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Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-252 241

Article original

PDCD6 favorise la prolifération et la métastase des cellules de

carcinome hépatocellulaire par le biais de la voie AKT/GSK3β/β-
caténine*.

WEN Shi Yuan1,# , LIU Yan Tong2 , WEI Bing Yan3 , MA Jie Qiong1 , et CHEN Yan Yan4,#

1. College of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi, Chine ; 2. School of Life
Science and Technology, ShanghaiTech University, Shanghai 201210, Chine ; 3. Shanxi Key Laboratory of
Experimental Animals and Animal Models for Human Diseases, Laboratory Animal Center, Shanxi Medical
University, Taiyuan 030000, Shanxi, Chine ; 4. School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu,
Chine.

Résumé
Objectif La mort cellulaire programmée 6 (PDCD6), une protéine liant le Ca2+ , a été signalée comme
étant exprimée de manière aberrante dans toutes sortes de tumeurs. L'objectif de cette étude était
d'explorer le rôle et le mécanisme de la PDCD6 dans les carcinomes hépatocellulaires (CHC).
Méthodes L e s niveaux d'expression de PDCD6 chez les patients atteints de cancer du foie et dans
les lignées cellulaires de CHC ont été analysés à l'aide de la bioinformatique et de la technique du
Western blotting. La viabilité cellulaire et les métastases ont été déterminées par des tests au
méthylthiazol tétrazolium (MTT) et des tests transwell, respectivement. Le Western blotting a été utilisé
pour tester les biomarqueurs associés et les facteurs de la voie moléculaire dans les lignées cellulaires
du CHC. LY294002, un inhibiteur de PI3K inhibant AKT, a été utilisé pour supprimer la voie AKT/GSK3β/β-
caténine afin d'aider à évaluer le rôle de cette voie dans la carcinogenèse du CHC associée à PDCD6.
Résultats L ' analyse de la base de données de l'Atlas du génome du cancer (The Cancer Genome Atlas
Database) a suggéré que les niveaux d'expression élevés du PDCD6 étaient liés à la progression du
cancer du foie. Ceci est cohérent avec notre découverte de niveaux d'expression de PDCD6 plus élevés
dans les lignées cellulaires de CHC que dans les lignées cellulaires d'hépatocytes normaux. Les résultats
des tests MTT, de migration transwell et de Western blotting ont révélé que la surexpression de PDCD6
régulait positivement la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de CHC. À l'inverse,
l'augmentation de l'expression de PDCD6 en présence d'un inhibiteur de l'AKT a inhibé la prolifération,
la migration et l'invasion des cellules du CHC. En outre, PDCD6 favorise la migration et l'invasion des
cellules du CHC par la transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude mécaniste a prouvé que le
PDCD6 agissait comme un promoteur de tumeur dans le CHC par le biais de la voie AKT/GSK3β/β-
caténine, en augmentant l'expression des facteurs de transcription, la prolifération cellulaire et les
métastases.
Conclusion Le PDCD6 joue un rôle stimulant dans le CHC par le biais de la signalisation AKT/GSK3β/β-
caténine et pourrait être une cible potentielle pour la progression du CHC.
Mots clés : PDCD6 ; Carcinome hépatocellulaire ; Prolifération ; Métastase
Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-252doi :
10.3967/bes2023.027ISSN : 0895-3988
www.besjournal.com (texte intégral) CN : 11-2816/QCopyright ©2023 by
China CDC
 *Ce travail a été soutenu par la Fondation scientifique de la province de Shanxi pour les jeunes [20210302124668] ; le

Fonds de démarrage de la recherche scientifique pour les docteurs de la province de Shanxi [SD2115] ; le Fonds de
démarrage de la recherche scientifique pour les docteurs de l'université médicale de Shanxi [XD2021] ; et les programmes
d'innovation scientifique et technologique des établissements d'enseignement supérieur de Shanxi [2021L215].
#La correspondance doit être adressée à WEN Shi Yuan, maître de conférences, courrier électronique :

shiyuanwen@sxmu.edu.cn, téléphone : 86- 19865848658 ; CHEN Yan Yan, maître de conférences, courrier électronique :
yanyanchen@ujs.edu.cn, téléphone : 86-13610071446.
Notice biographique du premier auteur : WEN Shi Yuan, femme, née en 1992, docteur, maître de conférences,
spécialisée en oncologie.
242 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
de signalisation,
252 dont la Wnt/β-caténine et la
INTRODUCTION phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protéine kinase B
(AKT), ont été impliquées dans la régulation de la TEM

