UNIVERSITÉ PARIS 13

U.F.R LÉONARD DE VINCI

SANTÉ-MÉDECINE-BIOLOGIE HUMAINE
BOBIGNY

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MASTER 1ère ANNEE

"BIOLOGIE - SANTE"
THERAPIES ET TECHNOLOGIES DU VIVANT
Parcours Thérapies expérimentales et applications en pathologies humaines

MÉMOIRE DE STAGE

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GUERRACHE Abderrahmane

Mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques

dans les cellules souches tumorales de cancers du rein humains

INSERM UMR_S942

MASCOT

Equipe 2 du Pr Guilhem BOUSQUET

Marcel Cachin, 93017 Bobigny cedex

Directeur du laboratoire et encadrant : Pr Guilhem BOUSQUET

Co-encadrant : Dr Guillaume GAPIHAN

Année universitaire 2018/2019

1
Remerciements

Je remercie tout d’abord le Professeur Guilhem BOUSQUET de m’avoir permis d’effectuer mon stage
au sein de son laboratoire. Je le remercie tout particulièrement de son esprit critique, de ses conseils,
de m’avoir fait confiance, de m’avoir fait partager ses connaissances, de m’avoir appris à structurer
mes idées et d’opter pour un vocabulaire plus approprié selon le contexte. Je le remercie de sa patience
et du temps qu’il m’a consacré afin de m’enseigner au mieux une méthode de rédaction et présentation
scientifique correct. Je le remercie aussi de m’avoir donné la chance de participer dans un projet de
recherche en oncologie.

Je remercie spécialement le Dr Guillaume GAPIHAN de m’avoir accompagné tout au long de mon

stage. Il a su me transmettre une partie de ses connaissances sur le projet et m’a fait part de son
expérience. Travailler sur un projet commun de rechercher fut une expérience intense et très
enrichissante.

Je remercie le Pr Anne JANIN pour son expertise, son esprit critique enrichissant et de sa gentillesse.

Je remercie également le Dr Christophe LEBOEUF pour ça présence et son bon humeur et le Dr

Morad El BOUCHTAOUI, pour son aide.

Je remercie tous les membres de l’équipe U942 ainsi que mes camarades stagiaires : Raymond,
Mélanie, Justine et Loura.

Je leur souhaite à toutes et tous, le meilleur pour l’avenir.

2
Table des matières

Introduction……………………………………………………………………….…5

I. Cancer du rein…………………………………………………….5
1. Définition et classification……………………………………...…...…………………5
2. Epidémiologie et facteurs de risque du cancer du rein……………...………………….6
3. Biologie du cancer du rein…………………………………………...………………....6
4 Traitements actuels du cancer du rein………………………………...………………....8

II. Cellules souches cancéreuses…………………………………...8

1. Définition et caractéristiques des cellules souches cancéreuses…………………..……8
2. Marqueurs des cellules souches cancéreuses dans le cancer du rein………………..….8

Contexte du projet…………………………………………………………….….9
I. La situation clinique…………………………………………...……………………….9
II. Résultats obtenus dans le même contexte : puce Affymetrix……………….………..11
III. Troponine de type-2 (TNNT2)………………………………………………………12

Matériel et méthodes………………………………….……………………..…..13
I. Xénogreffes et dissection des souris…………………………………...………….…....13
II. Coupes de tumeurs congelées……………………….…...……………………….……13
III. Tri cellulaire par MACS et cytometrie en flux…………...…….……………….…….13
IV. Extraction d’ARN…………………………………………....….…………………….14
V. Réverse transcription………………………………………………..…………………14
VI. PCR quantitative……………………………….…………………...…………………14

Résultats et discussion……………………...…………………………..……….15
I. Confirmation des résultats de la puce Affymetrix par RTqPCR………………………..15
II. Caractéristiques des souris et des xénogreffes, et rendement des extractions d’ARN....16
III. Etude des niveaux d’expression de TNNT2 dans les cellules couches cancéreuses…..17
IV. Optimisation des conditions de tri des cellules souches cancéreuses……………….…17

Perspectives...........................................................................................................…...20

Références bibliographiques…………..…………………………………...…..21

3
Abréviations

ADNc: Acide désoxyribonucléique miR: micro-ARN

complémentaire
mTOR: mechanistic target of rapamycin
AFA: Alool, Formol et Acide acétique
NMRI: Souche non consanguine qui a une
AKT: Protéine Kinase B grande viabilité et fertilité.

ALDH: Aldéhydes déshydrogénases PBS: phosphate buffered saline

APC: Adenomatous Polyposis Coli PCR: polymerase chain reaction

ARN: Acide ribonucléique PDGF β: platelet-derived growth factor β

ATP: Adénosine Triphosphate PDK: Phosphoinositide Dependent Kinase

BSA: Sérum Albumine Bovine PEB: autoMACS® Running Buffer

CCCR: Cancer à cellules claires rénales PHD: prolylhydroxylase

CCR: Cancer à cellules rénales PI3K: phosphatidylinositol-3-kinase

Cq: Cycle de quantification PIP: phosphatidyl-inositol diphosphate

CSC: Cellules souches cancéreuses PTEN: Phosphatase and TENsin homolog

CXCR4: CXC Récepteur de type 4 RT: Reverse transcription

dNTP: désoxyribonucléotides Triphosphate TBP: TATA box binding protein

El B: Elongin B TEP-TDM: Tomographie par émission de

positons
EDTA: Éthylènediaminetétraacétique
TGF-β1: Transforming Growth Factor-1
ENG: Endoglin
TnC: Cardiac muscle troponin C
FITC: Isothiocyanate de fluorescéine
TnI: Cardiac muscle troponin I
GAPDH: Glycéraldéhyde-3-phosphate
déshydrogénase TNNT2: Troponine de type 2 gene

HIF: Hypoxia Inducible Factors TnT: Cardiac muscle troponin T

HE: Hématoxyline Eosin TSC: tuberous sclerosis complex

HRE: Hypoxic Responsive Elements VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor

Hs: Homo sapiens VHL: Von Hippel-Lindau gene

MACS: Magnetic Activated Cell Sorting

4
Introduction
I. Cancer du rein

1. Définition et classification :

Les carcinomes à cellules rénales sont le type histologique le plus fréquent des cancers du
rein. Sur le plan histologique, il s'agit d'un type tumoral polymorphe, constitué principalement de
cellules tumorales et d’un stroma comportant entre autre les vaisseaux tumoraux (1). Les avancées
de la cytogénétique ont permis une meilleure caractérisation de ces tumeurs. La caractérisation des
voies métaboliques accompagnant la tumorigenèse vise à identifier de nouveaux biomarqueurs. Ces
biomarqueurs peuvent constituer des outils permettant d'affiner le pronostic et d’améliorer la prise en
charge thérapeutique (2).

