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Cytothérapie 25 (2023) 537-547

CYTÔ H R.APY
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ARTICLE PLEINE LONGUEUR

Fabrication

Génération de cellules T infiltrant les tumeurs (TIL) dérivées du cancer du côlon pour la
thérapie cellulaire adoptive

Hendrik Christian Albrecht1,6,*,**, Dirk Gustave2,*, Jannis Schwanemann1,6,

Werner Dammermann3,6, Frank Lippek4,6, Karsten-Henrich Weylandt5,6, Hans Hoffmeister2,
Stéphane Gretschel1,6
1Département de chirurgie générale, viscérale, thoracique et vasculaire, hôpital universitaire Ruppin-Brandenburg, Neuruppin, Allemagne
2Zellwerk GmbH - HiPer-Group, Eichsta€dt, Allemagne
3Centre de médecine interne II, Hôpital universitaire de Brandebourg, Brandebourg, Allemagne
4Institut de pathologie et de cytologie, Hôpital universitaire Ruppin-Brandenburg, Neuruppin, Allemagne
5Service médical, divisions de gastroentérologie, hépatologie, oncologie, hématologie, endocrinologie, hôpital universitaire Ruppin-Brandenburg, Neuruppin, Allemagne

6Faculté des sciences de la santé de Brandebourg, Faculté de médecine de Brandebourg Theodor Fontane, Neuruppin, Allemagne

ARTICLE INFO BSTRACT

Historique des articles : La thérapie cellulaire adoptive (ACT) utilisant des cellules immunitaires spécifiques et des cellules souches est apparue comme une option
Reçu le 18 mai 2022 thérapeutique prometteuse qui pourrait compléter les thérapies anticancéreuses traditionnelles à l’avenir. En particulier, les lymphocytes
Accepté le 13 janvier 2023
infiltrant les tumeurs (TIL) se sont révélés efficaces contre les tumeurs solides dans divers essais cliniques. Malgré l'énorme fardeau de la
maladie et le grand nombre de décès prématurés causés par le cancer colorectal (CCR), les études sur les TIL isolées du tissu tumoral de
Mots clés: patients atteints de CCR sont encore rares. À ce jour, les études sur l’ACT manquent souvent de processus d’expansion contrôlés et
thérapie cellulaire adoptive comparables ainsi que de populations de lymphocytes T sélectionnées pertinentes pour l’ACT. Nous décrivons une procédure pour
cancer colorectal générer des TIL spécifiques au patient, qui sont des conditions préalables aux essais cliniques d'ACT dans le CCR. La fabrication et les
dosage des cytokines
caractéristiques de ces TIL diffèrent dans des modalités importantes des TIL couramment utilisés pour cette approche thérapeutique. Des
immunothérapie
échantillons de tissus tumoraux ont été obtenus auprès de 12 patients subissant une intervention chirurgicale pour un CCR primaire,
bioréacteur à perfusion
thérapie personnalisée contre le cancer,
principalement présentant une faible instabilité microsatellitaire (pMMR-MSI-L). Les tumeurs présentes dans les échantillons réséqués

production de masse de lymphocytes T ont été examinées pathologiquement et un volume approuvé de tissu tumoral a été transféré dans un bioréacteur à perfusion jetable.
lymphocytes infiltrant les tumeurs Les échantillons de tissus ont été soumis à un processus de culture contrôlé automatiquement et hautement reproductible dans un
système de bioréacteur à perfusion fermé conforme aux BPF utilisant un milieu de départ contenant de l'interleukine-2 et de
l'interleukine-12. La croissance de TIL à partir d'échantillons de tissus a été initiée par une supplémentation à court terme avec un cocktail
d'activation spécifique. Au cours de l'expansion ultérieure, les TIL ont été cultivées dans un milieu enrichi en interleukine-2. L'expansion
des TIL dans un processus en deux phases à faible échelle dans le bioréacteur Zellwerk ZRP dans des conditions hyperoxiques a abouti à
un nombre d'environ 2£dix9cellules. Les TIL élargis étaient principalement constitués (73 %) de CD3 pertinents pour l'ACT.+/CD8+
phénotype de mémoire effectrice (CD45RO+/CCR7-). Les TIL récoltés dans ces conditions présentaient un potentiel fonctionnel élevé,
confirmé par stimulation non spécifique (interféron-g, facteur de nécrose tumoral-undosage des cytokines)
© 2023 Société internationale de thérapie cellulaire et génique. Publié par Elsevier Inc. Ceci est un article en libre accès sous
la licence CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

IntroductionFin tagué TaggedFinTaggedPmange. Il s’agit de la troisième maladie tumorale la plus répandue

Le carcinome colorectal (CCR) est l'une des tumeurs malignes du tube digestif
les plus courantes et une cause importante de cancers liés au cancer.
* * Correspondance : Hendrik Christian Albrecht, Département de chirurgie générale, viscérale,
thoracique et vasculaire, Hôpital universitaire Ruppin-Brandenburg, Neuruppin, Allemagne.
chez les deux sexes dans le monde et la deuxième cause de décès parmi tous les cancers.
1,2]. Au fil des décennies, le traitement classique de ces tumeurs, c'est-à-dire l'excision
chirurgicale, la chimiothérapie standard et la radiothérapie, a été perfectionné, ce qui a
permis de prolonger considérablement la survie, en particulier pour les tumeurs
détectées aux premiers stades de la maladie. Malgré les programmes de dépistage et les
stratégies préventives, environ 25 % des patients présentent encore des stades tumoraux
tardifs. Les progrès en matière de chirurgie et l’expansion des options de traitement

Adresse e-mail:h.albrecht@ruppiner-kliniken.de (HC Albrecht). systémique n’apportent qu’une faible amélioration de la survie médiane chez les patients
* Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale. atteints de CCR métastatique. Ces dernières années, la mortalité