L
e cancer du foie représente 9,1 % de dans le cancer[15] . En outre, ces mêmes voies sont
l'ensemble des décès par cancer dans le également essentielles à la prolifération tumorale[16,17] .
monde. Près de 83 % des cas de cancer du L'AKT est une sérine/thréonine kinase qui active de
foie sont diagnostiqués chez les personnes nombreux processus biologiques, notamment la
âgées. prolifération, la mort cellulaire, les métastases et
Les cancers du foie sont plus fréquents dans les pays l'angiogenèse[16,17] . Une phosphorylation anormale de
sous-développés[1] , 50 % des diagnostics et des l'AKT est
décès liés au cancer du foie étant enregistrés en
Chine[2] . Les carcinomes hépatocellulaires (CHC)
représentent plus de 75 à 90 % de tous les cas de
cancer du foie, tandis que le taux d'incidence du
cancer du foie augmente le plus rapidement parmi
toutes les formes de cancer[3,4] . De nombreuses
thérapies avancées ont eu un impact positif sur le
diagnostic du CHC, mais, en raison d'une incidence
élevée de métastases, l a survie globale des patients
atteints de CHC reste médiocre[5,6] . En outre, le taux
toujours élevé de récidive du CHC entraîne une
faible survie[7] . Il est donc nécessaire d'étudier
d'urgence des cibles potentiellement puissantes
pour le diagnostic précoce et le traitement efficace
du CHC.
La mort cellulaire programmée 6 (PDCD6),
également connue sous le nom de gène 2 lié à
l'apoptose (ALG-2), est une protéine de liaison au
calcium exprimée de manière ubiquitaire. Le gène
PDCD6 code pour cinq structures EF-hand répétitives
en série et un cadre de lecture ouvert de 191 acides
aminés[8] . Plusieurs études ont évalué l'expression
de PDCD6 dans des échantillons cliniques de tissus
tumoraux ou de lignées cellulaires, rapportant des
impacts incohérents de PDCD6 dans différentes
tumeurs et espèces. Le PDCD6 est exprimé de
manière ubiquitaire dans les tissus de souris adultes.
Chez le rat, la PDCD6 est exprimée à des niveaux plus
élevés dans les tissus d'hépatome que dans les tissus
hépatiques normaux[9] . Le PDCD6 est fortement
exprimé dans les tissus du cancer du poumon
humain et dans les cellules métastatiques du cancer
de l'ovaire[9,10] . En outre, PDCD6 régule positivement
la capacité métastatique des cellules de cancer de
l'ovaire[10] . En revanche, de faibles niveaux
d'expression de PDCD6 ont été trouvés dans le
cancer du poumon non à petites cellules et le cancer
gastrique[11,12] . Comme le PDCD6 n'a pas encore été
identifié comme un oncogène ou un inhibiteur de
tumeur dans le CHC, nous avons étudié ces rôles
potentiels du PDCD6 dans les tissus humains du CHC
et les lignées cellulaires cancéreuses.
L'incidence élevée de la migration cellulaire dans
le CHC contribue au mauvais pronostic des patients
atteints de CHC. Il a été démontré que la transition
épithéliale-mésenchymateuse (TEM) joue un rôle
crucial dans l'augmentation de la fréquence des
métastases cancéreuses[13,14] . De nombreuses voies
 PDCD6 dans le carcinome 243
hépatocellulaire HepG2 et Hep3B avec expression stable ou
associée à la malignité et à un mauvais knockdown de PDCD6 ont été placées dans des
pronostic[18] . Dans le CHC, l'augmentation de plaques à 96 puits (3 000 cellules/puits) et incubées
l'activité de l'AKT (état de phosphorylation) avec du MTT pendant 4 h avant d'être placées dans
favorise les événements intracellulaires, tels que du DMSO complet pendant 10 min. L'activité
l'inactivation (phosphorylation) de la glycogène métabolique, indiquée par un changement de la
synthase kinase-3β (GSK3β)[19] . La densité optique, a été déterminée par l'absorbance
phosphorylation à Ser9 bloque l'activité mesurée à 570 nm.
catalytique de la GSK3β, entraînant une
accumulation accrue de β-caténine nucléaire qui
favorise l'expression de facteurs cancérigènes, à
savoir le facteur T-cell/lymphoid enhancer-
binding factor (TCF/LEF), qui à leur tour stimulent
la croissance cellulaire et les métastases[20] .
Les données ci-dessus suggèrent que
l'exploration du mécanisme moléculaire
potentiel pourrait permettre d'identifier des
stratégies thérapeutiques innovantes pour le
CHC. Notre objectif dans cette étude était
d'explorer l'effet et le mécanisme de PDCD6 dans
le CHC. Nous avons découvert que PDCD6
agissait comme un puissant oncogène du CHC,
favorisant la prolifération et la métastase par le
biais de la voie AKT/GSK3β/β-caténine. En
conclusion, nos résultats identifient PDCD6
comme une cible diagnostique et thérapeutique
importante dans le CHC.

PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES

Culture cellulaire et produits chimiques

Les lignées cellulaires humaines de cancer du
foie HepG2 et Hep3B (American Type Culture
Collection ; MD, USA) et la lignée cellulaire
humaine d'hépatocytes normaux LO2 (Chinese
Academy of Sciences, China) ont été cultivées
dans du milieu Dulbecco's modified eagle
medium (DMEM) (Gibco, Thermo Fisher
Scientific, USA) avec 10 % de sérum bovin fœtal
(Gibco, Thermo Fisher Scientific) et 1 % de
pénicilline/streptomycine (Gibco, Thermo Fisher
Scientific) à 37 °C dans 5 % de CO2 . Le LY294002
(CAS# 154447-36-6 ; Sigma-Aldrich Co., MO, USA)
a été dissous par le DMSO sous forme de solution
stock (20 mmol/L) et a été dilué dans le milieu de
culture avant utilisation (cellules traitées avec 10
μmol/L LY294002).
Essai de viabilité cellulaire
Nous avons utilisé un test au méthylthiazol
tétrazolium (MTT), tel que mis en œuvre dans le
kit de test de prolifération cellulaire MTT
(Beyotime, Chine), pour évaluer le métabolisme
cellulaire (un indicateur de la viabilité et de la
croissance cellulaires) et la cytotoxicité des
médicaments expérimentaux (LY294002) sur les
cellules HCC[21] . Pour cet essai, les cellules
244 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
252
exemplaires. Les amorces suivantes ont été utilisées
Essai Transwell pour la RT-qPCR :
La capacité de migration et d'invasion des
cellules a été mesurée à l'aide du test de migration
transwell mis en œuvre dans un système HTS
transwell-24 avec une membrane transwell de 8 μm
de taille de pore (Corning ; NY, USA)[21] . En bref, 200
μL de suspension cellulaire dans un milieu DMEM
sans sérum ont été placés dans la chambre
supérieure, et 600 μL de milieu de culture avec 10%
de sérum ont été placés dans la chambre inférieure
pour la chimio-attraction des cellules. Après 48 h de
culture à 37 °C sous 5 % de CO2 , les cellules
séquestrées dans la chambre supérieure ont été
considérées, par définition, comme non
métastatiques, tandis que les cellules qui ont
traversé la membrane dans la chambre inférieure
ont été considérées comme des cellules invasives.
Les cellules ont été fixées par de l'alcool méthylique
pendant 10 minutes et colorées avec du cristal violet
à 0,1 % pendant 10 minutes avant que les cellules
supérieures ne soient retirées à l'aide de cotons-
tiges. Les cellules métastatiques prélevées dans cinq
zones choisies au hasard dans la chambre supérieure
ont été comptées manuellement au microscope
optique. Pour le test d'invasion, l'adhésion au
Matrigel (un modèle de la couche basale de
l'épithélium) ajouté aux chambres supérieures a été
contrôlée.
Tirage Western
Le test de Western blotting a été réalisé selon le
protocole standard[21] . Tous les anticorps ont été
dilués dans un mélange (20:1) de solution saline
tamponnée au Tween, comme suit :
p-AKT (1:1 000), AKT (1:1 000), GSK3β (1:2 000),
p-GSK3β (1:2 000), β-caténine (1:2 000), Vimentine
(1:1 000) et E-cadhérine (1:1 000), tous achetés
auprès de Cell Signaling Technology (CST ; MA, USA) ;
PDCD6 (1:2 000), β-actine (1:2 000), PCNA (1:2 000),
β-tubuline (1:2 000), et l'anticorps secondaire de
chèvre anti-lapin/souris conjugué à la HRP (1:5 000),
tous achetés auprès de Proteintech (Chine).
RT-qPCR
L'ARN total a été extrait des cellules à l'aide des
réactifs TRIzol (TransGen, Chine). La transcription
inverse de l'ARN en ADN complémentaire (ADNc) a
été réalisée à l'aide du kit de réactifs PrimeScript RT
(TaKaRa, Japon) selon le protocole du fabricant. La
RT-qPCR a été réalisée à l'aide du mélange maître
SYBR® Green Realtime PCR (TaKaRa). Le seuil de
cycle (Ct) a été déterminé séparément pour chaque
gène à partir des changements de plis cibles par la
méthode 2−ΔΔCT après avoir standardisé
l'amplification à la β-actine (le contrôle interne).
Chaque expérience a été réalisée en trois
PDCD6 dans le carcinome qPCR. 245
PDCD6
hépatocellulaire
5′-ATGGCCGCCTCTTACC-3′ (en avant)
5′-TCCTGTCTTTATCGACCCTG-3′ (Reverse)
CCND1
5′-TGTCCTACTTCAAATGTGCA-3′ (en avant)
5′-ATTGGAAATGAACTTCACATCTGT-3′
(Reverse) c-MYC
5′-TGAGGAGACACCGCCCAC-3′ (en avant)
5′-CAACATCGATTTTCCTCATTC-3′ (Reverse)
MMP-7
5′-CAGATGTAGTGCCAGATG-3′ (en avant)
5′-TGTCAGCAGTTCCCCATACA-3′
(Reverse) MMP-9
5′-CTCTGGAGGTTCGACGTGAA-3′ (en avant)
5′-GGCTTTCTCGGTACTGGA-3′ (Reverse)
β-actine
5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′ (en avant)
5′-CTCTAATGTCACGCACGAT-3′ (Reverse)
Surexpression ou shRNA Knockdown de PDCD6
dans des lignées cellulaires de CHC
Nous avons utilisé le vecteur lentivirus
recombinant pLVX- IRES-GFP-puro chargé de
séquences PDCD6 clonées, du gène entier ou de
fragments, pour infecter les lignées cellulaires
humaines HCC et induire la surexpression ou le
knockdown de PDCD6, respectivement. Pour la
surexpression, la séquence entière du gène PDCD6
a été clonée. Pour le knockdown, deux shRNA
personnalisés basés sur des séquences en épingle à
cheveux du gène PDCD6 ont été clonés dans le
vecteur plasmidique pLKO.1. Les séquences shRNA
du gène PDCD6 humain sont les suivantes :
sh PDCD6 #1 :
CCGGCAACTCCGGGATGATCGATAACTCGAGTTATC
GATCATCCCGGAGTTGTTTG sh
PDCD6 #2 :
CCGGGCAGGTTGACGGATATATTCTCGAGAATA
TATCCGTCAACCTGCTTTTTG
Les particules lentivirales recombinantes ont été
fabriquées en transfectant transitoirement les
cellules 293T. Brièvement, à l'aide de la
Lipofectamine 2 000, 4 μg du plasmide de
surexpression ou de shRNA de PDCD6, 2 μg du
plasmide psPAX2 et 1 μg du plasmide pMD2.G ont
été simultanément transfectés dans des cellules
293T ensemencées dans des plaques de culture de
60 mm. Après une incubation de 48 h à 37 °C sous 5
% de CO2 , le surnageant de la culture cellulaire
contenant le virus a été recueilli et filtré. Les
lentivirus recombinants récoltés ont été utilisés
pour infecter les cellules HCC en les incubant
ensemble pendant 48 h après avoir ajouté 3 μg/mL
de polybrène. Après incubation, les cellules HCC
avec surexpression ou knockdown de PDCD6 ont
été criblées avec 2 μg/mL de puromycine avant de
mesurer les niveaux d'expression de PDCD6 dans les
cellules en utilisant le Western blotting et la RT-
246 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
252
sélectionnés dans les données TCGA pour une analyse
Analyse bioinformatique des données de l'Atlas du plus approfondie. Un test t de Student à deux
génome du cancer (TCGA) échantillons appariés a révélé que les niveaux de PDCD6
Les données RNA-seq obtenues à partir étaient significativement plus élevés dans les tissus
d'échantillons de carcinome hépatocellulaire du foie tumoraux que dans les tissus non tumoraux.
ont été téléchargées directement à partir du portail
de données The Cancer Genome Atlas (TCGA)
(https://portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-LIHC).
Sur les 371 cas de carcinome hépatocellulaire du foie
représentés dans les données extraites, nous avons
sélectionné pour une analyse plus approfondie les 50
cas pour lesquels des données appariées étaient
disponibles pour le carcinome hépatocellulaire
primaire et les tissus normaux adjacents. Nous avons
quantifié les niveaux d'expression des gènes en
termes de FPKM (fragments par million de base) sur
la base des résultats de l'ARN-seq.
Statistiques
Les données PDCD6 extraites des échantillons de
carcinome hépatocellulaire en ligne ont été
analysées à l'aide de Prism (version 8.0, GraphPad ;
CA, USA). L'analyse de survie Kaplan-Meier a été
réalisée pour évaluer la valeur pronostique de PDCD6
à l'aide de l ' outil Kaplan-Meier Plotter Online
(http://kmplot. com/analysis/). Le test t de Student
bilatéral implémenté dans Prism a été utilisé pour
identifier les gènes différentiellement exprimés entre
la tumeur primaire et les échantillons normaux
adjacents. P < 0,05 a été défini comme
statistiquement significatif.