Il existe plusieurs types histologiques de cancer du rein, regroupés sous le terme de cancers à cellules
rénales :

Le carcinome à cellules claires du rein représente 75% des tumeurs malignes rénales de l’adulte. Il est
issu des cellules du tube contourné proximal et caractérisé par une prolifération de cellules claires à
cytoplasme optiquement vides s’associant à une néoangiogènése marquée. Le cancer à cellules claires
rénales est métastatique dans 30% des cas (3).
Le cancer à cellules rénales de type tubulo-papillaire représente 15% des tumeurs rénales. Il est
originaire des cellules du tube contourné distal. Il existe deux sous types, le sous-type 1 de bon
pronostic et le sous-type 2 de mauvais pronostic. La différence entre les deux sous types est
histologique.

Le cancer à cellules rénales de type chromophobe qui se développe à partir des cellules intercalaires de
type B, survient chez des patients plus jeunes et représente 5% des tumeurs rénales de l’adulte (2).

Les carcinomes à cellules rénales de type papillaire ou chromophobe ont un meilleur pronostic
puisqu’ils sont souvent de bas grade. Le carcinome des tubes collecteurs et le sarcome rénal
engendrent un pronostic sombre puisqu’ils sont souvent très agressifs (3).

Les circonstances du diagnostic des différents cancers du rein sont très proches et seule l’analyse
histologique permettra de les distinguer et de déterminer le sous type histologique. Le pathologiste
devra également définir les facteurs pronostiques histologiques reconnus comme facteurs indépendants
pour la survie : l’organisation cellulaire, stade de différentiation tumorale, le stade TNM (Dimension
de la tumeur, métastases ganglionnaires et à distance) et le grade nucléaire de Fuhrman (morphologie
et la taille des noyaux et des nucléoles) (2).

2. Epidémiologie et facteurs de risque du cancer du rein :

Le cancer à cellules rénales est le seizième cancer le plus fréquent dans le monde entier, avec
environ 403 262 nouveaux cas diagnostiqués en 2018 selon GLOBOCAN IARC Kidney 2018. Il
représente 3 % des tumeurs solides. C’est la douzième cause de décès par cancer, avec 175 098 cas de
mortalité en 2018. Le sexe ratio est estimé à 1,5:1 avec une prédominance masculine et un pic
d'incidence se produisant entre 60 et 70 ans (4).

5
En France, Il y a environ 14000 nouveaux cas de CCR et 4700 décès par an, pour les deux sexes. C’est
le septième cancer le plus fréquent chez l’homme et le dixième chez la femme. La France se situe au
neuvième rang chez les hommes et au douzième chez la femme parmi les pays de l’union européenne
ayant les plus hauts niveaux d’incidence. En termes de mortalité, la France se classe respectivement au
treizième et vingt et unième rang (4).

Géographiquement, l’incidence du cancer à cellules rénales est plus élevée dans les pays
développés. La raison est multifactorielle (5). Il existe des facteurs de risque environnemental telle
l’obésité, l’alcool et le tabagisme. Certains sont suspectés, comme l’hypertension artérielle. Des
facteurs d’expositions professionnelles comme l’exposition au cadmium et à l’amiante peuvent être
des facteurs de risque (6).
Il existe également des formes familiales héréditaires, dont la plus fréquente est la maladie de
Von Hippel-Lindau, qui est caractérisée par une mutation inactivatrice du gène appelé VHL,
représentant 1 à 2 % des cancers à cellules rénales (7).

3. Biologie du cancer du rein :

Le cancer à cellules rénales est une maladie complexe caractérisée par des mutations dans
plusieurs gènes. La perte de fonction du gène suppresseur de tumeur est la cause essentielle du cancer
du rein y compris des formes sporadiques (8).
Le gène suppresseur de tumeur VHL est identifié en 1993. Il est exprimé dans tous les tissus et à tous
les stades de développement examinés. Il code pour la protéine pVHL. Elle a pour principale fonction
la régulation négative de la production du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), facteur clé de
l'angiogenèse. Les fonctions de la protéine pVHL ne se limitent pas uniquement au processus de
l'angiogenèse mais interviennent également dans la différenciation et le contrôle de la prolifération
cellulaire. Les altérations germinales du gène VHL sont à l'origine de la maladie de von Hippel-Lindau
alors que les altérations somatiques sont responsables de la majorité des adénocarcinomes à cellules
claires sporadiques.
La mutation causale du gène VHL est identifiable chez presque tous les patients atteints de cette
affection. Il s'agit le plus souvent de mutations ponctuelles (75% des cas) portant sur la séquence
codante, mais des micro-délétions, des micro-insertions ou des délétions étendues ont également été
observées. Plus de 150 mutations différentes ont été répertoriées sur l'ensemble des 3 exons (9).
Cette inactivation du gène VHL favorise l’activation et la stabilisation de HIF-α. Ce dernier en se liant
à HIF-β, transloque dans le noyau et induit l’expression de certains gènes, contenus dans le locus HRE
(Hypoxic response element), dont le VEGF et le PDGF (platelet-derived growth factor) (Figure 1).
Cette induction favorise l'angiogenèse, la croissance cellulaire et de l’inhibition de l’apoptose. En
physiologie, cette voie est appelée la voie de l’hypoxie, où en absence d’oxygène, le HIF-α est régulé
positivement (10).
Le VEGF est le facteur de croissance le plus impliqué dans l'angiogenèse, en particulier dans les
cancers à cellules rénales, dans lesquels il est fortement surexprimé. Le VEGF se lie aux récepteurs
tyrosine kinase (les VEGFR) sur les cellules endothéliales. Ce qui entraîne l'activation de la cible
mécanistique de la rapamycine (mTOR), suivie d'une cascade d'événements de phosphorylation en
aval qui favorise la croissance, la prolifération, l'angiogenèse, la motilité et la survie des cellules
endothéliales, ainsi que la synthèse de protéines impliquées dans la voie phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K) / AKT / mTOR (8).

6
Cette voie de signalisation joue un rôle clé dans de nombreux cancers. La majorité de ces marqueurs
responsables de l’apparition de cancer du rein sont actuellement ciblés en thérapeutique (Figure 2) (8).

