dans la rgulation des changes gazeux et des changes deau entre la plante et son environnement. Il sagit dun ensemble cellulaire, lappareil stomatique (cellules de garde pore stomatique souvent entour de cellules pidermiques diffrentes par leur taille et leur forme des autres cellules pidermiques voisines- les cellules subsidiaires). Ces stomates peuvent tre ouverts ou ferms et dans ce dernier cas les changes gazeux et lvapotranspiration sont alors trs rduits. Le mcanisme de fermeture des stomates repose sur une fuite dagents osmotiques au niveau des cellules de garde les faisant passer dun tat turgescent un tat moins turgescent ou semi-plasmolys dterminant ainsi le resserrement du pore stomatique. Lors du stress hydrique les stomates se ferment en rponse lABA, un stimulus hormonal, dont la concentration augmente dans les feuilles (suppos tre libr ou synthtis de novo au niveau du msophylle foliaire) et plus spcifiquement au niveau des cellules de garde. LABA entrane une fuite de K+ au niveau des cellules de garde.

Le gros problme de ltude des interactions hormone / rcepteur rside dans le caractre labile des liaisons chimiques faibles qui stablissent entre les 2 partenaires. Une approche pour rsoudre ce problme rside dans le marquage par photoaffinit. Le principe du marquage de protines, de rcepteurs par photoaffinit est le suivant : certaines molcules comportent des groupements chimiques qui par photoactivation deviennent trs ractifs et peuvent former des liaisons covalentes irrversibles. Si la molcule est par ailleurs radioactive, ou fluorescentes on peut ainsi marquer de faon stable la protine rceptrice. LABA contient un groupement ctone qui peut tre photoactiv par irradiation par des longueurs donde de 330 nm. Ceci peut fournir un moyen de marquer irrversiblement des rcepteurs protiques potentiels de lABA sans utiliser dhormones modifies. Quand lhormone naturelle ne contient pas de groupement photoactivable on peut travailler avec des drivs dhormones sur lesquels on a greff des groupements photoactivables (groupement azido dans le cas de lauxine) avec bien sr conservation de lactivit biologique. Protocole exprimental : On prpare des protoplastes dpiderme de fve en pelant les pidermes de Fve et en les mettant en contact avec des enzymes de digestion des parois ce qui libre le protoplaste entour par la membrane plasmique. Par un procd de centrifugation diffrentielle on peut mme obtenir spcifiquement des protoplastes de cellules de garde. Les protoplastes sont ensuite incubs avec de lABA triti H-cis(S)-ABA. La forme active de lABA sur la fermeture des stomates.. On irradie la suspension de manire provoquer le marquage par photoaffinit dventuels sites rcepteurs. Des contrles sont effectus 1. avec lnantiomre cis(R) ABA qui est biologiquement inactif 2. avec une protine banale lalbumine de srum de buf pour valuer la possibilit de fixations aspcifiques. Linterprtation des diffrents rsultats montre quil existe une fixation spcifique et aspcifique de lABA physiologiquement actif au niveau des protoplastes de cellules de garde. Cette fixation est moins importante au niveau des protoplastes de msophylle foliaire. La fixation de lhormone radioactive sur son site de fixation obit une cintique de saturation et peut tre dplace par de lhormone froide non radioactive de faon trs spcifique (isomre physiologiquement actif seul efficace pour le dplacement). Des traitements mnags des protoplastes des cellules de garde par une protase, la trypsine supprime compltement la fixation de lABA en conservant lintgrit du protoplaste. Les sites de fixation seraient donc des protines. Ces expriences ne dmontrent cependant pas le caractre fonctionnel du rcepteur, la protine ayant lie lABA pouvant tre un transporteur ou une enzyme de dgradation.

III-B- f- Un exemple dapproche gntique pour la caractrisation de rcepteur hormonal : le cas des rcepteurs de lthylne Le rcepteur de lthylne est un des rcepteurs les mieux caractriss au plan molculaire et gntique. Sa caractrisation repose sur ltude de mutants de sensibilit lthylne dont le mutant ETR1 dArabidopsis qui ne prsente plus le phnomne de triple rponse lors dapplication dthylne. Le clonage positionnel du gne mut et lanalyse du produit du gne a montr une analogie marque avec une famille de protines senseurs de lenvironnement chez les bactries : les systmes deux composantes constitus dun domaine de perception du signal et de transmission du signal : une histidine Kinase et dun domaine receveur : le rgulateur de rponse. La perception du signal entrane gnralement une autophosphorylation dans un domaine conserv de lhistidine Kinase la phosphate tant ensuite transfr un rsidu aspartate du receveur. Ce type de systme double composante se retrouve chez les bactries dans la perception de la lumire, de loxygne et chez les plantes a t aussi impliqu dans la rponse la lumire et aux cytokinines. Dans ces diffrents exemples on retrouve le domaine conserv des histidines Kinases HNGFG. Dautres caractristiques communes entre le gne ETR1 et des gnes bactriens suggre une origine volutive partir des bactries. Le gne ETR 1 a t exprim dans des levures ce qui leur confre laptitude fixer lthylne. Il sagit donc bien dun rcepteur dthylne car on associe ici les preuves gntiques et biochimiques. Un ion cuivre est ncessaire pour la fixation de lthylne sur le rcepteur dArabidopsis et le cuivre est co-purifi avec la protine rcepteur. Une cystine en position 65 est par ailleurs indispensable pour linteraction entre le cuivre et la protine. Au total le rcepteur qui est un dimre interagit avec lthylne ce qui rsulte en un changement conformationnel de site de liaison propag en suite au domaine transmetteur. Par analyse du gnome, plusieurs gnes ETR ont t caractriss chez Arabidopsis (au moins une famille de 5 membres) qui comprennent des domaines communs mais aussi des spcificits. Ceci permet de les classer en 2 sous familles ETR1 et ERS1 qui ont en commun le domaine conserv de lhistidine Kinase, ETR2, EIN4, ERS2 qui ne lont pas. Ces diffrents gnes pourraient coder des rcepteurs affects des rponses spcifiques ou des tissus spcifiques. Il faut noter cependant quil nexiste quune redondance fonctionnelle partielle entre les diffrents gnes de rcepteurs car les mutants insensibles lthylne au niveau de la triple rponse nauraient pu sinon tre obtenus.

III C- LACIDE INDOLACETIQUE ET LES AUXINES Rappelons tout dabord les tapes essentielles dans la connaissance de lAIA. Darwin Went 1880 observation du phototropisme chez les coloptiles de gramines excitation perue au sommet et transmise vers la base 1926 rcupration par diffusion dune substance active sur la croissance appele auxine, dauxein = crotre. Mise au point dun test biologique permettant dapprcier les teneurs en substance active 1934 identification chimique de lauxine lacide indolactique (isol initialement partir durine humaine) puis caractrisation de cette structure dans les tissus vgtaux (Zea mays) par Haagen Smith en 1942 recensement des diffrentes rponses des plantes laction de lAIA. Caractrisation de substances naturelles ou synthtiques action auxinique. tudes sur le mode daction de lAIA au niveau molculaire en particulier dans le phnomne de grandissement cellulaire dveloppement des substances action auxinique en agriculture. 1990-2005 perception / transduction du message auxinique. Exploitation de la gnomique et de mutants pour la comprhension de la production et des mcanismes daction de lAIA. III C a- Nature chimique des auxines : Nous utilisons le terme auxine au pluriel car au-del de lidentification chimique de lacide indolactique dautres substances se sont rvles actives sur les tests biologiques initialement dfinis pour quantifier lAIA. Ces tests ne sont pas en fait absolument spcifiques de lAIA mais dune famille de compos action biologique commune : les auxines. Auxines naturelles : il sagit de structure noyau indole trs voisine de lAIA. Il faut cependant noter que la plupart de ces substances sont impliques dans les voies de synthse de lAIA, en tant quintermdiaires, et il nest pas clairement tabli si elles ont une action auxinique par elles mmes ou si leur effet rsulte de leur conversion rapide en AIA lors du test biologique (effet de prcurseurs). Dautres substances non indoliques comme lacide phnylactique ont une action auxinique cependant plus faible, mme concentration, que lAIA. Auxines de synthse : il sagit de molcules qui miment les effets des auxines naturelles. Ce sont gnralement des structures de type indolique ou bien :

Kgl

1925-1970

1970-1990

de type phnoxycarboxylique de type naphtalne actique de type benzoque Les plus connues de ces molcules sont le NAA et le 2-4 dichlorophnoxyactique qui de fortes concentrations sont utilises comme herbicide (effet hyperauxinique toxique car la molcule qui nest pas dgrade saccumule). Des tudes importantes ont t ralises dans une optique relation structure-fonction pour dgager des points communs entre toutes ces structures actives. La plupart de ces molcules ont un noyau insatur et un groupement carboxylique. Une thorie intressante a t propose par Thimann (1969). Elle fait apparatre des analogies marques dans la rpartition des charges dans lespace (charge positive 5,5 de la charge ngative porte par le carboxyle). Ces observations suggrent la fixation de lhormone sur un rcepteur selon un processus de complmentarit de charges. Par exemple la charge positive de lazote de lindole et la charge ngative du carboxyle dans le cas lAIA seraient associes deux sites de charges complmentaires sur le rcepteur. La spcificit de la reconnaissance est confirme par le fait que de lgres modifications dune molcule peuvent supprimer son activit, le 2-4 D est actif mais le 2-6 D est inactif. Par ailleurs des molcules structures proches des auxines inhibent comptitivement lauxine. Ce sont des anti-auxines : exemple 2-4-6 trichlorophnoxyactique. Ces substances occuperaient les sites rcepteurs de lAIA ou un site particulier du rcepteur sans induire la suite des vnements et la chane de transduction du signal auxine. III C- b- Rpartition et volution dans la plante : Initialement caractrise dans les coloptiles de gramines, lAIA et les autres auxines semblent prsentes chez toutes les plantes vasculaires. Chez les formes vgtales infrieures (Bryophytes, algues, champignons) la rpartition et laction biologique sont trs limites. LAIA est galement produit par les bactries Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae mais par des voies de synthse diffrentes. Le rle de la molcule pour la bactrie nest pas clair mais elle intervient dans linteraction plante/bactrie. Chez les plantes les sites de synthse maximum sont souvent les sites daccumulation (apex, jeunes feuilles) mais il faut aussi noter comme nous le verrons plus loin que lAIA un transport polaris qui conduit sa migration de lapex vers la base. Dune manire gnrale les racines sont plus pauvres en auxine que les parties ariennes (les concentrations dans les tissus vgtaux varient de 10 300 g/kg matriel frais). La fig. ( ) donne une volution des teneurs en diffrentes auxines dans les diffrents rangs foliaires de plantes de tabac la suite dune sparation des molcules par chromatographie en phase gazeuse. IIIC- c- Facteurs intervenants dans la rgulation du taux dauxine Biosynthse Dgradation Transport Inactivation : Lauxine comme les autres hormones doit pour jouer son rle de messager chimique ne pas demeurer une concentration constante dans les tissus mais voir ses teneurs fluctuer. Cest la vague auxinique qui va dterminer une rponse dans le temps, adapte au contexte de morphogense et de la diffrenciation.