RÉSULTATS

L'expression de PDCD6 a été significativement

favorisée dans le CHC
Pour examiner l'importance clinique de PDCD6
dans le CHC, nous avons analysé in silico la
corrélation entre les niveaux d'expression de PDCD6
et les résultats des cas de CHC en utilisant les
données RNA-seq du projet TCGA. Les niveaux
d'expression de PDCD6 étaient significativement plus
élevés chez les 371 patients atteints de CHC que
chez les 50 individus sains de la base de données
(Figure 1A, P < 0,001). En outre, l'analyse de survie
Kaplan-Meier a révélé une survie globale
significativement plus courte chez les patients
présentant des niveaux élevés d'expression de
PDCD6, comme l'indique un rapport de risque de 1,4
(figure 1B, test du log-rank, P = 0,045). Ces résultats
suggèrent que les niveaux élevés d'expression de
PDCD6 sont en corrélation avec les stades avancés
du CHC. Pour tester plus avant la signification
clinique de PDCD6 dans le CHC, les 50 ensembles de
données appariées pour la tumeur primaire et les
échantillons adjacents non tumoraux ont été
 PDCD6 dans le carcinome des phénotypes épithéliaux en phénotypes247
dans les tissus adjacents non tumoraux (figure
hépatocellulaire
1C, P < 0,001). Nous avons confirmé ce résultat mésenchymateux (Figure 3E).
dans une expérience de culture cellulaire, où Une analyse similaire a révélé des résultats
nous avons observé que l'expression de PDCD6 opposés dans les cellules avec PDCD6 knockdown.
était respectivement multipliée par 8,171 et Par rapport au contrôle, le nombre de cellules
6,321 dans les cellules HepG2 et Hep3B par migrantes était réduit (figures 4A et 4B), et la
rapport aux niveaux mesurés dans les lignées capacité des cellules à migrer était réduite.
cellulaires d'hépatocytes normaux (Figure 1D).
Ces résultats suggèrent fortement que PDCD6
pourrait jouer un rôle crucial dans le CHC.
PDCD6 est impliqué dans la viabilité des cellules du CHC
Pour vérifier l'effet latent de PDCD6 dans la
progression du CHC, la surexpression (OV)
(Figure 2A-B) ou le knockdown (KD) (Figure 2C-D)
de PDCD6 dans les cellules HepG2 et Hep3B ont
été établis à l'aide de deux systèmes lentiviraux
recombinants alternatifs et confirmés par
Western blotting (Figure 2A, C) et RT- qPCR
(Figure 2B, D). Le test MTT a révélé que l'activité
métabolique cellulaire (une mesure de la viabilité
cellulaire) était significativement augmentée
dans les cellules HCC avec surexpression de
PDCD6 (Figure 2E) et, au contraire, était
significativement réduite dans les cellules HCC
avec knockdown de PDCD6 (Figure 2F).
L'antigène nucléaire des cellules proliférantes
(PCNA), un marqueur clé de la prolifération
cellulaire, augmentait lorsque PDCD6 était
surexprimé dans les cellules de CHC (figure 2G),
mais diminuait dans les cellules de CHC où
PDCD6 était désactivé (figure 2H). Ces données
indiquent que PDCD6 est impliqué dans la
régulation de la prolifération des cellules du CHC.
PDCD6 améliore la migration et l'invasion des
cellules du CHC par EMT
Ensuite, nous avons cherché à savoir si
PDCD6 affectait la migration et l'invasion des
cellules HCC. Nous avons constaté que les
cellules HepG2 et Hep3B surexprimant de façon
stable PDCD6 présentaient une migration
cellulaire significativement accrue (Figure 3A et
3B) et une capacité d'invasion significativement
accrue à travers le revêtement de la matrice
extracellulaire (Figure 3C et 3D).
Dans les cellules cancéreuses, la progression
de l'EMT est étroitement associée à la métastase
cellulaire. Nous avons donc examiné l'effet de
PDCD6 sur le niveau d'expression des marqueurs
liés à l'EMT, tels que la E-cadhérine et la
vimentine, dans les cellules HepG2 et Hep3B. Les
résultats ont révélé que la surexpression de
PDCD6 était associée à une diminution de l'E-
cadhérine en combinaison avec une
augmentation de l'expression de la vimentine,
démontrant q u e les niveaux de PDCD6 avaient
une influence significative sur la transformation
248 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
252
L'invasion était réduite (figures 4C et 4D) dans les agissant dans le noyau cellulaire pour réguler
cellules HCC dont l'expression de PDCD6 était plusieurs gènes cibles en aval, notamment le (c)-MYC
réduite. Le knockdown de PDCD6 a également été cellulaire, la cycline D1 recombinante (CCND1), la
associé à l'inhibition de la progression de l'EMT par métallopeptidase matricielle 7 (MMP7) et la MMP9.
la régulation à la hausse de la cadhérine E et la En utilisant le test de Western blotting, nous avons
baisse des niveaux de vimentine (figure 4E), ce qui confirmé que le niveau de (p)-AKT phosphorylée, de
est l'inverse des effets observés pour la p-GSK3β et de β-caténine augmentait lorsque PDCD6
surexpression de PDCD6. En résumé, PDCD6 était surexprimé (Figure 5A), alors que l'expression
contribue à l'augmentation des métastases des de chacune des trois protéines était inhibée lorsque
cellules du CHC en induisant la TEM. l'expression de PDCD6 était réduite au silence
(Figure 5B). De plus, en utilisant la RT- qPCR, nous
PDCD6 active l'axe de signalisation
avons déterminé les niveaux d'expression des gènes
AKT/GSK3β/β-caténine dans le CHC
cibles en aval de la β-caténine. Comme le montre la
Dans le cancer, la phosphorylation active AKT figure 5C, la surexpression de PDCD6 a augmenté
qui, à son tour, inactive GSK3β par phosphorylation à l'expression de c-MYC, CCND1, MMP7 et MMP9. À
Ser9, inhibant ainsi la catalyse GSK3β de la l'inverse, l'inactivation de PDCD6 a entraîné la
dégradation de la β-caténine qui conduit à une régulation négative de ces mêmes gènes (figure 5D).
augmentation de l'accumulation cytoplasmique ainsi Ces résultats suggèrent que PDCD6 active
qu'à l'importation nucléaire ultérieure de la β - l'expression de c-MYC, CCND1, MMP7 et MMP9.
c a t é n i n e . La β-caténine est une protéine
transcriptionnelle.