Figure 1 : Voie VHL/HIF/VEGF dans le cancer à cellules claires rénales (voie de l’hypoxie).
En présence d’oxygène, la prolylhydroxylase (PHD) réalise l’hydroxylation de HIF. Une fois hydroxylé, HIF peut être
polyubiquitinylé par le complexe polyenzymatique formé autour de pVHL (qui comprend Rbx, Culin2 (Cul2), Elongin B (El
B), Elongin C (El C) et NEDD8), et être ensuite dégradé par le protéasome. En cas d’hypoxie ou d’inactivation de VHL (cas
du cancer du rein), HIF-α va se lier à HIF-β, se transloque dans le noyau entraînant une surexpression de nombreux gènes
HRE (hypoxia responsive elements). Ces gènes-cibles comprennent notamment le VEGF, le PDGF β, le TGF α, le CA IX, l ’
EPO et le Glut1 (Edeline et al, Bull Cancer 2010) (22).

Figure 2 : Voie PI3K/AkT/mTOR dans le cancer à cellules claires rénales.

Après fixation du facteur de croissance (FC) sur son récepteur, celui-ci active la PI3-kinase, qui phosphoryle le
phosphatidyl-inositol diphosphate (PIP2) en phosphatidyl-inositol-triphosphate (PIP3). PTEN assure l’effet inverse. Le PIP3
va activer PDK1, qui activera à son tour AkT. AkT va inhiber TSC (tuberous sclerosis complex), qui inhibe à son tour mTOR.
Finalement, mTOR joue sur la régulation de facteurs qui contrôlent des protéines-clés dans la traduction:. Au total, il en
résulte une stimulation de la traduction, qui conduit notamment à une augmentation de protéines liées à la survie cellulaire,
et par ailleurs à une augmentation de l’expression de HIF-α. De plus, mTOR peut également être activée par la voie des
MAP-kinases (Edeline et al, Bull Cancer 2010) (22).

7
 4. Traitement actuel du cancer du rein :

Les traitements actuels du cancer du rein sont les anti-angiogéniques. Ces traitements, seuls ou
associées à d’autres molécules thérapeutiques anticancéreuses ont montrés leurs efficacités. Parmi ces
médicaments actuellement commercialisés, on retrouve les molécules inhibitrices spécifiques qui
ciblent les VEGFR et PDGFR comme le sunitib, et les anticorps monoclonaux comme par exemple
ceux dirigé contre le VEGF comme le bevacizumab. L’inconvénient majeur de cette approche
thérapeutique est le développement d’une résistance aux traitements. Cependant, les mécanismes des
résistances aux thérapies ciblées restent mal compris. Une meilleure connaissance de la biologie du
cancer du rein et en particulier des cellules souches cancéreuses peut permettre la misent au point de
nouveaux traitements pouvant contourner celles-ci (11). L’un des mécanismes de résistance est celui
de l’utilisation des voies alternatives de l’angiogenèse. Les cellules tumorales en particulier les
cellules souches cancéreuses sont probablement un acteur de cette résistance aux
anti-angiogéniques (12).

II. Les cellules souches cancéreuses

1. Définition et caractéristiques des cellules souches cancéreuses :

Selon des critères consensuels, les cellules souches cancéreuses sont capables de s'auto-
renouveler et ont un potentiel tumorigène. Ces cellules sont retrouvées dans de très nombreux cancers
solides, que ceux-ci soient dérivés de cellules épithéliales (adénocarcinome pulmonaire, carcinome
mammaire…etc) ou de cellules mésenchymateuses (9), (12).
Les cellules souches cancéreuses présentent les caractéristiques d’auto-renouvèlement d’un potentiel
de prolifération et de différenciation, l’expression de une activité télomérase, l’activation des voies
de signalisation anti-apoptotiques, la possibilité d’entrer en phase de quiescence, de l’augmentation de
l’activité des transporteurs membranaires, de meilleures capacités de migration cellulaire, de survie en
l’absence d’adhésion à un substrat, et de résistance à l’hypoxie (13). Ces propriétés expliquent en
partie leur l’agressivité. Elles offrent la possibilité de former des métastases et de résister aux
traitements anti-tumoraux chimio thérapeutiques, radio thérapeutiques et anti-angiogéniques (14).
Les cellules souches cancéreuses présentent aussi des caractéristiques propres qui les distinguent des
autres populations cellulaires. Ce sont des propriétés le plus souvent acquises à la suite d’altérations
génétiques. Ces caractéristiques se résument en une prolifération anarchique guidée par des
dysfonctionnements du programme d’auto-renouvèlement ainsi qu’une différenciation anormale
souvent partielle et une activité télomérase souvent modifiée (10).

2. Marqueurs des cellules souches cancéreuses dans le cancer du rein :

Différents marqueurs de surface caractérisent les cellules souches cancéreuses dans les cancers
à cellules rénales, notamment le CXCR4 appelé aussi CD184, un récepteur à la chimiokine CXCL12.
Il est exprimé par les progéniteurs hématopoïétiques humains, les progéniteurs rénaux et les cellules
souches du cancer du pancréas. Le CD105 appelé aussi Endogline et constitue la chaine du récepteur
au Transforming Growth Factor-1 (TGF-β1). Le CD133 ou la prominine 1, exprimé par les cellules
souches hématopoïétiques, les progéniteurs rénaux, les cellules souches du cerveau et du cancer du
côlon (10).

8
L’identification des cellules souches cancéreuses dans le cancer du rein peut se faire grâce à ces
marqueurs de surface. Ce sont généralement des chaines de récepteurs ou des récepteurs entiers.
Cependant, le CXCR4 est probablement le marqueur le plus fiable des cellules souches cancéreuses
dans le cancer du rein. La surexpression de CXCR4 chez des patients atteints de cancer à cellules
claires rénales était en corrélation avec un mauvais pronostic (Figure 3) (9, 14). Il a été rapporté que
l’expression de CXCR4 sur les membranes des cellules souches cancéreuses était en réponse à des
conditions défavorables de survie induites probablement par les médicaments antiangiogéniques. Cette
expression était associée à une invasion métastatique (15).

Figure 3 : Marqueurs et caractéristiques moléculaires de la cellule souche cancéreuse, acteur clé

dans la promotion du cancer à cellules claires rénales.
Diaphonie de signalisation hypothétique dépendant de HIF-1α/2α au sein de cellules souches cancéreuses
rénaux supposés impliquant les voies de trois marqueurs associés: CD105, CXCR-4 et ALDH. En tant qu'oncogène présumé,
HIF-2α est supposé conduire la progression du cancer à cellules claires rénales pseudo-hypoxique (pVHL défectueux),
incluant éventuellement la promotion d'un phénotype agressif et immature ressemblant aux cellules souches cancéreuses. Ces
activations dans cette cellule rend le caractère souche persistant, induit l’auto renouvèlement et la division asymétrique,
ainsi que l’angiogenèse et la résistance aux signaux de la mort (D’après Myszczyszyn et al, 2015) (10).