https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2023.01.009
1465-3249/© 2023 Société internationale de thérapie cellulaire et génique. Publié par Elsevier Inc. Il s'agit d'un article en libre accès sous la licence CC BY-NC-ND (http://
creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
538 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
a légèrement augmenté chez les patients plus âgés (> 50 ans) mais est resté stable chez
les patients plus jeunes (20-49 ans) [3,4].
il existe un besoin de stratégies thérapeutiques efficaces, en particulier dans les tumeurs
chimioréfractaires. Les CRC présentant une charge mutationnelle élevée répondent à
l'immunothérapie. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (anticorps programmés
spécifiques à la mort 1 comme le pembrolizumab ou le nivolumab) obtiennent des réponses
durables dans le CRC par mésappariement, réparation déficiente, instabilité des microsatellites
élevée (dMMR-MSI-H)[5]. Seules les tumeurs avec dMMR-MSI-H répondent à l'immunothérapie
avec des inhibiteurs de point de contrôle[5]. Cependant, les tumeurs dMMR MSI-H sont
retrouvées chez seulement 15 % des patients atteints de CCR.6,7].
Récemment, le transfert cellulaire adoptif (ACT) utilisant des lymphocytes T infiltrant
la tumeur (TIL), l'insertion d'un récepteur d'antigène chimérique ou la modification du
récepteur des lymphocytes T est apparu comme une approche prometteuse pour le
traitement des tumeurs. ACT peut être utilisé pour exploiter la réponse immunitaire des
lymphocytes T de l'hôte pour l'immunothérapie dans laquelleex vivoLes TIL activés et
expansés en masse provenant de tumeurs individuelles réséquées sont réinjectés au
patient. L'ACT utilisant les TIL a obtenu une rémission complète durable chez 20 à 25 %
des patients atteints de mélanome métastatique[8]. Des traitements efficaces ont
également été rapportés pour d'autres tumeurs solides, telles que le cancer du col de
l'utérus et le cancer des ovaires.9,dix].
des études antérieures ont montré que les interactions entre le
microenvironnement immunitaire et la réponse immunitaire médiée sont liées à
un pronostic favorable du CCR[11-14]. Un degré élevé de lymphocytes infiltrant les
tumeurs (TIL) dans les échantillons est associé à une diminution du caractère
invasif de la tumeur, à une moindre atteinte ganglionnaire et à une amélioration
de la survie.[15-19].
Malgré l'énorme fardeau de la maladie et le grand nombre de décès
prématurés causés par le CCR, et malgré la justification d'une approche
immunothérapeutique, cette entité n'a été qu'un objet mineur dans la recherche
en thérapie cellulaire.[20-22]. De plus, les études sur l’ACT manquent souvent de
processus d’expansion contrôlés et comparables ainsi que de populations de
lymphocytes T sélectionnées pertinentes pour l’ACT.
Le but de cette étude était d'étudier la faisabilité de l'isolement des TIL à
partir d'échantillons de tissus CRC et de l'expansion massive des TIL pour l'ACT
dans un processus contrôlé en deux phases dans un bioréacteur à perfusion. Les
TIL élargis ont été caractérisés en fonction du phénotype et l'activité a été
déterminée sur la base de la cytotoxicité pour différentes stimulations.
Méthodes
échantillons d'humour
des échantillons de tissus tumoraux ont été obtenus auprès de patients
atteints d'un CCR primaire subissant une résection chirurgicale sans
chimiothérapie, radiothérapie ou immunothérapie préopératoires au département
de chirurgie générale, viscérale, thoracique et vasculaire, hôpital universitaire
Ruppin-Brandenburg, faculté de médecine de Brandebourg, dans le cadre d'une
étude visant à analyser les acides gras essentiels/médiateurs lipidiques et leur
fonction dans les tumeurs solides (Comité d'éthique de la faculté de médecine de
Brandebourg n° Z-03-20170508). Tous les patients ont donné leur consentement
éclairé écrit pour participer à l'étude et ont été inclus 12 tumeurs primitives du
côlon obtenues par résection chirurgicale à visée curative. Des données cliniques
supplémentaires sur les patients sont répertoriées dansTableau 1. Après résection
chirurgicale, les tumeurs ont été localisées dans la pièce et ouvertes par une
incision du côté luminal ou extraluminal. Le centre de la tumeur, la marge invasive
et l'environnement péritumoral ont été identifiés et des échantillons de tissus ont
été prélevés dans la zone de la marge invasive.
Caractérisation pathologique et transport versin vitrotraitement
Les IL ont été quantifiées dans les échantillons de tissus obtenus avant
expansion et leur phénotype a été caractérisé. Pour ce processus, des échantillons
de tissus inclus en paraffine et fixés dans du formol ont été utilisés et des lames
colorées à l'hématoxyline-éosine (H&E) ont été préparées.
La méthode standardisée pour l'évaluation des TIL dans les tumeurs
solides sur les coupes H&E a été appliquée conformément aux directives de
le Groupe de travail international sur les biomarqueurs en immuno-oncologie[23].
Une évaluation H&E semi-quantitative des TIL a été réalisée à 200-400£
grossissement. De plus, des échantillons de tissus ont été examinés par
immunohistochimie pour détecter toute infiltration de lymphocytes T CD4 et CD8
positifs (Figure 1 supplémentaire).
TaguéPLes anticorps suivants ont été utilisés pour l’immunocoloration : mono-
CD4 clonal de souris anti-humain (Agilent Technologies [Santa Clara, CA,
USA], 4B12, prêt à l'emploi) et monoclonal de souris anti-CD8 humain
(Agilent Technologies, C8/144B, prêt à l'emploi).
Les lames immuno-colorées ont été analysées de manière semi-quantitative
par un pathologiste, qui a évalué le rapport entre le nombre de cellules
positivement colorées et le nombre total de cellules dans cinq champs de
puissance élevée. Les zones présentant une nécrose importante, une hémorragie
ainsi que des artefacts histologiques ont été exclues de l'analyse.
TaguéPdes échantillons de tissus tumoraux de chaque donneur ont été transportés au
laboratoire dans des conditions antibiotiques et antifongiques (CellGenix
GMP DC Medium [Sartorius CellGenix, Freiburg, Allemagne], 10 % de sérum
humain [PAN Biotech, Bavière, Allemagne], 100 unités de pénicilline, 0,10 mg
de streptomycine et 0,25mg d'amphotéricine B par mL [Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA]).
À la suite d'événements de contamination au cours de la culture primaire
et de la perte de deux échantillons de tumeurs, le milieu de transport a été
rempli de réactif antibiotique-antimycotique doublement concentré (200
unités de pénicilline, 0,20 mg de streptomycine et 0,50mg d'amphotéricine B
par millilitre).
Activation et expansion du TIL en mode bioréacteur à perfusion
TaguéPréparation du tissu tumoral, culture etex vivoexpansion de
Les lymphocytes infiltrant les tumeurs ont été réalisés selon un procédé de
culture exclusif développé par Zellwerk GmbH [24,25]. Le tissu tumoral a été
coupé en 2£2£Morceaux de 2 mm et versés dans 15 ml de milieu de culture
complet (CCM), composé de milieu CellGenix GMP DC (Sartorius CellGenix),
10 % de sérum humain (PAN Biotech), 1 % de solution antibiotique
antimycotique (100 unités de pénicilline, 0,10 mg de streptomycine et 0,25m
g d'amphotéricine B par millilitre) (Sigma-Aldrich) et 1 000 UI/mL d'IL-2
humaine (Proleukin ; Clinigen, Burton upon Trent, Royaume-Uni). Après avoir
ajouté 10 ng par millilitre d'IL-12 humaine (qualité premium ; Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Allemagne), la suspension a été transférée via un port
directement dans un bioréacteur à perfusion. La croissance, l'activation et
l'expansion de TIL ont été réalisées dans un bioréacteur à perfusion 30MM à
usage unique, conforme aux BPF et complètement fermé. Les essais en
bioréacteur ont été effectués sur une plate-forme de surgénérateur GMP,
€mer, Allemagne) et associ-
Control Unit (tous deux de Zellwerk GmbH, Oberkra
logiciel créé [26,27]. Cette plateforme permet la mesure et le contrôle de la
température du milieu, du pH et de la pO2(point de consigne pour la température :
36,5°C ; pour le pH : 7,2-7,3 [régulé par le CO2afflux]; pour PO2: 25% [en utilisant
un mélange gazeux de 25% O2et 75% N2]).
TaguéPLa première période de culture au sein d'un bioréacteur comprenait
6-8 jours. L'inoculation a été réalisée avec différents nombres de morceaux de tissus
dans du CCM avec 10 ng par millilitre d'IL-12 humaine dans des conditions d'aération
statique (5 % de CO2, 25% O2, 70%N2). Dans les deux premières expériences, nous avons
inoculé 50 morceaux de tissus, chacun dans un volume total de 400 mm.3. Plus tard, le
volume tissulaire total a été réduit à 240 mm3(30 pièces, quatre donneurs) et ensuite, de
chacun des 5 donneurs 10 pièces (80 mm3) ont été inoculés, ce qui a permis d'obtenir le
meilleur rendement. Aux jours 3 à 5 de la première période de culture, la croissance et
l'expansion de TIL sont initiées par une courte poussée d'activation : un cocktail
contenant 30 ng par millilitre d'anticorps anti-CD3 humain (clone OKT3 ; Miltenyi Biotec)
et un certain nombre de 2 millions d'anticorps allogéniques. des cellules nourricières
humaines par morceau de tumeur (irradiées avec 55 Gy) sont perfusées une fois dans un
bioréacteur. Au cours des 3 à 5 jours suivants, une croissance accélérée des TIL est
observée.
TaguéPLa deuxième période de culture commence avec le démarrage du milieu de culture.
lation dans la cuve du bioréacteur ainsi qu'un afflux continu de CCM
frais. Le processus de culture est désormais automatiquement contrôlé
par un algorithme basé sur des mesures continues de pH, pO2et
 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547 539

Tableau 1
Patients et caractéristiques des tumeurs.

