Galle COMBEAUX (gaelle.combeaux@laposte.net) Nathalie FRATINI (nathalie.fratini@laposte.net) Claire MASSIMI (claire.massimi@laposte.net) Marion PUIMATTO (marion.puimatto@laposte.

net)

EPU1 Groupe 2 22/05/2006

LARN INTERFERENCE
Tuteur : docteur Gilles Pags Responsable du projet : Richard Christen

Anne 2005-2006

Sommaire
Sommaire ................................................................................................................................... 2 Liste des abrviations ................................................................................................................. 3 Introduction ................................................................................................................................ 4 1. Principe de lARN interfrence.............................................................................................. 5 1.1. Historique de lARN interfrence ................................................................................... 5 1.1.1. Dcouverte fortuite du phnomne dARN interfrence ......................................... 5 1.1.2 Dcouverte du phnomne chez les mammifres ..................................................... 7 1.1.3 Situation actuelle ....................................................................................................... 8 1.2. Mcanisme de lARNi..................................................................................................... 8 1.2.1. Mcanisme de la phase dinitiation.......................................................................... 8 1.2.2. Mcanisme de la phase effectrice........................................................................... 13 1.2.3. Etape damplification ............................................................................................. 16 2. Techniques de laboratoire .................................................................................................... 17 2.1. L'ARNi sur cellules en culture ...................................................................................... 18 2.1.1. Choix de la squence cible des siARN................................................................... 19 2.1.2. Conception des siARN ........................................................................................... 21 2.2. Visualisation du phnomne dARNi ........................................................................... 33 2.2.1. Immunofluorescence .............................................................................................. 33 2.2.2.RT-PCR................................................................................................................... 39 2.2.3. Un exemple dexprience....................................................................................... 43 2.3. Les expriences dARNi chez lanimal......................................................................... 44 2.3.1. Ladministration locale de siARN.......................................................................... 45 2.3.2. Ladministration de siARN par voie systmique ................................................... 47 2.4. Contrles ngatifs et positifs ......................................................................................... 49 2.5. Limites et contraintes des expriences dARNi ............................................................ 50 3. Applications de la machinerie de lARN interfrence ......................................................... 54 3.1. Le cancer ....................................................................................................................... 55 3.1.1. Silencing des oncognes......................................................................................... 55 3.1.2. Silencing du VEGF ou de son rcepteur ................................................................ 81 3.1.3. Silencing des tlomerases....................................................................................... 89 3.1.4. Silencing de p53 (et protines associes) ............................................................... 96 3.2. Le VIH......................................................................................................................... 103 3.2.1. Gnralits............................................................................................................ 104 3.2.2. Silencer les gnes du VIH .................................................................................... 112 4. Matriel et mthodes .......................................................................................................... 152 4.1. Matriel et mthodes de la partie Historique .............................................................. 152 4.2. Matriel et mthodes de la partie Mcanisme ............................................................. 155 4.3. Matriel et mthodes de la partie Techniques de laboratoire...................................... 163 4.4. Matriel et mthodes de la partie Applications Cancer............................................... 174 4.5. Matriel et mthodes de la partie Applications du VIH.............................................. 196 Annexes.................................................................................................................................. 205 Fiche temps : .......................................................................................................................... 207 5. Bibliographie...................................................................................................................... 208 Liste des figures ................................................................................................................. 220 Conclusion.............................................................................................................................. 225 Rsum ................................................................................................................................... 226 Summary ................................................................................................................................ 226

Liste des abrviations

ARNdb : Acide RiboNuclique double brin ARNi : ARN interfrence ARNr : Acide RiboNuclique ribosomal CMH : Complexe Majeur dHistocompatibilit CMV : Cytomgalovirus CHS : Chalcone Synthase DC : cellule dendritique dbSin : double strand Sindbis EMSA : Electrophoresis Mobility Shift Assay FACS : Fluorescence Activated Cell Sorting FAM : carboxyfluorescein-5-succimidylester FISH : Fluorescent In Situ Hybridation FITC : Fluoresceine Iso Thio Cyanate Gag : Group-specific Antigen GAPDH : Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GST : glutathione S-transferase hTERT : human Telomerase Reverse Transcriptase LTR : Long Terminal Repeat MALDI-TOF : Matrix-Assisted Laser DesorptIonionization- Time-Of-Flight miARN : micro Acide RiboNuclique MMT : Mthylcyclopentadinyl tricarbonyle de manganse Nef : Negative Regulatory Factor PAZ : Piwi Argonaute Zwille PBMC : Cellules Mononuclaires du Sang Priphrique PBS : Phosphate Buffered Saline Pol : POL Polyprotein PEG : PolyEthylne Glycol PEI : PolyEthylenImine PLK1 : Polo-Like Kinase 1 RdRP : RNA-directed RNA polymerase Rev : Regulator of Virion RISC : RNA-induced silencing complex RRE : Rev Response Element Sa-gal : Senescence-Associated -galactosidase SARS : Severe Acute Respiratory Syndrome SEC : Cassette dExpression drive de SiARN shARN : short hairpin ARN siARN : Small Interfering ARN SIV : Simian Immunodeficiency Virus stARN : Small Temporal ARN Tat : Trans-Activator of Transcription TIV : Transcription In Vitro TSP1 : Thrombo-Spondine 1 UNAIDS : United Nations Programme on HIV and AIDS VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor Vif : Viral Infectivity Factor VIH : Virus de lImmunodficience Humaine Vpr : Viral Protein R Vpu : Viral Protein U 3

Introduction
LARN interfrence (ARNi) est un mcanisme naturel, qui a dabord t caractris chez les plantes dans les annes 1990. Il sagit dun processus qui consiste inhiber lexpression de gnes cibles. Il est conserv au cours de lvolution et cest ainsi quen 2001 un laboratoire la mis en vidence chez les mammifres. Ses principales caractristiques sont sa spcificit et son efficacit. Par consquent, il fait lobjet de nombreuses recherches, que ce soit sur le plan fondamental ou en recherche applique. Dailleurs, le journal Science a considr lARNi comme la meilleure russite scientifique en 2002, et l'une des 10 meilleures avances scientifiques de lanne 2003. Cest pourquoi nous avons choisi deffectuer notre projet de recherche sur ce domaine. Nous avions obtenu quelques informations gnrales sur ce sujet lors de nos prcdentes recherches sur les thrapies anti-cancreuses cibles. Nous nous tions alors rendus compte quil serait intressant dapprofondir nos connaissances sur cette technique. Ainsi, lARNi pourrait tre utilise comme outil thrapeutique pour toutes les maladies caractrises par une surexpression de protines ou lapparition de mutations aberrantes. Pour notre projet, nous avons ainsi choisi de dvelopper deux de ces pathologies, savoir le cancer et linfection par le virus de limmunodficience humaine (VIH). En effet, le cancer implique trs souvent des gnes muts induisant une croissance cellulaire incontrle. On pense alors utiliser lARNi pour identifier les gnes du cancer puis les inhiber. Dans le cas du VIH, on peut envisager dteindre lexpression de gnes viraux pour notamment empcher la rplication du virus. Il faut cependant noter que les chercheurs fondent leur espoir sur cette mthode pour combattre dautres types de pathologies telles que des maladies neurodgnratives, oculaires, infections virales En recherche fondamentale, il peut servir comprendre la fonction dun gne dans la cellule ou au sein dun organisme entier. Nous avons dcid de ne pas dvelopper ce point lors de notre tude. Nous nous sommes interrogs sur les points suivants : quel est le principe de ce phnomne ? Comment lutilise-t-on concrtement en laboratoire ? En quoi peut il offrir une avance dans le cadre de la recherche fondamentale et thrapeutique ? Et par ailleurs, quelles sont les limites rencontres ? Nous avons divis notre travail en quatre parties. Nous expliquons tout dabord le principe de lARNi, dans lequel nous prsentons un bref historique et le mcanisme de ce processus. Puis nous nous sommes intresss aux techniques de laboratoire permettant lutilisation de lARNi. Nous avons galement abord les limites de ces techniques. Puis, nous avons tudi deux applications possibles : le cancer et le VIH. Enfin, nous prsentons notre matriel et mthodes expliquant la manire dont nous avons collect nos informations et orient nos recherches.

1. Principe de lARN interfrence

Le gnome subit des altrations qui, si elles ne sont pas rpares, peuvent provoquer des mutations, dltions ou translocations gniques ; cela modifie l'expression des gnes, et ainsi entre autres, des protines. Certaines de ces altrations aboutissent la synthse d'une protine anormale ou sa surexpression. Ces altrations peuvent tre lorigine de maladies, dont beaucoup de cancers. Les chercheurs ont donc tudi diffrents moyens dinhiber spcifiquement lexpression dune protine anormale. Diffrentes techniques ont t dveloppes depuis plusieurs annes, notamment des approches concernant lARN anti-sens. Les chercheurs ont rcemment dcouvert une nouvelle technique, fonde sur une inhibition naturelle de l'expression gnique : l'ARN interfrence (ARNi). L'ARNi a t conserv au long de lvolution chez les Eucaryotes. Il fait aujourdhui l'objet d'un intrt grandissant dans le monde de la biologie car il montre une grande efficacit dans linhibition gnique. Par ailleurs, le phnomne dARNi permet de comprendre la fonction des diffrents gnes dans les gnomes aujourdhui squencs en permettant linhibition de lactivit du gne do une disparition de sa fonction.

1.1. Historique de lARN interfrence

Le phnomne dARNi, depuis 1990, prend de plus en plus dimportance dans le monde de la biologie. Diffrentes tapes ont permis daboutir la dcouverte de ce mcanisme et sa comprhension. 1.1.1. Dcouverte fortuite du phnomne dARN interfrence La premire manifestation du phnomne dARNi fut observe par lquipe de Richard Jorgensen en 1990. Ce chercheur travaillait sur les mcanismes de coloration des ptunias et souhaitait intensifier la couleur des ptales. Pour cela, il introduisit dans lorganisme une copie du gne CHS (chalcone synthase), responsable de la coloration des fleurs. Contre toute attente, il observe que 42% des fleurs dans lesquelles le gne CHS a t introduit sont blanches (contre 9% des fleurs contrle) ou anormalement pales. [M1].

Fleur sauvage

Fleur obtenue introduction du gne

aprs Fleur obtenue introduction du gne

aprs

Figure 1 : Phnotypes de la plante sauvage et des plantes transgniques obtenues aprs introduction du gne CHS. On constate que les fleurs obtenues aprs introduction du transgne ont un phnotype diffrent du phnotype parental : 42% des fleurs sont blanches et dautres sont pales. [M1].

Lanalyse des ARN isols partir des fleurs blanches et protgs contres des ARNases a montr que le taux dARNm produit par le gne tait fortement rduit par rapport au taux dARN des fleurs contrles.

Figure 2 : Profil dexpression de lARN de CHS introduit et celui de CHS endogne. La ligne 1 reprsente les poids molculaires des marqueurs. La ligne 2 est la sonde non digre. La ligne 3 est un contrle. Les lignes 4 9 contiennent les ARN protgs des ARNases et issus de corolles de taille variable. La ligne 10 est un contrle ngatif. Les flches indiquent les fragments dARN endognes (E) et introduits (I). [M1]

La copie de gne introduite a inhib la pigmentation. Cette quipe a montr que ce gne navait pas t altr (lors de lintroduction) en squencant sa rgion codante et en la comparant avec la squence du clone dADNc (ADN complmentaire) dont elle tait drive. Ils ne constatrent aucune diffrence. Il semblait donc que lintroduction du transgne CHS avait inhib lexpression du gne endogne. Ainsi, en ajoutant un gne codant pour une protine dont la synthse tait dj prise en charge par un gne endogne, la protine nest plus exprime (ou moins exprime). A lpoque, le phnomne fut appel co-suppression . Ce phnomne fut r observ bien plus tard dans le rgne animal par les tudes menes par le groupe dAndrew Fire chez le nmatode C. elegans. Identifi sous le nom de PTGS chez les plantes pour Post-Transcriptional Gene Silencing , ce mcanisme dextinction de lexpression dun gne par lintroduction dARN homologue, fut alors appel ARN interfrence . [M2, M6]. Lquipe dAndrew Fire a montr que lintroduction dARN dans des cellules pouvait interfrer avec la fonction dun gne endogne et rduire spcifiquement lexpression de protines. Ils ont en effet pu inhiber 96% des 2300 gnes (environ) du chromosome III de C. elegans et ont dtermin la fonction dun gne impliqu dans la migration du noyau lors de la division cellulaire. [M2]. Ce mcanisme dextinction gnique est donc conserv chez les plantes, le nmatode C. elegans et la drosophile. Il a volu partir dun mcanisme naturel de dfense antivirale. [M7,M8]

Au premier abord, il semblait peu probable que le mcanisme de lARNi fonctionne chez les vertbrs. En effet, lintroduction dARN dans les cellules de mammifres dclenche une forte raction antivirale non spcifique, appele rponse interfron. Il y a induction de la synthse dinterfron de type I et activation de deux types denzymes : la protine PKR et la 2,5oligoadenylate synthtase. Lactivation de ces voies bloque la synthse des protines cellulaires et provoque une dgradation non spcifique des ARN messagers dans les cellules atteintes. Ceci a pour but de bloquer la rplication de particules virales et de protger les cellules voisines.[M5] Les premires notions ont merg des travaux des groupes de Carthew et de Sharp sur les extraits dembryons de drosophile. Ils ont mis en vidence que lextinction des gnes de faon squence-spcifique avait lieu au niveau post-transcriptionnel et que la dstabilisation de lARN messager cibl tait provoque par lassemblage dun complexe nuclasique au niveau de lARNm qui provoquait sa dgradation. [M4,M9]. 1.1.2 Dcouverte du phnomne chez les mammifres En 2001, un article sur lARNi parait dans Nature et entrane un vritable engouement scientifique. En effet dans celui-ci, Sayda M. Elbashir montre que le phnomne existe chez les mammifres. Au mme moment, elle explique sa dcouverte au congrs annuel de la RNA Society. Dans cet article, lquipe dmontre que de petits fragments dARN inhibent rapidement, facilement et spcifiquement les gnes des cellules humaines. Lquipe a mis en vidence que la nature de la rponse cellulaire tait contrle par la taille de lARN introduit. De ce fait, lintroduction directe dans les cellules de mammifres de courts oligonuclotides (de 21 23 bases) pouvait bloquer spcifiquement lexpression du gne cibl sans dclencher de rponse antivirale de type interfron [M3]. Cela fournit un nouvel outil chez les mammifres, tant dans la recherche fondamentale (comprhension des gnomes) que dans la recherche applique (le traitement de maladies encore incurables devient envisageable). Lquipe de Elbashir dmontre dans larticle que lARNi supprime spcifiquement lexpression des gnes endognes dans diffrentes lignes de cellules mammifres, y compris dans les cellules embryonnaires de rein humain et les cellules HeLa. [M3]. Les chercheurs effectuent des expriences semblables sur des cellules de mammifres et des cellules de drosophiles. Ils transfectent lARNi avec un plasmide contenant le gne de la lucifrase. Aprs vingt heures, ils observent une fluorescence. Les rsultats obtenus sur la drosophile sont conformes aux attentes de lquipe : ils observent une inhibition spcifique de lexpression de la protine de la lucifrase complte. Sur les cellules de mammifres, ils obtiennent, pour une expression du gne beaucoup plus forte, une suppression spcifique nettement moins importante mais non ngligeable de lexpression de la protine. Deux hypothses sont alors proposes : lexpression trs importante du gne empche une dgradation aussi quantitative que chez la drosophile ou laccessibilit limite du gne cible diminue le taux dARN dgrad. Lquipe effectue dautres recherches pour confirmer les rsultats obtenus et conclut que le phnomne dARNi fonctionne dans les types de cellules utilises mme si la dgradation ne se fait pas 100%.

1.1.3 Situation actuelle Depuis les annes 1990, et particulirement depuis 2001, un grand nombre de chercheurs sintresse au phnomne de lARNi pour tenter de mieux comprendre le mcanisme. Cependant, certains points restent inexpliqus : on ne sait actuellement pas pourquoi lextinction de lexpression du gne nest que partielle. Depuis 2001, le phnomne prend aux yeux des chercheurs un caractre universel. [M6]. De nombreux laboratoires de biologie cellulaire, molculaire ou de gntique travaillent aujourdhui en utilisant le phnomne dARNi, notamment pour la comprhension de diffrents gnes. En effet, en effectuant une recherche RNAi sur PubMed, on obtient 5789 rponses (dont 630 revues) pour 9826 pour la recherche gene silencing . En considrant que lARNi est un moyen de silencer les gnes, on remarque ici que sur PubMed le nombre de documents sur lARNi reprsente plus de la moiti de celui sur le silencing des gnes. LARNi est aussi tudi dans le cadre de la mdecine et de laspect thrapeutique de maladies diverses : infections virales, cancers, maladies neurodgneratives Toutes ces pathologies restent aujourdhui sans traitements efficaces et ont souvent une origine inconnue. LARNi, qui est au stade exprimental du point de vue thrapeutique, constitue un vritable espoir dans le cadre des thrapies de ces pathologies. Ce nest quen 2004 que les premiers tests sur lhumain ont t effectus.

1.2. Mcanisme de lARNi

Dans ltat actuel des connaissances, le processus de lARNi consiste en deux tapes distinctes : La phase dinitiation : elle consiste en la production des petits ARN interfrents partir du brin dARN exogne. De faon intressante, ces ARN interfrents ne sont pas exprims de faon endogne chez les mammifres. La phase effectrice : elle met en jeu une activit nuclasique qui dtruit lARNm cibl en le coupant. Elle est commune tous les organismes. [G1 ;G5] 1.2.1. Mcanisme de la phase dinitiation Le phnomne de lARNi est initi par la reconnaissance de lARNdb par un complexe nuclasique. Ce complexe dcoupe cet ARNdb en petits fragments de 21 25 nuclotides avec des extrmits 3 symtriques comportant 2 nuclotides sortants. Grce aux tudes ralises sur la drosophile, on peut caractriser cette activit enzymatique capable de reconnatre et de dcouper lARNdb [G32]. Cette activit est assure par une ribonuclase de la famille de la RNase III appele Dicer [G7,G25]. 1.2.1.1. Enzyme Dicer Cette enzyme, trs conserve tant chez le nmatode C. elegans que chez les mammifres, est localise dans le cytoplasme, ce qui implique que lARNi est de faon prdominante, un processus cytoplasmique.[G25]. La protine Dicer possde : un domaine ARN hlicase dans sa rgion N-terminale, un domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), deux domaines ARNase III, 8

un motif de liaison lARNdb dans sa rgion C-terminale. [G10 ;G11].

Figure 3 : Structure de lenzyme Dicer. Elle possde un domaine hlicase, un domaine PAZ, deux domaines ARNase III et un motif de liaison lARNdb. [G26].

Ltude de la structure de lenzyme a permis de concevoir un fonctionnement en dimre antiparallle [G26]. Elle se divise en quatre sites actifs, dont les deux centraux seraient inactifs cause de lintroduction de rsidus dans le centre catalytique du deuxime domaine de Dicer. Lquipe de Bernstein a pu caractriser en 2001 lexistence de deux types de Dicer chez la drosophile. Des mutations sur le gne Dicer-1 empchent linhibition de la traduction de lARNm alors que des mutations sur Dicer-2 perturbent la dgradation des certains ARNm. Cependant chez les mammifres, un seul type de Dicer a t dcouvert. [G24]. De plus, on savait que Dicer-2 se liait une protine R2D2 (R2 car elle a deux sous-units et D2 pour Dicer-2), il a t rcemment dcouvert que R3D1 se fixe de la mme manire Dicer-1 [G14].

Figure 4 : Deux voies de lARNi : par les siARN ou par les miARN. La voie de lARNi peut tre mdie par des siARN ( gauche) ; lenzyme dicer-2 sassocie R2D2. Ou bien la voie dARNi empreinte lutilisation des miARN ( droite) ; Dicer-1 lie cette fois-ci R3D1. [G14].