Contexte du projet

1. La situation clinique :

Le patient, âgé de 54 ans, avait un adénocarcinome rénal à cellules claires métastatique. Les
métastases ont été diagnostiquées au niveau de péritoine et des poumons. Le patient était sous
traitement antiangiogénique sunitinib. Le traitement a permis une réponse quasi complète et a pu
éliminer les métastases, mais pas la tumeur primitive qui persistait au niveau du rein gauche (Figure 4).
La figure représente une tomodensitométrie du cas clinique et la localisation de la tumeur primitive et
des métastases avant et après traitement. C’est un examen TEP-TDM (Tomographie par émission de
positons), une technique de médecine nucléaire qui permet d’identifier certaines lésions tumorales. Le
scan repose sur l'injection d'un traceur radioactif, le glucose marqué par le fluor 18 qui, une fois
métabolisé, émet des photons qui seront détectés grâce à un gamma caméra.
Un hypermétabolisme du glucose correspond au métabolisme des cellules tumorales et à des zones
tumorales actives représentées par des zones denses en image (16).

9
Avant traitement, en coupe longitudinale (Figure 4-A), nous observons un hypermétabolisme
physiologique du glucose au niveau du cerveau et du cœur et au niveau des reins et de la vessie,
organes responsables de l’élimination. Un hypermétabolisme tumoral pathologique ne délimitant pas
le rein gauche est observé sous forme de petits endroits tumoraux ainsi qu’au niveau du péritoine
indiquant la présence des métastases.
Après traitement (Figure 4-B), en coupe longitudinale, nous observons l’absence des métastases
péritonéales. Cela indique une réponse quasi complète au traitement. Mais la tumeur primitive persiste
au niveau du rein gauche. Ce rein à fait l’objet d’une néphrectomie.

Figure 4: Tomodensitomètre du patient participant au projet.

A- Avant traitement par le Sunitinib. B- Après traitement par le Sunitinib. A et B: Image prise par un scanner en coupe
longitudinale après injection du traceur, le glucose marqué. (D’après Guilhem BOUSQUET, INSERM UMR_S942. 2018).

A partir de la pièce de néphrectomie (Figure 5), un échantillonnage a été réalisé en se basant sur les
zones tumorales actives et en évitant les zones nécrotiques.

Figure 5 : Coupe opératoire à partir d’une néphrectomie de rein gauche du patient après une
macrodissection.
Le patient présente un CCCR métastatique. La photo représente une coupe longitudinale au niveau du rein (celle du gauche).
La partie supérieure montre la tumeur plus au moins nécrosée et enkystées. La partie inferieur de l’organe montre un bout
du rein non envahi par la tumeur. Le nodule carcinose représente une tumeur entière. Quatre zones ont été disséquées pour
faire les différentes analyses et les xénogreffes. La zone 1 correspond au nodule carcinose, les autres zones (2, 3 et 4)
correspondent à la tumeur peu nécrosée (Laboratoire INSERM UMR_S942 ; laboratoire de pathologie, hôpital Saint Luis,
Paris).

10
Chacune des 4 zones échantillonnées a été divisée en 4 fragments (Figure 6):
- Un fragment frais pour xénogreffe murine sous-cutanée.
- Un fragment frais pour un tri magnétique des cellules exprimant CXCR4 ou CD105, deux
marqueurs de cellules souches cancéreuses.
- Un fragment fixé en formol pour les analyses histologiques.
- Un fragment immédiatement congelé pour analyse moléculaires.

Figure 6 : Démarche expérimentale du projet.

Notre objectif était d’étudier les caractéristiques des cellules souches cancéreuses dans le cancer à
cellules claires rénales, afin d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance aux anti-angiogéniques
et de déterminer des marqueurs d’agressivité tumorales.

Au moment où j’ai commencé mon stage, le projet était en cours. Des résultats préliminaires
correspondant aux colorations Hématoxyline-Eosine (HE), des xénogreffes à l’analyse
transcriptomique sur puce Affymetrix ont été obtenus à partir desquels j’ai commencé mon travail.

2. Résultats obtenus dans le même contexte : Analyse transcriptomique :

Afin d’étudier le profil d’expression des gènes dans les cellules souches cancéreuses du cancer
du rein, un tri cellulaire par sélection positive sur colonnes (MACS : Magnetic-activated cell sorting)
a été réalisé. Le marquage utilisé cible les marqueurs membranaires CXCR4 et CD105.
Les fractions CXCR4+, CD105+ et CXCR4-/CD105- ont fait l’objet d’une extraction immédiate de
l’ARN pour analyse transcriptomique sur puce Affymetrix. Pour des raisons statistiques, nous avons
fait le choix de regrouper les données des 4 zones échantillonnées, en comparent les fractions
CXCR4+/CD105+ versus CXCR4- CD105-.

L’analyse bio-informatique retrouve 2267 gènes sous exprimés et 15 gènes surexprimés dans la
fraction positive par rapport à la fraction négative. Parmi les gènes surexprimés, nous avons constaté
la présence de deux gènes codants surexprimés (Tableau 1), parmi eux, le gène TNNT2, un gène
codant une protéine cardiaque. La différence dans l’expression de ce gène dans les deux fractions était
significative.

11
A partir de ces résultats, nous avons développé une hypothèse sur le fait que le gène TNNT2 pourrait
être un des marqueurs des cellules souches cancéreuses résistantes aux anti-angiogéniques.

Identifiant du Fold change Identifiant du Fold change

gène gène
MIR6738 4,10 TNNT2 3,45
ARLNC1 4,01 HS1B3-IT1 3,10
PGM5-AS1 3,37 MIR6777 3,53
MIR1229 2,08 LINC01654 3,68
MIR6819 5,23 CECR7 2,72
NDFIP2-AS1 2,91 LOC101928372 3,91
ELMOD1 5,23 MIR6819 2,65
MIR206 2,39

Tableau 1: Résultats de la puce Affymetrix montrant les gènes surexprimés.

Le profil d’expression des 15 gènes surexprimés dans les cellules CXCR4+CD105+ en comparaison avec leur expressions
dans les cellules CXCR4-CD105-, montre des gènes codants et des gènes non codants, connus ou inconnus.

3. Troponine T de type-2 (TNNT2) :

Le TNNT2 (Troponine T de type 2) est le gène codant la protéine TnT (Troponine-T2).