A B
Expression du PDCD6
dans le LIHC
1.0 HR = 1,42 (1,01-2,01)
80 ***
logrank P = 0,045

0.8
60
Niveau d'expression du

0.6
Probabilité

40
0.4
PDCD6

20 Expression
0.2 Faibl
e
Élev
0
0 é
Non-tumeur (n = 50) Tumeur (n = 0 20 40 60 80 100 120
371) Durée (mois)

C D
2

50 LIHC
pG

p3
2
He

He
LO

***
Niveau d'expression du

40 PDCD6

30
β-actine
20
PDCD6

10

0
Non-tumeur Tumeur

Figure 1. PDCD6 est significativement régulé à la hausse dans les tissus et les lignées cellulaires du cancer
hépatocellulaire humain. (A) Niveaux d'expression de PDCD6 extraits de la base de données TCGA pour
371 cas (médiane de 18,57 unités) de tumeurs et 50 cas non tumoraux (médiane de 7,712 unités). (B)
Analyses de survie Kaplan-Meier des patients atteints de carcinome hépatocellulaire (LIHC). Une forte
expression de PDCD6 était associée à une survie courte (rapport de risque = 1,42). (C) Niveaux de PDCD6
dans 50 tissus LIHC (médiane de 17,95 unités) et 50 tissus normaux adjacents (médiane de 7,712 unités)
de la base de données TCGA. (D) Les niveaux d'expression de la protéine PDCD6 ont été détectés par
Western blotting dans une lignée cellulaire d'hépatocytes normaux (LO2) (médiane de 1,015 unité) et
PDCD6
dansdans
deuxle lignées
carcinomecellulaires de CHC ( HepG2 et Hep3B) (médianes de 8,171 unités et 6,321 unités,249
hépatocellulaire
respectivement). P < 0.001.
***
250 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
A B 15 252
6 6 ***
CD CD ***

par qPCR (Fold)

- -PD V- ur V-PD
OV cteur OV O cte O 10 OV-Vector

Expression de
ve ve OV-PDCD6
PDCD6

l'ARNm
5
β-
actine HepG2 Hep3B
0
HepG2 Hep3B

C D 1.5

6#1 6#2 6#1 6#2 KD-Vector

par qPCR (Fold)

eur DCD DCD eur DCD DCD KD-PDCD6#1
ct KD-P -P ct KD-P -P 1.0
KD KD

Expression de
Ve Ve KD-PDCD6#2
KD KD
PDCD6

l'ARNm
0.5
******
β- ******
actine Hep3B 0
HepG2
HepG2 Hep3B
E
1.0 HepG2 0.6 Hep3B
OV-
*** ***
0.8 *** Vecteur
***
** 0.4 ** OV-PDCD6
0.6
OD 570

OD 570

** **
**
0.4 * **
* 0.2
0.2

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Jours Jours
F
0.8 HepG2 0.6 Hep3B
KD-Vector
** ***
0.6 ** ** KD-PDCD6#1
*
* 0.4 KD-PDCD6#2
OD 570

OD 570

0.4
0.2
0.2

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Jours Jours
G H
6 6 6#1 6#2 6#1 6#2
CD CD eur PDCD PDCD teur PDCD PDCD
- -PD V- ur V-PD Ve
ct
KD
-
KD
-
Ve
c KD
-
KD
-
OV cteur OV O cte O
ve ve KD KD
PCNA PCNA