1.2.1.2. Fonction nuclasique de Dicer : formation des siARN La fonction principale de Dicer est de cliver lARNdb en petits fragments. Pour remplir cette fonction, Dicer doit reconnatre lARNdb et sy lier. Dicer semble tre localise dans le rticulum endoplasmique, du moins pour Dicer humaine, ce qui lui procure une augmentation de spcificit. Elle peut alors discriminer les ARNdb devant rendre silencieux des gnes, de ceux essentiels pour la traduction et pour dautres processus ARNdpendants. Une fois l ARNdb reconnu, Dicer na pas besoin de Mg+ pour sy fixer, en revanche ce cation est indispensable pour le clivage. De plus, ces ions stabilisent la dimrisation Dicer/ARNdb. Le clivage de lARNdb ne ncessite pas dATP chez les mammifres, mais pour la drosophile et les nmatodes, lATP se lie au domaine

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ATPase/hlicase de Dicer. Diffrentes hypothses sont proposes pour comprendre lintrt de lhydrolyse de lATP; elle pourrait permettre : le dplacement de Dicer le long de lARNdb et le droulement local du substrat ; le relargage du produit par lenzyme et pour son transfert la nuclase RISC (phase effectrice) ; un rarrangement structural de Dicer ncessaire pour la liaison et le clivage du substrat suivant. [G33]. Dicer se compose de deux domaines catalytiques, do un clivage des deux brins de lARN fix tous les 22 nuclotides dintervalle. Les modifications dans Dicer par rapport la squence consensus entranent une variation dans lespace entre les centres catalytiques, ce qui explique la variation spcifique dans la longueur des fragments produits. Ces fragments sont appels small interfering ARN (siARN). Dicer clive lARNdb prfrentiellement ses extrmits. Lefficacit du clivage dpend de la longueur de lARNdb. Dicer reste lie au produit de clivage, ce qui ralentit lactivit enzymatique. 1.2.1.3. Production des miARN : intervention de Drosha et Dicer Dicer est galement implique dans la production dune autre classe de petits ARN, appels micro ARN (miARN). [G23]. Du fait de leur petite taille, les miARN sont longtemps passs inaperus dans les processus classiques de purification dARN. Ils ont t identifis, il y a une dizaine dannes chez le ver C. elegans. Par la suite, ils ont t bien dcrits chez Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster et Homo. sapiens. De faon remarquable, certains miARN sont trs conservs au cours de lvolution, ce qui suggre une fonction biologique importante [G27]. La maturation des miARN fait intervenir au moins deux protines apparentes lARNaseIII : Dicer, comme dit prcdemment, et Drosha [G34]. Cette dernire appartient chez lHomme un gros complexe multiprotique contenant de nombreuses hlicases et protines du sarcome dEwing. Elle peut aussi tre associe DGCR8 (alias Pasha), une protine se liant aux ARNdb [G34]. Elle intervient dans le nucloplasme o elle convertit un transcrit primaire (pri-miARN) en un ARN ayant une forme dpingle cheveux denviron 70 nuclotides, on parle alors de pr-miARN. Ce dernier est pris en charge par Dicer qui faonne un intermdiaire de maturation transitoire nomm miARN:miARN*. Seul un brin formera le miARN mature, gnralement, celui dont lextrmit 5 est la moins apparie. Chez les plantes, les prcurseurs des miARN sont plus longs et ont une structure plus complexe. [G4].

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Figure 5 : Biosynthse des miARN. Drosha et Dicer sont deux enzymes intervenant dans la maturation du miARN. A partir dun ARN prcurseur en tige boucle imparfaite ces enzymes produisent un ARN simple brin denviron 21-23nuclotides [G8].

Il semblerait que dautres facteurs participent cette biosynthse, notamment lexportine 5 qui assure le transport du pr-miARN du noyau vers le cytoplasme. Depuis 2002, plusieurs groupes se sont focaliss sur lidentification des squences pouvant former des boucles et gnrer ces petits ARN de 21-23 nuclotides [G31]. Leurs efforts ont conduit lidentification denviron 250 miARN chez lHomme mais il est probable que ce nombre sera bientt largement dpass. Les premiers miARN dcouverts furent lin-4 et let-7, des small temporal ARN (st ARN) qui interviennent dans le contrle du dveloppement de lanimal. La molcule dARN lin-4 (lineage-abnormal-4) rgule ngativement les gnes du dveloppement lin-14 et lin-28. Plusieurs travaux suggrent quelle exerce une rpression post-transcriptionnelle en se fixant au niveau de squences homologues situes dans la rgion 3UTR des ARNm. Dune faon similaire, let-7 (lethal-7) est un rgulateur transcriptionnel ngatif qui cible les rgions 3 UTR du messager lin-41 [G35]. On peut citer dautres miARN comme par exemple isy qui cible cog (gne dterminant lasymtrie neuronale) chez C. elegans. Chez la drosophile miR-14, bantam et miR-2, entre autres, contrlent la prolifration et/ou la diffrenciation cellulaires en modulant lexpression de gnes pro apoptotiques tel que hid [G30 ; G37]. Chez les mammifres, certaines cibles restent inconnues, cest le cas de lARNm attaqu par miR-181[G36].

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Figure 6 : Exemples de miARN dont la fonction biologique et /ou les cibles ARNm sont caractrises [G15].

La phase dinitiation se termine en aboutissant la production de petits fragments, siARN ou miARN, grce la diversit de la ribonuclase Dicer et par lintervention de Drosha. 1.2.2. Mcanisme de la phase effectrice Le but de cette tape est daboutir linhibition de lexpression de gnes cibls. Les siARN ou miARN, aprs avoir t produits grce Dicer, vont par la suite guider le complexe effecteur endonuclasique RNA-Induced Silencing Complex (RISC) sur lARNm homologue dtruire. [G12] 1.2.2.1. Le complexe RISC Le complexe RISC a t identifi partir dembryons de drosophile sous la forme dun complexe prcurseur de 250 kD par le groupe de Zamore [G17]. Il se compose de plusieurs domaines : [G7 ;G16] une protine de la famille des Argonautes : Cette protine peut varier selon les espces. Nanmoins, la protine Ago2 est trs conserve entre les espces. Son homologue chez lHomme est le facteur dlongation eIF2C, initialement caractris par son association aux ribosomes et son rle dans la traduction des protines. La protine argonaute/eIF2 est basique et a un poids molculaire denviron 100 kD. [G3}. De plus, sa nature dans le complexe influence la fonction de RISC. En effet, dans les RISC sassociant aux siARN, on retrouve lArgonaute Ago1 alors que dans les RISC contenant les miARN on trouve Ago2. o le domaine PAZ sapparierait avec le domaine PAZ de Dicer grce au facteur R2D2 ou R3D1 ; cela permettrait alors de lier l'ARN simple brin [G7 ;G6] o le domaine Piwi en C-terminal une hlicase permettant de dissocier lARNdb. Celle-ci est ATP-dpendante. A lheure actuelle, on a montr quune hlicase (la Gemim3) coprcipitait avec efF2CD2 (composant argonaute de RISC humain).

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une protine dFXR ou FMRP (homologue chez l'homme) qui est une protine de retard mental d au X fragile. Elle appartient des complexes ribonucloprotiques et rgule l'expression de certains gnes. Cependant son rle prcis dans le phnomne de l'ARNi n'a pas encore t identifi. [G18]. 1.2.2.2. Activation de RISC Le complexe inactiv contient les siARN ou miARN sous leur forme double brin alors que la forme active de RISC contient les formes relaxes simple brin qui servent de guide pour la reconnaissance de la cible. Il faut donc tout dabord que RISC reconnaisse Dicer, et cela se fait grce son domaine Ago. Ensuite, lhlicase composant RISC permet la dissociation des deux brins ; cette tape ncessite de lATP. On obtient ainsi un complexe RISC activ qui va pouvoir aller attaquer lARN cible. [G19 ;G38].

Figure 7 : Mode dactivation du complexe RISC. Dicer (ici Dcr-2) et sa protine associe (ici R2D2) sont lis au siARN double brin. Le domaine Ago-2 du complexe RISC reconnat tout dabord Dicer puis R2D2. Ensuite, Ago-2 clive le brin bleu. On obtient alors la forme active de RISC en simple brin. Elle peut maintenant aller reconnatre lARNm cible. [G33].

Un complexe RISC de plus grande taille (500 kD) a t identifi dans les cellules S2 de drosophile, suggrant quin vivo dautres protines peuvent interagir et moduler lactivit de ce complexe. Cependant, la sous-unit catalytique du complexe RISC na pas encore t identifie [G33]. 1.2.2.3. Deux mcanismes daction : dgradation dARNm ou inhibition de la traduction Une fois activ, RISC est guid par lARNi vers lARNm auquel il se fixe. Une diffrence fondamentale entre les siARN et les miARN rside dans la force de la liaison du fragment

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lARNm cible. En effet, contrairement la liaison des siARN sur leur squence cible, la liaison du miARN est imparfaite et forme une zone de msappariement. Ceci a pour consquence daboutir deux mcanismes daction diffrents. Dans le cas des siARN, il y a destruction de lARNm ; le siARN est fix par RISC sur une rgion codante de lARNm cible. La fixation des miARN sur lARNm se fait de manire imparfaite sur une rgion 3 non codante, donc cela a pour consquence de bloquer la traduction du gne et dempcher la synthse de la protine correspondante.

Figure 8 : Comparaison des mcanismes daction des siARN et des miARN. Le siARN gnr par laction de lenzyme Dicer se lie, par lintermdiaire du complexe RISC, sur une rgion codante dun ARN messager. La parfaite complmentarit de squence entre le siARN et lARN messager provoque la dgradation de ce dernier. Le miARN est gnr partir dun prcurseur en forme dpingle cheveux par lenzyme Dicer. Il est reconnu par un complexe qui ressemble au complexe RISC. Celui-ci provoque la liaison du miARN au niveau des rgions 3 non codantes dun ARN messager. La liaison imparfaite du miARN au niveau du messager provoque son inhibition post-transcriptionnelle et empche la synthse de la protine correspondante. [G15].

Finalement, soit lappariement entre ARNm et siARN cre une rgion de lARNdb activant le systme de dfense naturel de la cellule contre les virus (prsentant frquemment des ARNdb). Cela peut donc prsenter galement un intrt pour lutter contre les virus. Lendonuclase de RISC clive alors lARNm. LARNm tant dtruit, la protine normalement code par cet ARN ne peut plus tre synthtise. Soit la molcule hybride ARNm/miARN associe au complexe RISC va engendrer linhibition de la traduction du gne. [G7]

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Figure 9 : Fonctionnement classique de la machinerie de lARN interfrence. LARN double brin est reconnu et cliv par Dicer en siARN et miARN. Ces petits ARN se lient ensuite RISC formant ainsi un complexe, activ par de lATP, qui se lie lARNm cible. [G7].

Il existe des similitudes importantes dans le mcanisme daction des siARN et des miARN. Ainsi, il est possible que lARNi soit la voie ancestrale visant contrler les pathognes qui aurait volu vers le mcanisme des miARN pour contrler les propres gnes de la cellule. Empcher la traduction de lARNm plutt que le dtruire pourrait tre un meilleur moyen den moduler lexpression. Ainsi la phase effectrice se termine. Quelque soit la mthode employe (siARN ou miARN), le rsultat final reste le mme : lexpression dune protine est inhibe. [G2]. 1.2.3. Etape damplification Linhibition de protine par le phnomne dARNi ne semble exiger quune trs faible quantit initiale dARNdb. On suppose donc quil y a une tape damplification dans le phnomne dARN interfrence RdRP (RNA-directed RNA polymerase) est une polymrase qui intervient dans le phnomne de transitivit de lARNi pour augmenter lefficacit dinterfrence de lARN. [G20]. Il a t dmontr que, chez C. elegans, lARNi implique la production de deux populations de siARN par lintervention de RdRP [G21]. Le premier groupe de siARN (siARN primaires) provient de lARNdb initialement inject et permet de rendre silencieuses des rgions dARNm particulires par complmentation de squence. La liaison siARN/ARNm cible induit le clivage de lARNm et produit alors une structure servant de signal RdRP pour initier la synthse de siARN secondaires. Ces siARN secondaires ont une squence et une structure rvlant leur formation par RdRP ; ce sont des ARN anti-sens de lARNm cliv. Ils sont synthtiss par RdRP partir de lextrmit 3OH du siARN primaire anti-sens servant damorce sur lARNm cible [G28 ;G29]. Le rsultat de cette raction est la formation dun nouvel ARNdb. Ce dernier est alors utilis comme substrat par Dicer. Ce modle dit de PCR dgnrative aboutit une amplification du signal siARN. Ces siARN secondaires correspondant aux rgions de transcrit en amont de la cible initiale peuvent aussi rendre silencieux les ARNm de squence complmentaire la leur, pour augmenter la rponse. On pense que les ARNdb primaires sont initialement reconnus de manire diffrente par rapport la reconnaissance des ARNdb secondaires, produits par

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RdRP. Lamplification exponentielle du nombre de siARN permet des rponses plus sensibles et plus slectives. [G4 ;G22].

Figure 10 : Amplification des siARN grce RdRP. Deux diffrentes voies impliques dans le phnomne dARNi. A partir du ARNdb inject, Dicer forme des siARN primaires. Ces fragments se lient ensuite RISC pour aller reconnatre lARNm cible. A partir de l, soit on empreinte la voie classique aboutissant la dgradation de lARNm, soit RdRP synthtise un nouveau brin qui sera par la suite cliv par Dicer, on obtient alors les siARN secondaire ; il y a une amplification du nombre de siARN dans la cellule. Et ensuite la boucle se referme [G7].

Labsence dhomologue de RdRP chez la Drosophile et les Mammifres suggre soit que dautres enzymes sont utilises pour lamplification, soit que le nombre de siARN primaires est suffisant pour produire une rponse efficace [G29]. On pense dans tous les cas que dautres mcanismes damplification interviennent pour le phnomne dARNi.

2. Techniques de laboratoire
Lutilisation du mcanisme dARN interfrence pour induire le silencing de gnes est une nouvelle mthode de laboratoire trs excitante permettant de crer des phnotypes de perte de fonction . Actuellement, lARNi est donc un puissant outil utilis pour comprendre la fonction des gnes. Elle est galement utilise dans un but thrapeutique. En effet, il semble que lARN interfrence constitue un outil de choix pour silencer lexpression de gnes surexprims dans diverses maladies. Dans cette partie, nous allons nous attacher dcrire les diffrentes techniques dont dispose concrtement le chercheur pour raliser des expriences dARN interfrence. Nous verrons donc que celles-ci peuvent se faire sur des cultures cellulaires (in cellulo), mais aussi, in 17

vivo, sur des animaux entiers. Une exprience dARNi se compose de plusieurs tapes successives. Pour chacune de ces tapes, plusieurs lments sont ncessaires : 1 2 3 4 Un ARN double brin (duplexe) spcifique qui cible le transcrit dun gne particulier pour induire le phnomne dARN interfrence Un systme dadministration efficace de lARN double brin Des tests pour suivre le processus dARN interfrence Des contrles appropris

2.1. L'ARNi sur cellules en culture

Il faut dj distinguer les expriences dARNi ralises sur les cellules non-mammifres de celles ralises sur les cellules mammifres. En effet, selon le type cellulaire tudi, les techniques employes pour mener bien lexprience ne seront pas les mmes. Chez les systmes non-mammifres comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, on introduit dans la cellule de longs ARNdb (en gnral > 200pb) complmentaires de lARNm cible, pour induire le mcanisme dARNi. Une fois dans la cellule, la nuclase cytoplasmique Dicer clive les longs ARNdb en ARNdb de 21 23 nuclotides. Puis le processus naturel d'ARN interfrence se poursuit (RISC...) jusqu l'extinction de l'expression du gne cible. [N1] Dans les cultures de cellules mammifres, lARNi est induit par des siARN introduits directement dans la cellule. Ces siARN miment le produit gnr par Dicer lors de la phase initiatrice de lARNi naturelle. On nintroduit donc pas de longs ARNdb, car on s'est aperu que ces derniers pouvaient induire une rponse anti-virale dans la cellule mammifre. Les siARN pourront galement tre exprims sous forme de structure en tte dpingle , via une construction dADN. Les diffrents moyens d'administration des siARN sont dvelopps dans la partie qui suit.[N1] On voit donc que llment introduit diffre selon le type cellulaire (figure 11).

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Technique employe pour des cellules non mammifres

Technique employe pour des cellules mammifres

Figure 11 : Deux protocoles diffrents suivre pour raliser des expriences dARN interfrence sur cellules mammifres ou non-mammifres. En ce qui concerne les cellules non-mammifres, on introduit un ARNdb dans la cellule. Celui-ci va suivre le processus naturel de lARN interfrence, savoir dgradation par RISC en siARN puis association au complexe enzymatique RISC. Pour les cellules mammifres, on introduit dans la cellule directement un siARN. Une fois dans la cellule, celui-ci va se complexer RISC et le guider vers lARNm cible. Le but final est toujours la dgradation de lARNm par RISC. [N1].

2.1.1. Choix de la squence cible des siARN Quelle que soit la faon dont on va synthtiser les siARN, la premire tape dans le design de ces derniers est le choix de leur squence cible. Ce choix se fait en gnral, aprs consultation de la littrature actuelle dans le domaine tudi. On peut aussi se baser sur de observations empiriques. Des tudes ont dmontr que dans des cellules mammifres, lintroduction dARNdb de plus de 30 nuclotides active une rponse anti-virale de type interfron. Ceci conduit donc la dgradation non spcifique des ARNm et une rduction gnrale de la traduction protique au sein de la cellule. En consquence, on fabrique toujours des siARN de moins de 30 nuclotides de long. [N7]. La premire chose faire est de trouver une squence de 21 nuclotides dans lARNm cible, qui commence par un dinuclotide AA. En commenant par le codon initiateur de la transcription AUG, on cherche donc cette squence spcifique. Toutes les squences commenant par ce dinuclotide, et avec les 19 nuclotides suivants en 3 constituent donc un site cible potentiel pour les siARN. Cette stratgie concernant le choix de la cible des siARN est base sur les observations de lquipe de Elbashir. En effet, ils ont constat que les siARN avec un dbordement en 3, constitu dun dinuclotide UU, taient les plus puissants (plus puissants que les duplexes bouts francs). [N3, N18].

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Ceci est en accord avec le fait que la RNA polymrase III, lorsquelle synthtise les hairpin siARN naturels, arrte la transcription au niveau dune squence poly (T), ce qui cr une molcule dARN avec une petite queue poly(U). Si le dbordement contenant le dinuclotide terminal en 3 est diffrent, on observe quand mme un phnomne dARN interfrence. Il est cependant dconseill dutiliser des rsidus G dans cette rgion de dbordement, cause de la possibilit de clivage du siARN par les RNases au niveau des rsidus G simple brin. [N3] Il est galement fortement recommand de choisir 2 4 squence cible pour un gne. En effet, des recherches ralises par Ambion ou Dharmacon ont montr que plus de la moiti des siARN crs de manire alatoire induisent une diminution dau moins 50% du taux dARNm cible. Dautre part, on estime quenviron 1 siARN sur 4 provoquent une diminution de 75 95 % du niveau dexpression. Cependant, aucune relation entre la position du site cible sur lARNm, et la puissance de siARN na encore t tablie. [N1] Typiquement, on teste 4 squences de siARN, par ARNm cible. Il est prfrable despacer les squences du siARN sur la longueur du gne cible, pour rduire les chances de cibler une rgion de lARNm qui est fortement structure, ou lie des protines rgulatrices. Dailleurs, il existe une mthode pour cibler de manire efficace les squences dARNm. Cette mthode est base sur lobservation faite que les sites accessibles dun ARNm endognes peuvent tre cibls pour la dgradation par une RNase synthtique. Chaque site accessible identifi de cette manire est ensuite utilis comme insert dans la construction de notre choix. [N1] Une autre rgle importante est dviter les squences cible qui prsentent 16-17 paires de bases contigus similaires dautres squences codantes. En effet, des tudes ont permis de voir quon pouvait assister un silencing de gnes non-cibls contenant seulement 11 nuclotides contigus identiques au siARN. Ces rsultats dmontrent que les siARN ne peuvent tre utiliss que pour des cibles ne prsentant pas de trop fortes similarits avec dautres gnes. Cest ainsi que loutil BLAST pourra se rvler trs important, pour la comparaison de squences. Cet outil puissant est disponible sur le serveur du NCBI. Le but est dliminer les squences cible qui prsentent un trop fort taux de similarit avec dautre gnes. [N4]. En ce qui concerne les cellules non mammifres, les expriences d'ARN interfrence semblent tre assez simples. En effet, pour ces cellules, de longs ARNdb (en gnral > 200pb), complmentaires de l'ARNm cible sont utiliss pour induire le mcanisme d'ARNi. Le design de ces ARNdb est trs simple puisqu'en principe, n'importe quel long ARNdb complmentaire de l'ARNm cible sera efficace. Ces ARNdb peuvent tre gnrs par transcription in vitro. Les mthodes d'administration sont aussi trs simples. Ainsi, pour administrer un ARNdb dans une cellule S2 de Drosophila, celui-ci peut tre directement ajout dans le milieu de culture. Les ARNdb peuvent galement tre directement injects dans l'embryon de ver ou de mouche. [N1]. Nous allons donc plutt nous intresser aux expriences d'ARN interfrence ralises sur des cellules mammifres. Dans ce cas, on a alors recours des siARN. Dans la partie qui suit, nous allons dcrire les diffrents moyens d'obtenir ces siARN.