Donneur Âge, oui Sexe Préparation Site tumoral Classification des tumeurs (UICC) MSI-H/MSS

TIL-52.1 85 m Luminal Côlon ascendant pT3 pN0 (0/19) L1 V0 Pn0 G1 MSS

TIL-53.1 79 F Luminal Côlon ascendant pT3 pN1b (3/14) pM1a (HEP) L1 V0 Pn1 G1 MSS
TIL-54.1 62 m Luminal Côlon sigmoïde pT3 pN1a (1/18) cM1 (HEP) L1 V1 Pn1 G1 pT3 MSS
TIL-55.1 75 m Luminal Côlon sigmoïde pN1a (1/15) L0 V0 Pn0 G1 MSS
TIL-56.1 71 m Luminal Côlon ascendant pT2 pN0 (0/25) L1 V0 Pn1 G1 MSS
TIL-57.1 84 m Luminal Ascension du côlon pT4b pN1a (1/12) L1 V1 Pn0 G3 MSI-H
TIL-58.1 83 F Luminal Côlon sigmoïde pT4a pN0 (0/27) L0 V0 Pn0 G1 MSS
TIL-59.1 78 m Luminal Côlon sigmoïde pT1 pN0 (0/16) L0 V0 Pn0 G1 pT2 MSS
TIL-61.1 85 F Extraluminal Côlon sigmoïde pN0 (0/16 ) L0 V0 Pn0 G1 pT3 MSS
TIL-63.1a/bun 78 F Extraluminal Côlon transversal pN2a (2/28) L1 V0 Pn0 G3 pT2 MSI-H
TIL-66.1 78 m Extraluminal Côlon ascendant pN2b (16/24) L1 V0 Pn0 G1 pT3 MSS
TIL-68.1 70 m Extraluminal Côlon sigmoïde pN1 (5/35) L1 V1 Pn1 G2 MSS
f, femme ; m, homme ; MSI-H/MSS, instabilité ou stabilité des microsatellites ; UICC, Union internationale contre le cancer.
unTIL-63.1 : deux échantillons d'un donneur.

température dans le milieu en circulation et fournit aux cellules en
croissance un milieu frais.
Comme le CCM est uniquement complété par de l'interleukine (IL)-2, la
substance activatrice IL-12 est éliminée après environ 1 jour d'apport de CCM frais.
Circulation du milieu et apport de milieu frais nécessaire pendant toute la phase
d'expansion du TIL jusqu'à ce que la récolte soit pilotée automatiquement,
garantissant un apport homogène en nutriments. Pour obtenir un mouvement de
roulement, modifiant les zones de contact entre le TIL sédimenté, le récipient du
bioréacteur a besoin d'une courte agitation douce tous les 5 à 7 jours.
Pendant toute la durée de culture, des échantillons de surnageant ont été
régulièrement prélevés et les concentrations de glucose et de lactate ont été
systématiquement mesurées à l'aide d'un analyseur biochimique (YSI 2700 Select, YSI).
Lorsque la concentration de lactate a atteint une valeur cible de 1 g/L, l’afflux
de milieu frais (débit de perfusion) a été ajusté manuellement pour maintenir cette
valeur. Les cellules ont été développées jusqu'à ce qu'une production quotidienne
finale moyenne de lactate de 80 à 120 mg par jour soit atteinte. Le nombre de
cellules atteint était d'environ 1,5 à 2,5£dix9dans un délai de 3 à 4 semaines. Le
bioréacteur a été secoué pour suspendre les cellules avant de prélever des
échantillons pour le comptage cellulaire. Les cellules ont été récoltées,
simultanément séparées du matériel tissulaire par transfert par gravité sur le port
de maille, cryoconservées et stockées dans de l'azote liquide jusqu'à leur
utilisation pour la deuxième phase d'expansion.
Pour la deuxième phase d'expansion, les cellules ont été décongelées, lavées
et mélangées avec 20 ml de milieu de culture complet (comme mentionné
précédemment) et versées directement dans le bioréacteur. Le bioréacteur a été
inoculé avec environ 300£dix6cellules. Après 3 heures, lorsque les cellules se sont
stabilisées, la circulation moyenne et l'aération ont été activées. Lors de cette
expansion, les paramètres de procédé observés étaient comparables à ceux de la
première phase d’expansion. La tumeur
le volume de cellules inoculées utilisé pour la première ou la deuxième phase
d'expansion, la durée de culture et le rendement en cellules récoltées sont
indiqués dansTableau 2.
Caractérisation phénotypique par cytométrie en flux
TaguéPle phénotype des cellules expansées de chaque culture en bioréacteur
a été analysé à l'aide d'un cytomètre en flux BD Accuri C6 Plus (BD
Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ou MACSQuant Analyser 10 (Miltenyi
Biotec). La caractérisation de différents marqueurs de lignée et d'autres
marqueurs de surface exprimés a été réalisée directement après la récolte
en bioréacteur ainsi qu'après une culture à court terme de cellules
cryoconservées.
Pour l’analyse, les cellules ont été lavées, suivies d’une coloration
avec différents ensembles d’anticorps. Anti-CD3 PerCP-Cy5.5 (clone :
UCHT1 ; BioLegend, San Diego, CA, USA), anti-CD4 FITC (clone : RPA-T4 ;
BioLegend), anti-CD8 FITC ou PE (clone : SK1 ; BioLegend) , anti-CD28
APC (clone : CD28.2 ; BioLegend) ; APC anti-CCR7 (clone : G043H7 ;
BioLegend), APC anti-CD25 (clone : M-A251 ; BD Biosciences) ; anti-CD27
PE (clone : M-T271 ; BD Biosciences) ; anti-CD45RO PE (clone : UCHL1 ;
BD Biosciences) ; FITC anti-CD56 (clone : B159 ; BD Biosciences) ; anti-
CD127 PE (clone : HIL-7R-M21 ; BD Biosciences) ; anti-CD183 PE (clone :
1C6/CXCR3 ; BD Biosciences) ; anti-CD196 APC (clone : 11A9 ; BD
Biosciences) (panel 1) ou Anti-CD3 PE-Vio615 (clone : REA613), anti-CD4
APC-Vio770 (clone : REA623), anti-CD8 VioGreen (clone : REA734) , anti-
CD25 PE (clone : REA945) ; PE anti-CD27 (REA499) ; anti-CD28 APC
(REA612) ; FITC anti-CD45RO (clone : REA611) ; anti-CD56 APC (clone :
REA196) ; anti-CD127 APC (clone : REA614) ; anti-CD183 APC (REA232) ;
anti-CD196 PE-Vio770 (REA190) ; anti-CCR7 PE-Vio770 (clone : REA546)
(panel 2, tous

capable 2

Paramètres de culture : matière première, rendement cellulaire, durée de culture et métabolites en bioréacteur en première et deuxième phases d'expansion.

Donneur Inoculé Rendement cellulaire,£dix6 Longueur de Lactate final inoculé

Glycémie finale Rendement cellulaire,£dix6 Longueur de Glycémie finale Lactate final
pièces,£8 mm3 cultivation, consommation, production, cellules,£dix6 culture, d consommation, production,
d mg/j mg/j mg/j mg/j

TIL-52.1 50 dix 25 3 6 N/A

TIL-54.1 49 14.7 20 4.2 9.2 N/A
TIL-55.1 30 939 32 74,7 58,6 N/A
TIL-57.1 31 300,7 30 47.3 45,5 N/A
TIL-63.1b 30 1371 17 93,6 81 N/A
TIL-56.1 30 120 32 17.4 16 N/A
TIL-59.1 dix 1272 25 49.4 38 340 3100 23 143.2 120,6
TIL-61.1 dix 2175 28 118,6 100,3 324 2541 18 149,7 133.1
TIL-63.1a dix 1690 24 109 91 253 2815 18 154.1 138,5
TIL-66.1 dix 1875 24 93 79 350 2250 23 125,7 1134
TIL-68.1 dix 1750 21 93,3 80 307 1125 23 72,7 62
Première phase Seconde phase

N/A, non analysé.