Le taux dauxine active dans un tissu qui va contrler lintensit des rponses physiologiques, en parallle avec la sensibilit de ce tissu lauxine peut tre potentiellement rgul par diffrents facteurs qui relvent du mtabolisme de lauxine ou de son transport. + + + + + Biosynthse Dgradation Inactivation rversible Transport Compartimentation

Ces mcanismes qui sont particulirement bien connus dans le cas de l AIA peuvent intervenir pour lensemble des hormones nous les tudierons particulirement dans le cas de lAIA. Biosynthse : Le tryptophane est un prcurseur de lAIA ceci a t clairement dmontr par des expriences dapport de tryptophane marqu dans le cas de plantes obtenues en conditions striles (pour viter des effets de contamination bactrienne). Cependant selon les vgtaux les voies de conversion du tryptophane en AIA diffrent et on a pu identifier au moins 3 squences principales de conversion. La voie de lindoleactonitrile La voie de la tryptamine La voie de lacide indole pyruvique On na pas jusqu prsent caractris de mutants dficients en AIA (mutants de synthse) soit parce que la dficience est lthale soit parce que lAIA est synthtis par plusieurs routes. Effectivement en dehors des voies passant par le tryptophane il existerait une (des) voie(s) ne faisant pas intervenir cet acide amin. Ainsi le mutant orp de mas (pour orange pricarpe) comporte une mutation dans la voie de synthse du tryptophane. Les graines germent mais les plantules meurent aprs le stade 4 feuilles si il ny a pas de supplmentation en tryptophane. Or ces plantules contiennent de lAIA. Le prcurseur serait dans ce cas un driv indolique antrieur au tryptophane. Pour un mme plante la contribution des voies dpendante ou indpendante du tryptophane pourrait varier en fonction du dveloppement (ex : chez Arabidopsis). Le transport : Transport polaris de lAIA : (Rubery Raven Goldsmith) En effet il sagit dun transport polaris de lapex vers la base. Des expriences simples qui sont reprsentes sur le schma ( ) ont permis de confirmer ce phnomne. Ce transport est donc suppose tre unidirectionnel. Par ailleurs il sagit dun transport actif de cellules cellules stimul par lATP, dpendant de la T, de la prsence dO2 et sensible aux inhibiteurs mtaboliques (cyanure, azide de sodium). La vitesse de transport est de 10 20 mm/heure.

La polarit diminue mesure que lon sloigne de lapex et au niveau des racines les rsultats obtenus sont contradictoires. Ce transport de lauxine qui conduit lauxine des sites de synthse principaux : les apex, vers le reste de la plante peut tre artificiellement perturb par des analogues dauxine du type TIBA : acide triiodo-benzoque (inhibiteur) ou des composs fluorne (morphactines) qui entranent des morphologies anormales. Raccourcissement des tiges Ramification dsordonne des rameaux Nanisme

La thorie propose pour le transport polaris est appele thorie chimiosmotique de la diffusion polaire. Cette thorie implique que la cellule vgtale dpense de lnergie pour maintenir un gradient de pH de part et dautre du plasmalemme de telle manire que lespace parital est acide par rapport lintrieur de la cellule. Ce sont des ATPases qui expulsent les protons vers la paroi. Puisque les membranes sont plus permables aux molcules non ionises lauxine sous sa forme non dissocie pntre facilement de la paroi vers le cytoplasme par simple diffusion. Une fois dans le cytoplasme la plupart de ces molcules se dissocient en raison du pH cytoplasmique plus lev et ce phnomne permet une accumulation de lauxine dans le cytoplasme par dplacement de lquilibre, la membrane tant relativement impermable la forme ionise. La thorie implique en outre que la portion basale du plasmalemme est plus permable lanion auxine ou possde une plus grande proportion de transporteurs defflux que la partie apicale. En fonction de ces diffrents lments on peut concevoir le transport polaris de lAIA. Il a t effectivement localis par des techniques dimmunofluorescence, un transporteur dauxine la partie basale de parenchyme de tiges de pois. Les gnes codant le transporteur defflux, les gnes PIN sont au nombre de 8 chez Arabidopsis thaliana. Des travaux rcents ont remis en cause le dogme du transfert unidirectionnel de lauxine. Ainsi a t dmontr un changement de localisation de certains gnes PIN au cours du dveloppement et le rle de ces gnes dans ltablissement dun axe apico-basal lors de lembryognse : Nature 13 novembre 2003 Vol 426 p 147 Friml et al. La mise en place de cet axe est commune aux plantes et aux animaux. La premire tape chez les plantes consiste en la division du zygote en deux cellules distinctes. Chez Arabidopsis par exemple la cellule apicale est plus petite que la cellule basale. La cellule apicale se divise ensuite verticalement et la cellule basale continue se diviser horizontalement pour produire le suspenseur. Il a t montr que dans les premiers stades la cellule basale transporte lauxine et que la cellule apicale rpond lauxine. Cette complmentarit est lie lintervention dune protine implique dans lefflux de lauxine lapex de la cellule basale : PIN 7.

PIN 7 est localis par immunoraction dans la cellule basale immdiatement aprs la division du zygote dans le systme endomembranaire et sur la membrane plasmatique linterface avec la cellule apicale. Jusquau stade 32 cellules PIN 7 continue tre localis au sommet du suspenseur linterface avec lembryon en dveloppement. Aprs le stade 32 cellules la localisation asymtrique de PIN 7 volue se dplaant vers la partie basale des cellules du suspenseur. Il existe un redondance entre les diffrents gnes PIN et des mutants simples naboutissent pas 1 phnotype particulier, en revanche des quadruples mutants (pin1, pin3, pin4, pin7) montrent des dfauts profonds dans ltablissement dune polarit apico-basale. Ces rsultats montrent : Le polymorphisme gnique des gnes PIN Leur redistribution spatiale / polarise au cours du dveloppement prcoce de lembryon Leur rle dans la cration de gradients dauxine important pour la cration dun ple apico-basal et pour la morphogense. Inactivation : LAIA peut tre converti en formes conjugues inactives par associations avec des mtabolites prsents dans les cellules. ac. amins oses - liaisons peptidiques ex : indolyl aspartate - liaisons esters ex : indolyl glucose indolyl inositol

Ces formes conjugues peuvent tre mise en vidence la suite de lapport dAIA radioactif une plante : 50 % de lAIA est parfois retrouv sous forme conjugue aprs 3 heures. On peut galement montrer par identification et dosage que lAIA conjugu reprsente 50 90 % de lAIA total (dans les feuilles de pois de 2 semaines). Ces formes conjugues sont souvent prsentes des concentrations suprieures aux formes libres et elles sont trs rpandues dans les graines, o elles semblent participer la libration dAIA libre (par hydrolyse de liaisons esters alors que les liaisons peptidiques sont stables). Ainsi chez les semences de mas les formes conjugues diminuent lors de la germination alors que lAIA libre augmente, on caractrise la prsence dune enzyme qui hydrolyse lAIA inositol. Ces formes conjugues peuvent contribuer maintenir une certaine homostasie des teneurs en AIA. Ainsi chez les mutants tryp 5-1 chez Arabidopsis lanthramilate synthase est insensible au tryptophane son effecteur allostrique normal. On observe ainsi une forte augmentation des teneurs en tryptophane mais une stabilit de lAIA libre avec une augmentation des teneurs en AIA conjugues.

La dgradation de lauxine : LAIA peut tre dgrad par des oxydase de type proxydase (lAIA oxydase) selon cependant un mcanisme atypique des proxydases ne consommant pas dH2O2. Les produits de dgradation correspondent une voie catabolique sans dcarboxylation produisant de l acide oxindole 3-actique ou une voie catabolique avec dcarboxylation : dans ce cas le mthylne oxindole et lindolaldhyde sont les produits caractristiques. Les tissus gs sont gnralement riches en AIA oxydase ainsi que les racines, ce qui contribue un faible taux dAIA libre dans ces organes. Le catabolisme auxinique bien tudi dans les annes 1950 1980 est actuellement peu abord dans les recherches. IIIC- d- Diversit des effets biologiques. Exemple particulier de la croissance des fruits : Nous avons dis prcdemment quune mme hormone avait des effets multiples sur le dveloppement des plantes. On parle deffets pliotropiques. Ces rponses multiples dpendent du tissu tudi, du stade de dveloppement et correspondent ce que nous avons appel un certain tat de comptence des tissus li la proportion de rcepteurs et leur nature. Les effets pliotropiques pourraient compenser le faible nombre de messagers hormonaux chez les plantes (6) en comparaison avec les systmes animaux (40). Ceci sous toute rserve, tant donn la complexit suprieure des animaux au plan fonctionnel. Ces effets multiples sont mis en vidence par : Apport dhormones exogne sur les tissus Par ltude de corrlations entre laccumulation dhormones dans lespace et le temps et les rponses physiologiques observes. Cette multiplicit daction est particulirement bien illustre dans le cas de lauxine qui intervient sur : Division Elongation Diffrenciation cambium action typique sur les coloptiles action rhyzogne classique en interaction avec les cytokinines

Leffet sur le grandissement cellulaire est classique. Il est noter : 1. que gnralement lauxine est sans effet lorsquon lapporte sur des apex de plantes intactes. La plante disposant alors de ses centres producteurs dauxines aurait une concentration optimale et un apport exogne est sans influence. En revanche lauxine est active sur les tiges dont les apex ont t dcapits ou sur des parties isoles dorganes. 2. que la sensibilit des diffrents organes varie considrablement tiges 10 M

racines 10 M Au-del de ces concentrations, lauxine exerce un effet inhibiteur sur la croissance effet hyperauxinique. Lauxine intervient dans des phnomnes plus complexes lchelle de la plante entire faisant intervenir des interactions entre diffrentes hormones et dont nous reparlerons : rle dans la dominance apicale, labscission ou le retard de snescence. Nous dtaillerons ici le problme de la croissance des fruits. La formation des fruits correspond chez le vgtal une priode de croissance souvent rapide par division et longation cellulaire. Dune manire gnrale les fruits rsultent de la croissance des parois de lovaire de la fleur ou du rceptacle floral qui se produit ds la pollinisation et se poursuit la fcondation et pendant la formation des graines (lovaire est une partie de la fleur femelle qui renferme les ovules o se produira la double fcondation conduisant lembryon et au tissu de rserve). Nous avons dit que la croissance du fruit pouvait commencer ds la pollinisation, ceci se produit par exemple chez lOrchide et chez cette espce on a pu montrer que des extraits de pollen pouvaient dterminer la croissance des parois de lovaire. Ces extraits contenaient de lAIA et le pollen est ainsi une source dauxine. Dune manire plus gnrale, il semble donc trs probable que ce soit lAIA qui, produit par le pollen ou les graines en formation, soit responsable de la croissance du fruit. Si on limine les graine de certains fruits en formation (fraise) on arrte la croissance du fruit. Par ailleurs, on a pu galement montrer que lembryon et lalbumen tissu de rserve de la graine produisaient de lAIA au cours de leur formation. On peut ainsi observer lobtention de fruits sans pollinisation ni fcondation par simple application dAIA sur la fleur femelle (Tomates, Figue), on obtient alors des fruits sans graines : parthnocarpiques. On peut galement citer les expriences de NITSCH sur la Fraise ou les aknes sont la source dauxine, leur ablation sur le jeune fruit empche son dveloppement normal. La forme du fruit peut ainsi tre affecte par llimination spcifique de certains aknes mais laddition dauxine peut remplacer les aknes manquants. La production naturelle de fruits sans ppins (agrumes) correspond dautres situations ou certains mutants ont t slectionns. IIIC- e- Mcanismes daction dans le phnomne de grandissement cellulaire : Avant daborder ltude dun mcanisme daction de lauxine dans le grandissement cellulaire, rappelons les conditions du grandissement cellulaire. Ce grandissement est conditionn par une entre deau dans la cellule. Ainsi quatre types dvnements se produisent chronologiquement au niveau de la paroi lors de la croissance de la cellule. 1. 2. 3. 4. accroissement des proprits dextensibilit de la paroi entre deau rsultant de la diminution de la pression de turgescence extension des parois et grandissement de la cellule synthse de nouveaux lments des parois.