β- β-
tubuline tubuline
HepG2 Hep3B HepG2 Hep3B

Figure 2. PDCD6 favorise la prolifération cellulaire dans les lignées cellulaires humaines de CHC. Des
lentivirus recombinants ont été utilisés pour établir (A, B) la surexpression de PDCD6 ou (C, D) le
knockdown de PDCD6 dans les cellules HepG2 et Hep3B, ce qui a été déterminé par (A, C) Western
blotting et (B, D) RT-qPCR. Un test MTT a été réalisé pour déterminer l'effet sur la prolifération cellulaire
dans les cellules HepG2 et Hep3B par (E) la surexpression ou (F) l'inactivation de PDCD6. L'expression de
la protéine PCNA liée à la prolifération a été détectée par analyse western blotting pour les cellules HCC
avec (G) PDCD6-overexpression ou (H) PDCD6-knockdown (H). Les données présentées en B, D, E et F
sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. *P < 0,05,** P < 0,01,*** P < 0,001.
PDCD6 dans le carcinome
hépatocellulaire
Axe de signalisation AKT/GSK3β/β-caténine dans les
cellules du CHC.
PDCD6 favorise la prolifération et la métastase
des cellules du CHC par le biais de la voie
AKT/GSK3β/β-caténine
Pour déterminer si les effets observés du PDCD6
sur la prolifération et les métastases du CHC étaient
médiés par l'axe de signalisation AKT/GSK3β/β-
caténine, nous avons incubé les cellules HepG2 et
Hep3B avec 10 μmol/L LY294002 (un inhibiteur de
PI3K et un inhibiteur indirect d'AKT par la voie
PI3k/AKT) pendant 48 h pour limiter les activités
moléculaires dans la voie AKT/GSK3β/β-caténine.
Ensuite, nous avons utilisé le Western blotting pour
déterminer comment l'expression des protéines
connues pour être actives dans la voie AKT/GSK3β/β-
caténine changeait dans les cellules inhibées par
l'AKT. L'analyse a révélé que l'augmentation des
niveaux de p-AKT,
251
p-GSK3β et β-caténine causées par la surexpression
de PDCD6 ont été inversées par le traitement au
LY294002 (Figure 6A). En outre, le LY294002 a
également complètement inversé la viabilité accrue
de la prolifération des cellules HCC causée par la
surexpression de PDCD6 (Figure 6B). De même, le
traitement au LY294002 des cellules HepG2 et
Hep3B surexprimant PDCD6 a inversé
l'augmentation de la capacité de migration (Figure
6C et 6D) et d'invasion (Figure 6E et 6F) des cellules.
Ces observations prouvent que PDCD6 agit en amont
de la voie AKT/GSK3β/β-caténine pour promouvoir la
prolifération cellulaire et les métastases dans le CHC.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Dans cette étude, nous avons étudié le rôle et les
mécanismes moléculaires de PDCD6 dans la
prolifération du CHC.

A MigrationOV-Vecteur B
OV-PDCD6 500 Migration OV-Vecteur
** OV-PDCD6
400
HepG2 **
Numéro de

300
cellule

200

100
Hep3B
0
HepG2 Hep3B
C D
Invasion OV-Vecteur OV-PDCD6 Invasion
400
***
OV-Vecteur
300 OV-PDCD6
HepG2
Numéro de

***
200
cellule

100
Hep3B

0
HepG2 Hep3B
6 6
E CD CD
V- ur V-PD V- ur V-PD
O cte O O cte O
ve ve
E-cadhérine

Vimentine

β-actine
HepG2 Hep3B

Figure 3. La surexpression de PDCD6 favorise la migration et l'invasion des cellules du CHC. Les tests
transwell ont été utilisés pour déterminer la capacité de migration (A, B) ou d'invasion (C, D) des cellules
HepG2 et Hep3B avec la surexpression de PDCD6. (E) Les niveaux d'expression des protéines marqueurs
de l'EMT E-cadhérine et vimentine ont été détectés dans les lignées cellulaires HCC surexprimant PDCD6
à l'aide d'un Western blotting. Les données indiquées sont la moyenne ± SD de trois expériences
indépendantes. *P < 0,05,** P < 0,01,*** P < 0,001.
252
et les métastases. Sur la base des preuves
accumulées et des résultats présentés ici, nous
pensons que la PD peut être un oncogène important
dans le CHC. Nous avons montré, à l'aide d'une
analyse bioinformatique de la base de données TCGA,
que des niveaux d'expression élevés de PDCD6
prédisaient une mauvaise issue pour les patients
atteints de CHC, de sorte que PDCD6 pourrait jouer
un rôle important dans la pathogenèse du CHC. Nous
avons manipulé génétiquement des cellules de CHC
pour surexprimer ou rendre silencieux le PDCD6 et
nous avons constaté que la surexpression du PDCD6
augmentait la prolifération, la migration et l'invasion
des cellules de CHC, tandis que la réduction au
silence du PDCD6 avait l'effet inverse, affaiblissant la
viabilité des cellules de CHC et leur capacité
métastatique. En outre, nous avons constaté que,
dans les cellules de CHC, la surexpression de PDCD6
activait l'activité AKT (par phosphorylation), qui à
son tour phosphorylait GSK3β (à Ser9), inhibant
l'activité catalytique de GSK3β. L'inactivation de
GSK3β a conduit à une accumulation accrue de β-
caténine nucléaire, accélérant les taux de
transcription des gènes en aval, y compris c-MYC,
CCND1, MMP7 et MMP9, qui stimulent la
tumorigenèse du CHC et l'EMT (Figure 7).
Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
252
Dans l'ensemble, notre étude a révélé que PDCD6
était régulé à la hausse dans le CHC, favorisant la
prolifération des cellules du CHC et les métastases
par le biais de la voie AKT/GSK3β/β-caténine.
Des études ont rapporté les effets opposés de
PDCD6 dans différentes tumeurs. Certains résultats
ont indiqué que PDCD6 était un biomarqueur
pronostique pour le cancer gastrique à un stade
avancé et que PDCD6 était plus fortement exprimé
dans le cancer ovarien métastatique, facilitant la
migration et l'invasion des cellules[22,23] . En outre, le
PDCD6 a également été considéré comme un
biomarqueur pronostique potentiel pour
l'adénocarcinome précoce et le cancer de la bouche
avancé[24,25] . Néanmoins, plusieurs rapports ont
révélé que PDCD6 pouvait être considéré comme un
gène inhibiteur dans une variété de tumeurs
humaines. Dans les cellules ovariennes, PDCD6 régule
positivement l'activité antitumorale et l'apoptose en
ciblant la voie PI3K/mTOR/p70S6K[26] . Des preuves
convaincantes ont été rapportées que PDCD6 était
un nouveau gène répondant à la p53, s'accumulant
dans le noyau en réponse à l'apoptose.