540 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
Miltenyi Biotec) ont été utilisés comme marqueurs de lignée pour les lymphocytes T (Th, T.c, T.reg)
et les cellules NK, et combinés avec l'un ou l'autre des marqueurs de sous-type de lymphocytes T
pour la mémoire centrale naïve (TCM), des cellules T effectrices ou effectrices à mémoire (Teff, T.EM)
et pour les cellules T auxiliaires (Th1, T.h2, T.h17). Les cellules ont été colorées pendant 30 minutes à
température ambiante, lavées et finalement remises en suspension dans un tampon de
coloration frais.
Culture de cellules
lymphocytes infiltrant l'inflammation
Avant toute mesure analytique, les TIL cryoconservés ont été revitalisés en
culture à court terme. Les cellules ont été décongelées, suivies d'un lavage (350g,5
min) avec un milieu de culture préchauffé. Les cellules ont ensuite été remises en
suspension dans du CCM, transférées dans des flacons et cultivées pendant 48 h à
37°C, 25 % O.2, 5,5% de CO2. Ensuite, les cellules ont été collectées, centrifugées
(350g,5 min) et remis en suspension dans TIL-CCM.
Lignées cellulaires CRC
Pour la co-culture des lignées cellulaires TIL et CRC, des aliquotes
cryoconservées de chaque lignée cellulaire (COLO678 [ACC194], HCT116 [ACC581],
JVE127 [ACC813] ; DSMZ) ont été décongelées puis mélangées avec un milieu de
culture préchauffé (CRC-M ; RPMI -1640 [Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA], 10 % de sérum fœtal bovin [Sigma-Aldrich], 1 % de solution antibiotique
antimycotique (100 unités de pénicilline, 0,10 mg de streptomycine et 0,25mg
d'amphotéricine B par millilitre) [Sigma Aldrich]). Les cellules ont ensuite été
remises en suspension dans du CRC-M, transférées dans des flacons et cultivées à
37°C et 5,5 % de CO.2.
Tests fonctionnels
Interféron qualitatif (IFN)gessai de coloration
le potentiel des TIL à exprimer l'IFNga été analysé à l'aide d'un cytomètre en
flux MACS-Quant Analyser 10 (Miltenyi Biotec). Pour évaluer l’IFN intracellulaireg
expression des TIL, les cellules ont été cultivées comme décrit précédemment.
Après une culture à court terme, les cellules ont été remises en suspension dans
un milieu complété complet (comprenant 10 % de sérum humain, 1 % de solution
antibiotique antimycotique, IL-2) à une concentration de 2 millions de cellules par
millilitre. Puis, 50mL de cette suspension ont été transférés dans des plaques à
fond rond de 96 puits. Les cellules ont été stimulées avec un anticorps anti-CD3
(clone : OKT3, Miltenyi Biotec) à une concentration finale de 30 ng par millilitre. Le
phorbol-12-myristat-13-acétate (PMA) a été utilisé comme réactif de stimulation
alternatif et comme contrôle positif (concentration finale 2,5mg/ml). Après 1 h
d'incubation à 37°C, 25% O2, 5,5% de CO2, 50mL de GolgiStop (1:150, BD
Biosciences) et GolgiPlug (1:100, BD Biosciences), dilués dans un milieu complet
supplémenté (comprenant 10 % de sérum humain, 1 % de solution antibiotique
antimycosique, IL-2, Ac anti-CD3), ont été ajoutés. Après 5 heures supplémentaires
d'incubation, les cellules ont été collectées, centrifugées et incubées avec TruStain
FcX (BioLegend) pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, les
marqueurs de surface ont été colorés avec des anticorps anti-CD3 PerCP-Cy5.5,
anti-CD4 FITC et anti-CD8 PE pendant 30 min à température ambiante (détails Ab
décrits précédemment : panneau 1). La fixation/perméabilisation (kit de fixation/
perméabilisation BD Cytofix/Cytoperm ; BD Biosciences) pendant une nuit à 4°C a
été réalisée après lavage avec un tampon de coloration (350g,5 minutes). Le
lendemain, les cellules ont été lavées avec une solution de permanente/lavage et
colorées avec de l'anti-IFN.gAnticorps APC (clone : 4S.B3, BioLegend) pendant 30
min à température ambiante. Après le lavage final, les cellules ont été remises en
suspension dans un tampon de coloration et conservées à 4°C jusqu'à la mesure.
Dosage quantitatif des cytokines
Les concentrations de cytokines sécrétées ont été analysées à l'aide d'un
cytomètre en flux MACSQuant Analyser 10 (Miltenyi Biotec). Pour évaluer le
potentiel des TIL à sécréter différentes cytokines, les cellules ont été cultivées
comme décrit précédemment. Après une culture à court terme, les cellules
ont été remis en suspension dans un milieu complet supplémenté
(comprenant 10 % de sérum humain, 1 % de solution antibiotique
antimycotique, IL-2) à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.
Ensuite, 200mL de cette suspension ont été transférés dans des plaques à
fond rond de 96 puits. Les cellules ont été stimulées avec des Ac anti-CD3 à
une concentration finale de 30 ng/mL (clone : OKT3, Miltenyi Biotec). De plus,
après 6 h d'incubation, les surnageants ont été collectés, centrifugés (10 000
g,1 min) et les surnageants acellulaires ont été congelés à -20°C.
Pour mesurer différentes cytokines en parallèle, des tests cytotoxiques
Miltenyi Biotec MACS-Plex ont été utilisés. Dans ce test, nous avons combiné les
produits suivants, le kit de base cytotoxique MACSPlex mix, le standard
cytotoxique MACSPlex mix et les kits de réactifs cytotoxiques MACSPlex mix pour
l'IFN.get facteur de nécrose tumorale (TNF)un.
Le jour de la mesure, les surnageants ont été décongelés, centrifugés (10
000g,10 min) et préparé comme décrit par le fabricant. Pour analyser et
quantifier, les quantités de cytokines ont été mesurées par le mode
MACSQuant Analyzer Express pour MACSQuant Instrument.
Dosage de dégranulation et de cytokines intracellulaires
La dégranulation et l'expression intracellulaire des cytokines ont été analysées
à l'aide d'un cytomètre en flux MACSQuant Analyser 10 (Miltenyi Biotec). Pour
étudier la dégranulation et l'expression des cytokines intracellulaires (IFNg, TNF
un) de TIL induits par des stimuli spécifiques aux cellules tumorales, trois lignées
de cellules CRC ont été co-cultivées avec des TIL. Deux à trois jours avant la co-
culture, les lignées cellulaires CRC ont été remises en suspension dans du CRC-M
(RPMI-1640, 10 % de bovin fœtal, 1 % de solution antibiotique antimycotique) à
une concentration d'un demi-million de cellules par millilitre. Ensuite, 100mL de
cette suspension a été transféré dans une plaque à fond plat de 96 puits et cultivé
à 37 ° C, 5,5% de CO2. Le jour de la co-culture, les TIL à court terme (comme décrit
précédemment) ont été remis en suspension dans un milieu complété complet
(contenant 10% de sérum humain, 1% de solution antibiotique antimycosique et
IL-2) à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre. Puis, 50mL de
cette suspension a été transférée dans des plaques à fond plat de 96 puits
contenant des lignées cellulaires CRC (après élimination du milieu CRC). CD107a-
Ab (anti-CD107a APC [REA792] ; Miltenyi Biotec) et/ou PMA (doublons pour chaque
lignée cellulaire CRC comme contrôle de stimulation ; concentration finale 2,5mg/
mL) ont été transférés dans des cocultures TIL-CRC. Après 1 h d'incubation à 37°C,
25% O2, 5,5% de CO2, 20mDes L de GolgiStop (1:132, BD Biosciences) et de
GolgiPlug (1:99, BD Biosciences), dilués dans un milieu complet supplémenté, ont
été ajoutés. Après 5 heures supplémentaires d'incubation, les cellules ont été
collectées, centrifugées et lavées avec un tampon de coloration (solution de
rinçage autoMACS incluant BSA; Miltenyi Biotec). Les cellules ont ensuite été fixées
et colorées comme décrit par le fabricant (extracellulaire : anti-CD3 PE-Vio770
[REA613], anti-CD4 APC-Vio770 [REA623], anti-CD8 VioGreen [REA734] ;
intracellulaire : anti-IFNgFITC [REA600] et anti-TNFunPE [REA656] ; tous les
anticorps de Miltenyi Biotec). Après le lavage final, les cellules ont été remises en
suspension dans un tampon de coloration et immédiatement mesurées. Chaque
co-culture TIL-CRC a été analysée en triple.
analyses statistiques
Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 9 (GraphPad
Software, Inc., San Diego, Californie, États-Unis). Les différences statistiques entre les
échantillons non stimulés et stimulés ont été déterminées à l'aide d'un test d'analyse
unidirectionnelle non paramétrique du test de rang de variance (Friedmann) avec le test
de comparaisons multiples de Dunn.
Résultats
Dépistage pathologique
TaguéPLe dépistage athologique des échantillons de tumeurs obtenus a montré un
taux d'infiltration moyen de TIL de 34 % (5 % à 60 %) en utilisant la coloration H&E.
 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547 541

Tableau 3
Fréquence en pourcentage des sous-populations TIL : les échantillons de tissus ont été examinés pathologiquement par H&E et coloration immunohistochimique.