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2.1.2. Conception des siARN Il existe typiquement 5 mthodes pour gnrer les siARN. 1 2 3 4 5 synthse chimique transcription in vitro digestion in vitro dun long ARNdb par Dicer ou RNase II expression via un plasmide ou un vecteur viral expression via un produit de PCR (cassette)

Pour les 3 premires techniques, les siARN seront ensuite introduits directement dans les cellules mammifres par lipofection ou lectroporation Chacune de ces mthodes est adapte un type prcis dexpriences et un but en particulier. Chacune dentre elles a ses avantages et ses dfauts. Nous allons dcrire leurs applications possibles. [N1]. 2.1.2.1. La synthse chimique La synthse chimique est la mthode de prparation des siARN la plus utilise pour des expriences transitoires en culture cellulaire, car les siARN sont plus faciles transfecter que les plasmides. De plus, les siARN pr-designs et prts lemploi sont facilement disponibles. Elle apparat donc comme la mthode la plus rapide et facile pour les chercheurs. Elle reste cependant la mthode de gnration des siARN la plus chre. [N19] Des socits sont spcialises dans le design de siARN, cest le cas de la socit Ambion , qui est actuellement le leader sur la march, dans le dveloppement et la conception de produits utiliss en biologie molculaire. Ambion est partenaire de Cenix BioSciences, spcialistes dans le domaine de lARNi. La cration des siARN se fait alors par synthse chimique. La compagnie Cenix a dvelopp un algorithme qui permet daugmenter encore lefficacit des siARN, par rapport aux mthodes traditionnelles dcrites par Tuschl and al. En effet, aprs ralisation de nombreuses expriences dARNi, cette quipe de recherche a nonc un certain nombre de rgles respecter, qui permettent dobtenir une rduction denviron 50% dans lexpression des gnes cibls. Quelles sont ces rgles ? 1 Le siARN doit possder un dbordement UU en 3, que ce soit sur le brin sens, ou anti-sens 2 Le contenu en G/C doit tre denviron 50%. En effet, il semblerait que les siARN avec 30 50 % de contenu en GC soient plus actifs que ceux avec un contenu plus lev en rsidus GC. Un faible contenu en GC est donc corrl avec une augmentation de lefficacit de silencing. Il semblerait aussi que les siARN contenant un fort taux de rsidus GC au niveau de lextrmit 3 du brin anti-sens, et un faible taux, ct 5 soient plus efficaces. Ce principe est une des cls de lalgorithme [N18] Dautres caractristiques sont prises en compte lors de la conception des siARN : la temprature de fusion des domaines internes du siARN, la longueur du siARN, la position de la squence cible dans la rgion codante, et le contenu en nuclotides du dbordement 3. Ces diffrents paramtres sont pris en considration dans lalgorithme. [N19] Lun des principaux avantages de la synthse chimique est son rendement lev de siARN purifis. Ses inconvnients incluent un cot lev, et un temps de ralisation relativement

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long (4 12 jours). A cause du cot, beaucoup de chercheurs optent pour dautres mthodes de synthse comme la transcription in vitro, puis ont recours la synthse chimique, uniquement pour la squence la plus efficace. La synthse chimique est surtout utilise pour des tudes qui requirent de grandes quantits dune squence ultra pure de siARN. Elle nest pas recommande pour des tudes long terme. Depuis quelques annes, plusieurs algorithmes de design des siARN ont t conus. Leur but est daugmenter le taux de succs du silencing des gnes humains. La conception de tels algorithmes est base sur de grandes explorations statistiques et sur la ralisation de nombreuses expriences. Pour concevoir leur algorithme, les socits Ambion et Cnix ont test de multiples siARN ciblant des centaines de gnes humains exprims des niveaux dtectables dans diffrentes ligns cellulaires. Ltape cl de cet algorithme est lanalyse de chaque squence de siARN pour maximiser la spcificit du ciblage. [N1]. Dans une exprience de screening sur 79 gnes humains ralise par Ambion/Cenix, et base sur leur nouvel algorithme, on a pu observer que 94 % des siARN crs permettent dobtenir une rduction dau moins 70% des niveaux dARNm cibls (figure 12).

Figure 12 : Efficacit des siARN crs par Cenix. Les siARN ciblant 79 gnes humains (codant tous pour des kinases) ont t cres en utilisant lalgorithme dvelopp par la socit Cnix. Les siARN candidats pour chaque cible ont t prpars et transfects une concentration finale de 100mM. 48 heures aprs la transfection, lexpression des gnes cibles a t quantifie par une RT-PCR en temps rel. La diminution relative de lexpression des ARNm cible a t compare avec des cellules transfectes avec un siARN contrle ngatif (normalisation avec un ARNr 18S). On voit que 74 des 79 siARN, soit 94% des siARN tests donnent un taux de silencing suprieur 70%. [N1].

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Figure 13 : Efficacit de diffrents siARN valids et utiliss diffrentes concentrations. Les siARN indiqus ont t complexs avec un mlange lipidique (siPORT Lipid) et les complexes ont t administrs des cellules HeLa places dans des plaques 24 puits. Les concentrations finales de siARN utiliss sont indiques. 48 heures aprs la transfection, lARN des cellules traites a t rcupr, et reverse transcrit (RT). Les niveaux dADNc cible ont t mesurs par une PCR en temps rel. Lexpression des gnes cible dans les cellules transfectes a t compare celle observe dans des cellules transfectes avec une concentration gale de contrle ngatif. Les taux dADNc des diffrents chantillons ont t normaliss en utilisant lARNr de la sous-unit ribosomale 18S. [N1].

La figure 13 montre la puissance de 6 siARN diffrents conus grce lalgorithme de Cnix. Ces siARN sont aussi efficaces dans la rduction des niveaux dARNm cible 10, 30, ou 100mM. Il a t dmontr que mme de trs faibles quantits de siARN, de lordre du piccomolaire, sont capables dinduire une trs forte rponse dARNi. [N5]. Lutilisation de squences de siARN trs efficaces permet de diminuer les quantits de siARN utilises pour lexprience, ce qui rduit le cot des ractifs. Ceci va galement permettre dutiliser diffrents siARN dirigs contre diffrents gnes, dans une seule exprience. Mais ce qui est encore plus important, cest quen rduisant la concentration efficace de siARN utilise dans une exprience, on va pouvoir maximiser la spcificit des effets de lARN interfrence. Ceci na t dmontr que trs rcemment. De plus, il faut prciser que trop de siARN peut conduire une toxicit cellulaire et une mort de la cellule. [N1] Actuellement la socit Ambion fournit des siARN ciblant 98 % des gnes de lhomme, de la souris, et du rat (selon la base de donnes du NCBI), soit environ 35.000 gnes.[N1] 2.1.2.2. Transcription in vitro Le but est ici de synthtiser une paire complmentaire dARNm de 21 nuclotides, grce une RNA polymrase (en gnral T7) et un brin dADN. Chaque brin dARN est synthtis de manire spare. Les brins sont ensuite apparis pour former un duplexe. Les siARN produits par cette mthode sont considrablement moins chers que ceux synthtiss de manire chimique. De plus, ils peuvent tre obtenus beaucoup plus rapidement. Une fois que les deoxynuclotides ont t obtenus, il faut compter environ 24 heures pour raliser la raction de transcription in vitro. Ensuite, on passe ltape de 23

transfection des cellules. [N8, N19] Les inconvnients de cette mthode sont une possibilit de scale up limite (augmentation des quantits synthtises). Il faut cependant noter que chaque raction produit assez de siARN pour raliser des centaines de transfections. Un autre dsavantage est le fait que cette mthode demande plus de travail au chercheur, compar aux siARN synthtiss chimiquement qui peuvent tre achets dj prpars. Les siARN obtenus par transcription in vitro sont aussi efficaces que ceux synthtiss de manire chimique, et ceci de plus faibles concentrations (0,5-20nM vs.50-100nM). Cette mthode est choisie pour screener des squences de siARN ou quand le prix de la synthse chimique du siARN est un obstacle. Elle nest pas recommande pour des tudes long terme ou pour des tudes qui rclament de grandes quantits de siARN. [N1] Il est noter que la synthse chimique dARN ncessite ensuite (le plus souvent) une purification par un gel dlectrophorse non dnaturant ou par lectrophorse capillaire, ce qui va permettre de vrifier que les brins du siARN sapparient correctement. [N8, N19]. 2.1.2.3.Digestion de longs ARNdb pour crer un mlange de siARN Cette technique de production des siARN et celles qui vont suivre ncessitent le design et le test de plusieurs squences de siARN, afin didentifier la plus efficace. Cest le principal inconvnient de ces techniques. La prparation de mlanges de siARN permet de surmonter ce dsavantage. Dans cette mthode, de longs ARNdb sont prpars par transcription in vitro dune rgion de 200 1.000 nuclotides de lARNm cible. Ces ARNdb sont ensuite digrs in vitro par une RNase III (ou Dicer), pour produire une population htrogne de siARN. Puisque ce mlange contient diffrents siARN, lefficacit du knock-down est quasiment assure (figure 14).

Figure 14 : Exprience de silencing du gne Ku-70. Une population de siARN ciblant 200 nuclotides de lARNm de KU-70 ont t prpars (grce la RNase III) puis ont t transfects dans des cellules HeLa, une concentration finale de 100nM. Les cellules ont t analyses 48 heures aprs la transfection par immunofluorescence. On constate une rduction des niveaux de Ku-70 de 86% dans les cellules transfectes par le mlange de siARN, compar au contrle (cellules non transfectes). [N1].

Le principal avantage de cette approche (mlange de siARN) est la possibilit dviter les tapes de tests qui visent dterminer les squences de siARN les plus efficaces. Ceci permet en retour de faire gagner aux chercheurs du temps et de largent. On peut noter

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dailleurs que les ractions la RNase III sont en gnral moins chres que celle ralises avec Dicer. Pourtant un des points ngatifs de cette approche est la possibilit dobserver des silencing non spcifiques, particulirement au niveau de gnes troitement similaires. Cette stratgie est le plus souvent utilise pour des analyses rapides et peu coteuses de phnotypes de perte de fonction . Elle nest pas recommande pour des tudes long terme, ou pour des tudes qui requirent une seule squence de siARN bien dfinie. A ce jour, cette stratgie marche trs bien dans les lignes cellulaires de type NIH-3T3, HeLa, S3, 293, BJ, et pour inhiber lexpression de nombreux gnes, tels que c-fos, GAPDH, La, actin, ou encore Ku-70. [N1] Une fois que les siARN ont t obtenus par ces mthodes de prparation in vitro (synthse chimique, transcription in vitro, ou digestion de longs ARNdb), ils doivent tre dlivrs aux cellules. Pour les cellules primaires, en suspension, ou pour les lignes cellulaires difficiles transfecter, on aura plutt recours llectroporation. Sous certaines conditions de tampon, cette technique se rvle tre une mthode dadministration des siARN trs efficace. En gnral, on utilise des tampons doux, qui ne compromettent pas la viabilit de la cellule. D'autre part, il faudra le plus souvent avoir recours des tapes de purification de ces siARN obtenus in vitro. Celle-ci va nous permettre de sassurer de la taille et de la puret des siARN, avant quils ne soient transfects. Pour un plus grand niveau de puret, il est recommand dutiliser des filtres de liaison et dlution en fibres de verre, ou bien des gels de purification en utilisant 15 20% dacrylamide, afin dliminer les nuclotides en excs, les protines et les sels de la raction.. On pourra galement raliser des dprotections, suivies de colonnes de purification. Ces mthodes garantissent un taux de purification de 80%. LHPLC et le PAGE garantissent, eux, une purification 97. [N19] On peut galement avoir recours 2 mthodes dadministration compltement diffrentes, savoir les vecteurs dexpression, ou bien les cassettes dexpression. Lutilisation de vecteurs dexpression de siARN, ou de cassettes dexpression drives de produit PCR, repose sur une transcription in vitro de siARN puis une introduction dans les cellules. Lun des avantages de ces mthodes est quon ne travaille pas directement avec de lARN. Les squences de siARN exprimes par ces mthodes ne doivent pas contenir de squence comportant 4-5 A ou T, qui agirait comme un site de terminaison pour la polymrase III. 2.1.2.4. Vecteurs dexpression des siARN Pour induire le mcanisme dARN interfrence, on peut donc avoir recours des vecteurs dexpression siARN. Ils permettent des tudes de knock-down long terme. Il y a diffrents critres respecter concernant les inserts codant pour lexpression des siARN. La plupart des designs possdent 2 squences rptes, inverses lune par rapport lautre, et spares par une courte squence spacer . Ils se terminent par une queue polyT, qui sert de site de terminaison de la transcription. Ces designs vont produire un ARN qui va se replier, et adopter une conformation en forme de petite pingle cheveux (figure 15). [N9].

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Figure 15 : Schma dun Small Hairpin RNA produit par un vecteur dexpression siARN. Ce schma illustre la relation qui existe entre shRNA et squence de lARN cible. La cible correspond une squence de 19 nuclotides avec un dinuclotide AA lextrmit 5. Le siARN en forme de tte dpingle qui va tre exprim dans la cellule aprs transfection se compose dun brin sens et dun brin anti-sens, dpars par une squence spacer dont la taille est variable. [N1].

La longueur des squences rptes inverses qui vont reprsenter la tige de lhairpin, la longueur et la composition de la squence spacer qui reprsente la boucle de l hairpin, et la prsence ou non du dbordement 5 varient beaucoup dune exprience dARNi lautre. Des expriences ont t ralises en utilisant une longueur de tige de 19 29 nuclotides. Ces siARN avec des longueurs de tiges variables fonctionnent tous aussi bien dans les tudes de silencing des gnes. La longueur et la squence de la boucle liant les squences sens et anti-sens du siARN peuvent varier. Les tudes ont montr des rsultats de silencing significatifs pour des siARN possdant des boucles de 3 23 nuclotides. [N9, N10] La figure 16 reprsente les boucles qui se sont rvles efficaces lors dexpriences dARN interfrence. Ces boucles varient tant dans leur longueur que dans leur composition.

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Figure 16 : Tableau qui rpertorie les diffrentes longueurs et squences de boucles efficaces. On voit que ces boucles peuvent avoir une taille allant de 3 23 nuclotides. On nobserve pas de vritable squence consensus, puisque les squences sont trs diffrentes dune boucle lautre. Toutes ces boucles se sont rvles efficaces dans des expriences dARN interfrence. [N1].

Les clonages traditionnels se font laide du vecteur pSilencer. La plupart des vecteurs dexpression des siARN possdent un promoteur RNA polymrase III (pol III) pour diriger lexpression des small hairpin RNA dans les cellules mammifres. Deux promoteurs de type ARN polymrase III ont t caractriss, U6 et H1 et sont utiliss dans les vecteurs dexpression des siARN. [N7] On peut se demander pourquoi ce type de promoteur est plus utilis que les autres. Cela vient du fait quils expriment naturellement une trs grande quantit de smallRNA dans les cellules mammifres et quils terminent la transcription en incorporant une queue de 3 6 rsidus Uridine. Ceci est important puisque nous avons vu que pour tre le plus efficaces possibles, les siARN doivent possder un dbordement en 3. Ces 2 types de promoteurs sont trs diffrents. Le promoteur U6 fait plusieurs centaines de paires de bases de longueur, tandis que H1 nexcde pas les 100 pb. La quantit et la localisation des siARN dont lexpression est contrle par ces 2 promoteurs varient dun type cellulaire lautre. En effets, des tudes de localisation ont montr que diffrents promoteurs RNA Pol III gnrent des smallRNA qui sont retrouvs dans diffrentes rgions de la cellule. Lexpression et la localisation des siARN affectant sans doute le succs des tudes dARNi dans les cellules mammifres, il est donc important de tester les siARN sous le contrle de ces 2 promoteurs. [N19]

La figure 17 reprsente un exemple de vecteur dexpression qui est trs utilis dans les expriences dARN interfrence. Il sagit du vecteur pSilencer 1.0-U6

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Figure 17 : Vecteur dexpression de siARN de type pSilencer. On voit que ce plasmide contient un promoteur pol III de type U6, un gne de rsistance lampicilline, lorigine de rplication dE.coli. Il contient aussi de 1 3 marqueurs de slection antibiotiques (gnes de rsistance la nomycine, la puromycine, ou lhygromycine). [N1].

Ce type de vecteur plasmidique a t dvelopp par Sui et al. lcole mdicale de Harvard et a t utilis avec succs pour le knock-down de lexpression de cdk-2 et des lamines A/C dans les cellules HeLa, H1299, U-2 OS et C-33A [N7] En gnral, les vecteurs sont linariss grce 2 enzymes de restriction diffrentes pour permettre un clonage directionnel. Deux oligodoxynuclotides ADN complmentaires reprsentant la squence du shRNA sont crs pour linsertion dans le vecteur (clonage). On les utilise alors pour transformer E.coli. Les vecteurs linariss sont purifis pour liminer les vecteurs stant referm sans insert. Une fois que le plasmide a t dlivr aux cellules, on observe normalement une expression des siARN. A cause de ltape de clonage, la procdure peut prendre plusieurs jours. De plus, un squenage de la rgion contenant linsert reste ncessaire. Cependant, ces limitations sont contrebalances par la possibilit de produire de trs grandes quantits de vecteurs, une fois quon a vrifi que le vecteur tait effectivement efficace dans les expriences de silencing gniques (figure 18).

Figure 18 : Insert cr pour le vecteur pSilencer 1.0-U6. Linsert est cr de manire spcifique pour chaque vecteur. Il contient les dbordements 3 et 5 appropris pour un clonage correct dans le vecteur (complmentaires des sites de restriction du vecteur). La squence et la longueur de la boucle peuvent tre trs variables et peuvent tre ajustes souhait. [N1].

La squence sens et anti-sens du siARN sont relis par une squence spacer qui peu tre variable dune exprience dARN interfrence lautre. Voici un exemple de spacer de 9 nuclotides qui est souvent utilis : TTCAAGAGA Cinq ou six T sont ajouts en 3, la fin de loligonuclotide. De plus, pour le clonage dans

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le vecteur pSilencer 1.0-U6 par exemple, il faut aussi ajouter un dbordement de nuclotides complmentaires des sites de restriction EcoR I et Apa I en 5 et 3 de loligonuclotide. On sattend alors ce que lARN rsultant se replie et adopte la structure en tige et boucle espre : 19 pb pour la tige et 9 nuclotides pour la boucle, et 3 4 U lextrmit 3.

Le clonage dans le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV (vecteur viral) est comparable celui vu prcdemment. On note cependant une exception : labsence des 5-6 T lextrmit 3 de loligonuclotide. Ceci sexplique par le fait que dans les systmes vectoriels bass sur le CMV, le signal de terminaison de la transcription est apport pat le terminateur polyA SV40. De plus, pour le clonage dans le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV, il faut ajouter, en 5 et en 3 de loligonuclotide, les dbordements de nuclotides contenant les sites de restriction Xho I et Spe I (figure19). [N10; N7; N11]

Figure 19 : Insert cr pour le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV. Linsert est constitu de la squence sens, de la boucle spacer, puis de la squence anti-sens complmentaire de la squence sens. Aux extrmits 5 et 3 figurent les dbordements qui vont permettre un clonage directionnel dans le vecteur pSilencer adeno 1.0 - CMV, cest--dire complmentaire des sites de restriction Xho I et Spe I. [N1].

Via les vecteurs dexpression des siARN, on va donc exprimer long terme des shARN (en forme de tte dpingle) dans les cellules transfectes. Ces shARN sont dabord exprims dans le noyau de la cellule, puis sont transports vers le cytoplasme. Puis, on suit le processus naturel du mcanisme dARN interfrence. La nuclase cytoplasmique Dicer va cliver le shARN en siARN de 21 23 nuclotides (figure 20). Les siARN sont ensuite dirigs vers le complexe protique RISC. Puis les brins du siARN guident le complexe RISC vers lARNm complmentaire. RISC dgrade alors la molcule dARNm cible. [N1]

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Figure 20 : Mcanisme qui se droule dans la cellule suite lexpression de siARN via un vecteur dexpression. Les vecteurs dexpression permettent une expression maintenue des shARN lintrieur de la cellule. Ces shARN sont dabord exprims dans le noyau cellulaire, puis transloquent vers le cytoplasme. Dans le cytoplasme, laction de Dicer va conduire la formation de siARN. [N1].

Sans doute lun des principaux avantages des vecteurs dexpression des siARN est quils sont parfaits pour des tudes long terme. Des vecteurs avec des marqueurs de rsistance un antibiotique peuvent tre utiliss pour rduire lexpression des gnes cible pendant plusieurs semaines (pression de slection). Une slection transitoire des cellules transfectes grce des marqueurs spcifiques permet lenrichissement des cellules qui ont bien intgr le plasmide. Ceci permet de compenser la faible efficacit de transfection pour les cellules difficiles transfecter. Rcemment, plusieurs groupes ont commenc prparer des adnovirus, des rtrovirus, et dautres types de vecteurs viraux pour lexpression des siARN. Cest en revanche une mthode qui nest pas adapte au screening des squences de siARN les plus efficaces. Ce screening serait possible, mais demanderait beaucoup de temps et un travail intensif. [N10] Il faut noter que la faible efficacit d'administration est l'une des principales raisons qui font qu'une exprience d'ARNi choue ou donne des rsultats de faux ngatifs. C'est ainsi qu'ont t dvelopps des agents qui augmentent l'efficacit de transfection. On a en gnral le choix entre 2 mthodes : la transfection medie par des lipides (lipofection) ou bien llectroporation. Le choix entre ces 2 mthodes se fait en fonction du type cellulaire utilis et des caractristiques de lacide nuclique transfect. Pour la majorit des cellules immortalises et des cellules adhrentes, on utilisera des agents de transfection de type lipidique. Il sagit de mlanges de polyamines (siPORT Amine) ou bien de mlanges de lipides cationiques et neutres (siPORT Lipid). Ces deux agents prsentent des efficacits de transfection diffrentes en fonction du type cellulaire utilis, mais permettent tous les deux lintroduction de siARN dans une grande varit de lignes cellulaires. Il est essentiel dutiliser des agents crs pour dlivrer des petits RNA (la plupart des

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agents disposition sur le march ont t crs pour la transfection de grands plasmides dADN et pas pour des petites molcules dARN). Certains agents sont spcifiques dune ligne cellulaire (ex : cellules eucaryotes dun certain type), tandis que dautres ont un spectre daction beaucoup plus large. Loptimisation des conditions est ncessaire, pour augmenter lefficacit et la reproductibilit de la transfection [N1, N10] 3.12.5. Cassette dexpression des siARN drives de PCR (SECs) Il est vrai que construire et tester 4 plasmides dexpression de siARN par cible demande beaucoup de temps. Cest pour cela quil est peut tre prfrable de screener les squences potentielles des siARN en utilisant des cassettes dexpression des siARN drives de PCR. Les SECs (siRNA Expression Cassettes) sont des produits de PCR qui incluent un promoteur et une squence de terminaison, encadrant une squence de siARN. Les SECs, caractriss comme rprimant lexpression des gnes de faon efficace, pourront tre clons dans des vecteurs pour des tudes long terme. [N1]. Les SECs ont t dcrites pour la premire fois par Castanotto et al. Elles doivent contenir un promoteur RNA pol III (H1 ou U6), une squence codant le shRNA, et un site de terminaison de la RNA pol III. Contrairement aux vecteurs dexpression des siARN qui requirent un clonage et un squenage avant lutilisation (ce qui peut prendre 1 2 semaines), les SECs peuvent tre gnres par PCR en moins dun jour. Pour prparer par PCR une SEC, il faut crer 1 ou 2 oligonuclotides dADN, reprsentant la squence du siARN. Ces oligonuclotides sont utiliss comme primers dans une ou plusieurs PCR. Ils contiennent un promoteur. Le produit rsultant de la PCR est purifi sur colonne. En gnral, on utilise comme la squence pour la boucle la squence suivante : 5 U U U G U G U A G 3

Comme pour les inserts crs pour les vecteurs, une squence terminatrice de 5-6 T est ajoute, pour agir comme un terminateur de lARN polymrase III. Pour un clonage correct, les sites de restriction Eco RI et Hind III sont ajouts dans le primer. Pour cloner cette cassette dexpression du siARN dans un vecteur, il faut que le vecteur aussi possde les sites de restriction Eco RI et Hind III. Lincorporation de sites de restriction lextrmit de la cassette est indispensable pour un sous clonage dans un vecteur plasmidique ou viral. On cr ainsi vecteur dexpression de siARN. Les vecteurs linariss contenant les gnes de rsistance la nomycine, lhygromycine, et la puromycine, sont appels des vecteurs pSEC. Ces gnes de rsistance permettent une slection des cellules mammifres. Une cassette dexpression des shARN est gnralement construite pour contenir la squence sens de la cible, suivie dune espaceur, puis de la squence anti-sens de la cible. Mais il a t dmontr que linversion de lordre des squences sens et anti-sens de la cible lintrieur de la construction dexpression du siARN ne changeait pas lactivit de silencing du siARN. [N1]. Les SECs constituent donc un excellent outil de screening, pour trouver les squences de siARN les plus efficaces, ou pour identifier les combinaisons de promoteurs et de si RNA qui apportent le meilleur rendement dans une ligne cellulaire donne. En fait, les SECs apportent le complment parfait des vecteurs dexpression des siARN.