Les mouvements de rentre deau dans la cellule qui se font par osmose sont conditionns par la concentration saline du contenu cellulaire (pression osmotique). Mais la cellule est entoure par un cadre rigide la paroi qui va lors de lentre deau opposer une rsistance (pression de turgescence). Lattraction relle que subissent les molcules deau va donc tre gale la diffrence entre pression osmotique et pression de turgescence. Pression de succion = Pression osmotique pression de turgescence. Il apparat donc quun lment dterminant dans lentre deau peut tre la diminution de la pression de turgescence, rsultat de laccroissement des proprits dextensibilit des parois. De nombreux arguments sont en faveur dun rle de lauxine sur le grandissement cellulaire via une action sur lextensibilit de la paroi. Les facteurs intervenants dans le relchement parital : 1. rle du pH Les mcanismes de modification de la structure paritales au cours de llongation ont t tudis sur des fragments dpicotyles, hypocotyles ou coloptiles, organes dont la croissance est due uniquement de llongation cellulaire (Figure). Placs dans une solution additionne dauxine, ces organes subissent une longation plus importante. Les tudes des facteurs capables de remanier les parois ont montr que llongation de coloptiles sous contrle de lauxine tait associe une acidification du milieu dans lequel tait effectue lexprience. Il a ensuite t observ que la mme longation tait obtenue par lincubation des coloptiles dans une solution acide. Rayle et coll. ont alors propos que les chantillons traits lauxine acidifient leur parois et que cette acidification (pH=5,5) pourrait permettre lactivation denzymes capables de remanier la paroi (Rayle and Cleland, 1992). Cest lhypothse de la croissance acide. Des expriences complmentaires de mesure de potentiels lectriques sur des protoplastes traits par une auxine (NAA) ont permis de montrer une hyperpolarisation des protoplastes lis une excrtion de protons en dehors de la membrane plasmique et une inhibition de cette hyperpolarisation par des anticorps anti-ATPase. Ces rsultats suggrent fortement que lauxine augmenterait lactivit ATP-ase via une action sur la transcription, la traduction ou le transport de la protine vers la membrane plasmatique. Comment lacidification agit-elle sur lextensibilit de la paroi ? Sans rappeler la structure et la composition chimique de la paroi en dtail on peut prciser que la paroi I est un composite form de plusieurs polymres associs par diffrents types de liaison cellulose hmicellulose matires pectiques protines

Ce sont surtout les interactions entre cellulose et hmicelluloses (2 composants majeurs) par lintermdiaire de liaisons H qui ont t considrs. Ces liaisons H stabilisent le composite et leur suppression le fragilise en le rendant plus mallable, plus extensible. 3 modes daction de lacidification sur lextensibilit de la paroi ont t envisags : 1. Hypothse dune action chimique dune concentration accrue de H sur la rupture de liaisons hydrognes Hypothse peu confirme par lexprimentation. 2. Hypothse de loptimisation en milieu acide de lactivit denzymes de dgradation des polysaccharides type glucanases. Certains arguments plaident en faveur de leur intervention = blocage de lexpansion par des anticorps antiglucanases, lauxine induit par ailleurs certains glucanases (chez la tomate). 3. Hypothse de lintervention dautres protines. 2. Rle des expansines : La paroi contient de nombreuses enzymes hydrolytiques (actives sur les polysaccharides, Fry, 1995) : glycosylhydrolases catalysant soit des hydrolyses au milieu des chanes (endoglycosylases comme les -,4- endoglucanases) ou leur extrmits (exoglycosylases comme les xylosidases). Par ailleurs, des transglycosylases spcifiques des xyloglucanes (xyloglucane transglycosylases hydrolases ou XTH, anciennement XET, voir 3) ont t identifies. Nanmoins, aucune de ces enzymes napparat plus active pH acide, et aucune ninduit une longation in vitro quel que soit le pH. Par contre, la purification dextraits paritaux dhydrocotyle de concombre a permis didentifier des protines, appeles Ex29 et Ex30 pour expansines, sans activit catalytique dtectable, capables dinduire une importante longation cellulaire pH acide (McQueen-Mason et al., 1992). Le clonage des gnes correspondant a conduit lidentification dune famille multignique subdivise en expansines et expansines conserves chez les Dicotyldones et les Monocotyldones (Cosgrove, 1999). Rcemment, grce au squenage complet du gnome dArabidopsis thaliana, une nouvelle classe est galement distingue : les expansines ou expansin-like proteins (Li et al., 2002). Lensemble des expansines comporte, dune part une domaine similaire au domaine catalytique dendoglucanases mais sans acides amins catalytiques, dautre par un domaine similaire aux CDB (Cellulose Binding Domains) de cellulases microbiennes (Figure). Les expansines forment une famille de 38 gnes chez Arabidopsis thaliana (www.bio.psu.edu/expansins/). Elles sont largement exprimes dans tous les organes, et en particulier dans les tissus en longation (Cosgrove, 1999 ; Cosgrove, 2000 ; Li et al., 2002). On peut noter en particulier diffrentes observations en faveur de leur rle majeur dans le relchement parital (revue par Cosgrove, 2000) : en particulier : les expansines Ex29 et Ex30 ne sont prsentes que dans des zones en longation de lhypocotyle. 3. Rle des XTH (ou xyloglucanes transglycosylases hydrolases) : Malgr leur incapacit induire in vitro un relchement parital plusieurs enzymes hydrolytiques sont exprimes spcifiquement dans les tissus en expansion.

Les XTH peuvent couper une molcule de xyloglucane et rattacher un des fragments sur une seconde molcule. Dans certains cas le transfert peut avoir lieu sur une molcule deau rsultant en un clivage simple comme celui ralis par une endoglucanase. Les XTH sont exprims dans des tissus en longation et induites par des traitements inducteurs de llongation (auxine). Par ailleurs, des fragments courts de xyloglucane (oligosaccharides) induisent une longation cellulaire mais les longs fragments linhibent. Les rsultats suggrent que le mtabolisme des xyloglucanes contrle llongation. 33 gnes de XTH ont t identifies chez Arabidopsis associs des profils dexpression tissus spcifiques mais aussi des spcificits de substrats. 4. Rle des endoglucanases : Elles sont incapable dinduire llongation in vitro mais des arguments plaident en faveur de leur intervention comme linduction par IAA de la glucanase CEL 7 chez la Tomate. IIIC- f- Les rcepteurs dauxine : Des protines de liaisons (Auxin binding proteins : ABP) pour lauxine ont t caractriss initialement par des techniques chimiques du type photoaffinit. Les expriences ont conduit la caractrisation danticorps vis--vis de ces protines et lidentification de gnes correspondants. Une difficult dinterprtation a port sur la localisation majoritaire dABP sur le reticulum endoplasmique, seule une faible proportion dABP tant situ au niveau de la membrane plasmique (en contradiction avec la localisation thorique des rcepteurs sur la M. P. et sur leffet biologique dauxines non permantes). La protine est un dimre de 44 Kd correspondant 2 sous-units de 22 Kd. Son rle fonctionnel est dmontr par quatre types darguments : 1. Lapport dABP1 de mas purifi des protoplastes de tabac, augmente la rponse dhyperpolarisation en prsence de NAA 2. Au contraire lapport danticorps ABP supprime cette rponse 3. Un mutant dinsertion dans le gne ABP1 a t identifi chez Arabidopsis thaliana. A ltat dhomozygote le mutant meurt dans la phase globulaire de lembryognse dmontrant le caractre essentiel de ce gne. 4. La surexpression du gne ABP1 chez le tabac (associ un promoteur inductible par la ttracycline) amplifie certaines rponses lAIA. Ces diffrents rsultats ne prjugent pas de lexistence dautres rcepteurs au-del dABP1. IIIC- g- Lauxine et le contrle de lexpression des gnes : Limpact de lauxine sur le grandissement cellulaire via une acidification de la paroi nest quune des rponses biologiques lAIA. Cette action biochimique sur une ATPase

saccompagne par ailleurs dun effet positif sur lexpression de gnes dans le cas du grandissement cellulaire ou dautres phnomnes. En clair, lapport dAIA entrane laugmentation dexpression dun grand nombre de gnes (le plus souvent dans le sens dune surexpression). Bien quon connaisse mal la chane de transduction du signal auxine on a approfondi au cours des dernires annes certains des mcanismes impliqus au niveau du contrle de la transcription par lAIA. Les promoteurs des gnes sensibles lAIA possdent en commun des squences (simples ou composites) communes qualifies dauxine responsive lments AUX-RE. Cette situation est exprimentalement dmontre par des expriences de dltion du promoteur ou par un couplage dun promoteur minimum contenant ces lments avec le gne GUS, qui est ainsi exprim et rponse lAIA. Cette prsence de squences spcifiques dans les promoteurs des gnes dont lexpression est contrle par les hormones est gnrale pour lensemble des hormones.

Au-del, des facteurs de transcription capables de reconnatre les squences AUX-RE ont t caractriss : les ARF1 (auxine response factor) et 23 gnes ARF1 ont t caractriss chez A. thaliana (pour des protines de 67 129 Kd). Cette multiplicit de facteur de transcription qui peut correspondre des voies de transduction spcifiques se complique encore par lintervention dune autre classe de gnes la famille AUX/AIA pour laquelle on a dmontr lexistence de 25 gnes. Ces gnes rpondent trs rapidement lauxine et comportent dans leur squence des lments trs comparables la squence de gnes ARF1 (dans la partie C terminale). Cette identit de domaine (domaine III et IV) facilite linteraction des protines AUX/AIA et ARF1 et cette liaison avec ARF1 module sa capacit dactivation de la transcription. Les protines AUX/AIA ont des demi-vies trs courtes de 8 10 minutes et leur dgradation contrle par le systme protasome ubiquitine dpendant est stimule par lAIA. Une complexit du systme rside dans le fait que selon les situations le complexe AUX/AIA/ARF1 stimule ou inhibe la transcription (le cas plus frquent est linhibition). Des mutants manquant de certains facteurs ARF prsentent des anomalies de dveloppement ainsi que certains mutants des gnes AUX/AIA. Rcemment un travail sur la tomate impliquant la sous expression selon la stratgie anti-sens dun gne AUX/AIA, le gne DR4, a montr lapparition de phnotypes caractristiques dune hyperauxinie telle que par exemple lapparition de fruits parthnocarpiques, AUX/AIA serait dans ce cas un rgulateur ngatif et dune manire gnrale le systme AUX/AIA pourrait reprsenter un systme de rtrocontrle par lAIA des phnomnes induits par lAIA (empchant que la machine semballe ). On a ici une dmonstration de la complexit des facteurs qui interviennent dans la rgulation de la nature et de lintensit des mcanismes transcriptionnels contrls par lAIA. Spcificit des gnes et protines ARF1 et AUX/AIA. Teneurs en protines ARF1 et AUX/AIA.

Dans le cas des gnes AUX/AIA la teneur en protines correspondantes rsulte la fois de lintensit de la transcription et de la vitesse de dgradation, toutes deux contrles par lAIA.

IIID- LES GIBBERELLINES : Les gibbrellines constituent un deuxime groupe de substances de croissance qui paraissent actuellement avoir une importance peut tre aussi grande que les auxines dans le dveloppement de la plante. Si les premires observations relatives la dcouverte de lauxine taient lies une rponse physiologique normale de la plante (les tropismes), les gibbrellines ont t mises en vidence la suite de lobservation dun fonctionnement pathologique. Elles ont en effet t caractrises la suite de ltude dune maladie du riz. IIID a Historique Dcouverte : Ds le dbut du sicle, des fermiers japonais avaient constat que certains plants de riz taient atteints de gigantisme. Ces plants cependant ne fructifiaient pas et ne prsentaient donc pas dintrt pour la production. Il fut tabli que cette anomalie dans la croissance rsultait de linfection par un Ascomycte parasite appel Gibberella fujikuroi (KUROSAWA, 1926) ou Fusarium moniliforme quand le champignon est cultiv in vitro = un extrait de son milieu de culture provoque les mmes symptmes dlongation, et vers 1938 on arriva isoler de ces milieux de culture un mlange de substances actives appeles gibbrellines. Ces travaux ne furent pendant longtemps connus quau Japon et ce nest quaprs la deuxime guerre mondiale que des recherches furent entreprises dans le monde occidental. Vers 1956, partir dune souche de Gibberella ne produisant quune seule gibbrelline on put isoler et caractriser chimiquement lacide gibbrellique ou GA3 (travaux de CROSS). Pendant ce temps, les physiologistes dmontraient les effets spectaculaires des gibbrellines isoles des filtrats de cultures de champignons sur la croissance de vgtaux ( trs faibles doses ces substances stimulent en particulier la croissance des espces naines : haricot, pois, mas) qui sont souvent des mutants de production de GA. Une dose de 0,1 g par plant permet de doubler la hauteur de pois nains. Paralllement on dmontrait la prsence des gibbrellines dans les tissus vgtaux (non infects) (PHINNEY et WEST en 1956 chez le concombre). Avec la mise en vidence de la rpartition gnrale des gibbrellines il apparaissait donc que lon tait en prsence dun nouveau groupe dhormones vgtales. IIID b-Nature Chimique et Diversit des Gibbrellines Naturelles : Nous avons parl de ces substances au pluriel car la caractrisation de la premire gibbrelline GA3 a t suivie de la mise en vidence de nombreuses autres gibbrellines dans les tissus vgtaux puisquon connat plus dune centaine de gibbrellines (130) lheure actuelle caractrises chez les vgtaux suprieurs et les champignons (certaines tant prsentes dans les deux sources). Ces diffrentes structures possdent en commun un squelette carbon le squelette gibbane qui constitue un systme de cycles pratiquement unique dans la chimie des substances naturelles. Les substituants carbons ports en 7 et 9a du noyau C tant runis par une liaison pour donner un 4me cycle. Dfinition des gibbrellines : Substances synthtises par les plantes possdant le squelette gibbane et actives vis--vis de tests biologiques spcifiques tels que la croissance de mutants nains (Mas) ou la production damylase par des albumens dorge.