L’emplacement cytogénétique du gène TNNT2 est 1q32.1 (17). La Troponine-T2 est une protéine
essentielle dans la cardiomyogènèse et pour la contraction des muscles cardiaques, elle s’organise dans
le cytosquelette des cardiomyocytes (18). La Troponine-T2 est l’une des trois protéines composant le
complexe protéique de troponine dans les cellules du muscle cardiaque. Le complexe de troponine a
trois sous-unités protéiques: la sous-unité de liaison au calcium troponine C (TnC), la sous-unité
inhibitrice d’actomyosine ATPase troponine I (TnI), et la tropomyosine ancrant la sous-unité
troponine T (ancrage de filament mince). La troponine T-2 interagit avec TnI, TnC, la tropomyosine et
l'actine pour jouer un rôle d'organisateur dans la régulation calcique de la contraction et de la
relaxation musculaires. Ce complexe fait partie d'une structure appelée sarcomère, unité de base de la
contraction musculaire (19). L’expression de la Troponine-T2 est régulée négativement par le miR31,
il a été rapporté que miR31 était surexprimé en hypoxie ou en cas de stress oxydatif, le ciblage
thérapeutique de cet ARN de régulation augmente les taux de la Troponine-T2 et donc une
amélioration du dysfonctionnement cardiaque (20). L’expression de la Troponine-T2 peut être inhibée
par le Triclosan dans des cellules souches embryonnaires humaines (16). L’implication de cette
protéine en oncologie n’a fait aucune publication dans la bibliographie.

Mon objectif dans cette partie de projet, durant mon stage, était de chercher une corrélation entre
l’expression des gènes TNNT2, CXCR4 et CD105 dans des cellules souches cancéreuses triées à
partir de xénogreffes du nodule carcinose provenant d’une tumeur rénale du patient. Le but est de
confirmer ou affirmer l’hypothèse suivante : le TNNT2 est un marqueur de cellules souches
cancéreuses résistantes aux antiangiogéniques dans le cancer à cellules claires rénales.

12
Matériel et méthodes
I. Xénogreffes et dissection des souris
Des tissus frais prélevés à partir de la néphrectomie ont été xénogreffés entre les omoplates de souris
NMRI Nude (fournisseur : Janvier-Labs). Le temps de croissance des xénogreffes est compris entre 21
et 60 jours. Cela dépend de l’agressivité de la tumeur (phénotype de la tumeur).
Des souris sont euthanasiés et disséquées et la tumeur est prélevée afin de faire un tri cellulaire pour
isoler des cellules souches cancéreuses. A chaque fois, une partie de la xénogreffe tumorale est
découpée en petits morceaux pour xénogreffer d’autres souris afin d’assurer la poursuite des passages
des xénogreffes, le nombre de souris ayant reçu la xénogreffe est de 3. Une partie des organes qui sont
prélevés en parallèle sont par la suite fixée dans de l’AFA (mélange d’alcool, de formol et d’acide
acétique) pour analyse histologique ou immédiatement congelés à -80°C pour étude moléculaire et
d’immunomarquage.

II. Coupes de tumeurs congelées

Les xénogreffes des tumeurs de différents passages du nodule de carcinose du patient sont coupées.
Ces tumeurs ont été stockées à -80°C. Nous avons inclue les tumeurs dans du cryomatrix et coupé des
coupes de 10 μm à -20°C dans un cryostat (Cryotome FSE, Thermo scientific) pour ne pas décongelé
les tumeurs. Ensuite, les coupes obtenues (10 coupes pour chaque échantillon de tumeur) sont lysées
dans le tampon RLT pour extraction d’ARN.

III. Tri cellulaire par MACS et cytometrie en flux

Le tri cellulaire à partir de la xénogreffe tumorale est réalisé sur des colonnes de MACS (Magnetic-
activated cell sorting) en suivant le protocole fourni. Nous avons dissocié mécaniquement la tumeur
par un policeman dans du milieu de culture RPMI1640 puis par pipetages successifs grâce à des
pipettes de volumes décroissants 25, 10 et 5 ml, suivi de tamisages à 70 et 30 µm respectivement.
Nous avons lavé les cellules par le tampon de PEB (autoMACS® Running Buffer contenant du PBS
sans Ca2 + et Mg2 +, additionné de 1% de BSA et de 5 mM d'EDTA) pour éliminer les débris. Nous
avons par la suite procéder au marquage, les cellules totales sont divisées en deux suspensions. La
première suspension cellulaire est marqué avec des anticorps anti-CXCR4 (réf : 130-100-070 Miltenyi
Biotech) (10µl d’anticorps anti-CXCR4 humain couplé à la protéine APC pour 107 cellules, 10
minutes d’incubation à +4°C suivie par un lavage par PEB et une incubation avec 20µl de microbilles
couplées à l’anticorps anti-APC pour 107 cellules) et la seconde suspension avec des anticorps anti-
CD105 (réf : 130-051-201 Miltenyi Biotech) (20µl de microbilles couplées à l’anticorps anti-CD105
humain pour 107 cellules, 15 minutes d’incubation à +4°C suivie par un lavage par PEB) (Figure 7).
Ensuite, les suspensions marquées sont triées sur des colonnes LS immobilisées sur le séparateur
MACS, activées par 1ml de PEB. Nous avons récupéré les fractions négatives contenants les cellules
CXCR4- et les cellules CD105- après application d’un champ magnétique. Ensuite, nous avons cassé
le champ magnétique pour élué les fractions positives contenants les cellules CXCR4+ et les cellules
CD105+.
Un deuxième marquage et tri est appliqué sur la fraction négative dans le but d’augmenter le
rendement des cellules contenants dans la fraction positive qui contient respectivement les cellules
CXCR4-, CXCR4+, CD105- et CD105+, comme montre le diagramme de tri dans (Figure 7).

13
Après avoir terminé le tri, nous avons contrôlé ça qualité par cytometrie en flux pour déterminer le
rendement en pourcentage de cellules triées. Nous avons marqué les billes par des anticorps anti-billes
couplés aux fluorochromes FITC (référence : 130-095-226 Miltenyi Biotech). La cytometrie est
réalisée sur le cytometre BD FACSCanto II - BD Biosciences.

Figure 7: Méthode suivie pour trier les cellules souches cancéreuses. Les fractions négatives sont
marquées une deuxième fois et sont retriées dans de nouvelles colonnes. F : Fraction.

IV. Extraction d’ARN

Les quatre fractions cellulaires obtenues après le tri cellulaire sont lysées par le tampon de lyse RLT +
éthanol 70% et une extraction d’ARN totaux est effectuée sur des colonnes à partir du kit QIAGEN
RNeasy Mini (référence : 74104), en suivant les constructions de fournisseur, une ADNase est incubée
au cours de l’extraction pour éliminer les ADN. Les concentrations d’ARN sont déterminées grâce à
l’appareil Nano Drop, qui détermine la concentration en acide nucléique en se basant sur leurs
absorbance à 260 nm. Les échantillons sont congelés à -80°C pour éviter leur dégradations.