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Un des inconvnients des SECS est quelles ne sont pas aussi facilement transfectes dans les cellules que les siARN. Etant donn que de nouveaux agents de transfection et de nouveaux protocoles ont t dvelopps, lefficacit de transfection des SECs devrait augmenter. Parce quelles sont gnres par PCR, les SECs ne permettent pas de scale up, sans clonage dans des vecteurs. On peut ainsi raliser des expriences dans lesquelles les SECs contiennent chacune un promoteur diffrent. On teste ainsi la capacit de ces diffrents promoteurs induire lexpression des siARN, et donc induire un knock-down de lexpression dun gne particulier (figure 21).

Figure 21 : Rduction diffrentielle dans lexpression du gne cible, en utilisant des SECs avec diffrents promoteurs. Les cassettes dexpression de siARN contenant les promoteurs Mo-U6 de souris, Hu-U6 humain, ou Hu-H1 humain et codant le shRNA spcifique de c-Fos ont t transfectes dans des cellules HeLa. 72 heures aprs la transfection, les cellules ont t analyses, en utilisant un agent de coloration du noyau, le DAPI, et une immunofluorescence a t ralise avec un anticorps dirig contre c-Fos. Les cellules non transfectes (NT), ainsi que les cellules transfectes avec une SEC exprimant un siARN contrle ngatif (scramble) montrent les niveaux naturels (sauvages) de c-Fos. La diminution relative dexpression gnique a t quantifie. Ces taux relatifs de c-Fos sont reprsents sur le graphe en barres. [N1].

Pour ces techniques d'introduction dans les cellules via des vecteurs ou des cassettes d'expression, on aura aussi recours des tapes de purification. En effet, tous les oligonuclotides dARN sont contrls par spectromtrie de masse de type 32

MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser DesorptIonionization- Time-Of-Flight). Il parat important de prciser quelques de rgles de base qui permettent de conduire au mieux les tapes de design et de conception des siARN dune exprience dARNi : 1 Eviter les RNases. En effet, ne serait-ce que des traces de ribonuclases peuvent saboter une exprience de siARN. Puisque les RNases sont prsentes partout dans lenvironnement du laboratoire, sur notre peau, dans lair, sur tout ce qui est touch par des mains nues, ou sur tout ce qui est en contact avec lair, il est important de prendre des prcautions pour prvenir et liminer la contamination par les RNases. 2 Maintenir des cultures cellulaires saines et des protocoles stricts pour une bonne reproductibilit de transfection. Sachant que lefficacit de transfection diminue avec le temps, il est recommand de na pas dpasser les 50 expriences de transfection sur une mme ligne cellulaire. Ceci permet doptimiser au maximum le rendement des expriences et dassurer une stabilit maximale des cultures cellulaires dune exprience lautre. [N1] [Annexe 1].

2.2. Visualisation du phnomne dARNi

Il existe diffrentes mthodes pour vrifier si lexprience dARNi a effectivement march. Nous allons en dvelopper deux : limmunofluorescence et la RT-PCR. 2.2.1. Immunofluorescence Pour amliorer la comprhension du mtabolisme des siARN, des mthodes de visualisation des siARN dans la cellule sont dveloppes. Les tiquettes fluorescentes sont couramment utilises pour suivre le mouvement de petites molcules dans la cellule ou entre les cellules. Cependant, les siARN interagissent avec des lments cellulaires et lon ne savait pas si laddition de groupements volumineux naffecterait pas ngativement la capacit des siARN induire le silencing des gnes. Certaines socits telles Ambion ont prpar des siARN tiquets avec de la fluorescence et les ont compar avec des siARN non tiquets. Ces siARN tiquets sont toujours fonctionnels et on peut suivre leur dplacement aprs transfection. Des siARN doublement tiquets ont t utiliss pour suivre la sparation des brins de siARN dans les cellules intactes. [N1]. 2.2.1.1. Les siARN tiquets restent fonctionnels Deux tiquettes couramment utilises, Cy3 et FAM ont t couples des siARN et on a valu leur implication dans le silencing. Les cellules ont t transfectes avec un siARN au niveau de la rgion 3' UTR de c-myc et qui tait soit non tiquet, soit tiquet avec Cy3 seul, soit avec une double tiquette Cy3 (sur le brin antisens)-FAM (sur le brin sens). Des siARN synthtiss chimiquement ont t tiquets en utilisant un kit Silencer Cy3 et FAM siARN de Ambion. 5 g de siARN c-myc synthtiss chimiquement et des contrles ont t tiquets en utilisant 7,5 l dagent marqu. Aprs marquage, les brins ont t purifis, resuspendus et hybrids avant la transfection. Kimura et al. ont montr quune down-rgulation de c-myc pouvait provoquer une diminution de la prolifration cellulaire. La capacit des siARN, tiquets ou non, modifier le taux de prolifration cellulaire a t value dans des cellules HeLa S3. La croissance des cellules transfectes avec les siARN c-myc tiquets ou non a t rduite un niveau quivalent compar au contrle (scrambled) (Figure 22B). Pour confirmer que cette diminution de la prolifration tait due au silencing de c-myc, on a tudi lexpression

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de la protine 48h aprs la transfection en utilisant la microscopie fluorescence (Figure 22A). Les rsultats montrent que les siARN tiquets ou non sont tous deux capables de rduire lexpression de la protine, alors que les cellules transfectes avec les siARN contrles ne montrent pas de silencing. [C2]

Figure 22 : Les siARN tiquets sont fonctionnels. Un siARN c-myc anti 3' UTR a t tiquet avec Cy3 et FAM sur un ou deux brins. Puis, les siARN ont t transfcts dans des cellules HeLa S3. 48h aprs la transfection, les cellules ont t analyses pour tudier lexpression de la protine c-myc et ce en utilisant la technique dimmunofluorescence. La protine c-myc apparat en vert. 72h aprs la transfection, les cellules qui ont t transfectes avec des siARN contenant 1,2 ou aucune tiquette ont t dnombres grce un hmocytomtre. Le nombre de cellules a t calcul par rapport une population cellulaire non traite. [N1].

Pour tendre ces observations dautres gnes, on a test des siARN associs GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ou la -actine (Figure 23). Ces siARN sont efficaces pour le silencing de gnes. Les siARN synthtiques ou transcrits in vitro sont capables de silencing, que ltiquette soit sur le brin sens et/ou antisens, et tiquets avec Cy3 ou FAM. Il ny a pas deffet cytotoxique associ la fluorescence. [N1]

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Figure 23 : Silencing de lexpression du gne GAPDH. Les siARN GAPDH et un contrle ont t tiquets avec Cy3, puis transfects dans des cellules HeLa S3, et analyss par microscopie fluorescence avec un anticorps anti-GAPDH. Rouge: siARN-Cy3. Bleu : DAPI; Vert: Anticorps anti-GAPDH. A. Silencing de lexpression de GAPDH dans les cellules HeLa S3. B. Le siARN contrle na pas deffet sur le taux de protines GAPDH. [N1].

2.2.1.2. Les siARN fluorescents peuvent tre suivis dans la cellule. Les siARN c-myc-FAM fluorescents ont t gnrs en tiquetant le brin dARN sens avec FAM et le brin antisens avec Cy3. Les siARN Cy3-FAM ont t transfects dans des cellules et visualiss laide de la microscopie fluorescence pour dterminer leur localisation subcellulaire. 48h aprs la transfection, les siARN taient localiss dans le cytoplasme prs de la membrane nuclaire (Figure 24). [N1].

Figure 24 : Sparation des brins du siARN. A. Les siARN c-myc-FAM ont ltiquette FAM sur le brin sens et ltiquette c-myc sur le brin anti-sens. 48h aprs la transfection, les cellules HeLa S3 ont t fixes et analyses en utilisant un microscope fluorescence Olympus. Les deux vues reprsentent diffrentes magnifications. Les flches pointent les foyers vert et rouge (brins sens et antisens individuels). B. Les siARN ont t tiquets sur le brin sens avec Blackhole et sur le brin sens avec c-myc, puis ont t transfects dans des cellules HeLa. 4, 24 et 48h aprs la transfection, les cellules HeLa S3 ont t fixes et analyses en utilisant un microscope fluorescence Olympus. [N1].

Dans les cellules en division, la fluorescence est concentre sur la ligne de division, suggrant que les siARN doivent tre diviss galement entre les cellules filles. Parmi la majorit des siARN-Cy3 antisens (en rouge) et siARN-FAM sens (en vert), on 35

trouve des siARN (en jaune) dans le cytoplasme prs de la membrane nuclaire et de faibles signaux vert et rouge ont aussi t observs (Figure 25). Les signaux rouges et verts isols sont le rsultat de la fluorescence de brins de siARN individuels. Pour confirmer ces observations, la technique du FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a t utilise pour valuer les siARN dans les cellules transfectes. Dans cette exprience, le brin sens de c-myc a t tiquet avec Blackhole quencher (IDT) et hybrid avec le brin antisens complmentaire de cy3. Dans la forme double brin, le signal Cy3 est teint par Blackhole et on nobserve presque aucun signal. Le siARN teint est transfect dans des cellules et la fluorescence est observe 4, 24, 48 et 72h aprs la transfection. Comme dcrit prcdemment, une faible quantit de fluorescence est dtecte 4h, ce qui est peut-tre d une extinction incomplte de Cy3. Plus tard, une augmentation significative du signal est dtecte (Figure 25B), ce qui montre que les siARN sens et antisens sont spars dans les cellules mammifres intactes. [N1]

Figure 25 : Distribution In Vivo de siARN. Panel A. Les siARN-Cy3 ont t transfects dans des cellules HeLa poussant sur des boites en utilisant un transporteur cationique lipidique tiquet avec NBD. A lheure indique, les chantillons ont t analyss en utilisant la microscopie fluorescence pour la distribution relative des siARN (en rouge) et des lipides (en vert). Les siARN taient localiss dans des rgions proches de la membrane nuclaire aprs la libration par le transporteur lipidique ; Panel B. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur des boites ont t transfects avec des siARN anti c-myc tiquets avec FAM sur le brin sens ou Cy3 sur le brin antisens. 48h aprs transfection, les cellules sont traites et analyses par un microscope confocal Leica. Les flches montrent des brins sens (en rouge) et antisens (en vert) individuels. [N1].

La localisation des siARN transfects soulve la question de savoir si les siARN sont concentrs dans des vsicules lipidiques drives de la transfection dun transporteur. Pour rpondre cette question, des transfections ont t ralises, utilisant un transporteur lipidique tiquet NBD (en vert) pour transfecter un siARN-Cy3 (en rouge). Nous avons examin la distribution des fluorescences rouge et vert divers endroits sur une priode de 72h aprs transfection. 4h seulement aprs la transfection, une petite quantit de siARN libr par des vsicules lipidiques est dtecte alors que la majorit des lipides et des siARN sont co-localiss dans les foyers cellulaires. 24 et 48h aprs la transfection, on observe une plus grande quantit de siARN libr (Figure 25). La protine est tout dabord dtecte 4h aprs la transfection, puis on observe une suppression de lexpression de la protine 24h et le maximum de la suppression de lexpression est observ 48h aprs la transfection (Figure 26). La priode o le silencing est le plus important au niveau de taux de dARNm et de protine correspond la libration maximale de siARN de la vsicule

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lipidique et la sparation maximale des brins. (Exprience non montre). [C3]

Figure 26 : Induction et Dure de lARNi provoqu par les siARN. A. Les cellules HeLa S3 sont transfectes avec des siARN au niveau du 3' UTR de GAPDH. Aprs 4h, 24h, 3, 6, 10 et 12 jours aprs la transfection, les cellules sont rcoltes et analyses par Northern blot pour les taux dARNm de GAPDH et dARNr de 28S. B. Graph de Northern du Panel A montrant les taux relatifs dARNm de GAPDH C. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips sont transfectes avec des siARN au niveau du 3' UTR de GAPDH. Aprs 4h, 24h, 3, 6, 10 et 12 jours aprs la transfection, les cellules sont rcoltes et lexpression de la protine GAPDH est analyse en utilisant limmunofluorescence. Le DAPI (bleu) cible le noyau; un anticorps anti-GAPDH (en vert) se lie la protine exprime. [N1].

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Figure 27 : Distribution des siARN dans les cellules HeLa S3 en division. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips ont t transfectes avec des siARN-Cy3 (en rouge) et analyses par immunofluorescence. Les cellules en division qui contiennent des siARN sont dtectes en observant la condensation des chromosomes et les sparations et reformations nuclaires. LADN est analys en utilisant le DAPI. Dans tous les cas de division cellulaire, les siARN sont localises dans la rgion centrale de la cellule. [N1].

Les cellules HeLa S3 ont t transfectes avec siARN dirigs contre GAPDH pour examiner linduction et la dure du silencing. GAPDH a rduit les taux dARNm et de protines. On peut supposer que les siARN ont t transmis aux cellules filles. Si ce ntait pas le cas, le pourcentage de cellules contenant des siARN serait rduit en seulement 2 ou 3 jours. La technique dimmunofluorescence a montr que les siARN taient principalement localises dans les cellules en division (Figure 27) et sont transmis aux cellules filles (Figure 28). [N1].

Figure 28 : siARN associs aux noyaux des cellules en division. Les cellules HeLa S3 ayant pouss sur cover slips ont t transfectes avec des siARN -FAM GAPDH. Les cellules on t rcoltes et fixes en utilisant 4% de Paraformaldehyde 48h aprs la transfection. Les cellules ont t examines en utilisant les fluorescences appropries. Les siARN (en vert) peuvent tre associs chaque noyau (en bleu) dune cellule en division. [N1].

Les siARN tiquets entrent effectivement dans la voie de lARNi et sont capables de silencing, ce qui permet de suivre lARNi dans les cellules et de dresser des conclusions sur son mode daction. [N1].

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2.2.1.3. Localisation Les ARNdb sont accumuls dans le cytoplasme prs du noyau. 4h aprs la transfection, la majorit des siARN est concentre dans des vsicules lipidiques. 48h aprs, les siARN sont localiss dans le cytoplasme proximit de la membrane nuclaire (Figure 25). Cette localisation pourrait reprsenter des sites de traitement des siARN ou les sites de rsidence de RISC. Dautres recherches ont suggr que les longs ARNdb dgradaient lARN mature. On ne sait pas si les siARN des cellules de Mammifres peuvent agir de la mme faon. Mais laccumulation de siARN dans le cytoplasme corrobore ce protocole. Une autre explication possible de la localisation prinuclaire est que les siARN sont groups an niveau des pores nuclaires o ils peuvent dtecter lARN qui doit tre transport dans le cytoplasme via les pores nuclaires. Quand une squence complmentaire est dtecte, les siARN vont la cibler pour cliver lARN ce qui conduit au silencing du gne. [N1] Bien que la dissociation des brins de siARN soit dtecte dans la cellule, on retrouve que la majorit des siARN transfects reste sous forme double-brin. On peut supposer que limportance de la sparation des brins est proportionnelle la quantit de siARN ncessaire pour le clivage direct dun gne. [C3]. 2.2.1.4. Dure Les expriences prsentes suggrent que les siARN sont maintenus dans les cultures pendant 10 jours puis quils sont transfrs dans des cellules filles. Dans ce cas, et sil ny a pas amplification des siARN dans les cellules de Mammifres, alors la dure des effets des siARN devrait tre directement proportionnelle la concentration des siARN dans la cellules et au nombre de divisions cellulaires qui ont lieu. Ainsi, une variable exprimentale majeure serait lefficacit de linjection de siARN dans la cellule et donc de la concentration initiale de siARN. Dans le cas o un siARN est transfect avec une faible efficacit, les siARN tiquets peuvent tre utiliss pour identifier individuellement les cellules qui ont effectivement reu le siARN. [N1] 2.2.2.RT-PCR La RT-PCR quantitative est une des techniques les plus utilises pour quantifier les changements dexpression gnique parmi des chantillons. Il existe diffrents kits pour analyser les chantillons par RT-PCR. En travaillant sur des chantillons cellulaires ou tissulaires, il faut extraire lARN, traiter lchantillon pour liminer de lADN gnomique contaminant, puis inactiver la DNAse I avec une protinase K. Si seul un petit nombre de cellules est disponible, le risque de perdre certains chantillons dARN est possible. On peut mesurer le silencing directement dans les lysats cellulaires, sans avoir besoin dextraire lARN. [N1] 2.2.2.1. Transcription reverse sans isoler lARN Lisolation de lARN est ltape la plus laborieuse et la plus longue de lanalyse de lARN, surtout quand plusieurs chantillons doivent tre analyss. On peut utiliser des kits qui ne ncessitent pas disoler lARN, ce qui permet danalyser de nombreux chantillons. La procdure est simple. Les cellules sont lyses, et traites avec la DNase I. La synthse de dADNc est produite directement partir du lysat cellulaire. [N1]

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2.2.2.2. Evaluation du silencing induit par les siARN La disparition des ARNm endognes peut tre dtecte directement par RT-PCR. La technique de RT-PCR est ralise laide dune enzyme spcifique : la Taq polymrase. Dans les kits, on la trouve en gnral 5L Il faut galement disposer de primers : ce sont en gnral des T7-Oligo (dT)24 ou bien des dcamres alatoires, une concentration de 100ng/L. Le choix du primer se fera en fonction de la cible, afin de maximiser le rendement de lamplification des ARNm. Enfin, il faut aussi avoir recours des dNTP (10mM) qui vont permettre la synthse. La raction de RT-PCR va permettre damplifier des ARN cible spcifiques, partir de mlanges complexes. La premire tape de rversetranscription est ralise laide dune Reverse Transcriptase. En gnral, on utilise le Molony-Murine Leukemia Virus (M-MLV) comme enzyme. Elle va allonger le primer (oligo dT), qui est appari avec le brin dARNm contenant le message dintrt. Cette enzyme a une trs grande stabilit et une trs faible activit RNase intrinsque. Cest pour cela quelle est en gnral prfre dautres enzymes comme lAMV rverse transcriptase. Pour raliser la PCR et amplifier la squence cible, on aura recours une paire de primers spcifiques. On peut disposer de diffrents types de kits qui proposent de raliser sparment la raction de RT et celle de PCR, ou bien de combiner les deux. [N1] Des contrles positifs sont raliss, laide de primers qui permettent lamplification de gnes conservs et exprims de faon constitutive (ex : gne de la protine ribosomale S15). Pour dmontrer lutilisation de cellules Cells-to-cDNA II-96 Automated Kit pour mesurer le knockdown de lexpression des gnes induits par les siARN, les chercheurs dAmbion ont ralis des tudes utilisant des cellules HeLa transfectes avec des siARN synthtiss chimiquement dirigs contre cdc-2, GAPDH et la survivine. 3000 cellules HeLa cellules taient dposes dans des plaques de 96 puits et incubes 37C. Les cellules taient transfectes avec 100 nM de chaque siARN ou avec un siARN contrle, et incubes 37C pendant 48h. Les cellules sont ensuite laves, lyses et traites la DNAse. On a utilis 5 l de lysat, et effectu la RT-PCR avec des sondes Taq. Une sonde pour lARNr18S a t utilise pour normaliser les donnes pour chaque exprience (ralises 8 fois) La figure 29 montre que le silencing peut tre dtect directement par la RT-PCR.