Les diffrentes gibbrellines se diffrencient par : Le nombre total datomes de carbone (gibbrellines en C19, ex : GA3 et en C20, ex : GA18). La prsence ou non de doubles liaisons Le nombre de carboxyles Le nombre et la position des substituants (OH ou CH3 en particulier). Diffrentes remarques propos de cette multiplicit de gibbrellines naturelles : La progression dans le nombre des gibbrellines connues est lie lutilisation des techniques trs efficaces de chromatographie en phase gazeuse associe la spectromtrie de masse (ce qui permet la fois sparation et analyse de la structure des molcules). Les gibbrellines sont affectes dun nombre qui correspond la chronologie de leur dcouverte (exception GA3, la premire mise en vidence). Un mme vgtal ne contient au maximum que 8 10 formes diffrentes (nous verrons lexemple du mas). Ces diffrentes formes ont des activits diffrentes vis--vis des tests biologiques ou mme peuvent tre inactives. GA3, GA4, GA7, GA14 ont le plus grand spectre dactivit. Cette diversit de structures actives pose un problme au niveau de la finalit. Sagit-il de substances hormonales voisines mais plus particulirement affectes une fonction particulire ? ou dintermdiaires dans la synthse dune seule forme active. Lexemple du mas permet de conclure en retenant la 2me hypothse. Chez le mas 8 gibbrellines ont t identifies GA53, GA44, GA20, GA29, GA19, GA17, GA1, GA8. Chez cette espce o de trs nombreux mutants sont disponibles diffrents mutants nains ont t tudis en particulier d1 et d5 (d pour dwarf) dont nous verrons les caractristiques aprs la description de la voie de biosynthse des gibbrellines.

Pour conclure propos de cette diversit il faut noter que lon retrouve cette pluralit de structures pour les hormones strodes chez les vertbrs qui prsentent par ailleurs des analogies de structure avec les gibbrellines. Sur un plan pratique des mlanges commerciaux de GA4 et GA7 sont produits partir de cultures de Gibbrella fugikuroi. IIID c Biosynthse et Mtabolisme des Gibberellines : Alors que les gibbrellines ont une structure assez complexe on a une bonne ide de leurs voies de synthse. Travaux initiaux de WEST (1965-1970) aux USA. Les gibbrellines appartiennent au groupe des terpnodes composs rsultant de la condensation dunits isoprne elles-mmes provenant dunits actate. Actate isoprne terpnes (mono sesqui diterpnes)

Appartiennent ce groupe une autre hormone vgtale lacide abcissique et des constituants vgtaux importants comme les strols vgtaux, les carotnodes, le caoutchouc polymre de milliers dunits isoprnes.

Sur un premier schma o est reprsent une voie de biosynthse simplifie des gibbrellines vous pouvez voir : lorigine mtabolique de diffrents terpnes, le niveau dintervention de certaines substances (rgulateurs de croissance) comme lAMO16-18 ou le CCC qui sont des antigibbrellines car elles bloquent la synthse des gibbrellines (ce sont des retardants de croissance). Sur un deuxime schma plus complet on peut voir que la voie de biosynthse des gibbrellines se droule 3 niveaux localisation subcellulaire distincte : chloroplaste, rticulum endoplasmique, cytoplasme. Toutes les enzymes de la voie de synthse ont t caractrises ainsi que la plupart des gnes correspondants. Certaine de ces enzymes sont multifonctionnelles (elles catalysent plusieurs ractions squentielles sur la chane) et certaines sont codes par de petites familles multigniques dont les membres sont rguls indpendamment par des facteurs endognes ou exognes (stade de dveloppement, lumire, hormones). Voir figure. La copalyl phosphate synthase est trs fortement exprime dans les tissus en croissance. La kaurne synthase est la premire tape spcifique de la synthse des gibbrellines il sagit vraisemblablement dune enzyme rgulatrice. Des cytochromes monooxygnases transforment le kaurene en GA 12 aldhyde. Des GA 20 oxydases transforment GA12 en GA 20. Finalement 2 classes dhydroxylases sont importantes : Les 3hydroxylases conversion de GA 20 en GA 1 ou de GA 9 en GA4 les formes actives.

les 2hydroxylases qui transforment GA1 en GA8 en linactivant en participant ainsi lhomostasie du pool de gibbrellines actives en limitant laccumulation excessive de GA1. Plusieurs commentaires sont faire propos de cette voie de synthse - Laccumulation de gibbrellines entrane par un phnomne de feedback la rpression des gnes de GA20 oxydases et 3hydroxylases. - Diverses expriences de gnie gntique ont montr le rle in vivo de ces gnes et enzymes ex : la surexpression de la 2hydroxylases entrane le nanisme des plantes par inactivation des gibbrellines. Un mutant de pois mut sur cet enzyme conduit au contraire un phnotype de rponse exagre aux gibbrellines. La multiplicit des gibbrellines une ou plusieurs formes actives ? Si lon revient maintenant aux mutants nains de mas d1 et d5 on a pu montrer que le mutant d5 voyait sa croissance rtablie par addition de Kaurne : le gne mut est celui de la Kaurne synthase. En revanche pour le mutant d1 seul lapport de GA1 permet la reprise de croissance toutes les autres gibbrellines en particulier GA20 sont inefficaces. Ces rsultats permettent donc de conclure, quau moins chez le mas, une seule gibbrelline GA1 est active et que toutes les autres gibbrellines sont des prcurseurs ou des formes dinactivation/ dgradation. Le gne mut correspond dans ce dernier cas lenzyme de conversion de GA20 en GA1. - Les gibbrellines existent galement sous forme lies avec des oses (glucosides inactifs) dont le rle physiologique est peu clair. Rle dans le transport, rversibilit de la liaison ?

IIID- d- Les Gibberellines dans la plante Rpartition- Transport : Les gibbrellines sont prsentes chez toutes les plantes suprieures, elles sont synthtises galement par certains champignons. Comme nous lavons dit on ne retrouve que quelques gibbrellines chez une espce donne, et les gibbrellines dtectes varient selon le stade de dveloppement. On pense que les sites de synthse sont les organes contenant les concentrations les plus leves en gibbrellines, apex des tiges et des racines, jeunes feuilles, mais aussi embryon et tissu de rserve des graines en dveloppement, fruits Les concentrations habituelles sont de 0,1 100 ng / g de tissu frais mais de 1 10 g au niveau des graines. Les gibbrellines ne prsentent pas de transport polaris la diffrence de lauxine. Appliques un niveau quelconque de la plante, elles peuvent avoir des effets rgulateurs sur toutes les autres parties. Elles ont t retrouves dans la sve brute et la sve labore et leur vitesse de transport (5 cm/h) analogue celle des sucres laisse supposer quelles sont transportes passivement dans les flux de sve dans le xylme et le phlome. Un transport de cellules cellules de type symplastique est galement probable, on constate en effet une rduction du transport par des inhibiteurs mtaboliques de type azide. IIID eEffets Physiologiques : Au niveau cellulaire comme les auxines, les gibbrellines ont la fois une action sur la division, llongation et la diffrenciation. Parmi les effets observables on peut citer : - Laction sur la croissance des tiges (au niveau des racines et feuilles on observe de trs faibles rponses) Cette action est particulirement spectaculaire sur des : 1) Mutants nains qui dans la majorit des cas ont perdu la facult de synthtiser des gibbrellines, par blocage gntique. Les retardants de croissance peuvent dterminer galement un nanisme chez des espces comme Chrysanthemum et leur effet est lev par apport de gibbrellines exognes. 2) Espces en rosette bisanuelles choux, laitue dont les entre-nuds sont trs courts pendant la 1re anne de vgtation et les feuilles sont accoles les unes aux autres. Dans la nature, chez ces espces les tiges sallongent la deuxime anne. Un traitement par les gibbrellines (0,1 mg / semaine) peut conduire rapidement des croissances spectaculaires (3 m de haut). Cependant, les gibbrellines ont un effet sur la croissance de nombreuses plantes normales et intactes comme la Tomate (qui ne possderaient donc pas des concentrations optimales pour leur croissance). Le plus souvent on assiste un accroissement des entre-nuds existant par des phnomnes dlongation essentiellement). Croissance des fruits Effet commun avec les auxines, mais les gibbrellines agissent sur des espces pour lesquelles lauxine na pas daction (Rosaces, Pcher, Pommier, Raisins). La parthnocarpie peut tre obtenue avec des gibbrellines. Leve de dormance

Lapplication de gibbrellines des bourgeons dormants permet la leve de dormance et leur dbourrement. Mme effet sur la leve de dormance des graines. Initiation de la floraison Pour des espces ayant des exigences photopriodiques ou de vernalisation pour fleurir, la transformation dun mristme vgtatif en mristme floral peut tre obtenue dans de nombreux cas par application de gibbrellines. Sans que lon sache si ces hormones sont directement impliques dans le processus physiologique normal. IIID f- Mcanismes Molculaires daction des Gibbrellines : Nous lavons vu les gibbrellines dterminent un nombre important de rponses mais leur mode daction au niveau molculaire a t, comme dans le cas de lauxine, essentiellement tudi en dtail vis--vis dun seul phnomne : linduction des enzymes dhydrolyse de lamidon dans les graines de crales. Exposition du problme Lembryon des graines de crales est entour dun tissu de rserve : lalbumen qui est luimme entour dune fine couche de cellules riches en protines (grains daleurone) appele couche daleurone. Quand la germination dbute, sous linfluence de lhumidit par exemple, les cellules de la couche daleurone librent des enzymes qui hydrolysent lamidon, les protines et le RNA de lalbumen, les produits solubles forms tant ensuite utiliss pour le dveloppement de lembryon. En 1958, YOMO au Japon et PALEG en Australie trouvrent que des graines dOrge prives de leur embryon et places lhumidit ne produisaient pas damylase. Si les grains et les embryons taient placs en suspension dans une mme fiole, les grains prsentaient alors une activit amylasique comme des semences normales. YOMO montra de plus que des extraits purifis dembryon appliqus sur les graines dterminaient lapparition de lactivit amylase. Ceci suggre, bien que lembryon fournit normalement la couche daleurone une substance qui lui permet de librer l amylase. Il sagit dune hormone la gibbrelline qui a t isole des grains dOrge sous la forme GA3 et qui peut remplacer laction de lembryon. Les tapes suivantes ont permis de montrer que laugmentation de lactivit amylase provenait dune synthse de novo de lenzyme (expriences de marquage en densit DO ou avec des acides amins 0 suivi dune centrifugation lquilibre) et que cette synthse provenait elle-mme de la production de nouveaux ARN messagers spcifiques (exprience de Northern, inhibiteurs de la transcription). De nombreuses tudes ont ensuite port sur la chane de transduction du message gibbrelline. Si diverses expriences dmontrent la prsence de rcepteurs de GA sur le plasmalemme (action dhormone non permante, inefficacit de la microinjection de GA) la nature molculaire du rcepteurs nest pas connue.