Sous-types Donneur Marqueur de surface

TIL-52.1 TIL-54.1 TIL-55.1 TIL-57.1 TIL-63.1b TIL-56.1 TIL-59.1 TIL-61.1 TIL-63.1a TIL-66.1 TIL-68.1

Pathologie Cellules T infiltrantes dix 50 dix 50 50 30 60 12 50 60 50 CD3+

Ème 95 80 20 50 50 80 50 70 50 50 70 CD4+
Tc 5 40 40 50 50 20 50 20 50 30 20 CD8+
Première phase NK N/A N/A 1,5 0,3 3.0 0,0 0,1 0,2 0,7 0,3 0,1 CD3-CD56+
Ème 9.3 0,6 55.2 26,0 39,8 24,5 18.6 55.3 29,8 CD3+CD4+
Tc 32,5 84,5 45,8 72,9 65,7 77,9 72,0 57.4 74.2 CD3+CD8+
TDP 0,2 0,0 1.4 0,2 0,2 17.3 0,5 0,7 0,8 CD3+CD4+CD8+
CD4_TEM 7.3 0,8 48.2 21.1 30,6 25.1 17.5 48.3 28.1 CD3+CD4+CD45RO+RCC7-
CD4_Teff 0,2 0,2 0,0 0,3 0,0 0,1 0,0 0,0 0,2 CD3+CD4+CD45RO-RCC7-
CD4_TCM 2.3 0,1 5.6 0,7 0,8 0,6 3.0 4.1 0,5 CD3+CD4+CD45RO+RCC7+
CD4_Treg 1.7 0,6 1.1 1.3 1.2 0,8 1.6 2.3 0,2 CD3+ CD4+ CD25+ CD127-
CD4_naïve 0,1 0,2 0,1 0,0 1.0 0,0 0,0 0,1 0,0 CD3+ CD4+ CD45RO-CCR7+
Th1 7.8 0,5 25.9 17,0 29.3 17.6 12,0 23,0 19,8 CD3+ CD4+ CD183+ CD196-
Th2 1.0 0,1 2.5 5.8 4.9 4.6 5.3 18.6 2.4 CD3+ CD4+ CD183- CD196-
Je17 0,0 0,1 4.9 0,3 0,7 1.6 1.1 6.2 0,8 CD3+ CD4+ CD183- CD196+
CD8+TEM 25,0 74,3 42,4 71,0 63,9 67,3 60,3 55,7 72,6 CD3+CD8+CD45RO+RCC7-
CD8+Teff 6.3 1.4 0,0 0,4 0,5 8.3 0,2 0,6 0,9 CD3+CD8+CD45RO-RCC7-
CD8+TCM 6.6 4.7 4.4 1.7 1.9 1,5 11.3 0,8 0,5 CD3+ CD8+ CD45RO+ CCR7+
Naïf de CD8+ 1.9 2.5 0,0 0,0 0,5 0,2 0,2 0,1 0,0 CD3+ CD8+ CD45RO-CCR7+
CD27+Tc 1.7 0,2 20,0 2.8 11.4 5.4 14.4 19.2 33,5 CD3+ CD8+ CD27+
CD28+Tc 8.5 5.6 27.2 10.6 49.2 16,5 41,8 37,5 43,6 CD3+ CD8+ CD28+
CD27+CD28+TDP 0,6 0,0 13.8 0,6 8.9 2.0 10.7 20,8 28,7 CD3+ CD8+ CD27+ CD28+
Seconde phase NK N/A N/A N/A N/A 0,1 0,1 1.1 0,0 0,2 CD3-CD56+
Ème 1.7 12.6 3.3 40,5 4.0 CD3+CD4+
Tc 95.1 93,4 92.1 55,6 88,8 CD3+CD8+
TDP 0,1 2.3 0,2 0,8 1.0 CD3+CD4+CD8+
CD4_TEM 1.6 18.9 3.2 39,8 3.4 CD3+CD4+CD45RO+RCC7-
CD4_Teff 0,0 2.5 0,0 0,0 0,5 CD3+CD4+CD45RO-RCC7-
CD4_TCM 0,1 0,6 0,3 0,6 0,1 CD3+CD4+CD45RO+RCC7+
CD4_Treg 0,2 0,1 0,0 6.8 0,1 CD3+ CD4+ CD25+ CD127-
CD4_naïve 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 CD3+ CD4+ CD45RO- CCR7+
Th1 1.2 10.2 2.4 24.9 2.5 CD3+ CD4+ CD183+ CD196-
Th2 0,2 0,4 0,3 8.0 0,4 CD3+ CD4+ CD183- CD196-
Je17 0,1 0,0 0,0 4.5 0,3 CD3+ CD4+ CD183- CD196+
CD8+TEM 94,4 36,5 85,7 53,6 80,4 CD3+CD8+CD45RO+RCC7-
CD8+Teff 0,2 19.7 2.4 1.3 6.1 CD3+CD8+CD45RO-RCC7-
CD8+TCM 0,5 0,3 1.6 0,8 0,3 CD3+ CD8+ CD45RO+ CCR7+
Naïf de CD8+ 0,0 0,1 0,3 0,0 0,0 CD3+ CD8+ CD45RO-CCR7+
CD27+Tc 12.9 2.3 4.4 22.2 11.3 CD3+ CD8+ CD27+
CD28+Tc 95,4 0,8 2.5 54,6 88.1 CD3+ CD8+ CD28+
CD27+CD28+TDP 12.9 0,3 0,6 22.2 11.3 CD3+ CD8+ CD27+ CD28+

Caractérisation phénotypique des cellules des deux phases d'expansion analysées par cytométrie en flux.
H&E, hématoxyline et éosine ; N/A, non analysé.

L'immunocoloration a révélé un taux moyen de 62 % (20 % -95 %) de CD4+Cellules
T et de 30% (5%-50%) CD8+Cellules T (Tableau 3,Figure 1 supplémentaire).
processus en deux phases d'expansion du TIL
L'expansion des TIL dans le bioréacteur exclusif ZRP a été conçue
comme un processus en deux phases : une première expansion initiale des
TIL après l'insertion de plusieurs morceaux de tumeur d'une taille définie
provenant tous d'une seule tumeur primaire, suivie d'une deuxième
expansion massive des TIL. après retrait de tous les morceaux de tumeur
initialement utilisés. Pour définir le volume tumoral total approprié ainsi que
la taille définie et le nombre d'échantillons de tumeur nécessaires pour la
première phase d'expansion, le bioréacteur ZRP a été inoculé comme suit.
Nous avons testé l'expansion du TIL en utilisant deux tissus tumoraux d'un
volume total élevé de 400 mm.3et coupé également en 50 morceaux d'un
volume approximatif de 8 mm3chaque. Ensuite, quatre tissus d'un volume
total intermédiaire de 240 mm3et enfin cinq tissus d'un faible volume total
de 80 mm3ont été testés. Au total, 11 analyses ont été réalisées en utilisant
trois volumes tumoraux définis différents.
volumes tumoraux totaux de 400 mm3ou 240mm3n'a donné qu'un
nombre faible à modéré de TIL après la première phase d'expansion, soit 10
millions à 1,4 milliard de cellules en six essais (Tableau 2/Figure 1UN). Un
seul passage avec une éprouvette de 240 mm3le volume total de la tumeur a
pu produire plus d'un milliard de TIL, un objectif intermédiaire défini du
première expansion et condition préalable à la deuxième phase d’expansion. Le
80mm3L’approche du volume total de la tumeur a donné une moyenne de 1,752
(1,272-2,175) milliards de TIL en cinq séries. Notamment, chaque course avec 80
mm3atteint le prérequis de 1 milliard de cellules.
Un volume d'inoculation initial de 0,25 à 0,34 milliard de cellules pour la deuxième
phase d'expansion a donné une moyenne de 2,366 (1,125 à 3,100) milliards de TIL, dans
lesquels quatre essais sur cinq ont permis d'obtenir plus de 2 milliards de cellules. La
durée moyenne de culture pour la phase d’expansion 1 était respectivement de 25 jours
(17 à 32 jours) et de 20 jours (17 à 23 jours) pour la phase 2.
Phénotypage IL
Toutes les cellules récoltées ont été analysées par cytométrie en flux (Tableau
3/ Figure 1AVANT JC). La première phase d'expansion a donné une moyenne de
28,8 % (0,6 %-55,3 %) CD4+et 64,6 % (32,5%-84,5 %) CD8+Cellules T dans les 11
séries, quel que soit le volume tumoral total inoculé. A noter, la proportion de CD8
+Les lymphocytes T ont augmenté en moyenne jusqu'à plus de 85 % au cours de la
deuxième phase d'expansion dans les cinq séries initialement commencées avec
80 mm.3volume total de la tumeur. La proportion de CD4+Les lymphocytes T se
sont stabilisés à 12,4 % (1,7 %-40,5 %).
De plus, nous avons analysé l'effecteur (TE) et la mémoire effectrice (TEM)
phénotype de toutes les cellules T récoltées (Figure 2). Concernant les lymphocytes
T mémoire effecteurs, après la première phase 25,2% (0,8%-48,3%) CCR7-
CD45RO+CD4+TEMcellules et 59,2 % (25,0 %-74,3 %) CCR7-CD45RO+
5Figure taguée42 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547

Fig. 1.Caractérisation de la suspension cellulaire élargie de 80 mm3volume tumoral total : rendement cellulaire (A) et fréquence des sous-ensembles de TIL dépendants de CD3 (CD4+, CD8+, CD4+CD8+) après les première (B)
et deuxième (C) phases d'expansion.