Figure 29 : Utilisation de cellules (Cells-to-cDNA II-96 Automated Kit) et de RT-PCR pour mesurer le silencing. Les cellules HeLa ont t transfectes avec des chantillons contrle (rouge) et des siARN spcifiques de cdc-2, GAPDH et de la survivine (bleu). Le signal de lARNr 18S a t mesur dans les cellules transfectes avec les siARN contrle (vert) et les siARN spcifiques (noir). [N1].

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Figure 30 : Cells-to-Signal Procedure. Aprs une lyse cellulaire de 5 min, les lysats peuvent tre directement utiliss pour la RT-PCR, aussi longtemps que les primers hybrident les liaisons exon-exon. Une rverse transcriptase est incluse pour contrler lamplification potentielle de squences gnomiques. La spcificit de squence de la Taq permet une ou deux tapes de RT-PCR, alors que la dtection avecSYBR Green, qui lie lADdb, ncessite deux tapes de RT-PCT pour diminuer les liaisons non spcifiques. [N1].

Les sondes sont de courts oligonuclotides qui prsentent des homologies avec la rgion interne du produit de la PCR et qui sont tiquets en 5 avec un fluorophore et en 3' avec un quencher. La quantification de lamplification par PCR dpend de lactivit exonuclasique en 5' de la Taq polymrase qui dgrade la sonde et spare le fluorophore du quencher. [N1] Dans la figure 31, les cellules HeLa ont t transfectes avec 30 nM de siARN dirigs contre GAPDH ou 30 nM de siARN contrle. 48 aprs la transfection, le kit est utilis pour prparer les lysas cellulaires pour la RT-PCR en utilisant des primers. Compar au siARN contrle, les siARN spcifiques de GAPDH ont teint lexpression gnique 80%. [N1]

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Figure 31 : Mesure du knock-down de lexpression gnique induit par siARN. Les cellules HeLa ont t dposes sur une plaque de 24 puits (3 x 104 cellules/puits). Elles ont t transfectes avec 30 nM de siARN contrle ou 30 nM de siARN GAPDH. Aprs 48 h, les cellules ont t rcoltes et lyses (volume final = 500 l). 3 l de lysat cellulaire a t utilise sans la premire tape de RT-PCR. Les signaux GAPDH ont t normalises en utilisant lARNr 18S comme contrle. [N1].

SYBR Green est un colorant des acides nucliques qui lie lADNdb et qui peut tre utilis pour dtecter les produits de PCR. Cette mthode ncessite plus doptimisation que les techniques qui utilisent des primers tiquets. SYBR Green est compatible avec les lysats cellulaires et les deux tapes de la PCR. En transfectant des cellules HeLa cells avec 30 nM de siARN dirigs contre GAPDH ou des siARN contrles, on remarque 72h aprs la transfection que le niveau dexpression de GAPDH a diminu de plus de 80% compar aux cellules transfectes avec le siARN contrle (Figure 30). Pour montrer que la fluorescence relative de SYBR Green rsulte des interactions avec des produits spcifique de la PCR, on a trac la courbe de dissociation pour chaque produit (Figure 32). Les crtes indiquent les amplifications de GAPDH et de lARNr 18S. [N1]

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Figure 32 : Mesure de lexpression gnique du knock-down par les siARN avec SYBR Green. Les cellules HeLa ont t dposes sur une plaque 96 puits (8 x 103 cellules/puits). Les cellules HeLa ont t transfectes avec 30 nM de siARN dirigs contre GAPDH ou 30 nM de siARN contrle. Aprs 72h, les cellules ont t rcoltes et lyses (volume final = 100 l). La courbe damplification montre la fluorescence relative pour 18S rRNA. [N1].

2.2.3. Un exemple dexprience Une quipe de l'universit de Californie a tudi le contrle de la prolifration et de la diffrenciation cellulaires par c-myc dans les cellules endocrines humaines du pancras. Cette quipe a utilis un siARN dirig contre c-Myc (partie 3'UTR). La suppression de l'activit de c-Myc dans les cellules HeLa S3 a t observe par une rduction de la prolifration cellulaire et une rduction de l'expression de la protine. (Fig. 33 A et B). Des diffrences des taux de prolifration ont t observes 48h aprs la transfection. La figure 33A montre la prolifration relative des cellules HeLa S3 transfectes avec les siARN c-Myc, les ARN c-Myc "scrambled", en tant que contrle positif, l'oligonuclotide phosphorothioate antisens et l'oligonucleotide phosphorothioate scrambled. La rduction de la prolifration cellulaire observe avec les siARN tait similaire celle observe avec l'oligonuclotide phosphorothioate antisens. [C1].

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Figure 33 : Down-regulation de c-Myc par ARN interfrence. Les cellules HeLa S3 ont t tranfectes avec des siARN dirigs contrec-Myc, des ARN "scrambled" de c-myc, des oligonuclotides antisens contrles (positifs), et des oligonucleotides "scrambled" phosphorothioate et analyses 48 h aprs pour des changements de prolifration. La prolifration cellulaire a t analyse en utilisant Alamar Blue assay. A : Les cellules HeLa S3 ont t transfects avec dessiARN dirigs contre c-Myc (partie 3'UTR), l'ARN c-Myc "scrambled". B : Le taux de protine c-Myc a t mesur par analyses d'images quantitatives de cellules transfectes. L'analyse des cellules TRM-6/PDX-1 a t ralise par microscopie confocale, aprs transfection avec des siARN-c-Myc (C et D) ou avec des siARN scrambled (E et F). Les cellules ont t "colores" pour la protine c-Myc (rouge) et pour la somatostatine (vert). [C1].

La suppression de c-Myc endogne dans les cultures de TRM6/PDX-1 induit l'expression de la somatostatine, pour les cellules positives pour la somatostatine (flches dans C et D). Les cellules positives pour la somatostatine montrent des colorations rduites voire absentes pour c-Myc. De telles cellules ne sont jamais observes dans des cultures transfectes avec des siARN scrambled (E et F). Les noyaux sont rvls en colorant avec du DAPI (bleu). Pour contrler si la down-rgulation du c-Myc endogne est suffisante pour induire la diffrenciation, l'quipe a utilis des siARN dirigs contre l'ARN de c-Myc dans les cellules TRM6 et TRM6/PDX. Les cellules ont t transfectes avec ces siARN. (Fig. 33 C et D). Ce rsultat suppose un rle causal de c-Myc dans la rgulation de la diffrentiation endocrine. [C1].

2.3. Les expriences dARNi chez lanimal

Le silencing des gnes par la mthode dARN interfrence est trs utilis pour tudier la fonction des gnes dans les cultures de cellules mammifres. Bien que cette stratgie semble trs puissante, elle ne permet pas une valuation prcise de la faon dont les gnes fonctionnent lintrieur dun organisme entier. Pour faire face ce problme, les

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chercheurs sont, lheure actuelle, en train dappliquer lARNi in vivo. Bien quelle nen est qu ses premiers balbutiements, lARNi in vivo montre dj des rsultats encourageants et laisse esprer de grandes avances lavenir. Il est ncessaire de passer cette tape in vivo sur animal entier, afin de savoir si la suppression dun gne en question va tre compatible avec la vie. En gnral, on mute un gne dans des cellules embryonnaires. Si on nobtient pas dadulte viable, la fonction du gne est donc importante pour le dveloppement embryonnaire de lanimal. Ltude sur animal apporte une notion supplmentaire, et permettra par exemple de voir que le gne suit des cycles dactivation/suppression au cours du dveloppement Il existe actuellement deux mthodes pour dclencher lARNi in vivo : ladministration directe de siARN, ou ladministration de vecteurs plasmidiques et viraux qui expriment un shRNA. Celui-ci sera par la suite transform en un siARN actif. Comme cest le cas avec lapplication de lARNi dans les cultures cellulaires, lutilisation de siARN semble tre plus efficace que celle des vecteurs dexpression de shRNA. En effet, pour les expriences dARNi sur cultures cellulaires, il est plus facile dobtenir des siARN efficaces. De plus, les siARN sont petits (par dfinition) et nont besoin de traverser que la membrane cellulaire, et pas la membrane nuclaire, pour tre efficaces. Leur administration est donc bien plus facile. Au contraire, la construction des vecteurs dexpression des shRNA prend du temps, particulirement quand on prend en compte le temps ncessaire pour crer et tester plusieurs squences de shRNA. On pourra manipuler directement les cellules souches embryonnaires afin dobtenir un knock-down maintenu de lexpression des gnes. [N20] Le succs dune exprience dARNi in vivo dpend de lefficacit de la technique dadministration, mais aussi de la rtention du siARN au niveau du rseau vasculaire du tissu dintrt, et de lintgration du siARN dans les cellules de ce tissu. De plus, les siARN doivent rester stables jusqu ce quils rejoignent leur destination cible. Bien quil soit encore tt pour tirer des conclusions sur ces techniques, on a pu observer des rsultats trs encourageants avec ladministration des siARN de manire locale, ou bien par voie systmique. [N1]

2.3.1. Ladministration locale de siARN

Figure 34 : Stratgies dadministration des molcules de siARN in vivo. Il existe diffrentes techniques pour administrer des siARN sur un animal entier. On pourra ainsi avoir recours des injection intra nasales (dans le nez), intrathecales (dans le cerveau), intradermales, intramusculaires, intra pritonale (dans la cavit pritonale), ou encore raliser des injections hypodermiques ou des perfusions intra vasculaires au niveau de la queue. [N1].

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Les principales mthodes dadministration locales de siARN sont les administrations intrapritonales (IP), intranasales (IN), intramusculaires (IM), intratrachale (ITr), intrathcale (ITh), intratumorale (ITu), ou en sous-cutane (SC) (figure 34). Ladministration intra pritonale est ladministration locale la plus utilise. Les organes typiquement cibls par cette mthode sont les organes et les tumeurs de la rgion abdominale. Ladministration intra pritonale introduit les siARN dans la cavit pritonale. Il sagit de lespace entre le pritoine parital, la membrane attache la paroi abdominale, le pritoine viscral, la membrane qui entoure les organes internes, et la cavit abdominale. Ladministration IP empche la squestration des oligonuclotides dans le poumon et dans le foie. Elle peut tre utilise pour cibler les tumeurs de la cavit pritonale. Les siARN diffusent lextrieur de la cavit pritonale pour rejoindre la circulation sanguine et lymphatique. Pour une administration locale de siARN efficace, il faut utiliser des tampons appropris. En voici quelques-uns quil est possible dutiliser : 1 Un tampon salin (0,9% Na Cl), ou contenant des sucres comme le mannitol ou le glucose (5 15%) 2 Un tampon phosphat et salin (PBS = Phosphate Buffered Saline) 3 Une solution de Ringer : 147 mM de NaCl, 4mM de KCl, 1, 13 mM de CaCl2.

Sans doute lun des plus grands succs de ladministration locale des ARNsi est venu de ladministration locale de siARN dans lil. Ainsi, un siARN spcifique du VEGF a t dlivr dans lespace sous rtinien, chez une souris. Il a permis une rduction significative de langiogense au niveau de lil. Dans ce modle, il na pas t ncessaire de modifier le siARN, ou de le complexer avec un polymre lipidique ou un autre agent de transfection (comme cest le cas dans dautres systmes). [N12] Plus rcemment, un siARN spcifique du VEGF, dvelopp par Acuity Pharmaceutical a t design pour tre administr par injection intravitrale (dans lhumeur vitre). Il est actuellement en phase II dessai clinique pour le traitement de la dgnrescence maculaire lie lge. Dans les modles de rats, des siARN modifis spcifiques du canal cationique P2X3 mut, responsable de douleurs, ont t dlivrs avec succs dans les cerveaux des rats, via une infusion intrathcale. Ceci a t fait en utilisant des pompes implantes de manire chirurgicale. Les siARN ont ainsi inhib de manire significative la douleur neuropathique. Bien quelle ne soit pas trs pratique pour bon nombre de chercheurs, cette technique a nanmoins permis de dmontrer que les siARN pouvaient tre dlivrs avec succs, localement, dans le cerveau du rongeur. Elle a aussi permis de voir que des tudes fonctionnelles in vivo de gnes lis au systme nerveux central, grce aux siARN, taient possibles. [N13] Il est galement possible dinjecter des siARN dans la moelle pinire ou dans les ganglions de la racine dorsale, via limplantation dun cathter. [N21] Il y a ainsi un intrt considrable dlivrer des siARN dans le poumon, afin de dtudier les problmes pulmonaires ainsi que les maladies infectieuses, et pourquoi pas de traiter la grippe, le SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome), ou dautres maladies pulmonaires, causes par des virus ARN. Dans une tude prometteuse ralise sur le primate, un systme dadministration nasal a t utilis pour dlivrer un siARN spcifique du virus SARS. On a ainsi observ une rduction

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de la fivre, une diminution de la charge virale, et une rduction des lsions alvolaires. Cette tude a donc dmontr la validit du systme dadministration intranasale de siARN dans le poumon [N15]. 2.3.2. Ladministration de siARN par voie systmique Les organes typiquement cibls par cette mthode sont : le foie, les reins, la rate, les tumeurs , les xnogreffes. Elle est actuellement applique chez les rongeurs et les primates non humains. Ladministration systmique inclut les diffrentes techniques qui suivent : 1 intraveineuse (IV) 2 sous-cutane (Sub-Q) 3 High Pressure Tail Vein (HPTV) 4 Low Pressure Tail Vein Pour cette technique aussi, lutilisation de tampons est requise. La strilit des tampons, des tubes, des seringues et des cathters doit tre maintenus tout au long de lexprience. Il faut savoir quune majorit des siARN injects par voie systmique sont excrts par le rein. Par consquent, une perfusion continue ou de multiples injections peuvent tre une stratgie approprie, pour maintenir les taux de siARN plasmatique levs. [N1] La validit de cette mthode chez les mammifres a t dmontre pour la premire fois en ralisant une injection hydrodynamique en intraveineuse (au niveau de la tail vein) chez la souris. Dans cette exprience, des siARN ont t injects rapidement dans la veine dans un grand volume de solution aqueuse. On a alors observ sa localisation lintrieur des hpatocytes. En parallle, Song et al. ont dcouvert que linjection hydrodynamique de siARN spcifiques de Fas avait pour consquence de silencer Fas dans les hpatocytes de souris, et ce pour une priode de 10 jours. Ce type de traitement protgerait les hpatocytes contre une stimulation de lapoptose, via les anticorps Fas ou la concanavaline A. Il protgerait aussi les souris de lhpatite. [N14] Plus rcemment, une administration par intraveineuse, faible volume et pression normale a t ralise. Elle utilisait un siARN ciblant lapolipoprotine B chez la souris. Le rsultat observ tait le silencing du gne dans le foie et le jjunum. Les siARN avaient t conjugus avec du cholestrol pour permettre une administration cible, et incluaient des modifications du squelette et des sucres, pour permettre une stabilit dans le srum. On a galement observ que les taux plasmatiques de la protine taient diminus. [N16] Ladministration de siARN par voie systmique reste trs envisageable pour le traitement de plusieurs types de tumeurs, et pour le ciblage de nombreuses autres cibles in vivo. Dautre part, plusieurs groupes sont en train de tester lutilisation de complexes dadministration des siARN bass sur des lipides ou de nano particules. Ce travail sur ladministration des siARN par voie systmique illustre bien les 3 principaux obstacles qui doivent tre surmonts pour quun siARN soit efficace in vivo : une administration slective dans le tissu dsir une protection adquate contre la dgradation au cours du cheminement vers le tissu cible une protection du siARN dune excrtion rapide La stabilisation chimique est obtenue par une modification du siARN. Elle ne semble pas tre ncessaire dans la plupart des cas. Actuellement, lutilisation des complexes lipidiques

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ou de nano particules montre des rsultats plus encourageants que les modifications chimiques pour assurer un adressage correct des siARN. [N17] Bien que de trs gros progrs aient t raliss, ladministration dacides nucliques dans des organes, des tissus, ou des cellules spcifiques ncessite encore de nouvelles avances, notamment le dveloppement possible de nouvelles conjugaisons ou de formulations. Plusieurs quipes ont dmontr que les ARN doubles brins taient significativement plus efficaces, dans le mcanisme d'ARN interfrence que les ARN simples brins anti-sens. [N6]. Ainsi, l'quipe de Fire a dcouvert qu'aprs injection dans des animaux adultes, les ARN simple brins avaient un effet plus modr que les mlanges d'ARN double brins. D'autre part, ils ont observ que les doubles brins induisaient une ARN interfrence plus spcifique. Les effets de cette interfrence taient aussi vidents chez les animaux adultes que pour leurs descendants. De plus, seulement quelques molcules d'ARNdb taient ncessaires pour affecter la cellule. Le fait que les effets d'interfrence persistent aussi bien pour les gnrations futures suggre qu'il y a une diffrence fondamentale de comportement entre les ARN natifs (ex : ARNm) et les molcules responsables de l'ARNi. Ainsi, l'injection de ARNdb produit une diminution plus prononce, voire mme une limination de l'ARNm endogne (compar aux ARN simples brins). Pour observer cela, lquipe de recherche a utilis pour ARNm cible mex-3. Celui-ci est abondant dans les gonades est dans lors des premires tapes du dveloppement embryonnaire. Une hybridation linaire in situ peut tre ralise sur ces ARN. Les rsultats ont montr qu'aprs injection de ARNdb spcifiques de mex-3 dans le nmatode, on n'observait plus d'ARNm mex-3 endognes. Au contraire, chez les animaux auxquels on avait inject des ARN anti-sens de mex-3, on observait toujours des niveaux significatifs d'ARNm. (Figure 35) [N6]

Figure 35 : Effets de l'ARN interfrence de mex-3 sur les niveaux d'ARNm endognes. On voit ici des expriences d'hybridation in situ sur embryon. Un ARN anti-sens de mex-3 ou des ARNdb ont t injects dans les gonades des animaux adultes qui ont t nourris pendant 24 heures avant la fixation et l'hybridation in situ. Les ARNdb de mex-3 ont produit un arrt de 100% du dveloppement embryonnaire, alors que plus de 90% des embryons produits par des parents injects avec des anti-sens ont clos. Les antisens mex3ont permis de dterminer la localisation endogne de lARNm mex-3(coloration noire). On observe ici des embryons au stade 4 cellules, mais des rsultats similaires ont t obtenus avec des embryons au stade 1 8 cellules. a. Contrle ngatif montrant labsence de coloration sil ny a pas hybridation des sondes. b. Embryon provenant des parents non injects (on voit ainsi le schma normal de distribution des ARNm endognes de mex-3. c. Embryon provenant de parents injects avec un ARN anti-sens de mex-3. Ces embryons (ainsi que leurs parents) possdent lARNm, bien que les niveaux soient infrieurs ceux retrouvs chez les sauvages. d. Embryon provenant de parents injects avec un ARNdb correspondant mex-3.les ARNm mex-3 ne sont plus dtects. [N2].

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2.4. Contrles ngatifs et positifs

Une exprience de siARN complte doit toujours saccompagner de contrles appropris pour pouvoir valider les rsultats. Diffrents types de contrles peuvent tre effectus. Nous allons dans la partie qui suit en prsenter quelques-uns. U n contrle ngatif qui ne cible aucun transcrit endogne (ex : qui cible la lucifrase) est ncessaire, pour vrifier les effets non spcifiques sur lexpression gnique causs par lintroduction de siARN. On peut aussi raliser un siARN avec un mismatche sur 1 ou 2 paires de bases, ou bien avec la mme composition en nuclotides que notre siARN, mais auquel il manque une squence significative. Pour construire ce siARN contrle ngatif, il suffit de changer la squence nuclotidique sur une certaine portion du siARN, et vrifier que ce nouveau siARN ne prsente pas un taux de similarit trop fort avec un autre siARN. On change en gnral la squence nuclotidique du siARN le plus actif pour notre cible. L encore, un BLAST se rvle ncessaire, afin dviter de crer un siARN trop homologue avec un autre gne du gnome de lorganisme tudi. Il est galement possible dutiliser des siARN non spcifiques. Ce contrle va donc nous permettre de distinguer les effets non spcifiques. On peut galement avoir recours des squences de siARN diffrentes, mais ciblant le mme ARNm (plusieurs siARN pour une mme cible). Cest dans ce cas un contrle de multiplicit. On pourra ainsi utiliser un seul siARN un temps t et 2 ou 3 siARN ciblant le mme gne un autre temps. On pourra donc effectuer des comparaisons. Avant cela, chaque siARN devra tre test pour vrifier quils rduisent lexpression gnique des niveaux comparables. Ce contrle est le meilleur moyen de sassurer de la qualit des rsultats dARNi. Pour beaucoup de types cellulaires, un contrle positif appropri est apport par des gnes housekeeping (ex : ARNr 18S, GADPH). Il sagit de gnes qui ont un effet biologique facilement mesurable. Il faut pour cela transfecter les cellules avec diffrentes concentrations dun siARN contrle positif. On mesure alors la rduction du niveau de la protine contrle ou du niveau dARNm, en comparant avec les cellules non transfectes, 48 heures aprs la transfection. Ce contrle permet donc de vrifier que linhibition de lexpression du gne cibl a effectivement lieu. Les contrles positifs permettent aussi doptimiser les conditions de transfections, et de sassurer que les siARN ont bien t dlivrs. Par consquent, souvent plus dun contrle positif sont ncessaires. Le principe est donc de mesurer les niveaux dARNm afin de vrifier lefficacit de transfection et linduction du mcanisme dARN interfrence. On pourra aussi effectuer des contrles quantitatifs, cest--dire une titration des siARN. Elle permet de dterminer la plus faible concentration en siARN qui reste efficace dans linhibition de lexpression gnique. En effet, les siARN sont souvent trs efficaces de faibles concentrations. Cette titration permet de limiter les effets secondaires. Ceci est trs important car la machinerie dARN interfrence (et en particulier le complexe RISC) est saturable. Enfin, il pourra savrer ncessaire de mesurer des niveaux dARNm et de protines. Ceci permet de voir si la diminution de lexpression gnique du gne cible a lieu au niveau transcriptionnel (effet des siARN) ou au niveau traductionnel (effet des miRNA). [N1, N6]

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2.5. Limites et contraintes des expriences dARNi

Cependant, nous pouvons tre un peu critique propos de cette technique. En effet, lARNi nest pas un mcanisme miracle et possde des limites. Certaines dentre elles ont dj t abordes lorsque les techniques de laboratoire ont t dcrites. Plusieurs tudes ont montr que les siARN pouvaient induire une rponse anti-virale de type interfron dans des cellules mammifres. Cela provoque une dgradation non spcifique des ARNm et la traduction est diminue. La taille des siARN est donc un facteur important dans les contraintes : il faut utiliser des siARN de moins de 30 nuclotides. [C9]. Deux groupes ont identifi des messagers de la rponse interfron dont lexpression tait modifie par lintroduction de siARN [C9 ;C10]. Cette dtection de la rponse interfron induite par les siARN na peut-tre pas t ralise avant car elle est transitoire ou bien parce que les lignes cellulaires cancreuses utilises par les chercheurs ne manifestent pas cette rponse interfron. Cet effet peut tre vit en diminuant les doses de siARN. Il est possible de programmer RISC par transfection de cellules avec des siARN synthtiques qui miment lARNm. [C7 ; C11].