En revanche, de nombreux messagers secondaires et lments de la chane de transduction ont t proposs dans le mcanisme daction des gibbrellines avant la stimulation de la transcription : Lion Ca Le pH cytosolique La calmoduline Le GMP cyclique Ces diffrents paramtres augmentent squentiellement lors du traitement de protoplastes de cellules daleurone par GA. Par exemple, GA3 accrot la teneur en calcium cytosolique via louverture de canaux calciques, le retour des concentrations normales de calcium serait du des Ca ATPases de la membrane plasmique et un influx de calcium vers le RE. Des protines G htrotrimriques sont galement impliques dans les premires tapes de la transduction : le MAS 7 qui stimule lchange GDP/GTP stimule la production d amylase. Au niveau terminal de la chane de transcription il faut souligner dans le promoteur du gne d amylase lexistence dun Gibberellic acid responsive complex GARC avec 3 rgions essentielles dont une le GARE (gibberellic acid responsive element). Par ailleurs, un cDNA codant une protine de 60 Kda (GAB1) avec un domaine en doigt de Zinc rpt a t caractris ainsi quun gne GAMyb (facteur myb) stimulant la production d amylase en labsence de GA. GA stimule, par ailleurs, la production de GAMyb. La rponse finale dpend dun quilibre entre GAB1 inhibiteur de la transcription et GAMyb activateur. Enfin il faut souligner que l amylase est une glycoprotine scrte lextrieur des cellules daleurone (pour quelle puisse migrer ensuite vers lalbumen). Des inhibiteurs de glycosylation bloquent donc cette scrtion. IIID g Modification des taux de Gibberellines chez les plantes par gnie gntique : Une amlioration de la productivit des crales a repos sur lobtention de varits seminaines chez lesquelles lutilisation de lazote des amendements tait plutt utilis pour la mise en place du grain que de la tige. De ce point de vue on peut rappeler que deux gnes dits de la rvolution verte le gne de bl Rht et le gne de riz Sd1 sont impliqus dans la signalisation associ GA et sa biosynthse respectivement. Par gnie gntique plusieurs approches peuvent tre envisages pour rduire les taux de GA 1. rduire la biosynthse 2. augmenter le catabolisme 1. Par exemple des constructions anti-sens du gne de GA 20 oxydase rduisent les taux de gibberellines chez Arabidopsis 2. Surproduction de GA2 oxydase une enzyme du catabolisme de GA. Un groupe Japonais (2003) vient dobtenir des rsultats intressants selon cette approche en transformant une varit de riz par une construction associant le gne de GA2 oxydase au promoteur (la synthse de GA chez le riz est dpendante des organes) dun gne de biosynthse de GA dans les tiges.

Les plantes transformes ont un phnotype semi-nain mais une floraison et un dveloppement du grain normal contrairement des plantes o le gne tait associ un promoteur constitutif (actine). IIIE - LES CYTOKININES La troisime catgorie dhormones que nous abordons aujourdhui les cytokinines prsentent comme les prcdentes AIA, gibberellines des effets biologiques multiples mais leffet initialement mis en vidence porte sur la division cellulaire, plus particulirement sur la cytokinse do le nom de cytokinines. IIIE a- Historique et dcouverte : La dcouverte des cytokinines a t associe la recherche des exigences hormonales des cultures dorganes ou de tissus vgtaux in vitro. Ces tissus ou organes isols de la plante exigent en effet pour se dvelopper des lments divers dans le milieu et en particulier des hormones. 1941 Van Overbeek met en vidence les proprits actives du lait de noix de coco* vis--vis de la croissance de jeunes embryons de Datura stramonium. Ce milieu est toujours utilis en culture de tissus vgtaux. * endosperme liquide de la noix de coco qui se solidifie par la suite et qui est trs riche en acides nuclques. 1954 Le groupe de SKOOG montre que la croissance in vitro des tissus de moelle de tabac ne peut se faire avec la seule prsence dauxine (faible croissance pas de division, seulement grandissement cellulaire). La recherche de substances actives conduit mettre en vidence laction positive Du lait de noix de coco Dextrait de levure De DNA autoclav 1955 Miller obtient partir de sperme de Hareng autoclav (trs riche en ac. nuclques) une substance capable dinduire la division cellulaire des tissus de moelle de tabac de trs faibles concentrations 1 g/litre. Cette substance a t identifie il sagit de la 6-furfurylaminopurine ou kintine actuellement encore utilis comme rgulateur de croissance. Dautres substances synthtiques de nature voisine et des drivs de ladnine isols des vgtaux ont une action comparable. Lensemble de ces substances est regroup sous le terme de cytokinines : Adnines substitues ayant une action sur la croissance et la diffrenciation des tissus vgtaux en culture in vitro IIIE b- Nature chimique : A ct de la kintine dautres substances synthtiques activits cytokinine existent dont la plus connue est la benzyladnine disponible commercialement trs utilise en culture in vitro .

Des activits cytokinines ont t initialement caractrises dans divers extraits vgtaux : lait de noix de coco, extraits de divers fruits mais sans identification des structures actives. En 1964, 9 ans aprs la dcouverte des cytokinines LETHAM identifie dans les endospermes laiteux de mas (Zea Mays) la 4-hydroxy-3mthyl-2butnyl amino purine ou Zatine. Depuis cette molcule a t caractrise dans de nombreuses plantes ; elle est responsable de lactivit biologique du lait de noix de coco. Par la suite on a abouti la caractrisation chez les vgtaux de lisopentenyladnine libre ou sous forme de riboside qui semble la plus largement rpandue. Ces cytokinines naturelles sont plus efficaces que les cytokinines synthtiques. Relations structure activit : De nombreuses substitutions sont possibles au niveau du groupement NH2 de ladnine tout en conservant lactivit. Substitution sur les cycles : perte dactivit lexception de la substitution en 9 dun hydrogne par un groupement ribose ou ribose phosphate. IIIE c- Biosynthse Mtabolisme : La voie de Biosynthse est trs simple. Les cytokinines sont des adnines substitues, ladnine est une base purique, constituant naturel des vgtaux qui intervient dans la synthse des acides nucliques. Les cytokinines naturelles connues rsultent de la substitution dun hydrogne du NH2 (en 6) par une chane, 5 atomes de carbone correspondant une unit isoprne de type pyrophosphate disopentnyle (Cf synthse Gibb-ABA). Cette origine a t dmontre par des incorporations de mvalonate marque dans les cytokinines. Une enzyme ralisant le couplage 5AMP + pyrophosphate disopentenyle est lisopentenyltransfrase IPT (cytokinine synthase) cette enzyme naccepte pas ladnine ou ladnosine comme substrats elle a t caractrise initialement ainsi que son gne chez les microorganismes et cest La caractrisation rcente du gne chez les vgtaux qui conclut dfinitivement le dbat polmique relatif la production des cytokinines non pas par la plante mais par la flore piphyte qui la colonise. Les cytokinines existent et sont actives la fois ltat libre ltat de nuclosides et de nuclotides. Curieusement on trouve des structures de type cytokinine dans les ARN de transfert (tRNA). Les t RNA aprs avoir fix un ac. amin vont le transfrer et permettre son incorporation dans une chane polypeptidique en voie de formation au niveau des ribosomes. Chaque t RNA possde 2 rgions de sa molcule particulirement typiques celle o se fixe lac. Amin celle appele anticodon (correspondant une squence de 3 nuclotides) qui lui permet de sapparier avec le codon correspondant du RNA messager et donc de contribuer la traduction de cet ARN messager en introduisant au bon endroit le bon ac. amin.

Les ARN de transfert qui ont une structure secondaire en feuille de trfle en raison de liaisons hydrognes entre bases complmentaires comportent de nombreux nuclotides rares ou inhabituels : natures des bases mthyles, addition, substitution type de liaisons entre base et sucre et parmi ces nuclotides rares on trouve des structures de type cytokinine comme les adnines substitues. Ces cytokinines occupent une position spcifique adjacente lanticodon se terminant par un A. Cette prsence des cytokinines dans les t RNA se retrouve donc chez les vgtaux mais aussi chez les animaux et bactries. On a envisag que les cytokinines proviendraient de la dgradation des t RNA vgtaux mais les tudes ralises sur le renouvellement (turn over) des t RNA vgtaux semblent indiquer que celui-ci nest pas suffisamment rapide pour maintenir une quantit de cytokinines compatible avec les exigences pour la croissance. Par ailleurs cest la forme isomrique cis-zatine qui est prsente dans les t RNA alors que la forme trans-zatine est la forme prdominante et la plus active dans les tissus, il existe cependant une cis-trans isomrase dans les tissus vgtaux. Au final on pense que les cytokinines ont une double origine : synthse via lIPT et via la dgradation des t RNA. Les cytokinines lorsquelles sont apportes de faon exogne subissent 3 types de transformation. Formation de nuclotides mono-di-triphosphates qui sont actifs au mme titre que les cytokinines bases et qui pourraient mme tre les formes actives les plus gnrales. Formation de glucosides O-cytokinines glucosyls sur la chane latrale ces ractions sont rversibles et les glucosides constituent donc des formes de rserves inactives. N-cytokinines glucosyls sur les N en 7, 9, 3 ; il sagit dans ce cas dune dsactivation rversible (le glucose est dans ce cas li un atome dazote du noyau purique). Dgradation par limination de la chane latrale et perte dactivit sous laction dune cytokinine oxidase. Cette enzyme maintiendrait lhomostasie du taux de cytokinines (elle est ainsi inhibe par la diphnylure qui mime, par effet indirect, les effets de lapport de cytokinines exognes). La raction catalyse est du type : isopentenyladnosine adnosine. IIIE d- Cytokinines dans la plante : Il est classiquement admis que les cytokinines sont produites de faon prfrentielle dans les racines, bien que les embryons, les jeunes fruits, les bourgeons aient aussi une autonomie de production. Elles sont prsentes dans les racines en grande quantit et sont synthtises partir de prcurseurs radioactifs. On retrouve des cytokinines dans les exsudats racinaires de certaines plantes (Mas)

Les feuilles sont dpendantes des racines pour la production de cytokinine Exemple : Phaseolus vulgaris lorsque lon sectionne une tige feuille et si on la maintient en survie dans leau le taux de cytokinines diminue mais recommence augmenter lors de la formation de racines adventives. Les cytokinines seraient transportes dans le xylme. Appliques de faon exogne au niveau des feuilles elles migrent peu. Division cellulaire : Un des effets des cytokinines est de permettre la cytokinse c'est--dire la formation dune paroi transversale assurant la sparation de deux cellules filles. Cest en raison de cette action spcifique sur cette phase de la division cellulaire que le nom de cytokinine a t donn ces hormones. Il faut galement remarquer que dans les conditions des essais biologiques les cytokinines seules sont sans action sur la division cellulaire mais quelles ne peuvent agir quen prsence dauxine. Ceci est un exemple de complmentarit daction entre deux substances de croissance = synergie qui doit vraisemblablement se retrouver dans de nombreux cas. Si lon considre lintervention des cytokinines dans les conditions naturelles on peut faire rfrence aux tissus tumoraux pour lesquels on a montr une nette activation de la synthse des cytokinines et on peut penser que dans les zones mristmatiques des tissus normaux ces systmes de synthse sont particulirement actifs. Diffrenciation Les cytokinines permettent la diffrenciation de bourgeons sur des tissus en culture leur action est contrebalance par celle des auxines qui favorisent la production de racines, la diffrenciation du tissu dpendant en fait de lquilibre auxine . cytokinines Leve de dormance : les semences de diverses graines Tabac, Laitue, voient leur germination stimule par les cytokinines. Cet effet peut avoir des rpercussions cologiques. Aux USA les graines dune plante parasite des cultures Striga asiatica ne germent quau contact des scrtions racinaires de la plante-hte Mas. Au-del de cette observation il est possible que les cytokinines aient un rle plus gnral dans la germination des semences dans les conditions naturelles. Effet sur la mobilisation des mtabolites MOTHES (1961) a dcouvert que des applications localises de cytokinines des feuilles entranait une mobilisation de mtabolites apports de faon exogne des zones de dpt vers la zone traite ou une rtention de mtabolites au niveau du traitement (sels minraux acides amins).