Figure 2.Fréquence des lymphocytes T effecteurs (CD45RO-RCC7-) et les lymphocytes T mémoire effecteurs (CD45RO+RCC7-) après les première (A) et deuxième (B) phases d'expansion. Un seul point représente la valeur en
pourcentage de chaque 80 mm3expansion du bioréacteur tumoral.
 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
Figure 3.Fréquence de l'IFNgexprimer CD4+, CD8+et CD4+CD8+Cellules T double-positives : l’expression de l’IFNga été mesuré après stimulation TIL avec des Ab anti-CD3 (A) et du PMA (B) dans les première et deuxième
phases d'expansion. Les points simples représentent les valeurs moyennes des expériences de stimulation individuelles (n = 5 ; moyenne§erreur standard de la moyenne). Les différences statistiques entre les échantillons
non stimulés et stimulés ont été déterminées à l'aide d'un test d'analyse unidirectionnelle non paramétrique du test de rang de variance (Friedmann) avec le test de comparaisons multiples de Dunn. **P = <0,01 ; ****P = <
0,0001. Les valeurs individuelles de chaque tumeur peuvent être trouvées dansTableau supplémentaire 1.
CD8+TEMles cellules ont été atteintes. La deuxième phase a abouti à un CCR7
de 12,0 % (1,6 %-39,8 %).-CD45RO+CD4+ TEM cellules et 72,6%
(36,5%-94,4%) CCR7-CD45RO+CD8+TEMcellules. Pour les cellules T effectrices,
la première phase a donné 0,1 % (0,0 % 0,3 %) de CCR7-CD45RO-CD4+Cellules
T et 2,1 % (0,0 % -8,3 %) CCR7-CD45RO-CD8+Cellules T. La deuxième phase a
abouti à 0,6 % (0,0 % 2,5 %) CCR7-CD45RO-CD4+Cellules T et 5,9 % (0,2 %-19,7
%) CCR7-CD45RO-CD8+Cellules T (Figure 2).
Tests de fonction IL
Dégranulation et expression des cytokines
La fonction effectrice des cellules T récoltées a été évaluée en analysant la
dégranulation (expression de CD107a) et/ou l'expression de cytokines (IFNgainsi
que le TNFun) après une stimulation de courte durée avec des réactifs non
spécifiques du CRC comme l'anticorps anti-CD3 ou le PMA, et par co-culture avec
des lignées cellulaires CRC (JVE127, COLO678, HCT116) (figure 3,Tableau
supplémentaire 1,Figure 2 supplémentaire,Figure 3 supplémentaire).
- complexe de récepteurs cellulaires/stimulation spécifique CD3 des lymphocytes T du
la première phase d'expansion a conduit à 0,8% (0,4%-1,3%) IFNg+CD4+Cellules T et 3,1 %
(2,3 %-4,7 %) d'IFNg+CD8+Cellules T. En passant à la deuxième phase, la stimulation a
entraîné une production d'IFN de 1,2 % (0,4 %-1,9 %).g+CD4+Cellules T et 4,2 % (1,0 %-6,6
%) d'IFNg+CD8+Cellules T. La stimulation par PMA des lymphocytes T dès la première
phase d'expansion a conduit à 12,0 % (7,1 % -21,0 %) d'IFNg+CD4+Cellules T et 50,6 %
(34,7 %-66,0 %) IFNg+CD8+Cellules T. En passant à la deuxième phase, la stimulation a
abouti à 19,0 % (2,0 % -44,7 %) d'IFNg+CD4+Cellules T et 53,4 % (22,7 %-77,1 %) IFNg+CD8
+Cellules T (figure 3,Tableau supplémentaire 1).
La stimulation avec des lignées cellulaires CRC a entraîné une expression de CD107a
de 0,6 % et 1,2 % dans CD4+Cellules T dès la première phase d'expansion et dans une
fourchette de 0,8 % et 2,0 % dans CD8+Cellules T (sans stimulation : 1,0 %-1,1 % et 0,9
%-1,1 %). Dans la deuxième phase, la stimulation par les lignées cellulaires CRC a conduit
à 0,7 % à 2,5 % de CD107a.+CD4+Cellules T et 0,9 % à 2,3 % de CD107a+CD8+
Cellules T (sans stimulation : 0,9 %-1,1 % et 1,0 %-1,1 %). L'analyse des TIL de
première phase a révélé 0,5 % à 1,3 % d'IFNg+CD4+Cellules T et 0,5 % à 2,3 %
d'IFNg+CD8+Cellules T (sans stimulation : 1,0%-1,1% et 0,9%-1,1%). A la fin de
la deuxième phase, 0,5%-1,6% d'IFNg+CD4+et 0,8 % à 2,2 % d'IFNg+CD8+
Cellules T (sans stimulation : 1,0%-1,3% et 1,0%,
543
respectivement) ont été mesurés. La troisième molécule, le TNFun, a été exprimé
dans 0,8 % à 1,7 % des CD4 de première phase+cellules et 0,7 % à 2,6 % de CD8 de
première phase+cellules (sans stimulation : 0,5%-1,1% et 0,8%-1,0 %). Après la
deuxième phase, 0,7 à 2,6 % des lymphocytes T CD4+ et 0,8 à 2,7 % des
lymphocytes T CD8+ ont été mesurés positifs au TNF.un(sans stimulation :
0,2%-1,0% et 0,1%-1,1%, respectivement).
En résumé, la co-culture de lignées cellulaires TIL et CRC n’a montré
aucun effet de dégranulation ni d’expression de cytokines après 6 h de
stimulation. Seul le co-traitement avec la lignée cellulaire CRC et le PMA a
provoqué une augmentation du CD107a et de l'IFN.get TNFunexpression (
Figure 2 supplémentaire,Figure 3 supplémentaire). Un total de 2,7% à 22,3%
de CD4+et 22,8%-50,3% de CD8+Les lymphocytes T de première phase ont
exprimé CD107a après co-stimulation de la lignée cellulaire CRC plus PMA
(sans stimulation : 1,0 % à 1,1 % et 0,9 % à 1,1 %, respectivement). La
stimulation des lymphocytes T de deuxième phase a entraîné 5,8 % à 34,8 %
de CD107a+CD4+et 35,0 % à 69,2 % CD107a+CD8+Cellules T (sans stimulation :
0,9%-1,1% et 1,0%-1,1%). La mesure des TIL de première phase a révélé
0,4 % à 12,1 % d'IFNg+CD4+Cellules T et 2,8 % à 51,0 % d'IFNg+CD8+Cellules T
(sans stimulation : 1,0 %-1,1 % et 0,9 %-1,1 %, respectivement). A la fin de la
deuxième phase, 0,8%-22,0% d'IFNg+CD4+et 5,1 % à 56,3 % de l'IFNg+
CD8+Des lymphocytes T (sans stimulation : 1,0 %-1,3 % et 1,0 %) ont été trouvés. TNFuna
été exprimé dans 8,0 % à 39,6 % des CD4 de première phase+Cellules T et 11,7 % à 57,4 %
de CD8 de première phase+Cellules T (sans stimulation : 0,5 %-1,1 % et 0,8 %-1,0 %,
respectivement). Dans la deuxième phase, le TNFun+CD4+Les lymphocytes T ont été
mesurés dans une plage de 11,1 % à 55,3 % et le taux de TNFun+CD8+Cellules T dans une
plage de 11,1 % à 70,2 % après co-stimulation de la lignée cellulaire CRC plus PMA (sans
stimulation : 0,2 % à 1,0 % et 0,1 % à 1,1 %, respectivement) (Figure 2 supplémentaire,
Figure 3 supplémentaire).
Dosage quantitatif des cytokines
TaguéPLes analyses de l'expression des cytokines intracellulaires ont été étendues
par quantification du surnageant de culture de lymphocytes T (tous deux IFNget TNFun
après stimulation non spécifique du CRC par des anticorps anti-CD3 et du PMA (Figure 4,
Tableau supplémentaire 2). Les niveaux de cytokines trouvés dans les surnageants de
culture cellulaire après stimulation des lymphocytes T reflètent les résultats du protocole
de coloration intracellulaire des cytokines. Stimulation par anti-CD3
5Figure taguée44 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
Figure 4.Concentrations de cytokines (IFNg, TNFun) : Les TIL ont été analysés après stimulation avec des Ab anti-CD3. Les première (A) et deuxième (B) phases d’expansion ont été examinées. Chaque barre représente la
valeur moyenne des mesures doubles (moyenne§erreur standard de l'homme). Les valeurs individuelles de chaque tumeur peuvent être trouvées dansTableau supplémentaire 2.
Personne n'a causé un IFNgsécrétion dans une plage de 120 pg/mL à 2980
pg/mL (témoin sans stimulation anti-CD3 : 54 pg/mL à 265 pg/mL) et un TNF
unsécrétion jusqu'à 737 pg/mL (jusqu'à 1 pg/mL sans stimulation) dans les
suspensions cellulaires, cultivées en première phase d'expansion. IFNgla
sécrétion des cellules, récoltées à partir de la deuxième phase d'expansion,
était comprise entre 800 pg/mL et 2 140 pg/mL (non stimulée : 25 pg/mL à
94 pg/mL) et pour le TNFunsécrétion dans une plage de 183 pg/mL à 578
pg/mL (non stimulée : 0,5 pg/mL à 1,5 pg/mL) dans les suspensions
cellulaires (Figure 4,Tableau supplémentaire 2).
Discussion
Lors du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le cancer
colorectal, il a été constaté que seules les tumeurs les moins fréquentes avec