V. Réverse transcription

Une transcription réverse (RT) est réalisée en utilisant le kit GoScript™ Reverse Transcriptase
(réf : A500C), Promega, France. Le kit est constitué d’un mélange contenant le Go script 1X, dNTPs,
MgCl2, Rnase Free water et la transcriptase réverse. Ce mélange est incubé avec nos échantillons
d’ADNc avec une concentration de 80 ng chacune en présence de Random Primers dans l’appareil
C1000™ Thermal cycler, avec un programme d’incubation (15 minutes à 37°C suivie par 30 secondes
à 85°C puis stockage à 4°C) le volume total était 40µl pour chaque échantillons.

14
 VI. PCR quantitative

Après avoir obtenu les ADNc, une qPCR utilisant GoTaq® qPCR Master Mix (réf : A60001) Promega,
France (contenant le Taqman master mix) est réalisée sur les quatre fractions en utilisant deux gènes
de ménages : TBP (réf : Hs 00427620 m1) et GAPDH (réf : Hs 03929097-g1) (Voir protocole, tableau
annexe 3). Les amorces cibles utilisés sont CXCR4 (réf : Hs 00976734 m1), CD105 (réf : Hs
00923996-m1 ENG) et TNNT2 (Hs 00943911-m1) respectivement. Toutes les amorces ciblent
l’ADNc humain. La plaque de la qPCR était déposée par la suite, après une courte centrifugation, à
l’intérieur de l’appareil C1000™ Thermal cycler et un protocole. Le protocole contient les étapes
suivantes : un pré-échauffement à 50°C pendant 2 minutes suivi par une étape d’activation de la Taq
polymérase et une dénaturation initiale à 95°C pendant 10 minutes puis 60 cycles de PCR comportant
chacun : une étape de dénaturation à 95°C pendant 9 secondes suivie par une étape d’hybridation et
d’élongation à 58°C pendant 1 minute.

Résultats et discussion
I. Confirmation des résultats de la puce Affymetrix par RTqPCR
La confirmation de la surexpression de TNNT2 dans cellules souches cancéreuses triées à partir des
échantillons du malade était impossible vu que les ARN extraient ont été totalement utilisés pour faire
l’analyse de transcriptome sur la puce Affymetrix.
Nous avons par contre obtenu avec succès des modèles de xénogreffes à partir du nodule de carcinose
(zone 1) sur 3 passages (le quatrième est en croissance), nous avons extrait de l’ARN à partir de
coupes des tumeurs congelées qui sont coupées au cryostat. Nous avons cherché à déterminer les
expressions de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 sur ces coupes de tumeurs entières par RTqPCR.
Les résultats obtenus montrent des niveaux d’expression stables de CXCR4 et de CD105 à mesure des
passages (Figure 8). Ce qui indique probablement que le nombre de cellules souches cancéreuses ne
change pas en fonction des passages de xénogreffes. Ce résultat corrobore avec celui de Varna et al, et
Rasti et al (9), (15). De plus, les niveaux d’expression de TNNT2 sont probablement faibles,
correspondant à des Cq autour de 32 à 35. Cette faible expression est peut être liée à une expression
préférentielle dans les cellules souches cancéreuses, minoritaires dans la tumeur.

10 Xénogreffes issus du nodule de carcinose (zone 1)

Niveau d'expression

6 CXCR4

4 CD105
TNNT2
2

0
Passage 0 Passage 1 Passage 2

Figure 8: Expression de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 en fonctions des différents passages de

la xénogreffes de la zone 1 (nodule du carcinose). Des ARN ont été extraits à partir des coupes de tumeurs
congelées. Une réverse transcriptase suivie d’une PCR quantitative ont été réalisé avec une normalisation par les
expressions stables des deux gènes de ménages TBP et GAPDH dans les mêmes échantillons.

15
 II. Caractéristiques des souris et des xénogreffes, et rendement des
extractions d’ARN
Nous avons ensuite voulu étudier l’expression de TNNT2 sur les fractions CXCR4 et CD105 triées à
partir des xénogreffes. Cela à cause d’une expression faible de TNNT2 dans les tumeurs entières,
probablement à cause d’une population minoritaire des cellules souches cancéreuses. Pour cela nous
voulons enrichir ces cellules. De ce fait, trois souris xénogreffées par des tissus du nodule de carcinose
ont été successivement utilisées. Les caractéristiques des souris sont représentées dans le tableau 2.
Les souris ont été euthanasiées et disséquées et les xénogreffes de tumeurs ont été récupérées sur
lesquelles nous avons fait des tries de cellules souches cancéreuses. Les cellules obtenues dans les
différentes fractions sont lysées et une extraction d’ARN est effectuée. Les concentrations en ARN
sont déterminées pour faire une RTqPCR.

Code souris R19-0102 R19-0104 R19-0117

Paramètres
Passage de la xénogreffe Passage 5 Passage 5 Passage 5
Poids de la souris (grammes) 23 28,1 24,1
Poids de la tumeur (grammes) 10 7,7 3,4
Longueur / Largeur / Hauteur 13,68 / 12,51 / 7,02 10,8 / 7,7 / 9,2 11,11/10,4/7,55
de la tumeur (en centimètres)
Fractions [ARN] (ng/µl) après extraction à partir des cellules triées
Avant tri - - 233,3
CXCR4- 50,3 34,5 138,3
CXCR4+ 41,7 18,8 139,3
CD105- 55,7 43,7 -
CD105+ 37,5 19,8 -

Tableau 2 : Paramètres recueillis au cours de la dissection et de l’extraction d’ARN que j’ai fait
au cours du stage.

III. Etude des niveaux d’expression de TNNT2 dans les cellules

couches cancéreuses
Nous avons effectué un tri cellulaire des cellules CXCR4+CD105+ qui sont probablement les cellules
souches cancéreuses. Une extraction d’ARN a été effectué sur les 4 fractions contenant
respectivement : les cellules CD105-, les cellules CXCR-, les cellules CD105+ et les cellules CXCR4+.
Une détermination des expressions de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 par RTqPCR à été réalisé.
Les 4 fractions ont été obtenus après tri des cellules à partir de deux xénogreffes de tumeurs
séparément qui corresponds aux souris R19-0102 et R19-0104 respectivement.

Nous avons observé plusieurs choses (Figure 9):

i. Des niveaux d’expressions comparables de CXCR4 et de CD105 dans les fractions négatives
et positives.
L’hypothèse peut être que l’expression en ARNm est un mauvais reflet pour l’expression en
protéines membranaires.
ii. Des niveaux d’expressions faibles de TNNT2, quelle que soit la fraction.
L’hypothèse est peut être d’un tri sub-optimal.