Cet effet actuellement inexpliqu peut tre en partie lorigine des deux autres manifestations de laction des cytokinines que nous dvelopperons plus tard Laction sur la dominance apicale Laction anti-snescence

Les cytokinines produites par les bactries : diffrentes bactries pathognes ou colonisatrices des plantes produisent des cytokinines ce qui entrane au niveau des vgtaux des phnomnes tumoraux par multiplications cellulaires anarchiques. Agrobacterium tumefaciens avec transfert du gne IPT la plante Pseudomonas savastanoi sans transfert de gne mais excrtion de cytokinines Rodococcus fascians producteur de cytokinines produit un phnotype particulier que nous verrons propos de la leve de dominance apicale : les balais de sorcire. On ne connat pas de mutants affects dans la synthse des cytokinines ni dinhibiteurs de la synthse des cytokinines. Cependant la transformation gntique des plantes par diffrents gnotypes dAgrobacterium tumefaciens a apport des conclusions intressantes. En culture de tissus les tissus tumoraux rsultant de laction de cette bactrie se rvlent autotrophes par rapport aux hormones suggrant que le transfert de TDNA entrane une surproduction dhormones (ils nont pas besoin dapport dhormones exognes contrairement aux tissus normaux). Trois gnes ont t ainsi identifis dans le TDNA. Deux impliqus dans la production dAIA. Le gne 1 code une enzyme de formation dindole actamide. Le gne 2 code une enzyme hydrolysant lindole actamide en tryptophane. Le 3me gne correspond lIPT enzyme de synthse des cytokinines. Des expriences de mutagense par insertion de transposons (transposon TN) chez agrobacterium tumefaciens ont conduit des souches affectes dans certains de ces gnes. La transformation des plantes par ces souches modifies a conduit des phnotypes tumoraux spcifiques qui on conduit associer le locus affect lallure de la tumeur. tms tmr pour pour tumour tumour shooty rooty

Les mesures de teneurs en hormones de ces tissus tumoraux ont montr une rduction des quantits en auxine chez tms, une rduction des quantits en cytokinines chez tmr. Les locus ont t ensuite associs des gnes codant des enzymes de synthses de ces hormones mais ces expriences ont surtout montr limpact des balances hormonales sur la diffrenciation. La corrlation observe confirme les rsultats dcrits lorigine pas Skoog et Miller pour les tissus de tabac en culture. Formation de tiges favorise par un rapport racines favorise par un rapport lev faible cytokinines auxine cytokinines AIA

IIIE e- La perception et la transduction du signal cytokinine : Un des systmes les plus conservs pour la transduction des signaux extracellulaires est la voie des protines G liant le GTP. Ce sont les protines G qui en changeant de conformation lors de lchange GDP-GTP se lient des protines effecteurs et les activent (enzymes, canaux ioniques). De nombreuses vidences dmontrent lexistence de ce systme chez les plantes. Systmes affines pour P GTP Systmes ragissant aux anticorps contre les units G , G mais pas G Il est vraisemblable que le systme des G protines existe donc chez les plantes. Ces observations suggrent que des rcepteurs membranaires 7 domaines transmembranaires (qui sont coupls aux protines G) existent donc galement chez les plantes. Ces rcepteurs sont trs nombreux 1 % du gnome chez les animaux et sont capables de reconnatre des messages aux structures aussi varies que les photons, les ions, des effecteurs chimiques En 1998 le groupe de Hooley Bristol en exploitant les homologies de squence aux niveaux des EST de Arabidopsis, riz, pin a pu trouver des squences prsentant des homologies avec les 7 TM receptors. A partir de ces informations on est arriv au clonage dun gne chez Arabidopsis : GCR1 qui est exprim un faible niveau dans diffrents organes de la plante. La transformation de plantes avec des constructions antisens (promoteur 35 S) conduit des transformants phnotype modifi analogue celui de plantes manquant de cytokinines ou celui dun mutant CVR1 insensible aux cytokinines. Par ailleurs, le transformant est moins sensible lapport exogne de benzyladnine. Arguments en faveur dun systme double composante dans la perception / transduction du signal cytokinine Ces systmes comprennent comme cela a t mentionn prcdemment : une partie rcepteur une partie transmetteur (histidine kinase) une partie rgulateur de rponse Une approche par Activation TDNA Tagging a consist transformer un grand nombre de plantes (50 000 cals dA. thaliana) par une construction comprenant un ttramre du domaine enhancer du promoteur 35S. Linsertion au hasard de cette squence dans un promoteur quelconque va amplifier la transcription du gne correspondant et permettre galement de localiser le promoteur interrompu (par hybridation). Le crible de slection a port sur la recherche de plantes prsentant un phnotype comparable celui rsultant dun apport de cytokinines (prolifration de tiges, verdissement acclr, inhibition de la formation de racines).

Le gne CKI1 a t caractris, il code pour un systme deux composantes et sa surexpression donne un phnotype correspondant lapport de cytokinines exognes (pas encore de liaison entre la protine et les cytokinines dmontre). Enfin un screening de mutants par rapport la perte de sensibilit aux cytokinines en cultures de tissu a conduit isoler le mutant Cre1-1 cytokinine . Le mutant ne rpond pas lapport exogne de kintine, zatine, IPA. Le gne correspond une histidine kinase et la mutation correspond au changement dune Glycine 467 par Asparagine 467. Cependant le mutant ne prsente pas danomalie au niveau du systme arien sur la plante entire mais seulement des altrations du systme vasculaire des racines suggrant le fonctionnement majoritaire de CRE 1 dans les racines, do lide de rcepteurs tissus spcifiques. IIIE f- Ingnierie de la production des cytokinines : Deux dmarches ont t envisages des fins soit fondamentales ou appliques. La surexpression du gne IPT. Ce gne a t associ diffrents promoteurs. un promoteur constitutif fort comme le 35 S entrane une surproduction de cytokinines avec les symptmes associs classiques : perte de dominance apicale rduction du systme racinaire augmentation du nombre de chloroplastes. Cependant la plante a un dveloppement gnral perturb par excs de cytokinines. Le gne IPT a donc t associ des promoteurs inductibles ou exprims de faon spcifique dans le temps. gne de protine de heat shock induit par un lvation de T gne exprim lors de la snescence Dans ces conditions la surproduction de cytokinines modre ou limite dans le temps se traduit par des effet positifs, antisnescence en particulier. La deuxime approche consiste inhiber par une stratgie antisens ou RNAi le gne de cytokinines oxydase. Cette approche potentiellement intressante a t encore peu utilise. IIIF - LETHYLENE IIIF a- Dcouverte du rle hormonal : La dmarche qui a conduit la dcouverte du rle hormonal de lthylne est tout fait diffrente de celle que nous avons voque pour les autres hormones.

En effet, laction de lthylne exogne est connue depuis longtemps sur les vgtaux et ce nest qu la suite de la dmonstration de la prsence naturelle de lthylne chez les plantes que lon a conclu son action hormonale. Ds 1886 une jeune Botaniste russe NELJUBOW observait leffet du gaz dclairage sur la morphologie de plantules de pois : raccourcissement et paississement des tiges, perte du gotropisme ngatif : ensemble de rponses regroupes sous le terme de triple rponse. Parmi les diffrents effets de lthylne ce sont cependant les observations relatives la maturation des fruits qui ont t dcisives dans la dcouverte de son rle hormonal. 1924 : 1937 : DENNY : lthylne permet le jaunissement et la maturation des citrons GANE : montre que les manations gazeuses de pommes mres initient la maturation des fruits verts et que lthylne constituait le gaz actif (premire dmonstration de la production dthylne par un vgtal). A partir de ce moment on attribue un rle lthylne dans la maturation des fruits et lon montre que de nombreux fruits mettent de lthylne. le dveloppement de chromatographie en phase gazeuse fit franchir une nouvelle tape car cette mthode trs sensible et particulirement adapte la dtection de ce gaz permet de montrer que lthylne tait prsente dans toute les parties de la plante. Paralllement on dmontrait au-del de la maturation les actions diverses de lthylne sur le dveloppement des vgtaux et en 1969 ce compos tait finalement rang parmi les hormones vgtales. Produite par les vgtaux, active faible dose et distance du lieu de synthse lthylne rpond tout fait la dfinition dune hormone. Elle reprsente cependant des caractristiques particulires au niveau du transport : on observe en effet une diffusion gazeuse lintrieur de la plante mais aussi lextrieur do la possibilit daction sur dautres individus. Cette proprit suggre une analogie avec les phromones animales. Son caractre gazeux la fait, par ailleurs, comparer un autre gaz loxyde nitrique (NO) molcule gazeuse implique dans la signalisation chez les animaux (les vgtaux produisent aussi de loxyde nitrique). IIIF b Production par la plante : En raison de la sensibilit et de la spcificit de lanalyse chromatographique en phase gazeuse on ne retient pratiquement pas de test biologique pour estimer les quantits dthylne dans la plante (sensibilit 10 mole - 10 l). Les fruits, les fleurs et diffrents organes de la plante produisent de lthylne. On distingue gnralement : La teneur interne (TI) Lmission dans latmosphre (EAth)

1955-1960 :

Exemple pour la Poire Williams :

TI= 80 l/g EAth = 200 l/g/24h

Aux USA, ABELES a estim que la production dthylne par les plantes tait de 2.10 tonnes par an. Cette production peut tre compare celle provenant des vhicules et des industries 15.10 tonnes par an. Ces concentrations pourraient tre toxiques pour les plantes mais lthylne est soit transform par oxydation par lozone par raction avec les oxydes dazote la lumire ou utilise par les microorganismes du sol. Il est noter : 1) Que la production dthylne est trs sensible aux facteurs de lenvironnement : lumire, temprature, diffrents types de stress (blessures, radiations, scheresse, attaques par les microorganismes, etc). Dans le cas de ces agressions cette synthse accrue dthylne saccompagne de la formation de composs phnoliques, les enzymes de synthse PAL ou doxydation (peroxydase) de ces composs tant nettement actives. Lthylne dclenche ainsi des ractions de la plante qui peuvent tre assimiles des sortes de ractions de dfense de la plante (cicatrisation, protection) do lappellation dHormone de Stress. 2) Que la production dthylne est stimule par les auxines (naturelles ou synthtiques). Les travaux d ABELES et de BURG (1968-1972) ont montr que de nombreuses rponses obtenues chez les plantes lors de lapplication dauxine pouvaient tre reproduites par lexposition des plantes lthylne. Ainsi de nombreuses rponses attribues lauxine aux fortes concentrations se produiraient par lintermdiaire de lthylne (inhibition de llongation). Cette interaction pourrait fournir un contrle naturel lors de la production excessive dauxine. IIIF c Voies de biosynthse et rgulation de la synthse : Depuis longtemps il avait t dmontr que la mthionine (ac. amin) tait un prcurseur de lthylne. En effet, si on apporte de la mthionine marque des tranches de pommes ou de bananes on observe une incorporation de la radioactivit dans lthylne. Lthylne driverait des carbones 3 et 4. Les tapes intermdiaires ont t ensuite caractrises selon la squence : Mthionine S-adenosyl mthionine Acide cyclopropane carboxylique (ACC) Ethylne

Lenzyme de synthse de S-adenosyl mthionine la SAM synthase nest pas spcifiquement impliques dans la synthse de lthylne car son produit est majoritairement utilis comme donneur de mthyle dans dautres synthses : lignines, polyamines Les autres enzymes plus en aval ont un rle plus spcifique. Lenzyme de synthse de lACC semble jouer un rle rgulateur important dans la production de lthylne. Cest une ACC synthase enzyme comportant un groupement prosthtique pyridoxal phosphate dont lactivit est bloque par des inhibiteurs, des enzymes pyridoxal-P.