Plusieurs gnes peuvent tre simultanment cibls par les siARN, et cela peut compromettre linterprtation correcte de la fonction des gnes cause de la nonspcificit de la raction. Ainsi, il est essentiel de tester la spcificit dun siARN avant deffectuer une analyse phnotypique complte. Il faut comparer l'effet d'un siARN celui cr par un siARN contrle (ne reconnaissant aucune squence connue par exemple). Une quipe de chercheurs a ainsi test diffrents siARN dirigs contre une protine de liaison lactine, Thymosin 4 (T4). Ils ont dtermin lefficacit du silencing de T4par les siARN. Ils ont galement dmontr un knockdown partiel de T10 qui est une protine homologue de T4 (70.4% dhomologie). Pour dterminer la spcificit des siARN, lquipe a introduit des squences cibles du gne rapporteur de la lucifrase (the introduction of target sequences downstream of the luciferase reporter gene). La capacit des siARN silencer sa cible est dtermine quantitativement par une diminution de lactivit de la lucifrase. Des oligonuclotides synthtiques ont t lis au site Styl qui est situ entre le splice donor site et la rgion polyA du gne de la lucifrase et introduits dans des plasmides pGL2-Basic, permettant ainsi la transcription de lARNm de la lucifrase contenant la squence cible. Le fait que le site Styl soit non-palyndromique permet que les oligonuclotides soient orients dans le bon sens (Figure36).

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Figure 36 : Dtermination de la spcificit de lARNi laide de constructions. A. Des oligonuclotides ont t synthtiss, ils contiennent des siARN de 23 nuclotides appropris pour gnrer les extrmits Styl. Des oligonuclotides complmentaires ont t lis dans le site de Styl dans pGL2-Basic. B. Les squences cibles des siARN T4 et les squences analogues de T10 ont t introduites dans les constructions dcrites prcdemment. Aprs transfection dans des cellules de mammifres, lARNm de la lucifrase est transcrit. La transcription nest pas affecte par la prsence des squences cibles et la lucifrase fonctionnelle est produite. Les shARN T4, quand ils sont co-transfects et transcrits par la polymrase III, dirigent le complexe RISC vers les squences cibles complmentaires de T4. LARNm est dgrad; il ny a pas transcription et aucune activit de la lucifrase nest dtecte. Une squence cible mismatch T10 nest pas reconnu par les shARN, lARNm est dgrad et lactivit de la lucifrase est dtecte.

Quatre constructions ont t cres, deux dentre elles contiennent les rgions cibles des siARN de T4 et les deux autres contiennent celles de T10. Les cotransfections de ces constructions avec les shARN appropris montrent une diminution significative de lactivit de la lucifrase (87%) ce qui montre lefficacit des siARN. (Figure37A). Ni les siARN mismatch (T4shRNA2) ni les contrles RasGAP shRNA naffectent lactivit de la lucifrase. Au contraire, lactivit du rapporteur T4 2 a t slectivement silence par T4shRNA2 (89%) mais pas par T4shRNA1 (Figure37B). Lactivit du rapporteur T10 1 na pas t affecte par T4shRNA1 (en comparaison avec le contrle) (Figure37A) et T4shRNA1 ou T4shRNA2 nont pas affect le rapporteur T10 2. Cependant, la construction T4shRNA2, qui comporte 12 mismatches de squence avec la rgion analogue de T10 a rduit lactivit du rapporteur T10 1 de 42%. Bien que le gne trs proche de T4 ne soit pas affect par la construction T4shRNA1, lquipe na pas exclus la possibilit quil y ait dautres gnes dans le gnome qui pourraient tre silencs par cette construction.

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Figure 37 : Utilisation du gne rapporteur de la lucifrase pour dterminer la spcificit des shARN T4. Des cellules NIH3T3 ont t transfectes avec une construction contenant soit les rgions cibles de T4 soit celles de T10. La capacit des shARN T4 induire lARNi a t montre par une co-transfection. Le T4shRNA1, qui est le shARN complmentaire au rapporteur T4 1, induit une down-rgulation de lactivit de la lucifrase de 87% (A).Les shARN non-complmentaires (T4shRNA2 ou le contrle RasGAPshRNA) nont pas rduit de faon significative lactivit de la lucifrase. De mme, T4shRNA2 a spcifiquement rduit de 89% lactivit de la lucifrase pour le rapporteur T4 2.

Cette exprience a permis de comparer le potentiel des diffrents siARN induire le phnomne dARNi sur la protine T4 mais aussi de tester la slectivit de knock-down de chaque siARN contre la protine T10. cette technique peut tre applique de nombreuses tudes bases sur lARNi dans lesquelles le risque de cibler des gnes homologues existe et particulirement quand ce knock-down slectif a t difficile prouver par des expriences semi-quantitatives classiques. [C4]. Une diffrence de seulement quelques nuclotides dans la squence de lARN cible peut modifier lefficacit dun siARN. Une quipe a compar des phnomnes dARNi en utilisant diffrents promoteurs, rapporteurs et squences cibles. Ils ont montr que le systme bas sur lutilisation de la fluorescence avait des dsavantages vidents compars lutilisation du gne de la lucifrase. De plus, certaines combinaisons entre les promoteurs, rapporteurs et squences cibles, pourtant couramment utilises, peuvent tre maladroites pour tester les effets de lARNi. [C5]. Certains facteurs peuvent influencer lefficacit du silencing. On peut les classer en deux catgories, une concernant les facteurs cellule-spcifiques et une 52

concernant les facteurs molculaires de lARNi. *facteurs cellule-spcifiques: ils varient selon les espces. Par exemple, en effectuant le silencing du gne lamine dans des cellules de souris et de lhomme, on observe des diffrences de rduction de lexpression du gne. En effet, le niveau dexpression du gne lamine de la souris est moins efficacement rduit chez la souris que chez lhomme sous les mmes conditions. Les chercheurs ont donc trouv des effets cellulaire-dpendants. Dans les cellules HeLa, 26 des 44 siARN standards tests ont rduit le niveau dexpression de la protine dau moins 90% et seuls deux duplexes de siARN ont rduit lexpression denviron 50%. [C12]. De plus, des diffrences au niveau de lefficacit de transfection entre diffrentes lignes cellulaires influence lefficacit des siARN. Des chercheurs se sont intresss au silencing du gne Erb B3 dans des lignes de mylome humain. Ils ont constat que le silencing fonctionnait pour des cellules adhrentes mais pas pour des cellules non adhrentes, alors que lefficacit de transfection tait la mme dans les deux types de cellules. Les auteurs en ont conclu que le fait que les siARN soient pigs dans des vsicules de lendosome empchait leur libration dans le cytoplasme. [C13]. Pour la technique des siARN, il existe diffrents avantages et inconvnients selon la technique de dlivrance des siARN : Approche siARN Mthode dlivrance siARN de Principaux avantages des dlivrance de siARN haute concentration la dlivrance peut tre contrle Principaux inconvnients dlivrance difficile dans certaines cellules primaires

Duplexes de siARN - lipidique synthtiques - lectroporation

Duplexes de siARN - lipidique gnrs par la lectroporation transcription in vitro ou Dicer

dlivrance de siARN haute concentration peu cher

difficult de contrler la qualit des siARN

Expression transitoire de shARN partir de construction de promoteur polIII shARN exprims partir de promoteurs polIII dans des

transfection transitoire de plasmides ou PCR infection avec vecteurs viraux

gnration rapide de vecteurs peu cher les virus favorisent la dlivrance

expression pas acheve

effets viraux ngatifs

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vecteurs viraux [N20]. *facteurs molculaires: comme vu prcdemment, la longueur du duplex siARN est un facteur majeur dans la dtermination de lefficacit du silencing. En effet, une quipe de chercheurs a montr que des duplexes de 17pb ne sont pas efficaces mme en additionnant des extrmits, alors que des duplexes de 19pb avec 4 mismatches en position terminale sont toujours capables dinduire un silencing. [C14]. Ils ont donc dmontr que des siARN sans extrmit spcifique sont plus efficaces pour le silencing. En bloquant lextrmit 5 du brin antisens, on observe une importante perte de lactivit de lARNi, alors que le blocage de lextrmit 3 na aucun effet ngatif. Il existe ainsi diffrentes faons damliorer le silencing en effectuant des modifications chimiques sur les siARN. [C8,C12;C14]. Une trs faible quantit de siARN est introduit dans les cellules. Linhibition de lexpression dun gne peut tre perdue aprs quelques jours cause de la dilution dans des cellules en croissance ou cause de la dgradation des siARN transfects. [C7]. Pour faire face ce problme, plusieurs groupes ont dvelopp des plasmides qui expriment des shARN ayant une structure analogue celle des preshARN intermdiaires et ont utilis des promoteurs dpendants de lARN polymrase III.

On peut recenser les avantages et inconvnients de chaque technique de silencing : [C15]. Avantages Spcifique Simple Peu cher dominant Capable de dterminer les fonctions de rgions discrtes de la protine Suppression stable possible Facile administrer 100% de silencing Inconvnients Transfection-dpendante Efficacit variable spcificit Transfection-dpendante

ARNi Oligonuclotides anti-sens Transfection ngatif de

et

Inhibiteurs Knockout

Souvent non-spcifique Production laborieuse Cher Mutants ltaux peuvent empcher le dveloppement embryonnaire

3. Applications de la machinerie de lARN interfrence

Nous avons choisi de traiter deux applicationsClivage par Dicer le mcanisme dARNi : le thrapeutiques pour cancer et linfection par le VIH. Le cancer est une pathologie extrmement complexe cause par diffrents facteurs : lactivation de multiples oncognes, la mutation de gnes suppresseurs de tumeurs, linduction de stress cellulaires. Ces vnements ont lieu en gnral de faon simultane. Concernant le VIH, il existe de nombreux gnes viraux impliqus dans

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diverses tapes de son dveloppement : lentre du virus dans la cellule, sa rplication ou encore sa propagation. Linfection par ce virus est galement une pathologie complexe puisquil faut lutter contre une machinerie trs organise.

3.1. Le cancer
La croissance et la division des cellules normales sont sous le contrle dun rseau de signaux chimiques et molculaires trs finement rguls. Les altrations gntiques peuvent totalement drgler ces voies de signalisation, ce qui conduit une croissance et une division incontrle des cellules. De telles cellules cancreuses ne meurent alors plus quand elles le devraient. Le cancer implique le plus souvent des gnes mutants qui induisent une croissance incontrle des cellules. Beaucoup de laboratoires et dentreprises pharmaceutiques travaillant sur le cancer, utilisent lheure actuelle lARNi pour identifier les gnes ayant un rle cl dans le processus de cancrisation et qui pourraient tre cibls. On dnombre environ 400 gnes directement relis au phnomne du cancrisation. Une question reste pose : est ce que les ARNi peuvent tre utiliss comme agents pharmaceutiques chez lhomme? Les chercheurs esprent pouvoir injecter directement, ou via des vecteurs dexpression des siRNA, chez lhomme, afin de silencer les gnes cancreux surexprims ou bien muts. Depuis quelques annes, les chercheurs ont silenc une douzaine de gnes responsables de cancers, avec de lARNi. On a observ beaucoup de succs en laboratoire sur des cultures cellulaires. Un certain type de cancer reprsente une cible particulirement intressante, ce sont les cancers ayant pour origine une translocation chromosomique. Ainsi, les protines de fusion rsultantes de ce phnomne peuvent constituer une cible pour cette stratgie. En thorie, les protines sauvages ne seraient pas touches. Etant donn que les cellules malades du systme sanguin sont relativement accessibles, les leucmies font partie des premires formes de cancers potentiellement gurissables par le mcanisme de lARNi. Le but est toujours de silencer des gnes et dobserver ensuite le rponse tumorale. Dautre part, les expriences dARN interfrence apportent aux scientifiques un nouvel outil pour dcouvrir et comprendre le rle de gnes dans le dclenchement ou linhibition de cancers. Plutt que de prendre un rle leader dans les thrapies anticancreuses cibles, lARN interfrence constitue plus aujourdhui un espoir de soutien pour les chimiothrapies (utilisation en combinaison). 3.1.1. Silencing des oncognes Les proto-oncognes sont des gnes normaux qui sont impliqus dans la croissance et la division cellulaire. Laltration de ce type de gnes, par des mutations par exemple, peut conduire au dveloppement doncognes. Ces derniers vont alors promouvoir ou permettre une croissance cellulaire excessive et continue. Par consquent, les oncognes sont fortement impliqus dans le processus de cancrisation. Linhibition cible des oncognes dans les cellules tumorales semble tre une approche fort intressante pour le dveloppement de thrapies anticancreuses bases sur lARN interfrence.

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3.1.1.1. Ras La protine Ras est une protine G intermdiaire entre les rcepteurs et les facteurs de transcription. Elle existe sous trois formes diffrentes : H-Ras, K-Ras et N-Ras. Ras est localise la surface de la membrane plasmique laquelle elle est attache par un rsidu farnsyle. La protine Ras intervient dans la voie MAP kinase (figure 38). Les cibles de cette voie sont entre autres des facteurs de transcription tels que c-myc et c-jun. [M24].

Figure 38 : La voie Erk. Cette voie est compose de trois MAP kinases (Raf, Mek, Erk). Ras intervient en amont de cette cascade de kinases, do une rgulation des gnes cibles de la voie Erk par Ras. [M24].

La signalisation dbute au niveau de la membrane plasmique o un facteur de croissance se lie un rcepteur, celui-ci se dimrise alors. La phosphorylation du rcepteur active des GEF, facteurs dchange de guanine, comme SOS. Ces facteurs sont attachs au rcepteur par des protines adaptatrices shc et grb-2. Les protines GEF poussent RAS relarguer le GDP et lchanger contre le GTP. En effet, SOS se fixe sur des rgions particulires de Ras-GDP (Switch 1 et 2), ce qui dplace S1 du site de fixation de GDP-GTP. Le GDP diffuse laissant la place au GTP. Cel conduit la forme active de Ras : Ras-GTP [M24]. La surexpression de Ras est observe dans un trs grand nombre de cancers (et l'inhibition de la farnsylation se traduit par un effet antitumoral). L'activit de Ras-GTP est stoppe par sa dphosphorylation sous l'influence de Ras-GTPases. Dans divers cancers, on trouve des Ras-GTP rsistants l'hydrolyse par les RAS-GTPases, ce qui se traduit par une stimulation permanente de la transcription [M24]. Ras GTP active la protine Raf par une phosphorylation. A son tour, Raf phosphoryle Mek qui active une kinase rgulatrice extracellulaire Erk par une phosphorylation. Erk phosphoryle plusieurs cibles qui provoquent des modifications de lexpression des gnes et lactivit enzymatique [M24]. La protine Ras joue un rle essentiel entre le stimulus externe provoqu par les facteurs de croissance et la transcription gntique. Toute altration du gne Ras provoque une stimulation non contrle de cette protine. Ras entrane une prolifration cellulaire anarchique et une transformation maligne. Ras et Raf ont t identifis comme des protooncognes. La mutation de ces gnes est mettre en relation avec une cancrisation.

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La protine Ras est mute dans de nombreux cancers dont celui du pancras (90%), de la thyrode (60%), du colon (45%) De plus, 35% des cancers tmoignent dune augmentation de lactivit des MAP Kinases. [M24]. La voie Ras semble responsable de la prolifration (activation), de lapoptose (inhibition), de la novascularisation (induction). De nombreux articles expliquent les tudes faites sur diffrents cancers et sur linhibition de Ras implique dans ces cancers. La forme tudie est la forme oncognique K-Ras. Ces articles montrent la dmarche et les analyses classiques faites sur diffrentes lignes cellulaires. Dans un article publi en avril 2005 dans le World Journal of gastroenterology, lquipe de W. Wang effectue des recherches sur le cancer du pancras. Leur but est didentifier un (ou des) siARN efficaces contre K-Ras dans le cancer du pancras chez lHomme sur les cellules de la ligne MiaPaCa-2. Pour cela, il tudie leffet de la mutation de Ras, et linhibition de sa forme mute. Pour se faire, il utilise le principe dARNi. Ces tudes sont faites dans lide dexplorer diverses stratgies thrapeutiques. Les mthodes utilises et les analyses faites sont classiques dans ce type dtudes et sont communes plusieurs articles. Les chercheurs entreprennent de construire la cassette dexpression du siARN (SEC) ciblant la squence du gne de K-ras activ, didentifier plus de squence de siARN efficace contre K-Ras dans les cellules cancreuses pancratiques humaines (ligne MiaPaCa-2) par SEC. Ils travaillent dans le but de rvler les effets anti-cancreux de lARNi et ses possibilits thrapeutiques. [M16]. Trois sites diffrents de SEC ont t construits par PCR. K1/siRNA, K2/siRNA et K3/siRNA sont localiss sur les sites 194, 491 et 327 respectivement. Ils ont t transfects dans les cellules par des liposomes pour inhiber lexpression de K-Ras activ. Dans les groupes interfrents des sites 194 et 491, nous dtectons un phnomne dapoptose dans les cellules par FACS aprs une incubation de 48h, ensuite nous testons lalternance du gne K-Ras dans les cellules tudies par PCR et immunofluorescence. [M16]. Aprs transfection, les auteurs font de nombreuses analyses pour observer les rsultats obtenus par linhibition spcifique de K-Ras mut. Une exprience de RT-PCR a t utilise pour lanalyse de lexpression de lARN de K-Ras dans les cellules MiaPaCa-2 (figure 39). Les fragments dADN amplifis se situent une position correspondant une taille de 400 pb, lactine utilise comme marqueur se situe vers 500 pb.

Figure 39 : Dtection de l'inhibition de l'expression de l'ARNm de K-Ras dans les cellules MiaPaCa-2 par RT-PCR. Ligne 1 : cellules normales ; ligne 2 : cellules transfectes sans ADNc ; ligne 3 : cellules transfectes par un siARN non spcifique ; ligne 4 : cellules transfectes par K1 ; ligne 5 : cellules transfectes par K2 ; ligne 6 : cellules transfectes par K3. [M16].

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Les intensits des bandes correspondant aux cellules transfectes par K1 et K2 sont plus faibles compares les contrles et les cellules normales, mais les cellules transfectes par K3 ne sont pas diffrentes des cellules contrles. Ces rsultats fournissent la preuve que les squences de K1 et de K2 ciblant K-Ras inhibent lexpression de lARNm cibl spcifiquement. [M16]. Une exprience dimmunofluorescence est faite pour dtecter une inhibition dexpression au niveau de la protine (figure 40). Les cellules sont incubes avec un anticorps FITC et observes par un microscope fluorescence.

Figure 40 : Dtection de l'inhibition de l'expression de la protine K-Ras par immunofluorescence dans les cellules MiaPaCa-2. A : cellules normales ; B : cellules transfectes par K3 ; C : cellules transfectes par K1 ; D : cellules transfectes par K2. [M16].

Les cellules normales montrent une forte fluorescence verte, ainsi que les cellules transfectes par K3. Au contraire, les cellules transfectes par K2 ou K1 ne montrent pas de fluorescence verte. Ces rsultats montrent que les siARN K1 et K2 rduisent lexpression de la protine K-Ras dans cette ligne cellulaire. [M16]. Une analyse de FACS est effectue dans le but dobserver les diffrents taux dapoptose dans des cellules contrles et dans des cellules transfectes par les diffrents ARNi (figure 41).

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Figure 41 : Analyse par FACS du taux d'apoptose dans les cellules transfectes par le siARN contre K-Ras Val 12. A : analyse de cellules normales, B : analyse de cellules transfectes sans ADNc, C : analyse de cellules transfectes par un ADNc non spcifique, D : analyse de cellules transfectes par le siARN K1, E : analyse de cellules transfectes par K2, F : analyse de cellules transfectes par K3. [M16].