dMMR-MSI-H répondent à l'immunothérapie avec des inhibiteurs de points de
contrôle.[5]. Parce qu’une densité élevée de lymphocytes infiltrant la tumeur est
associée à un meilleur pronostic du CCR[11-14], ACT à l'aide de TIL est une
approche raisonnable qui tire parti de la réponse immunitaire spécifique des
lymphocytes T du patient envers la tumeur.
Le succès potentiel de l'ACT dépend à la fois de la quantité et de la qualité des TIL
expansés provenant du tissu tumoral. En termes de quantité, un nombre de 1£dixdixLes
TIL élargis sont considérés comme une dose appropriée pour une perfusion
thérapeutique [28,29]. Cependant, dans une étude pilote utilisant des lymphocytes T
expansés provenant de ganglions lymphatiques sentinelles du CCR pour l'ACT, des
réponses tumorales complètes ont été obtenues avec seulement 8£dix7cellules dans le
CCR métastatique[30]. Il faut tenir compte du fait que la densité des TIL est plus faible
dans les tumeurs gastro-intestinales (GI) que, par exemple, dans le mélanome.[31].
Dans notre étude, les échantillons de tissus tumoraux obtenus ont été soumis à un
dépistage pathologique, au cours duquel les TIL ont été examinés en H&E et par
immunocoloration. Le dépistage pathologique a révélé des taux d'infiltration de TIL de
5 % à 60 % et un CD4 variable+/CD8+ratio en faveur des CD4+cellules (moyenne 62/30%).
Indépendamment de ces taux d'infiltration initiaux, nos données montrent que
l'expansion des TIL dans un processus en deux phases à faible échelle dans le
bioréacteur Zellwerk ZRP à partir d'un CCR primaire réséqué chirurgicalement a abouti à
un nombre pertinent d'environ 2£dix9cellules. Il n'y avait pas
corrélation entre les taux d'infiltration de TIL lors du dépistage pathologique et le
nombre de cellules expansées. La deuxième phase peut être étendue pour
fabriquer plus de 10dixTIL, utilisant un bioréacteur avec une surface d'expansion 5
fois plus grande. L'expansion de TIL a été réalisée selon un processus en deux
phases pour séparer les cellules du tissu tumoral moyen et résiduel à la fin de la
phase 1 afin d'éviter les effets inhibiteurs liés à la tumeur.
Nous avons observé une forte dépendance de l'excroissance de TIL à la masse
tumorale au cours de la période de départ. Débuter l’expansion avec un volume tumoral
relativement important (400 mm)3; 50 pièces), nous avons constaté un rendement
cellulaire limité après la phase 1. Réduction du volume tumoral (à 240 mm3et plus tard à
80 mm3) a considérablement augmenté le rendement cellulaire après la phase 1 et a
abouti à un nombre de TIL pertinent pour l'ACT après la phase 2. Par conséquent, la
quantité de 80 mm3a été défini comme une norme optimisée. La raison du phénomène
décrit n'est pas claire, mais elle est probablement liée aux effets immuno-inhibiteurs
induits par la tumeur avec des volumes plus élevés de tissu tumoral présents.
TaguéPLes IL ont été fabriqués sur une plateforme sur laquelle le type de perfusion
les bioréacteurs fonctionnaient selon un processus de culture contrôlé
automatiquement. La croissance des TIL à partir de morceaux de tumeur, leur
activation et leur expansion à long terme ont été réalisées dans un système de
bioréacteur à perfusion fermé développé chez Zellwerk GmbH et établi depuis de
nombreuses années.26,27,28]. Ce bioréacteur à méandres se caractérise par un
flux laminaire directionnel du milieu, qui permet une distribution homogène des
nutriments et des gaz pendant la période de culture et minimise la perturbation
du contact cellule-cellule et cellule-surface.
Concernant les sous-types de TIL étendus, CD8+Les lymphocytes T constituent la
population cellulaire la plus importante pour la réponse anti-tumorale.32,33]. Il a été
postulé que les CD4 spécifiques à la tumeur+Cellules T en plus du CD8+Les lymphocytes T
pourraient améliorer et prolonger la réponse antitumorale dans l'ACT[34].
Dans notre étude, le CD4+/CD8+ratio constamment décalé vers CD8+
cellules pendant l'expansion du TIL, ce qui donne environ 65 % après la phase 1 et environ 86 %
de CD8+cellules après la phase 2. Cela contraste avec d’autres études, qui ont rapporté qu’une
proportion plus faible de CD8+Les cellules ont été développées à partir de tumeurs gastro-
intestinales par rapport au mélanome, dans lequel on trouve régulièrement plus de 70 % de
cellules CD8+.20,31]. Cependant, dans ces études, les TIL étaient principalement issus de
métastases de tumeurs gastro-intestinales. Cela reste flou
 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
si le matériau tumoral différent ou le processus d'expansion expliquent
les différents résultats.
Dans cette étude, double positif (CD4+CD8+) les cellules ont été trouvées dans
une petite proportion d'environ 2,4 % des TIL après la phase d'expansion 1 et
0,8 % après la phase 2, respectivement. Une réactivité tumorale a été notée pour
ces TIL doublement positifs dans le CCR. Cependant, comme la fréquence des TIL
doublement positifs est augmentée dans le CCR métastatique, il a été postulé que
ce sous-ensemble de TIL pourrait jouer un rôle dans le processus métastatique en
régulant négativement la réponse immunitaire à la tumeur.[35]. L’importance des
cellules doublement positives parmi les TIL expansés n’est pas encore déterminée.
Une caractérisation plus approfondie des sous-types TIL pertinents pour l'ACT comprend des
marqueurs pour l'expérience antigénique et la différenciation de l'effecteur (Teff) et les
lymphocytes T régulateurs (Treg). Les études précliniques et cliniques antérieures sur l'ACT ont
principalement utilisé des lymphocytes T non sélectionnés, notamment des lymphocytes T
cytotoxiques, auxiliaires et même immunosuppresseurs.regcellules [30,36]. Une caractérisation et
une sélection plus précises des cellules T utilisées pourraient constituer une approche
prometteuse pour améliorer l’efficacité et la sécurité de l’ACT.
Il a été démontré qu'un T élevéeff/Tregest essentiel pour une
immunosurveillance efficace des tumeurs gastro-intestinales et est donc la cible
d'une population TIL pertinente pour l'ACT.37,38]. Les cellules T trouvées dans le
microenvironnement tumoral inhibiteur sont principalement des cellules Treg,
mais semblent avoir un phénotype plastique qui peut être polarisé vers la fonction
effectrice lors de l'expansion dans l'IL-2.31,37,39].
Il a été démontré que CD45RO est un marqueur approprié pour le CD8 activé
par (antigène tumoral).+Les cellules effectrices T, qui ont le potentiel de provoquer
une réponse immunitaire anti-tumorale.40,41]. De plus, CD45RO+Les lymphocytes
T sont associés à une survie améliorée[40]. Par conséquent, viser une proportion
élevée de CD45RO+Les lymphocytes T pourraient augmenter l'efficacité des TIL
dans le contexte des approches ACT.
L'expression de CCR7 divise les cellules T mémoire en deux sous-ensembles fonctionnels.
RCC7-les cellules mémoire ont une fonction effectrice directe et sont donc considérées comme
des cellules T mémoire effectrices (TEM). RCC7+Les cellules sont des cellules T à mémoire centrale
(TCM) qui expriment des récepteurs de guidage des ganglions lymphatiques mais n'ont pas de
fonction effectrice immédiate[42].
Dans la présente étude, le phénotype du CD8+cellules mémoire effectrices
(CD45RO+/CCR7-) représentaient respectivement environ 60 % des TIL après la
phase d’expansion 1 et 73 % des TIL après la phase 2. Ceci suggère que cette
population cellulaire pourrait avoir un effet cytotoxique à long terme contre les
cellules tumorales.