LACC synthase a t purifie et clone. Cest un exemple dune famille multignique dont chaque membre est diffremment exprim en rponse des facteurs du dveloppement, de lenvironnement ou des facteurs hormonaux. Avec des sondes spcifiques une expression diffrentielle des diffrents gnes a t value par exemple : Une forme augmente lors de la maturation Une autre forme augmente en rponse des blessures Une dernire forme augmente en rponse lauxine LACC oxydase qui transforme lACC en thylne est une dioxygnase qui demande du fer et de lascorbate et fonctionne en prsence dO2. Elle correspond galement une famille multignique et subit galement une augmentation de son activit lors du stress. Plusieurs observations tendent montrer que la stimulation de la production dthylne la suite du stress procde dune nosynthse dACCsynthase qui jouerait un rle limitant dans la production dthylne. En effet, le systme de conversion de lACC en thylne apparat constitutif dans la plupart des tissus car lapport dACC une large varit de plantes ou de tissus dtermine un accroissement trs important de production dthylne. Lauxine, le wounding , le flooding stimulent la synthse dACC synthase et la production dACC et dthylne. Certains mutants de tomate rin sont incapables de mrir en raison dun dfaut dans la production dthylne. Lapport dACC maturation. La mutation concerne le gne de lACC-synthase leffet ngatif de lapport de diffrents prcurseurs de lACC. Lpinastie constate au niveau des feuilles lors de la croissance sur sols inonds est due au transport vers les parties ariennes dACC non transform au niveau des racines en raison de labsence dO2. Enfin lACC peut tre transform en une forme conjugue de manire irrversible : le malonyl ACC. Il a t propos de faon humoristique que la quantit de malonyl ACC retrouve chez une plante soit un indicateur des situations de stress vcues par la plante. Au-del des voies de biosynthse naturelle un certains nombre de composs chimiques exognes sont utiliss comme prcurseurs dthylne il sagit de lethephon ou de lethrel. La dgradation de lthylne essentiellement lextrieur de la plante implique une conversion en oxyde dthylne ou en thylne glycol. IIIF d Effets physiologiques : Lthylne peut tre considr comme une hormone mixte avec des effets positifs : initiation de la floraison, et des effets ngatifs sur le dveloppement : inhibition de la croissance, abscission, snescence. Elle exerce une influence sur toutes les phases du dveloppement de la germination la snescence souvent en interaction avec dautres hormones.

Maturation des fruits : Le phnomne de maturation englobe des changements biochimiques profonds qui conduisent des modifications de texture, du got, de la couleur du fruit et le rendent apte la consommation. Sans entrer dans le dtail de ces modifications il faut signaler quelles sont prcdes chez de nombreux fruits par un accroissement trs net de lintensit respiratoires que lon appelle crise climactrique, la priode antrieure ou phase pr climactrique tant une priode dactivit mtabolique ralentie (voir figure). Changements biochimiques lors de la maturation : Hydrolyse des composs pectiques Hydrolyse de lamidon Disparition des acides organiques Disparition des substances astringentes (tannins) 1. on a pu montrer que lapport de lthylne dclenche la crise climactrique et les phnomnes de maturation qui sen suivent. 2. des mesures de la production dthylne dans le fruit rvlent que la quantit de gaz saccrot avec la crise climactrique. 3. enfin lutilisation dinhibiteur de la production dthylne la rhizobitoxine retarde la maturation des pommes. Selon les fruits on constate que la production dthylne est parallle la monte de la crise climactrique ou la prcde en revenant sa valeur initiale lors de la monte (Banane). On considre donc que lthylne est lhormone de maturation naturelle des fruits. Le contrle de la production thylne a des applications commerciales dans le contrle de la maturation des fruits. La maturation des fruits peut tre considre comme une tape prcoce de la snescence qui est dfinie par rapport des critres de consommation. Lthylne de faon plus gnrale, induit la snescence chez dautres organes comme les fleurs ou les feuilles. IIIF e Mcanismes daction de lthylne : Lthylne est sans doute lhormone vgtale dont les mcanismes molculaires daction (perception, transduction du signal) sont les mieux connus. Ces rsultats sont lis une exploitation extensive de mutants dArabidopsis thaliana insensibles lthylne au niveau de la rponse physiologique classique de la triple rponse. Le mutant ETR1 (thylne rsistant) a permis lisolement du rcepteur dthylne. Ce gne isol par clonage positionnel code une protine qui comporte des homologies avec les systmes rgulateurs bactriens deux composantes : Domaine senseur pectine soluble sucres oses

Domaine histidine kinase (transmetteur) Domaine receveur (rgulateur de rponse). La protine rcepteur existe sous forme de dimres les 2 sous units tant lie par 1 pont disulfure. La protine recombinante est capable de fixer lthylne au niveau de sa rgion N terminale hydrophobe. La cystine 65 est implique dans cette fixation. Dautres mutants de sensibilit ont t caractriss tels que CTR1, EIN2, EIN3, ETR2, EIN4, ERS. Certains des gnes correspondants (ETR2, EIN4) correspondent peut tre une redondance des rcepteurs, dautres codent pour des intermdiaires de la chane de transduction. CTR1 code pour une protine rpresseur, car la mutation entrane une triple rponse constitutive. La liaison du rcepteur ayant fix lthylne avec CTR1 dsactive ce dernier. Lordre dintervention de ces diffrentes protines le long de la cascade perception transduction a commenc tre identifi : ETR1 CTR1 EIN2 EIN3 ERF1 Rponses Le domaine cytoplasmique de ETR1 interagit avec le domaine rgulateur de CTR1(protine kinase de type RAF). EIN2 protine membranaire, EIN3 et ERF1 (Ethylene response factor) qui sont pour les deux derniers des protines nuclaires rle de facteur de transcription se situent plus en aval. ERF1 est rapidement induit en rponse lthylne et dclenche un ensemble de rponses physiologiques quand il est exprim ectopiquement. Lintervention de ces gnes sur une mme voie de transduction a t ordonne par des tests gntiques dpistasie qui permettent par croisement de 2 mutants suivie dune autofcondation de dterminer par analyse du phnotype le gne qui agit avant lautre sur la chane (le gne qui agit en 1er donne le phnotype). IIIF f Applications biotechnologiques : Le mtabolisme de lthylne a fait lobjet de manipulations gntiques en vue de contrler la maturation. De nombreuses pertes de fruits rsultent en effet de phnomnes de maturation / snescence non contrls aprs la rcolte. Les interventions ont port sur la sous-expression des gnes dACC synthase ou dACC oxydase ou sur la surexpression dun gne bactrien dACC dsaminase du genre Pseudomonas qui ralise la conversion (ACC actobutyrate) Par ces diffrentes stratgies on a pu obtenir des plantes maturation diffre (tomate, melon). La maturation peut tre dclenche par apport dthylne (comme cest le cas industriellement pour la banane rcolte verte).

Une amlioration du procd consiste en lutilisation de promoteurs spcifiques associs ces gnes. Fruit spcifique pour viter des effets pliotropiques Ou inductibles par des conditions particulires Lumire inductible et transfert lobscurit par exemple pour initier la maturation. IIIG LACIDE ABCISSIQUE Des inhibiteurs de croissance ont depuis longtemps t caractriss chez les plantes il sagit souvent de composs phnoliques scrts ou excrts souvent actifs aprs leur oxydation. Ces composs sont impliqus dans les phnomnes dalllopathie c'est--dire linhibition de croissance dune plante par une autre plante proximit. Au-del de ces phnomnes une substance effet inhibiteur de la croissance qui a une rpartition gnrale et une fonction hormonale est lacide abcissique. IIIG a Historique Dcouverte : La dcouverte de lacide abcissique est intressante car elle a t ralise simultanment par des chercheurs travaillant dans des laboratoires diffrents sur des problmes physiologiques distincts. Dans les annes 1960, WAREING et ses collaborateurs au Pays de Galles recherchaient la cause de larrt de la croissance des arbres en automne et le facteur qui provoque la formation des bourgeons dormants. Ils obtinrent partir des feuilles dAcer pseudoplatanus un extrait acide qui tait un puissant inhibiteur de la croissance et qui appliqu aux apex des tiges feuilles tait capable dinduire la formation de bourgeons dormants. Ils appelrent la substance active encore inconnue : la dormine. ADDICOT et ses collaborateurs lUniversit de Californie DAVIS sintressaient au problme de labcission des feuilles et obtinrent partir du cotonnier deux substances abcissine I et abcissine II capables dacclrer labcission des feuilles de jeunes plants de coton. Paralllement tait caractris un inhibiteur de croissance du Lupin par WAIN en Angleterre. Lisolement de la dormine par CORNFORTH et al. (1966) permet sa caractrisation chimique et fut suivie par des travaux qui montrrent que dormine inhibiteur de croissance du Lupin et abcissine II taient en fait la mme substance qui fut dfinitivement appele acide abcissique en 1967 (ABA). IIIG b Nature chimique Biosynthse : LABA est un sesquiterpne, molcule en C rsultant de lassociation de 3 molcules disoprne. LABA prsente 2 types disomrie li dune part la prsence dun carbone assymtrique (le compos naturel est dextrogyre, le produit commercial est un racmique mlange des 2 isomres optiques) et dautre part lexistence dune double liaison sur la chane latrale isomrie cis-trans.

Le cis ABA est le seul actif dans le cas de laction de lABA sur la fermeture des stomates. Deux voies de biosynthse ont t successivement proposes pour lABA, la premire dite voie en C correspondrait la condensation de 3 molcules disopentenyl pyrophosphate selon un mcanisme analogue celui de la synthse des gibberellines. La 2me voie dite en C a t caractrise plus rcemment elle correspond une coupure de carotnodes en C du type zeaxanthine selon la squence : Zaxanthine (C) Violaxanthine (C) Xanthoxine (C) ABA aldhyde (C) ABA (C)

Divers mutants ont permis de caractriser cette voie de synthse travers des tudes qui sont de bons exemples de combinatoire dapproches gntiques, molculaires et biochimiques. Des mutants de tabac dficients en ABA (mutants ABA) sont altrs au niveau de la zaxanthine poxydase (cette enzyme possde en fait 2 activits conversion de la zaxanthine en antheraxanthine puis en violaxanthine). La zaxanthine qui est non dtectable chez la plante sauvage est bien reprsente chez le mutant alors que la violaxanthine prsente chez la plante sauvage nest pas caractrisable. Dautres mutants chez la tomate comme flacca (phnotype fltrissement permanent) sont affects dans des tapes terminales comme la conversion de ABA aldhyde en ABA. Diffrents mutants dits vivipares chez le mas (les graines germent sur le pied mre par dfaut dABA) sont bloqus diffrents niveaux de la chane de synthse du -carotne (Vp1, Vp2, Vp5, Vp9, Vp7) Vp7 par exemple est bloqu au niveau de la conversion lycopne en carotne. Au total il est maintenant admis que la voie en C nest pas oprationnelle chez les plantes mais chez certains champignons, la totalit de lABA venant de la voie en C chez les organismes chlorophylliens o la synthse de lABA a dailleurs lieu dans les chloroplastes riches en carotnodes (la zaxanthine epoxydase correspond un cDNA prsentant une squence dadressage vers le chloroplaste). Le catabolisme de lABA procde via une hydroxylation pour donner le 8 hydroxy ABA ensuite converti en acide phasque, lABA 8 hydroxylase est une monooxygnase phytochrome P. Cette dgradation intervient, par exemple lors du retour un tat hydrique normal aprs une priode de scheresse pour rduire le taux dABA. LABA peut galement tre converti en formes conjugues inactives : ABA glucosyl ester sur le COOH ABA glucoside sur lOH du carbone assymtrique. Au cours de la priode hivernale on assiste chez certaines espces une interconversion entre formes libres et formes conjugues.