Une fonction critique de la transformation par K-Ras est laugmentation de la rsistance lapoptose. Cette figure montre que lintroduction de K1 et K2 contre K-Ras mne un fort taux dapoptose. Par ailleurs, le nombre de cellules apoptotiques est trs important en comparaison aux cellules contrles. Le nombre de cellules apoptotiques a augment parmi les cellules de la ligne MiaPaCa-2 infectes par K1/siARN et K2/siARN. En termes quantitatifs, les pourcentages de cellules apoptotiques sont : 43,16% pour les cellules transfectes par K1 24,79% pour les cellules transfectes par K2 5,11% pour les cellules transfectes par K3 3,96% pour les cellules transfectes par un siARN non spcifique 1,74% pour les cellules normales 2,46% pour les cellules transfectes sans ADNc.

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Cette figure montre donc une activation du processus dapoptose pour les siARN K1 et K2. La transfection par K3 na pas deffet notable sur lapoptose. Les autres types de cellules sont des contrles ngatifs, il ny a pas daugmentation du taux dapoptose. [M16]. Les tests de RT-PCR et immunofluorescence montrent donc des effets de lexpression inhibe du gne K-Ras activ par ARNi dans les groupes K1 et K2. Lintroduction de K3 na pas deffets sur ces cellules. Par ailleurs, lexprience de FACS montre un impact de linhibition de lexpression de K-Ras (au niveau de lARNm et au niveau de la protine) sur le taux dapoptose : en effet le nombre de cellules apoptotiques est fortement augment. Dans les trois expriences prcdentes, le siARN K3 montre des rsultats semblables aux contrles, il ne montre donc aucun effet sur lexpression de K-Ras ou sur le taux dapoptose. Lquipe a considr que la squence choisie pour ce siARN ntait pas efficace. [M16]. Cette tude montre que lexpression de loncogne K-Ras peut initier le dveloppement du cancer du pancras. Elle suggre que linhibition de ce gne activ pourrait constituer une nouvelle stratgie thrapeutique du cancer du pancras ; lquipe dcrit les siARN spcifiques de K-Ras et efficaces dans linhibition de son expression (ici K1, K2, mais pas K3) peuvent constituer un puissant outil dans les traitements contre les cancers pancratiques humains. Un article semblable parait dans la mme revue, mais par une autre quipe quelques mois dintervalle. Dans cette tude, les chercheurs ont pour but dtudier leffet anti-tumoral in vitro de linhibition de Ras par un siARN introduit par adnovirus sur le cancer du pancras et les mcanismes associs. Ils expliquent linversion du phnotype par le silencing de RasVal12 induit par lintroduction dun siARN dans la ligne cellulaire cancreuse pancratique humaine Panc-1. [M17]. Pour se faire, ils utilisent un mode dadministration diffrent de celui utilis par lquipe prcdente. Un oligonuclotide de 63 nuclotides codant pour K-ras (Val 12) et un siARN spcifique sont introduits dans un plasmide 3.1-H1, linsertion du promoteur H1-RNA et la squence codant pour le siARN sont sur-clons dans un plasmide pAdTrack, ce qui permet dobtenir un plasmide pAdTrackH1-K-ras (val12). Apres une recombinaison homologue dans une bactrie et une transfection de tels plasmides dans la ligne cellulaire de mammifre 293, lexpression dun siARN codant pour Ras Val12, par lintermdiaire dun adnovirus, est obtenue (figure 42). [M17].

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Figure 42 : Schma reprsentant les grandes tapes de l'expression du siARN. Lexpression du siARN se fait par lintermdiaire dun adnovirus qui infecte les cellules de la ligne 293. KRas Val 12 est sous linfluence du promoteur H1. [M17].

La suppression stable de K-Ras (Val 12) a t dtecte par Northern Blot et Western Blot et lapoptose dans les cellules de la ligne Panc-1a t dtecte par cytomtrie de flux, comme dans le premier article sur Ras Val 12. Les chercheurs obtiennent des rsultats similaires. Par lintermdiaire du siARN ciblant KRasVal12, le phnotype oncognique des cellules cancreuses a t renvers. La cytomtrie de flux a montr que lindice apoptotique des cellules de la ligne Panc-1 a t sensiblement augment dans les cellules traites par le plasmide contenant le siARN : 18,70% 72h aprs linfection, 49,55% 96 heures aprs linfection. On effectue les mmes mesures sur des groupes de contrles : (pour le vecteur vide : 3,47% aprs 72 heures, 3,98% aprs 96h, pour le vecteur contenant p53 en tant que contrle ngatif : 4.21% aprs 72h, 3,72% aprs 96h). (p<0,05)

On notera que les pourcentages sont ici donns des temps diffrents ce qui apporte une prcision aux rsultats. De plus, dans cet article, les expriences sont faites en parallle dans les lignes Panc-1 et les lignes HeLa (contrle). [M17]. Cette tude montrent que les vecteurs drivs dadnovirus peuvent tre utiliss pour administrer les ARNi, ceci afin dinduire la perte permanente des phnotypes fonctionnels. Dans la thrapie gnique, linhibition slective de la version mutante dun gne uniquement tient compte des effets spcifiques des cellules tumorales alors que les cellules normales ne sont pas touches. De plus, lapoptose dans les cellules pancratiques

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cancreuses de la ligne Panc-1 peut tre induite aprs linfection par ladnovirus transfect par RasVal12 AdH1-K. Cette sorte dadnovirus contenant un lARNi pourrait tre un vecteur prometteur pour la thrapie anti-cancreuse. [M17]. Dans la revue Molecular Cancer Research, une tude explique les consquences molculaires du silencing du mutant K-Ras dans les cellules de cancer de pancras. Les auteurs disent justifier une probable thrapie dirige contre K-Ras. La mutation du gne K-Ras est un vnement prcoce dans le dveloppement de ladnocarcinome pancratique et par consquent un ARNi dirig contre un mutant de KRas peut reprsenter une nouvelle thrapie. Dans cette tude, les chercheurs tudient les consquences phnotypiques et molculaires de lexposition des cellules tumorales de pancras au siARN spcifique de la forme mutante de K-Ras. La rduction spcifique de K-Ras activ par lARNi dans les cellules Panc-1 et MiaPaca-2 aboutit des changements cellulaires consquents avec une capacit rduite de la forme de tumeur maligne. Ces changements ont lieu par lintermdiaire des mcanismes distincts mais refltent probablement une addition sur chaque ligne cellulaire dune stimulation dun oncogne. Les deux lignes cellulaires montrent une prolifration rduite aprs lutilisation de lARNi contre K-Ras, mais seulement les cellules MiaPaca-2 montrent une apoptose accrue. Ces lignes ont montr une migration rduite aprs la baisse de lexpression de K-Ras, mais les changements dans les niveaux dintgrines nont pas t consquents entre les lignes cellulaires. Les lignes montrent une altration du niveau de GLUT-1 (gne associ au mtabolisme en aval de c-myc) : les cellules Panc-1 montrent une diminution du niveau de GLUT-1 alors que les cellules MiaPaca-2 montrent un niveau lev de lexpression aprs linhibition de K-Ras. De plus, aprs utilisation de lARNi sur KRas, il y a eu une rduction du potentiel angiognique dans les deux types de lignes cellulaires. Les cellules Panc-1 voient une augmentation du niveau dexpression de la trombospondine-1, une inhibiteur endogne de langiogense, alors que les cellules MiaPaca-2 voient une inhibition de la production du VEGF, un stimulant primaire de langiogense dans les tumeurs pancratiques. On a trouv que linhibition du mutant K-Ras par ARNi aboutit une altration du comportement des cellules tumorales in vitro et suggre quun ARNi ciblant le mutant K-Ras peut tre efficace contre les cancers pancratiques in vivo. La drgulation des protines par des mutations aboutissant des formes constitutives actives, par des surexpressions ou par une activation en amont est commune dans les tumeurs humaines. Chez les protines Ras, K-ras est la plus frquemment mute et est par consquent une cible de la thrapie anticancreuse. La complexit de la signalisation de Kras prsente plusieurs opportunits en tant que cible thrapeutique. Un nombre dapproches diffrentes visant lactivit de K-ras ont t explores en essais cliniques. Plusieurs agents thrapeutiques tests ont dmontr une activit clinique, soutenant les dveloppements en cours des thrapies cibles contre K-ras. Toutefois, plusieurs de ces agents actuellement en cours dvaluation prsentent plusieurs cibles et leurs effets anti-tumoraux peuvent ne pas tre dus linhibition de K-Ras (par ARNi par exemple). A ce jour, de manire non slective, un inhibiteur non spcifique de K-Ras est disponible pour lusage clinique habituel. Les stratgies envisageables, leurs succs et leurs checs sont dbattre. [M19]. Ltude de ces articles permet de cibler les mthodes classiques dtude des protines oncogniques ou impliques dans le cancer par ARNi. Elle permet aussi de voir que lon

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obtient des informations sur le fonctionnement de ces protines et sur limpact du silencing de celles-ci sur dautres molcules. 3.1.1.2. c-Myc c-Myc est un facteur de transcription, dont la forme oncognique joue un rle cl dans la tumorigense. [N31]. Une tude rcente, ralise en 2005 que ladministration de siARN dirigs contre loncogne c-Myc permettait une rduction de plus de 80% de lexpression de cette protine dans des cellules MCF-7. Il sagit des cellules de cancers du sein, qui ont la caractristique dexprimer des niveaux levs de cet oncogne. Le but de cette tude tait dexaminer les effets anti-tumoraux de siARN dirigs contre cMyc. Ladministration des siARN sest faite laide dun vecteur dexpression contenant le promoteur Pol III (figure 43). Pour cela, il a fallu designer et synthtiser une paire doligonuclotides reprsentant la squence cible de lARNm c-Myc. Ces oligonuclotides ont donc ensuite t intgrs dans le vecteur dexpression (sous laction dune ligase). [N30].

Figure 43 : Reprsentation schmatique du vecteur dexpression pSilener 1.0 U6. Le promoteur U6-RNA a t clon devant la squence du siARN. Il sagit dune squence de 19 nuclotides, identique la squence de lARNm de c-Myc, spare de son reverse complmentaire par une courte squence spacer. Six rsidus thymidines ont t rajouts, comme signal de terminaison de la transcription pour la RNA Polymrase III. Sur ce schma, figurent galement la structure prdite du shARN (en forme de tte dpingle) aprs la transcription, ainsi que la structure du siARN de 21 nuclotides obtenu aprs laction de Dicer. [N30]

Des Western blot ont t raliss afin de quantifier les niveaux de la protine c-Myc. Les rsultats ont donc montr que les siARN dirigs contre c-Myc permettaient une rduction significative (plus de 80%) de lexpression de c-Myc dans les cellules MCF-7. Ce dclin du niveau dexpression de la protine c-Myc est corrl une rduction significative du taux de croissance des cellules MCF-7. De prcdentes tudes avaient dailleurs dmontr que c-Myc tait important pour la prolifration cellulaire et pour la croissance des cellules. Cest ainsi que des taux levs de c-Myc ont certainement une implication dans le dveloppement des cancers du sein. Dans cette exprience, des cellules MCF-7 ont t transfectes avec un vecteur dexpression pSilencer contenant le siARN dirig contre c-Myc. Le nombre de cellules a t compt tous les 2 jours aprs la transfection. Les donnes montrent les siARN permettent une diminution de 50 60 % de la croissance cellulaire (figure 44). [N30]

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Figure 44 : Les siARN dirigs contre c-Myc permettent de rduire le taux de croissance cellulaire. Les cellules MCF-7 ont t transfectes avec le vecteur dexpression pSilencer/c-Myc, ou avec le mme vecteur, mais vide. Aprs 48 heures, les cellules ont t rcupres, puis ont t remises en culture, avec une densit de 50 cellules / mm. Lexprience a t rpte trois fois. Les cellules ont ensuite t comptes tous les 2 jours. Les rsultats montrent que lexpression de siARN ciblant c-Myc diminue de faon significative la croissance des cellules. [N30].

Dautres analyses ont permis de dmontrer que la rduction des niveaux dexpression de cMyc tait corrle une inhibition de la formation de colonies cellulaires. Cette analyse a t faite avec des cellules MCF-7 transfectes avec un vecteur dexpression vide ou contenant linsert ciblant c-Myc. 48 heures aprs la transfection, les cellules ont t places dans un milieu dagar mou. Les colonies ont t comptes deux semaines aprs. On a pu observer que la rduction des taux de c-Myc par la technique dARN interfrence permettait une diminution significative (environ 65%) de la capacit des cellules MCF-7 former des colonies (figure 45). [N30].

Figure 45 : Le Knock down de la protine c-Myc par lARN interfrence rduit la formation de colonies sur lagar mou. Des cellules MCF-7 ont t transfectes avec des vecteurs dexpression vides ou contenant linsert ciblant cMyc. Les vecteurs vides servent de contrle. Les cellules ont ensuite t places dans un milieu contenant 0,35% dagarose et 10% de Srum de Veau Ftal. Le nombre de colonies a t dtermin 2 semaines aprs. a. photographies des boites de ptri contenant les cellules MCF-7 transfectes avec les vecteurs indiqu s au dessous. b. le nombre de colonies formes partir des cellules transfectes avec le vecteur contenant le siARN dirig contre c-Myc a t normalis par rapport au contrle, cest--dire aux cellules transfectes avec le vecteur vide. Les rsultats indiqus sont une moyenne de 3 expriences ralises de faon indpendante. [N30].

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Les effets du silencing de c-Myc sur la croissance tumorale ont t dtermins grce des expriences in vivo ralises sur la souris nude. On a ainsi mis en vidence que lARN interfrence dirige contre c-Myc rduisait la croissance des tumeurs sur ce type de souris. Pour cela, un nombre gal de cellules de cancer du sein MCF-7 (10^6 ou2.10^6) transfectes avec un vecteur contenant linsert ciblant c-Myc ont t injectes dans des souris femelle nude (5 animaux pour chaque traitement). 5 8 semaines aprs linjection, les souris ont t tues et le volume tumoral a t dtermin. Quand 10^6 cellules ont t injectes, les tumeurs sont apparues au bout de 8 semaines. On a observ en moyenne 3 5 tumeurs pas souris, du ct o on inject les cellules transfectes avec le vecteur vide, et aucune du ct o on inject les cellules transfectes avec le vecteur contenant le siARN dirig contre c-Myc. Quand 2*10^6 cellules ont t injectes, les tumeurs sont apparues au bout de 5 semaines. On a observ en moyenne 4 5 tumeurs du ct o on a inject les cellules contenant le vecteur vide, et aucune du ct o on a inject les cellules contenant le vecteur avec insert. Par consquent, lARN interfrence ciblant c-Myc rduit de manire significative la croissance tumorale dans des souris nude, en comparaison au contrle. Ceci suggre donc que cibler c-Myc par la stratgie dARN interfrence pourrait exercer un puissant effet antitumoral in vivo sur des cellules de cancer du sein MCF-7. [N30]. Paralllement, cette quipe a pu dmontrer que la rduction des niveaux de c-Myc par lARN interfrence induisait un phnomne dapoptose sur des cellules MCF-7. 24 heures aprs la transfection de cellules avec des vecteurs vides ou contenant linsert ciblant c-Myc, celles-ci ont t prives de srum pendant 36 heures. Les cellules ont ensuite t analyses par cytomtrie de flux et par essai TUNEL. Dans ce type dessai, les cellules en phase subG1 reprsentent les cellules apoptotiques. On a pu constat que 31,1% des cellules MCF-7 transfectes avec le vecteur contenant le siARN dirig contre c-Myc dclenchaient un phnomne dapoptose aprs la privation en srum. Dans le groupe de cellules contrle, seulement 5,8 des cellules dclenche une apoptose (figure 46). Sur lessai TUNEL est une analyse qui permet de mettre en vidence la fragmentation de lADN qui a lieu au cours du processus de lapoptose. Sur cet essai, on voit quenviron 40% des cellules transfectes avec pSilencer-c-Myc sont TUNEL-positive cest--dire montre un signe vident dapoptose. Dans le groupe de cellules contrle, seulement 6% des cellules semblent avoir dclench un mcanisme dapoptose. Ces rsultats semblent suggrer que la rduction des niveaux de c-Myc par lARN interfrence rende les cellules MCF-7 plus sensibles lapoptose aprs la privation en srum. (Figure 47)

Figure 46 : La down rgulation de c-Myc dans les cellules MCF-7 induit un phnomne dapoptose aprs la privation en srum. Les cellules MCF-7 ont t transfectes avec un vecteur dexpression vide ou contenant le siARN dirig contre c-Myc. 24 heures aprs la transfection, les cellules ont t prives en srum pendant 36 heures. Les cellules ont ensuite purifies, puis les cellules apoptotiques ont t mises en vidence par cytomtrie de flux. La population cellulaire en sub-G1 caractrise les cellules apoptotiques. Laxe des x reprsente le contenu en ADN, et laxe des y reprsente le nombre de cellules. [N30].

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Figure 47 : Essai TUNEL qui permet de dtecter les cellules apoptotiques in situ. Les cellules MCF-7 ont t faites pousser sur un milieu optimum, puis ont t transfectes avec les deux types de vecteurs (vides ou avec insert). 24 heures aprs la transfection, les cellules ont t prives en srum pendant 36 heures, puis ont t analyses par essai TUNEL pour mettre en vidence le phnomne dapoptose. Les noyaux noirs sont typiques de cellules en cours dapoptose. Les flches indiquent les cellules TUNEL-positives. [N30].

Lensemble de ces rsultats a donc permis de conclure que c-Myc avait un rle primordial dans le dveloppement des cancers du sein. Dautre part, il semblerait que la rduction des niveaux de loncogne c-Myc dans des cellules de cancer du sein reprsente un outil de choix comme thrapie anti-cancreuse cible. 3.1.1.3. STAT3 La protine STAT3 (signal transducer and activator of transcription) appartient la famille des protines STAT, on lui connat six gnes homologues (STAT1, STAT2, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6). Cette protine est un facteur de transcription impliqu dans un grand nombre de cancers, notamment dans le cancer invasif du sein. Lexpression de la protine STAT3 est presque omniprsente ; la protine est localise dans le cytoplasme, et nest transfre dans le noyau quaprs phosphorylation de la tyrosine. Elle a pour fonction une rgulation des gnes. Il existe deux transcrits et deux isoformes majeurs dans la famille STAT3 : ils sont nomms STAT3 et STAT3. Il existe cependant dautres formes de STAT3 minoritaires. La forme est constitue de 770 acides amins et a un poids molculaire de 93 kDa. La forme a un poids molculaire de 83 kDa. Etant donn la similarit des protines, on parlera dans cette partie de la protine STAT3 sans distinguer la forme de la forme , dans le cas contraire la distinction sera prcise. Il existe quelques rgions notables sur la protine STAT3 (Figure 48) : Le domaine de liaison de lADN, Le domaine SH2, Un site majeur de phosphorylation de tyrosine Y705 (et un site majeur de phosphorylation de srine S727).

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Figure 48 : Domaines notables de la protine STAT3. On distingue ici le domaine de liaison lADN en bleu, le domaine SH2 en vert et le domaine de phosphorylation en rouge. Le domaine color en jaune montre une zone constitue de quatre hlices, elle montre un fort enroulement. On remarque deux sites nots NLS sur cette figure : ces rgions montrent la possibilit de lentre de la protine dans le noyau. A lintrieur du noyau, la protine pourra jouer son rle sur la rgulation de lexpression des gnes. [M10].

La rgion C terminale de STAT3 est un domaine dactivation transcriptionnelle dont lactivit est augmente par la phosphorylation de la serine 727. La forme STAT3 ne possde pas ce domaine (rgion C terminale) ; elle est parfois utilise comme dominant ngatif. Les protines STAT3 sont des facteurs de transcription qui. Ils agissent en rgulant l'expression des gnes et doivent donc gagner le noyau. La translocation dans le noyau se fait aprs plusieurs tapes. Une fois recrute au niveau du rcepteur, les protines STAT3 sont rapproches des kinases JAK. Ces kinases JAK phosphorylent STAT3. Cette phosphorylation induit la dimrisation des facteurs de transcription : chaque protine contient un domaine SH2 qui s'associe avec la tyrosine phosphoryle d'une autre molcule STAT3 pour former un dimre (on notera que STAT3 peut shtrodimriser avec STAT1). De rcentes tudes suggrent quune dimrisation peut se faire sans phosphorylation, dans ce cas la phosphorylation mne des modifications de la conformation du dimre. [M10].