16
A partir de ces observations, nous avons essayé d’optimiser les conditions de tri des cellules souches
cancéreuses.

Deux xénogreffes du nodule de carcinose,

4 de passage 5

Niveau d'expression
3,5
3
2,5
CXCR4
2
CD105
1,5 TNNT2
1
0,5
0
CD105- CXCR4- CD105+ CXCR4+
cells cells cells cells
Avant tri Après tri

Figure 9: Expression de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 dans les fractions triées de deux
xénogreffes de tumeurs de la zone 1 (nodule du carcinose). Des ARN ont été extraits à partir des coupes de
tumeurs congelées. Une réverse transcriptase suivie d’une PCR quantitative ont été réalisé avec une normalisation par les
expressions stables des deux gènes de ménages TBP et GAPDH dans les mêmes échantillons.

IV. Optimisation des conditions de tri des cellules souches cancéreuses

Après la dissociation de la tumeur on avait beaucoup de viscosité et de débris cellulaires (cellules
nécrosées, matrice extra cellulaire, globules rouges …etc.). Ces derniers ont probablement influencé la
qualité de tri en se fixant d’une manière non spécifique aux anticorps lors des marquages et en
bouchant les colonnes lors de la sélection positive. Nous avons essayé d’éliminer les débris en
rajoutant une étape de lavage deux fois à la BSA 3% (un coussin de BSA) après la dissociation de la
tumeur. De plus, nous avons décidé de remarquer la fraction négative obtenue et la retriée dans des
nouvelles colonnes, afin d’enrichir le maximum de cellules marquées et d’éviter le marquage non
spécifique des débris et des cellules mortes.

Pour contrôler la qualité de tri, nous avons procéder à un marquage des billes, dans les différentes
fractions obtenus, par des anticorps anti-billes couplés aux fluorochromes FITC avant leur passage sur
un cytometre. Nous avons sélectionné une population cellulaire de taille moyenne et de faible
granulosité, c’était la population qui correspond probablement aux cellules tumorales. Le reste
représentait des cellules mortes, des globules rouges et d’autres débris cellulaires, de très petite taille.
Nous avons par la suite éliminé les cellules non individualisées pour ne pas avoir des faux positifs
(résultats non représentés). Cette étape est réalisée grâce au ratio FSC A (représente l’air sous la
courbe de la population cellulaire) sur FSC H (représente la hauteur de la courbe).

Après sélection d’une seul population de cellule, nous avons observé le marquage à l’FITC en
comparent les résultats des fractions avant tri avec ceux des fractions après tri (négatives et positives).
Le pourcentage de la fluorescence était très faible au niveau des fractions non triées (Figure 10-avant
tri) ce qui indique qu’on avait une population minoritaire de cellules souches cancéreuses parmi les
cellules tumorales totales (0,63% pour les cellules CD105+ et 1,32% pour les cellules CXCR4+).

17
Figure 10 : Résultats de la cytometrie en flux après tri des cellules souches cancéreuses. Contrôle de
la qualité de tri des CSC à partir d’une xénogreffe de la tumeur de la zone 1 (nodule carcinose). Les cellules couplées aux
billes magnétiques des différentes fractions ont été marquées par un anticorps couplé à l’FITC. Les dots plot ont été obtenus
après analyse des données par le logiciel Flowjo.

Dans les fractions après tri négatives, on avait un pourcentage de très faible de cellules marquées
(0,09% pour les cellules CD105+ et 0,81% pour les cellules CXCR4+) qui correspond aux cellules
souches cancéreuses ce qui indique un nombre hyper faible de cette population dans les fractions
négatives (Figure 10-après tri, fractions -). Ce résultat est prouvé après analyse de celui des fractions
après tri positives où on avait un pourcentage cellulaire de 53,9% de cellules CXCR4+ dans la fraction
CXCR4+ après tri et de 13,3% de cellules CD105+ dans la fraction CD105+ après tri (Figure 10-après
tri et figure 11). Ces cellules correspondent probablement aux cellules souches cancéreuses ce qui
indiquent que nous avons réussi à enrichir les cellules souches cancéreuses dans les deux fractions
positives. Cependant le rendement de tri des cellules CD105+ était faible et on avait un pourcentage de
86,7% de cellules non marquées. Ce signal correspond probablement aux débris qui ont été éluées
avec la fraction positive ou à cause d’une efficacité faible du marquage indiquant probablement une
faible affinité de l’anticorps anti-CD105.
Les cellules souches cancéreuses CXCR4+ ont été bien enrichies (Figure 11). Pour cela nous avons
décidé de continuer notre démarche avec la fraction contenant cette population cellulaire.

Ces résultats indiquent que l’utilisation d’un coussin de BSA améliore le tri en éliminant les débris.
L’albumine contenue dans la BSA se lient aux débris et les gardent dans le surnageant après une
centrifugation (21). De plus, le renforcement de tri par un remarquage et avec un second tri de la
fraction négative à d’améliorer notre technique. Cependant cette étape peut être une limite en donnant
des faux positifs grâce au marquage non spécifique des débris restants (le reste et les membranes des
cellules mortes).

18
 60 14
12
% CXCR4-billes-FITC

% CD105-billes-FITC
50
40 10
8
30
6
20
4
10 2
0 0
Avant tri Après tri Après tri Avant tri Après tri Après tri
CXCR4- CXCR4+ CD105- CD105+

Figure 11: Pourcentage des cellules avant et après tri des cellules souches cancéreues.
Le pourcentage a été obtenu à partir des résultats de la cytometrie en flux dur les fractions CXCR4 et CD105.

Après avoir confirmé l’enrichissement des cellules souches cancéreuses CXCR4+ par le tri cellulaire,
nous avons cherché à déterminer, de nouveau, l’expression de TNNT2 dans les fractions avant et après
le tri.
Nous avons observé des expressions de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 dans la fraction avant tri.
Ces expressions étaient comparables à celles qu’on avait observées dans le premier résultat sur des
tumeurs entières (Figure 8). L’expression de CXCR4 était un peu plus élevée que celle de CD105 (15).
et l’expression de TNNT2 était faible par rapport aux deux. Nous avons observé une expression plus
forte de TNNT2 dans la fraction positive après tri par rapport à la fraction négative après tri. Cela
indique probablement que les cellules souches cancéreuses CXCR4+ ont été les seules qui expriment
le gène codant la troponine T2 dans la population des cellules tumorales rénales. Ces constatations
indiquent aussi que les cellules souches cancéreuses Co-expriment probablement CXCR4 et CD105,
reste à confirmer.
De plus, nous avons observé sur le même résultat que les expressions de CXCR4 et de CD105 étaient
stables et similaires dans toutes les fractions, y compris la fraction négative contentant les cellules
CXCR4- ce qui peut, probablement confirmer l’hypothèse qui suspecte que l’expression en ARN peut
être un mauvais reflet pour l’expression de protéines membranaires. Le développement de cette idée
est nécessaire par d’autres confirmations.
La confirmation de l’expression des cellules souches cancéreuses CXCR4+ du TNNT2 confirme
l’hypothèse de nécessité d’améliorer le tri. Les résultats obtenus montrent qu’on avait bien optimisé la
technique de tri des cellules souches cancéreuses à partir des xénogreffes de tumeurs, par la
modification du protocole de tri.