IIIG c Effets physiologiques et mcanismes daction : Action sur la fermeture des stomates : il sagit dun phnomne trs important au plan physiologique puisquil permet de contrler les pertes deau de la plante et de maintenir lhomohydrie. Cest un exemple de rponse rapide une hormone de lordre de quelques minutes (lors de lapport dABA exogne). Harris et coll (1990) en utilisant un radio immuno essai (extrmement sensible) pour lABA ont t capables de quantifier lABA dans une seule cellule de garde. A la suite dun stress hydrique on observe un accroissement du taux dABA par un facteur 20. La production dABA se ferait en 1er au niveau des racines stresses qui peroivent le stress et lABA serait transport vers les apex. Le mcanisme daction de lABA sur la fermeture des stomates a t tudi via des mesures lectrophysiologiques au niveau de canaux ioniques. On a montr que lABA active un canal calcique du plasmalemme ce qui entrane un accroissement en calcium cytoplasmique qui secondairement induit louverture dun canal potassique sortant, de canaux anioniques et la fermeture canal K entrant. Le rsultat global est une fuite de K et la fermeture des stomates. Le mcanisme fin est plus complexe faisant intervenir des phnomnes de phosphorylation / dphosphorylation. Certains mutants insensibles lABA et prsentant une tendance au fltrissement ont permis lisolement dun gne mut qui est une phosphatase. De plus diffrentes tudes pharmacologiques laide dinhibiteurs de Kinases ou de phosphatases ont montr limportance dtapes de phosphorylation et de dphosphorylation dans la rgulation de lactivit des canaux ioniques impliqus dans la fermeture des stomates. A linverse des autres cellules vgtales, les cellules de garde ne comportent pas de plasmalemmes et sont donc isoles de leurs voisines. Il sagit dun systme clos adapt aux techniques lectrophysiologiques et aux micro-injections. Une approche originale ayant confirm lintervention de lABA dans la fermeture des stomates repose sur lexpression ectopique, obtenue par transgnse, danticorps contre lacide abcissique, ARTSAENKO et al, 1995. Un anticorps monoclonal prsentant une forte spcificit et affinit pour lABA a t caractris et le cDNA correspondant clon puis introduit dans une construction avec un promoteur fort pour la transformation du tabac. Le gne tranger est exprim dans le tabac et son expression conduit un phnotype fltri analogue aux mutants phnotype fltri de tomate (flacca). Diffrents travaux dj dcrits ont montr que le rcepteur lABA tait sur la face extrieure de la membrane plasmique (voir partie du cours concernant les rcepteur dhormones) mais la structure molculaire de rcepteur nest pas connue. Formation des graines et dormance : LABA intervient comme nous le verrons ultrieurement dans le contrle de lexpression de gnes qui correspondent des protines de rserve des graines et des protines permettant sans dommage la dshydratation des tissus (les dhydrines). Parmi ces protines une classe particulire a t spcialement tudie ce sont les LEA protines (late embryogenesis abundant) produite durant les phases tardives de lembryognse. Leur expression est associe lacquisition de la tolrance la dshydratation et elles sont censes protger les structures

cellulaires des effets de la perte deau (protection de protines ou de membranes). LABA est, par ailleurs, ncessaire lentre en dormance des graines et des bourgeons. LABA est dune manire gnrale un antagoniste des gibbrellines dans des phnomnes comme la dormance ou la production d-amylase par les cellules daleurone. Abcission : Bien que lhormone ait t initialement caractrise en relation avec labcission. Ce sont des doses supraphysiologiques qui sont actives et on pense que ces doses entraneraient la surproduction dthylne vritable hormone responsable de labcission. En conclusion le nom de dormine aurait t beaucoup plus adapt pour ce que nous appelons aujourdhui lacide abcissique. IIIH - LES BRASSINOSTEROIDES Les Brassinostrodes (BR) reprsentent une classe dhormones vgtales prsentant en commun des structures de strodes qui ont de multiples effets sur le dveloppement : germination des graines, longation des tiges, expansion des feuilles, diffrenciation du xylme. Le rle des Br a t clairement dmontr par ltude de mutants soit dficients, soit insensibles aux brassinostrodes qui prsentent diffrentes anomalies de dveloppement. Des phnotypes comparables peuvent tre obtenus par des inhibiteurs de biosynthse des Br comme le brassinazole (Brz). IIIH a- Dcouverte , Historique : Ces molcules ont t initialement isoles en 1970 du pollen de Brassica majus sous le terme de brassines, une molcule particulire appele brassinolide tant caractrise en 1979. Ces molcules appliques sur divers systmes exprimentaux des concentrations nanomolaires prsentent un effet marqu sur llongation cellulaire ou sur la prolifration cellulaire. Ceci indpendamment des effets induits par dautres hormones comme lauxine, les cytokinines ou les gibbrellines. Une quarantaine de structure actives ont t actuellement caractrises les Brs tant prsents chez les algues, fougres, gymnospermes, angiospermes mais pas chez les microorganismes. Le brassinolide est le plus actif biologiquement et le plus rpandu. Les preuves gntiques, dmontrant que les Brs taient essentiels pour le dveloppement normal des plantes, ont t trs rcemment apportes par ltude de mutants ainsi que des informations sur les mcanismes daction des brassinostrodes. IIIH b- Structure et Biosynthse des Brassinostrodes : Le brassinolide (Br type) est un strode prsentant un squelette cholestane qui possde un cycle B-7oxalolactonique et 2- hydroxyles adjacents sur le cycle A(C et C) et sur la chane latrale C et C.

Des analyses de structure fonction des Brs ont montr que les structures actives devaient prsenter un certain nombre de caractristiques qui sont retrouves dans le Br type le Brassinolide. Les diffrents Brs se distinguent par le nombre et la nature des substituants sur les cycles A et B et sur la chane latrale. La voie de synthse du Brassinolide partir du campestrol, un strol vgtal de rpartition trs gnrale a t tablie au cours des dernires annes. Elle comprend une srie de rductions, doxydation et dpimrisation (voir figure). Diffrents mutants ont t caractriss sur les nombreuses tapes de la chane de synthse. Le mutant nain det est un mutant dficient en BR qui est complment par lapport de Br exogne. La mutation concerne une strode rductase assurant la conversion du campestrol en campestanol. Lauxine et les gibbrellines ne complmentent pas la mutation au plan fonctionnel. Le fait que le gne det est ncessaire la biosynthse des Brs et que la perte de fonction entrane des modifications profondes du dveloppement : nanisme mais aussi dautres manifestations sur la dominante apicale, la snescence dmontre sans ambigut le rle hormonal des Brs. Un autre mutant nain appel CPD a t tudi, le gne a t clon et squenc. Les analogies de squence observes montrent que ce gne code pour une tape dhydroxylation dans la chane de synthse des Brs. Les apports de teasterone, thyphastrol, castastrone complmentent la mutation. Lapport de casthastrone est sans effet. La protine correspondant au gne mut catalyse la conversion de casthastrone en teasterone. Cest une hydroxylase a cytochrome P (appele CYP 90) qui prsente des analogies avec les strodes hydroxylases. Le phnotype sauvage est retrouv par transformation gntique avec le cDNA de cette hydroxylase. Mutants insensibles aux Brs : Des mutants de sensibilit au Br ont t caractriss par un crible de slection simple : absence dinhibition de la croissance racinaire par des doses leves de Br. Un excs de Br comme dans le cas de lAIA, entrane en effet, une inhibition de croissance. Un de ces mutants BRI1 (Brassinosteroid insensitive) correspond ces critres. A maturit il est nain et prsente dautres altrations phnotypiques. Il demeure sensible aux autres hormones : lauxine, cytokinines, AIA, thylne. La caractristique du gne a permis lidentification du rcepteur aux Brs (voir plus bas). IIIH c- Effets physiologiques des brassinostrodes : Les brassinostrodes ont des effets pliotropiques sur les systmes vgtaux. Nous avons dj parl de leur action sur la division et llongation cellulaire. Ils interviennent galement dans la diffrenciation des tissus vasculaires qui est supprime par apport duniconazole inhibiteur de la synthse des strodes mais rtablie par apport de Brassinolide. Ils acclrent la snescence dans des systmes simplifis (feuilles, cotyldons isols) par des effets antagonistes des cytokinines.

Les effets sur llongation cellulaire prsentent des cintiques diffrentes de ceux induits par lAIA dont les premires manifestations sobservent aprs 15 et le maximum aprs 30 45. Les premiers effets des Brs se manifestent, en effet, aprs 45 et peuvent se prolonger et augmenter pendant plusieurs heures. IIIH d- La perception et la transduction des brassinostrodes : Trends in Plant Science Vol 9 Feb 2004. Une premire remarque concerne le lieu de perception des hormones strodes qui est diffrent dans le rgne animal et le rgne vgtal. La plupart des rponses aux strodes chez les animaux impliquent la perception du message par des rcepteurs nuclaires alors que la perception se fait par un rcepteur plasmalemmique chez les vgtaux. Des tudes sur des mutants de sensibilit au Br chez Arabidopsis qui sont des mutants nains ont conduit lidentification dun rcepteur et dlments de la chane de transduction. Le rcepteur a t appel BRI1 pour Br insensitive cest un leucine rich repeats LRR receptor like kinase : LRR-RLK. BRI1 a un domaine extracellulaire contenant 25 LRR, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui porte une activit srine / thronine Kinase. La fixation de Br sur le rcepteur provoque son autophosphorylation et des mutations sur le domaine extracellulaire suppriment la fixation de Br et lactivation de la Kinase. La situation est cependant plus complexe avec lintervention potentielle de deux autres composants BAK1 qui pourrait former un htrodimre avec BRI1 et une srine carboxypeptidase BRS1 qui raliserait le processing dune partie extracellulaire de la protine BRI1 (voir figure). Divers composants de la voie de transduction ont t caractriss BIN2 est un rgulateur ngatif dont leffet est lev par lactivation du rcepteur. BZR1 et BES1 sont des protines nuclaires rgulateurs positifs en aval de BIN2. Au total lactivation du complexe BRI1 BAK1 inhibe BIN2 travers un mcanisme inconnu, ce qui permet laccumulation des formes non phosphoryles de BZR1 et BES1 qui sous cette forme activent les gnes cibles des Br. En labsence de Br la kinase BIN2 inhibe les rponses en phosphorylant BZR1 et BES1 et en les orientant vers la voie de dgradation impliquant le protosome 26S. Cette voie de transduction prsente de nombreuses analogies avec des voies impliques pour dautres signaux chez les animaux et les vgtaux (par exemple lauxine ou lthylne). De faon surprenante le rcepteur BRI1 de tomate a deux fonctions : la fixation de Br mais aussi de systmine, une hormone peptidique qui induit des rponses la blessure chez la tomate via la production dacide jasmonique. Les fixations se produisent sur 2 sites diffrents, se pose alors le problme de la spcificit de la rponse en aval et du choix de ce rcepteur

commun parmi les centaines de LRR-RLKcaractriss chez les plantes (210 chez Arabidopsis). Une situation comparable a t trouve chez la Drosophile avec le rcepteur Toll, la fois important pour le patterning dorsoventral et pour lacquisition de limmunit inne aux bactries et aux champignons. Dans ce cas les 2 phnomnes sont temporellement spars lors du dveloppement ce qui nest pas le cas chez la tomate pour BRI1. Les Brs contrlent lexpression gnique : Il a t montr par des expriences dapport de Brs des systmes vgtaux et de suivi de la synthse protique, et de la transcription et par des analyses de criblage diffrentiel (transcrits produits uniquement ou stimuls en prsence de Br) que les Brs favorisent la transcription de certains gnes. Chez le soja un gne a t caractris appel BRU1 (brassinosteroid upregulated) dont les transcrits augmentent 2h aprs lapport de Br mais non lors de lapport dauxine de cytokinine, de gibbrelline ou dacide dabcissique. La squence de ce gne BRU1 prsente des analogies fortes avec celle du gne connu codant pour la xyloglucane endotransglycosylase (XET). Laugmentation du message BRU1coincide avec laccroissement dextensibilit de la paroi et il est probable que les Brs agissent sur llongation cellulaire par lintermdiaire de la production de XET (gne appel aussi TCHU). Lactivation de la transcription se faisant par lintermdiaire dun facteur de transcription TCH4-BF1 qui se lie au promoteur du gne TCH4.