A B Migration
Migration KD-VectorKD-PDCD6#1KD-PDCD6#2 400

HepG2 300 KD-Vector

Numéro de

KD-PDCD6#1
200 KD-PDCD6#2
cellule

***
100 ***
Hep3B ***
***
0
HepG2 Hep3B

C D Invasion
Invasion KD-VectorKD-PDCD6#1 KD-PDCD6#2 300
KD-Vector
HepG2 KD-PDCD6#1
200
Numéro de

KD-PDCD6#2
cellule

100 ***
Hep3B ***
***
***
0
HepG2 Hep3B
E
6#1 6#2 6#1 6#2
eur DCD DCD eur DCD DCD
ct KD-P KD-P ct KD-P KD-P
Ve Ve
KD KD
E-cadhérine

Vimentine

β-actine

HepG2 Hep3B

Figure 4. Le knockdown de PDCD6 réprime la migration et l'invasion des cellules HCC. Les mêmes
PDCD6 dans leavec
expériences, carcinome
des résultats affichés de façon similaire, que dans la figure 3, mais pour les cellules 253
hépatocellulaire
HepG2 et Hep3B avec PDCD6 knockdown. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois
expériences indépendantes. *P < 0,05,** P < 0,01,*** P < 0,001.
254 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
252
induite par les dommages à l'ADN[27] . Notre étude 80 % des tumeurs malignes humaines proviennent
suggère que PDCD6 est un oncogène tumoral crucial de tissus épithéliaux tels que le poumon, le foie et le
régulant la voie AKT/GSK3β/β-caténine dans le CHC. côlon[31] . Au cours de l'EMT, l'instabilité de
Les patients atteints de CHC sont souvent l'adhésion basée sur la cadhérine E entraîne la
diagnostiqués à un stade avancé en raison du taux perturbation de l'adhésion cellule-cellule et
élevé de métastases dans le CHC qui facilite la augmente les métastases dans les tumeurs[32] .
récurrence du cancer. L'EMT est le processus de Plusieurs études ont rapporté que l'expression
modification du profil cellulaire, dans lequel les aberrante de PDCD6 induisait la voie de l'EMT pour
cellules épithéliales perdent leur organisation favoriser l'invasion et les métastases dans divers
polarisée et acquièrent la capacité de migrer et cancers[13] . Néanmoins, des recherches
d'envahir le mésenchyme[28] . Le processus d'EMT est supplémentaires sont nécessaires pour mieux
étroitement lié au développement et à la comprendre le mécanisme moléculaire par lequel
progression de diverses tumeurs malignes, y compris PDCD6 régule l'EMT.
le CHC[29,30] . Il convient donc de noter qu'environ De plus en plus d'éléments prouvent que
plusieurs voies de signalisation, y compris la voie
Wnt/β-caténine,

A B
6 6 #1 #2 #1 #2
CD CD D6 D6 D6 D6
V- ur V-PD V- ur V-PD cteur -PDC -PDC cteur -PDC -PDC
O cte O O cte O Ve KD KD Ve KD KD
ve ve KD KD
p-AKT p-AKT

AKT AKT

p-GSK3β p-GSK3β

GSK3β GSK3β

β- β-caténine
caténine

GAPDH GAPDH
HepG2 Hep3B HepG2 Hep3B

C HepG2 Hep3B
6 6 ***
*** *** *** *** ***
*** *** OV-
par qPCR (Fold)

par qPCR (Fold)

Vecteur
Expression de

Expression de

4 4
OV-PDCD6
l'ARNm

l'ARNm

2 2

0 0
c-MYCCCND1 MMP7 c-MYCCCND1 MMP7
MMP9 MMP9
D
1.5 HepG2 1.5 Hep3B
KD-Vector
KD-PDCD6#1
par qPCR (Fold)
par qPCR (Fold)

Expression de
Expression de

1.0 1.0 KD-PDCD6#2

l'ARNm
l'ARNm

0.5 ** ** 0.5
** ** ** ** *** *** ******
***** *** ****** ***
0 0
c-MYCCCND1 MMP7 MMP9 c-MYCCCND1 MMP7 MMP9

Figure 5. Le PDCD6 induit l'activation de la voie de signalisation AKT/GSK3β/β-caténine. (A, B) L'AKT, la p-

AKT, la GSK3β, la p-GSK3β et la β-caténine exprimées ont été détectées par Western blotting dans les
cellules HepG2 et Hep3B ayant reçu des doses de
(A) surexpression de PDCD6 ou (B) knockdown de PDCD6. (C, D) Les niveaux d'ARNm des cibles en aval de
la β-caténine ont été quantifiés par RT-qPCR à partir de l'ARN total extrait des cellules HepG2 et Hep3B
PDCD6
avecdans
une le carcinome stable de PDCD6 (C) ou un knockdown de PDCD6 (D). Les données présentées255
surexpression
hépatocellulaire
sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. *P < 0,05,** P < 0,01,*** P < 0,001.
256 Biomed Environ Sci, 2023 ; 36(3) : 241-
A Vecteur PDCD6Vecteur PDCD6 252
DMSO DMSO LY294002 DMSO DMSO LY294002