Nous avons prouvé, dans notre démarche, que les cellules souches cancéreuses est la seule population
cellulaire qui exprime le TNNT2. Ce gène pourrait être un marqueur des cellules souches cancéreuses
résistantes aux anti-angiogéniques.

19
 12,00

Niveau d'expression
10,00

8,00 CXCR4

6,00 CD105

TNNT2
4,00

2,00

0,00
Avant tri Après tri Après tri
CXCR4- CXCR4+

Figure 12 : Expression de CXCR4, de CD105 et de TNNT2 dans les fractions de CXCR4, avant
et après tri de cellules souches cancéreuses à partir d’une xénogreffe de la tumeur de la zone 1
(nodule du carcinose), passage 5. Des ARN ont été extraits à partir des coupes de tumeurs congelées. Une réverse
transcriptase suivie d’une PCR quantitative ont été réalisé avec une normalisation par les expressions stables des deux gènes
de ménages TBP et GAPDH dans les mêmes échantillons.

Perspectives
En premier lieux, une amélioration secondaire du protocole de tri des cellules souches cancéreuses est
souhaitable pour avoir une reproductibilité des résultats obtenus. Pour cela, une utilisation d’un kit qui
élimine les débris des xénogreffes de tumeur serait un plus pour l’optimisation du tri.

Une identification d’un marqueur de cellules souches cancéreuses résistantes aux anti-angiogéniques
dans le cancer à cellules claires rénales est prometteuse pour cibler cette population responsable de
l’agressivité tumorale en thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire de confirmer et d’approuver les
résultats obtenus dans ce projet par des techniques de caractérisation de la troponine T 2 dans les
cellules souches cancéreuses par Immunomarquage in situ sur des coupes de xénogreffe de tumeur
congelé, en fessant un triple marquage ciblant CXCR4, CD105 et TNNT2.

De plus, il est souhaitable de chercher une corrélation de l’expression de cette protéine avec les
passages des xénogreffes afin de voir si elle est responsable de l’agressivité des cellules souches
cancéreuses et de déterminer par la suite son rôle, après avoir créer des modèles de souris de Knock
Out et de Knock In.

Il est optative aussi de confirmer que l’expression en ARNm de CXCR4 et de CD105 n’est pas un bon
reflet de leur expression protéique. Il se peut que ces deux protéines membranaires subissent des
modifications post-traductionnelles où elles ne s’expriment pas à la surface des cellules cancéreuses
non souches. Ia se peut aussi que ces protéines soient inhibées et séquestrées par une interaction
d’autre(s) protéine(s) qui font qu’elles ne soient pas détectées par des anticorps mais leurs ARNm sont
détectés par PCR.

20
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22
Abstract
Renal cell carcinoma and its most frequent subtype, clear cell renal-cell carcinoma, are
predominantly characterized by mutations in the VHL gene leading to pathological
angiogenesis. The knowledge of kidney cancer biology is the reason why targeted anti-
angiogenic therapy is used. The appearance of resistance is the major drawback of this
therapy. It is probably caused by cancer stem cells that become more aggressive after
treatment and develop unknown escape mechanisms. The aim of our project is to characterize
anti-angiogenic resistant cancer stem cells from a patient with metastatic renal cancer who
underwent a nephrectomy. We sampled the less necrotic tumors from the nephrectomy piece.
We identified several overexpressed genes in the tumor stem cells with Affymetrix
microarray. Of these genes, TNNT2, a gene encoding a cardiac protein called Troponin T2,
was the only highly over-expressed coding gene. In parallel, we developed tumor xenografts
from nude mice to enrich the tumor cells.
We subsequently confirmed that the TNNT2 was overexpressed in cancer stem cells. This
expression is found in CXCR4 + cells compared to CXCR- cells after optimized sorting.
Our results indicate that TNNT2 is probably a marker of anti-angiogenic resistant cancer stem
cells in renal clear cell carcinoma. The fact that this gene could be one actor of this resistance,
remains to be confirmed.

Résumé
Les cancers à cellules rénales et leur sous-type le plus fréquent, le carcinome rénal à cellules
claires, sont majoritairement caractérisé par des mutations du gène VHL conduisant à une
angiogenèse pathologique. La connaissance de la biologie des cancers rénales est la raison
pour laquelle la thérapie ciblée anti-angiogénique est utilisée. L’apparition d’une résistance
est l’inconvénient majeur de cette thérapie. Les Cellules souches cancéreuses sont
probablement la cause de cette résistance. Ces cellules deviennent plus agressives après le
traitement et développent des mécanismes d’échappement inconnus. L’objectif de notre projet
est de caractériser les cellules souches cancéreuses résistantes aux anti-angiogéniques
retrouvées dans une tumeur maligne rénale métastatique d’un patient qui a subi une
néphrectomie. Nous avons échantillonné les tumeurs les moins nécrosées à partir de cette
pièce de néphrectomie.
Nous avons déterminé les gènes qui ont été surexprimés dans les cellules souches tumorales
par puce Affymetrix où le seul gène codant surexprimé était le TNNT2, un gène codant la
protéine cardiaque Troponine T2. Nous avons effectué des xénogreffes de tumeurs dans des
souris nude pour enrichir les cellules tumorales. Nous avons par la suite, confirmé que le gène
TNNT2 codant pour la Troponine T2 était surexprimé dans les cellules souches cancéreuses.
Cette expression est constatée dans les cellules CXCR4+ par rapport aux cellules CXCR- après
avoir effectué un tri optimisé de ces cellules.
Nos résultats nous ont permet de dire que le TNNT2 était probablement un marqueur des
cellules souches cancéreuses résistantes aux anti-angiogéniques dans le cancer à cellules
claires rénales. Ce fait que ce gène pourrait être un des acteurs de cette résistance, reste à
confirmer.

23