o étudier le potentiel fonctionnel des TIL obtenus lors d'une stimulation
non spécifique, nous avons choisi une période de stimulation de 6 h adaptée
aux tests également dans le contexte d'une utilisation clinique ultérieure, à
la fois en ce qui concerne la quantification de l'expression des cytokines
intracellulaires ainsi que pour la quantification de dégranulation dans le
surnageant.
La stimulation anti-CD3 et la coloration intracellulaire des cytokines ont révélé
CD8+IFNg+cellules dans 3 % des TIL en phase d’expansion 1 et 4,2 % des TIL en
phase 2, respectivement. Ces données semblent faibles par rapport aux rapports
de la littérature. Il convient toutefois de noter que la durée de la stimulation dans
ces études variait généralement entre 12 heures et plusieurs jours.[34]. Une
stimulation PMA d'une durée de 6 heures a entraîné la production de CD8+
IFNg+cellules dans 50 % des TIL récoltés en phase 1 et dans 55 % des TIL en phase
d’expansion 2.
De plus, la quantification de la dégranulation a montré une sécrétion pertinente de
cytokines dans le surnageant lors d'une stimulation à la fois par anti-CD3 et par PMA
pendant 6 heures. Dans l’ensemble, le potentiel fonctionnel des TIL élargi dans notre
étude a été confirmé lors d’une stimulation non spécifique.
En conclusion, un processus de bioréacteur fiable et standardisé pour
l'expansion de TIL à partir d'échantillons de tissus primaires de CCR a été établi, et
un nombre pertinent de TIL d'un sous-type pertinent pour l'ACT avec un potentiel
fonctionnel a pu être obtenu (l'ensemble du processus, illustré dansFigure 4
supplémentaireetFigure 5 supplémentaire). Dans ce processus, le bioréacteur
Zellwerk ZRP a permis un degré élevé de standardisation de la production massive
de cellules immunitaires dans un environnement fermé et dans des conditions
constantes.
545
TaguéPLa présente étude a examiné la faisabilité de l'expansion de TIL
à partir de tumeurs primaires du CCR réséquées, qui étaient principalement des
instabilités microsatellites de faible qualité (pMMR-MSI-L), et une génération de cellules
immunitaires à haut volume établie également à partir de ces tumeurs, qui ne sont pas
sensibles aux approches d'immunothérapie par inhibiteur de point de contrôle. Par
conséquent, les options ACT utilisant les TIL pourraient également constituer une
approche permettant d’exploiter une réponse immunitaire antitumorale pour ce sous-
ensemble de CCR.
Cependant, cette étude n’a pas étudié le potentiel fonctionnel cytotoxique des TIL
expansés lorsqu’ils sont stimulés par des cellules tumorales autologues. Au moment de
l’enquête, le matériel tumoral autologue n’était plus disponible. À titre d'approximation,
nous avons examiné le potentiel fonctionnel des TIL lorsqu'ils sont confrontés à une série
de lignées de cellules tumorales CRC disponibles dans le commerce. Cependant, la
dégranulation et l'expression intracellulaire des cytokines (IFNg, TNFun) après une
exposition de courte durée avec des lignées cellulaires CRC, n'a pas démontré le potentiel
cytotoxique des TIL expansés. Lorsqu'ils sont co-cultivés avec du PMA comme contrôle de
stimulation, les TIL se sont révélés avoir un potentiel fonctionnel (par rapport aux
observations dans des tests sans lignées de cellules tumorales). Cependant, les lignées
cellulaires CRC utilisées dans cette étude n'ont pas permis d'obtenir une stimulation
spécifique des TIL expansés. Il a été précédemment rapporté que les tumeurs gastro-
intestinales présentaient des mutations uniques et que les réponses antitumorales des
lymphocytes T étaient dirigées vers des néoantigènes et des peptides cryptiques
spécifiques à chaque patient.20,22,31,43]. Par conséquent, les lignées cellulaires du
cancer du côlon disponibles dans le commerce ne constituent probablement pas un bon
modèle pour démontrer la cytotoxicité spécifique des TIL expansés. Dans d'autres
études, nous évaluerons la fonction cytotoxique des TIL expansés lorsqu'ils sont stimulés
par des suspensions de cellules tumorales autologues cryoconservées, du matériel dérivé
de cellules tumorales ou des lignées cellulaires autologues.
En outre, ce sera la prochaine étape de tester des populations de TIL élargies à
partir de patients utilisant la méthode décrite ici dans une gamme plus large dein
vitroexpériences pour étudier un large éventail de modificateurs de la fonction
TIL, par exemple les acides gras polyinsaturés et les médiateurs lipidiques qui
jouent un rôle dans la tumorigenèse du côlon[44-47]. De plus, des facteurs tels
que l’immunonutrition préopératoire et le microbiote intestinal influencent la
composition et la fonction des TIL dans le cancer colorectal et constituent donc un
sujet prometteur pour des études ultérieures.[48].
Sur la base de ces prévisionsin vitroexpériences sur la fonction cytotoxique des
TIL élargis, futurin vivodes études pourraient être envisagées. Notamment parce
que le microenvironnement tumoral complexe peut affecter la fonction TILin vivo,
in vitroles données ne peuvent servir qu’à titre d’approximation. Les principaux
obstacles à l’ACTin vivoIl semble y avoir une persistance à court terme et un
mauvais trafic des cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral
immunosuppresseur, une anergie et une prolifération faible et insuffisante des
cellules immunitaires.[49], des effets qui ne peuvent être évalués et comprisin
vivo.
Nous nous sommes concentrés sur les tumeurs primaires du CCR lors de
l'établissement du processus d'expansion du TIL décrit ici afin d'exclure toute influence
des thérapies antérieures (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie). Cependant,
étant donné que les approches ACT pourraient être principalementrapport ultime
options de traitement chez les patients lourdement prétraités, il est peu probable que le
tissu tumoral primaire soit le matériau de choix pour l'expansion du TIL dans ces cas. Par
conséquent, dans une prochaine étape, nous examinerons si les résultats prometteurs de
l’expansion du TIL à partir de tumeurs primaires du CRC présentés ici s’appliquent
également à l’expansion du TIL à partir des métastases du CCR.
Déclaration d'intérêts concurrents
TaguéPLes auteurs n'ont aucun intérêt commercial, patrimonial ou financier
dans les produits ou les entreprises décrits dans cet article.
Contributions des auteurs
HCA, DG et JS ont collecté et analysé les données et rédigé les principales
parties du manuscrit. HCA, SG, JS et FL ont collecté et analysé les échantillons
de tumeurs. HCA, SG, HH, WD, K-HW ont conçu l'étude et
546 HC Albrecht et coll. / Cytothérapie 25 (2023) 537-547
complété le manuscrit. DG, HH et JS ont développé et fourni les TIL
pour les expériences. Tous les auteurs répondent aux critères du
Comité international des éditeurs de revues médicales (ICMJE)
concernant la définition de la paternité et ont approuvé l'article final.
Financement
HH est le PDG de Zellwerk GmbH et possède des brevets
(DE102018000561, EP3517600, WO2020078498) pour un processus
d'expansion basé sur un bioréacteur pour les cellules de tumeurs. DG
travaille pour Zellwerk GmbH. Les autres auteurs déclarent que la recherche
a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière
pouvant être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Matériel supplémentaire
Des documents supplémentaires associés à cet article peuvent être trouvés dans la
version en ligne à l'adresseest ce que je:10.1016/j.jcyt.2023.01.009.
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