PDCD6

p-AKT

AKT

p-GSK3β

GSK3β

β-caténine

GAPDH
HepG2 Hep3B
B
1.0 HepG2 0.6 Hep3B
*** *** OV-Vecteur
0.8 *** OV-PDCD6
*** ### 0.4 ### OV-PDCD6 + LY294002
** **
0.6 **
OD 570

OD 570

** ## ##
* ## ** ##
0.4 # #
0.2 * #
0.2

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Jours Jours

C OV- OV-PDCD6 D
Migration Vecteur DMSO LY294002 500 Migration
OV-Vector + DMSO
DMSO *** OV-PDCD6 + DMSO
400 ** OV-PDCD6 + LY294002
HepG2
Numéro de

300
## ###
cellule

200

Hep3B 100

0
HepG2 Hep3B
E OV-Vecteur OV-PDCD6 F
400 Invasion
Invasion DMSO DMSO LY294002
***
300
HepG2 *** OV-Vector + DMSO
Numéro de

OV-PDCD6 + DMSO
200 OV-PDCD6 + LY294002
cellule

###
100 ###
Hep3B
0
HepG2 Hep3B

Figure 6. PDCD6 favorise la croissance tumorale et la métastase par la voie AKT/GSK3β/β-caténine. Les
cellules HepG2 et Hep3B surexprimant PDCD6 ont été prétraitées avec LY294002 (10 μmol/L) pendant 48
h. (A) L'analyse par transfert Western a indiqué que le traitement par LY294002 a conduit à l'inversion de
l'augmentation de l'expression d'AKT, p-AKT, GSK3β, p-GSK3β et β - c a t é n i n e induite par la
surexpression de PDCD6. Le DMSO a été utilisé comme contrôle. (B) Le test MTT du métabolisme
cellulaire (indiquant la viabilité et la prolifération) a indiqué que le LY294002 a inversé la prolifération
cellulaire accrue. En outre, les tests transwell ont démontré que le LY294002 a également inversé
l'amélioration de la migration cellulaire (C, D) et de la capacité d'invasion cellulaire (E, F). Les données
présentées sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. *P < 0,05,** P < 0,01,*** P < 0,001,
par rapport au groupe témoin. #P < 0 , 05,## P < 0 , 01,### P < 0,001, par rapport au groupe de
surexpression de PDCD6.
PDCD6 dans le carcinome
hépatocellulaire
PI3K/AKT et NF-κB sont liés à un programme EMT
aberrant dans le cancer[33,34] . L'AKT est positivement
associé à la tumorigenèse cellulaire et à la
métastase[35] . GSK3β améliore la perméabilité de la
membrane mitochondriale et entraîne l'apoptose
cellulaire. Cependant, l'AKT phosphoryle GSK3β, ce
qui inactive et inhibe GSK3β pour supprimer
l'apoptose cellulaire. La phosphorylation de GSK3β
peut entraîner la séparation de la β-caténine du
complexe GSK3β et conduit à son importation
ultérieure dans le noyau. Les niveaux accrus de β-
caténine dans le noyau activent les facteurs de
transcription TCF/LEF, tels que la famille MMP, c-
MYC, CCND1, CD44, Slug et C-JUN, induisant ainsi la
prolifération et l'EMT des cellules cancéreuses[36,37] .
Les MMP, une famille d'endopeptidases
structurellement apparentées et dépendantes du zinc
et du calcium, dégradent les matrices extracellulaires
et facilitent le programme d'EMT[35] . La
surexpression de c-MYC et de CCND1 peut entraîner
la prolifération et induire des gènes liés au cycle
cellulaire[38,39] . Ces études ont démontré que la voie
AKT/GSK3β/β-caténine activée de manière aberrante
joue un rôle important dans la progression maligne.
Nos résultats indiquent clairement que PDCD6
favorise la prolifération cellulaire et les métastases
par l'intermédiaire de la voie AKT/GSK3β/β-caténine.
257
dans le CHC.
En conclusion, nos résultats actuels ont révélé
l'effet et les mécanismes moléculaires de PDCD6
dans la promotion de la prolifération et de la
capacité métastatique du CHC. PDCD6 régule l'axe de
signalisation AKT/GSK3β/β-caténine pour
promouvoir ces caractéristiques malignes dans le
CHC. Étant donné le rôle crucial de PDCD6 dans la
progression agressive du CHC, PDCD6 peut être
considéré comme une cible diagnostique et
thérapeutique potentielle pour le CHC.
CONTRIBUTIONS DES AUTEURS
WEN Shi Yuan et CHEN Yan Yan ont conçu et
élaboré le projet. WEN Shi Yuan et LIU Yan Tong ont
réalisé les expériences. MA Jie Qiong et WEI Bing Yan
ont participé à la discussion scientifique et à la
conception de la recherche. WEN Shi Yuan a rédigé
et révisé le manuscrit.
CONFLITS D'INTÉRÊTS
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Figure 7. Schémas des voies de régulation moléculaire qui sous-tendent la prolifération et les métastases
favorisées par PDCD6 dans le CHC. PDCD6 augmente l'expression de p-AKT et p-GSK3β. Ceci, à son tour,
favorise l'accumulation de β-caténine (dégradation réduite par GSK3β) dans le cytoplasme et l'entrée de
la β-caténine dans le noyau pour activer la transcription génétique des protéines en aval dans la famille
TCF/LEF pour contrôler les processus cellulaires, tels que la prolifération et la métastase.
258
Reçue : 17 juillet 2022 ;
Accepté : 20 septembre 2022
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