La phosphorylation du rsidu tyrosine induit une activit de fixation lADN de haute affinit (au niveau de la squence TTCNNNGAA) la protine et peut alors stimuler la translocation nuclaire. Ce mouvement est donc induit par la dimrisation des protines. Le mcanisme est inconnu, mais il est probable que ce dimre prsente une squence NLS (la figure 48 est base sur cette hypothse) ou puisse s'associer avec un partenaire qui lui permettra d'interagir avec l'importine (on notera quen cas gnral le passage dans le noyau se fait par lintermdiaire de la squence NLS). Il n'y a donc pas de molcules STAT3 dans le noyau sous forme de monomres. La stimulation de la phosphorylation entrane par ailleurs une scrtion de cytokines varies et de facteurs de croissances (LIF, OSM, Il-6, leptine, EGF, PDGF, HGF). Une fois arriv dans le noyau, le facteur de transcription se fixe sur les zones de rgulation du promoteur de p21 et active ce gne. L'expression de p21 augmente et le cycle cellulaire est bloqu, ce qui aboutit l'induction de la diffrenciation. La protine STAT3 agit donc directement sur des protines contrlant le cycle cellulaire, et par l la diffrenciation. Son expression est rgule par les protines en amont dans les voies dans lesquelles elle intervient : par exemple, lactivation de STAT3 dpend de sa 67

phosphorylation par les kinases JAK, or ces kinases sont fortement rgules et actives par diffrentes molcules (comme les cytokines par exemple). [M11]. La protine STAT3 est surexprime dans plusieurs cancers dont le glioblastome, les cancers du larynx, du cerveau, de la prostate et du sein. La forme constitutive active de STAT3 est une forme oncognique, bien que ces mutations naient pas t identifies dans les cancers humains jusquici. Lactivation constitutive de STAT3 est par ailleurs associe dautres types de pathologies tout a fait diffrentes des phnomnes de cancrisation telles que la maladie de Crohn, et dautres maladies inflammatoires (fibrose pulmonaire et des altrations aigues du poumon). La mutation de STAT3 mne par ailleurs lobsit chez la souris. Dans un article paru en avril 2005 dans la revue Cancer Research, les auteurs X. Ling et R.B. Arlinghaus dcrivent des expriences dinhibition de STAT3 par ARNi chez la souris. Ces manipulations semblent inhiber linduction des tumeurs du sein dans des cellules immunocomptentes. [M12]. Les membres de cette quipe de recherche ont examin les effets de linhibition de la protine STAT3 par ARNi en utilisant une petite pingle cheveux dun lentivirus dicistronique (shARN). Ils effectuent pour cela une construction utilisant un lentivirus (figure 49).

Figure 49 : Construction du shARN contre STAT3 dans le gnome d'un lentivirus. On transduit cette construction dans les cellules 4T1. Ce schma montre la structure de la construction du gnome du lentivirus dans lequel on a insr un shADNc. La transcription de ce shADNc est assure par un promoteur H1 et celle de la GFP par un promoteur EF1-. [M12].

Une exposition simple des cellules 4T1 au lentivirus contenant le shARN contre STAT3 aboutit une transduction de 75% des cellules avec la protine GFP dans un dlai de 96 heures (figure 50 A et B). Dans les cellules slectionnes pour lexpression de GFP, ni la protine STAT3 ni la forme STAT3 phosphoryle n'ont t dtectes. La formation de la tumeur induite par linjection des cellules 4T1 dans un morceau de graisse mammaire a t bloque par lexpression de shARN contre STAT3. Les souris contrle, auxquelles on avait inject des cellules 4T1 exprimant uniquement la GFP, forment des tumeurs. Ces rsultats montrent donc une efficacit parfaite dans 75% des cas (figure 50 C et D). [M12]. Lexpression de c-Myc a aussi t rduite de plus de 70% dans les cellules exprimant des niveaux de STAT3 considrablement rduits en comparaison aux contrles GFP . De manire intressante, on a presque entirement limin le niveau de Src activ, qui est connu pour activer STAT3, mais le niveau de la protine de Src lui-mme est rest le mme. On a par ailleurs limin de manire importante l'expression de la protine de torsion, un rgulateur mtastatique dans cellules o STAT3 est inhibe. L'activit d'invasion des cellules dans lesquelles STAT3 a t inhibe a t fortement rduite. [M12]. Cependant, le taux de prolifration cellulaire dans les cellules traites par lARNi tait semblable celui de la commande de GFP. Le cycle cellulaire n'a pas t affect non plus. Lquipe conclut de ces tudes que la protine STAT3 active joue un rle critique dans l'induction des tumeurs du sein induites par les cellules 4T1. Ce rle passe par laugmentation de l'expression de plusieurs gnes importants dont c-Myc et la protine de 68

torsion (qui est dfinie comme un rgulateur mtastasique). Ces tudes suggrent que l'expression stable du siARN contre STAT3 offre des possibilits intressantes en tant stratgie thrapeutique dans le cancer de sein . On a galement remarqu dans cette tude que lexpression dune protine, appele TWIST, implique dans le processus de mtastase a t fortement rduite. Ceci a pour consquence de rduire considrablement la capacit des cellules cancreuses envahir des tissus normaux, comme le poumon. On peut donc en dduire que STAT3 contrle lexpression de TWIST et serait donc implique dans le processus de mtastase. De nombreuses recherches doivent encore tre effectues sur ce sujet pour comprendre les mcanismes prcis de ce contrle. [M12].

Figure 50 : Rsultats de linhibition de STAT3 bans les cellules 4T1 da cancer du sein de la souris. La GFP et le shARN contre STAT3 sont exprims dans les cellules 4T1 par lintermdiaire de linfection par un lentivirus. A pattern de cytomtrie de flux des cellules 4T1 aprs linfection : le niveau de GFP es estim une expression dans 75% des cellules. B photographies des cellules 4T1 prises par un microscope a fluorescence. Comme contrle, les cellules sont tranduites avec un plasmide contenant uniquement la GFP. C Western Blot sur lysats cellulaires avec anticorps anti-STAT3, anti pTyr-STAT3 et anti-actine (contrle). Une quantit gale de protines a t charge sur chaque ligne de gel. D le contrle ngatif de shARN na pas deffet sur lexpression de STAT3 et sur la phosphorylation de la tyrosine de STAT3. [M12].

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Par ces expriences, on voit que le mcanisme dARNi permet une inhibition importante, mais non totale, de STAT3 mais a aussi des effets dinhibition de lexpression sur les protines des voies de signalisation o STAT3 est implique. On note que linhibition de STAT3 a un rle sur linvasion tumorale mais pas sur la prolifration ou le cycle cellulaire. Par ailleurs on remarque que ces expriences sont faites in vivo chez la souris et non sur lHomme. Le passage des expriences sur lHomme est difficile de par le mode dadministration des siARN et de par un problme thique dessais scientifiques sur lHomme. Dans un second article, une quipe dauteurs, dont X.Y. Zhang travaille sur les cellules de cancer du larynx. Ils cherchent inhiber dans ces cellules lexpression de STAT3 par lutilisation de siARN. [M13]. Lquipe effectue en premier lieu des recherches pour dterminer leffet inhibiteur du siARN de synthse sur lexpression de STAT3 dans les cellules cancreuses humaines du larynx (lignes Hep2) et pour tudier l'effet du siRNA/STAT3 sur la croissance et l'apoptose dans ces cellules Hep2. Pour cela, les chercheurs utilisent de lADNc codant pour le siARN contre lARNm de STAT3. Cet ADNc est synthtis dans le plasmide pSilencer1.0-U6siRNA-STAT3 . Les cellules Hep2 sont transfectes avec les mdiateurs Rpmi-1640 (non traits), le plasmide (vide), et siRNA de STAT3 respectivement. Les analyses de Northern Blot et de Western Blot de lexpression de STAT3, celles de lexpression de STAT3 phosphoryle sur la tyrosine (pTyr STAT3) et celles du Western Blot de lexpression de Bcl-2 dans les cellules Hep2 ont t effectues 72h aprs la transfection au MMT. Une cytomtrie de flux et une analyse AO/EB ont t utilises pour la dtermination de la prolifration cellulaire et lapoptose dans la ligne Hep2. [M13]. La protine pTyr-STAT3 est nettement exprime dans les cellules Hep2 non traites et dans les cellules traites avec le vecteur vide, alors que lexpression de pTyr-STAT3 est significativement rduite dans les cellules Hep2 transfectes avec le siARN contre STAT3. Ceci indique que le siARN de STAT3 a inhib lactivit de la protine. La transfection des cellules Hep2 avec le siARN de STAT3 a inhib de manire significative lexpression de STAT3 au niveau de lARNm mais aussi de la protine et linhibition a t caractrise par une transfection temps-dpendante. Le traitement des cellules Hep2 avec le siARN de STAT3 a eu pour consquence une inhibition dose-dpendante de la croissance des cellules Hep2, ce qui entrane une augmentation du taux dapoptose des cellules et une diminution du niveau dexpression de Bcl-2 (protine anti-apoptotique). Le siARN de STAT3 a eu un effet sur linduction de lapoptose une tape plus ou moins tardive. En dfinitive, cette tude dmontre que le siARN de STAT3 inhibe effectivement lexpression du gne STAT3 dans les cellules Hep2. Cela mne une surcroissance et linduction de lapoptose. Lutilisation de la technique de siARN peut fournir une nouvelle approche thrapeutique pour traiter le cancer du larynx et dautres tumeurs malignes exprimant STAT3 de manire constitutive active. Cet article montre les mmes caractristiques que larticle prcdent. Le phnomne dARNi inhibe STAT3 et dautres protines comme Bcl-2 dans ces cellules. Linhibition des ces protines peut sexpliquer par un contrle de STAT3 plus ou moins direct sur celles-ci. Par ailleurs, cette inhibition a un effet sur la croissance cellulaire et lapoptose ; ceci ntant pas surprenant tant donn que STAT3 joue un rle dans le cycle cellulaire. Par contre, cet article prcise une inhibition temps et dose-dpendante. Les expriences semblent ici tre effectues in cellulo. Il faut donc passer des expriences sur des organismes entiers avant de

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penser une possible thrapie anti-cancreuse chez lHumain, mme si les auteurs en formulent dors et dj lide. [M13]. Dans un article de janvier 2005 paru dans Cancer Research, des chercheurs tudient limplication de STAT3 dans des cellules cancreuses du colon chez lHomme. Dans cette tude, les chercheurs travaillent sur la contribution de STAT3 lactivit pro invasive des facteurs TFF (trefoil factor) et VEGF (vascular endothelial growth factor) dans les cellules colorectales humaines cancreuses HCT8/s11 exprimant des rcepteurs au VEGF. Le TFF3 (TFF intestinal) et le VEGF sont des activateurs de la voie STAT3. Linhibition des isoformes de STAT3 (par ARNi ou par voie pharmacologique classique) rduit la croissance tumorale chez des souris athymiques. Lanalyse de lexpression diffrentielle de gnes utilisant des ADNc a indiqu que la surexpression de STAT3 diminue. Les donnes suggrent que le TFF et le VEGF (principal rgulateur angiognique) exercent une activit pro invasive efficace par lintermdiaire de STAT3 dans les cellules cancreuses colorectales humaines. Ces chercheurs valident alors les nouvelles stratgies thrapeutiques visant STAT3 par des inhibiteurs pharmacologiques et le phnomne dARNi pour le traitement du cancer colorectal humain. Dans cet article, lARNi est utilis comme un simple inhibiteur et ne montre pas davantage particulier par rapport un autre type dinhibition. Cependant, il est intressant car il montre une possibilit dinhiber lactivit pro invasive du VEGF. Ces expriences montrent des interactions entre STAT3 et le VEGF, on peut alors se demander si linhibition de STAT3 pourrait influencer langiogense tumorale. [M14]. Un article datant de septembre 2005, paru dans Prostate et publi en ligne par Wiley InterScience explique les rsultats obtenus aprs une tude dARNi contre STAT3 sur la croissance cellulaire et lapoptose dans des cellules cancreuses humaines de la prostate. Dans cet article, les chercheurs expliquent que STAT3 est une protine principale de transduction du signal qui ngocie la signalisation par des cytokines, des facteurs de croissance et des oncoprotines et elle est active de manire constitutive dans de nombreux cancers dont le cancer de la prostate. Des tudes ont montr que STAT3 constitutive active joue un rle important dans le dveloppement et la progression du cancer de la prostate en favorisant la prolifration des cellules et en protgeant les cellules cancreuses de lapoptose. Cette quipe de chercheurs tudie une utilisation potentielle de lARNi dans lintention de bloquer lexpression, lactivation de STAT3 et leffet sur la croissance des cellules cancreuses de la prostate. Ces chercheurs ont identifi un siARN spcifique de STAT3 et ont dmontr que le blocage de lactivation de STAT3 par le siARN supprime la croissance des cellules cancreuses prostatiques, lexpression du gne STAT3 et induit lapoptose. Le siARN ne semble pas inhiber la prolifration ni induire lapoptose des cellules cancreuses non constitutives actives pour STAT3. De plus, le siARN inhibe le niveau dexpression du PSA dans les cellules cancreuses. Ces rsultats dmontrent que la signalisation de STAT3 inhibe par siARN dans les cellules prostatiques peut constituer une nouvelle stratgie thrapeutique pour le traitement des cancers de la prostate exprimant la protine STAT3 de manire constitutive active. [M14]. Cet article apporte un point important dans la cadre dun thrapie anti-cancreuse utilisant lARNi : dans cet article, on remarque que lARNi nest efficace que dans le cas dune protine STAT3 constitutive active. Cela montre une grande spcificit, utile uniquement pour une tumeur ou STAT3 est mute et constitutive active. On sait que le phnomne dARNi pose des problmes au niveau de la spcificit en particulier des cellules mutantes en

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comparaison aux cellules saines : en effet il faut trouver un ARNi spcifique dune protine tumorale uniquement. Sur cet aspect, cet article montre un point positif. Par contre, il faut noter que la spcificit pour cette forme rduit lutilisation de ce type dARNi une thrapie de cancer STAT3 constitutive active. On peut alors faire une analogie avec le traitement des cancers du sein HER2+++ par lHerceptine. Ce traitement nest alors ventuellement efficace que chez 30% des patientes atteintes de cancer du sein. On relve dans cet article une limite des thrapies anti-cancreuses cibles dont lARNi pourra faire partie. Ces thrapies tant trs cibles, elles ne concernent souvent quun faible pourcentage des patients. Ces divers articles montrent des avantages vidents dans le cadre dune possible thrapie anticancreuse utilisant lARNi. Une thrapie sur lHumain base sur ce type de stratgie nest pas prvue dans limmdiat, dune part parce que ladministration dARNi chez lHomme nest pas vidente, et celle de lentivirus na pas encore t approuve et parce que de nombreux problmes sont encore poss par le traitement des mtastases, notamment pour le cancer du sein. Mme sil faudra attendre encore longtemps avant de pouvoir effectuer de telles thrapies chez lHomme, ces expriences ont nanmoins permis de montrer quil tait possible de transfecter de manire stable des ARNi afin de silencer dfinitivement des gnes critiques pour la cancer tel que le gne STAT3 (R. Arlinghaus). De plus, ces articles montrent une coopration forte des diffrentes voies cellulaires. En effet, dans chacun des articles, linhibition de STAT3 entrane une modification de lexpression dautres protines. On remarque dailleurs que les protines alors impliques sont des molcules mises en jeu dans le cas de processus de cancrisation. On voit ici un impact de linhibition de STAT3 par ARNi sur Bcl2, le VEGF ces protines ont chacune un rle important dans la progression et le dveloppement tumoraux, la premire sur lapoptose, lautre sur langiogense. 3.1.1.4. PLK1 Dautres tudes ont t ralises sur loncogne PLK1 (Polo-Like Kinase 1). PLK1 est une srine/thronine kinase qui fait partie dune famille multi gnique. Les PLK jouent un rle important dans la rgulation du cycle cellulaire, et favorisent la progression de cellules vers le processus de mitose. De plus, on a dcouvert que PLK1 tait surexprim dans un grand nombre de tumeurs humaines, et son expression semble corrle une prolifration cellulaire et un pronostic tumoral. La drgulation de lactivit de PLK1 contribue donc crer une instabilit gntique qui provoque une transformation oncognique. [N33]. Ces tudes ont rvl divers rsultats, et ont notamment montr que le knock down de PLK1 entranait une rduction de la prolifration cellulaire et une augmentation du phnomne dapoptose. Une analyse a t faite pour dmontrer que la rduction des niveaux de PLK1 tait corrle une diminution de la prolifration des cellules tumorales. Pour cela, une quipe de recherche chinoise a fait appel la technique du MMT. Selon cette mthode, on a mis en culture 4 * 103 cellules sur des plaques 96 puits. Aprs 24 heures, des siARN et des liposomes ont t transfectes dans ces cellules. A diffrents temps aprs la transfection (24, 48, 72, et 96 heures) du MTT 5g/L a t ajout. Les cellules ont t incubes pendant 4 heures, puis le milieu a t enlev. On a alors ajout 100 L de DMSO pendant 5 minutes. On a alors mesur labsorbance de la suspension cellulaire, 570 nm. Les rsultas obtenus 72

pour les diffrents temps ont permis de tracer des courbes de prolifration. Les rsultats ont montr que les cellules qui prsentent une inhibition de lexpression de PLK1 se divisent moins rapidement que les cellules contrle transfectes avec seulement des liposomes. (figure 51). [N32 ; N36; N37; N53].

Cellules transfectes avec seulement des liposomes Cellules transfectes avec un siARN dirig contre PLK1
Figure 51 : Effet du knock down de PLK1 sur la prolifration cellulaire. Sur cette figure, on peut voir clairement que si on ajoute le MTT aprs un temps suffisamment long suite la transfection, les cellules transfectes avec le siARN dirig contre PLK1 montrent un taux de prolifration infrieur celui des cellules contrle transfectes avec seulement des liposomes. [N32].

En parallle, il a aussi t dmontr que linhibition de lexpression de PLK1 rduisait la viabilit des cellules. Pour cela, on a transfect des vecteurs dexpression contenant le siARN dirig contre PLK1 dans des cellules HeLa. Les cellules ont ensuite t mises en culture pendant 48 heures. Aprs avoir vrifi par Western blot que linhibition de lexpression de PLK1 avait effectivement eu lieu, on a examin la viabilit des cellules contrle ou qui prsentent un knock down de PLK1. La transfection avec le vecteur contrle montre un trs faible effet sur la viabilit cellulaire alors que seulement 10% des cellules dont lexpression de PLK1 est teinte restent attaches aux botes de culture 6 jours aprs la transfection (figure 52). [N34 ;N35]

Figure 52 : PLK est ncessaire la survie cellulaire. Des cellules HeLa ont t transfectes avec un vecteur vide ou avec un vecteur contenant le siARN dirig contre PLK1. Pour dterminer la viabilit cellulaire, les cellules flottantes et les cellules adhrentes ont t rcupres, et comptes sparment. La viabilit a t calcule comme le pourcentage de cellules attaches au milieu par rapport au nombre total de cellules. [N34].

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Un autre type danalyse a permis de dmontrer que linhibition de lexpression de PLK1 entranait des changements dans le profil mitotique des cellules. Cette analyse a t effectue par immunofluorescence et microscopie confocale. Aprs transfection des cellules avec un vecteur vide ou contenant le siARN dirig contre PLK1, on a ralis des images des 5 tapes qui constituent la mitose. On ainsi pu observer une lgre diffrence dans les quantits et les pourcentages de cellules prsentant un phnotype mitotique entre les cellules contrle et les cellules transfectes avec le vecteur contenant le siARN dirig contre PLK1 (figure 53). I Cellules contrle 20 II 41 III 8 IV 15 V 1 Autre type 15 Total 100

Cellules avec knock down de PLK1

46

33

10

100

Figure 53 : Effet des siARN spcifiques de PLK1 sur le phnotype mitotique de cellules MKN45 Cette table montre la rpartition des cellules en cours de mitose entre les diffrentes phases de la mitose. On observe donc que les cellules qui prsentent un knock down de PLK1 saccumulent plutt en phase I et IV. En revanche, trs peu de ces cellules se trouvent en phase II ou III de la mitose. Il faut galement prciser que dans cette analyse, 233 cellules prsentant un knock down de PLK1 taient en cours de mitose contre 314 pour les cellules contrle. [N34].

Dans cette table de rsultats, on peut constater que plus de cellules avec knock down de PLK1 (46% contre 20%) se trouvent en phase I de la mitose. Cette phase est caractrise par la rupture de la membrane nuclaire et la rpartition des chromosomes dans le cytoplasme. En revanche, trs peu de cellules dont lexpression de PLK1 est teinte (1% contre 41%) se trouvent en phase II de la mitose. Cette deuxime phase est caractrise par le regroupement des chromosomes au niveau de la plaque quatoriale de la cellule. On observe aussi trs peu de cellules, que ce soit les cellules contrle ou pas (2% contre 8%) en phase III de la mitose, caractrise par la sgrgation chromatique. En revanche, des ponts cytoplasmiques entre deux cellules en cours de sparation ont t observs chez les cellules PLK (8% contre 1%). Ces rsultats semblent suggrer que lappariement des chromosomes au niveau de la plaque quatoriale de la cellule (phase II) et la sparation des chromosomes (phase III) soient altres au cours de la mitose dans des cellules MNK45 transfectes avec un siARN dirig contre PLK1. [N32]. Un rsultat complmentaire de celui-ci a t mis en vidence par microscopie confocale. Ainsi, on a pu observer, 3 jours aprs la transfection, trois populations cellulaires diffrentes : des cellules avec une structure chromatinienne normale, des cellules avec une structure chromatinienne en forme dhaltres, et des cellules avec de la chromatine fragmente (figure 54). Environ 31% des cellules qui prsentent un knock down de PLK1 prsentent une structure chromatinienne en forme dhaltres, contre moins de 1% pour les cellules contrle. Ce phnotype est du au fait que les chromatines soeurs sont incapables de se sparer compltement durant lanaphase.

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Figure 54 : Analyse de la structure chromatinienne de trois populations cellulaires diffrentes. Des cellules HeLa mises en culture ont t transfectes par un vecteur dexpression vide (contrle) ou contenant le siARN dirig contre PLK1. Trois jours aprs la transfection, les cellules ont t fixes et lADN a t color au 4,6-diamino-2-phenylindole. Trois images typiques ont t observes : A gauche : cellules prsentant une structure chromatinienne normale. Au centre : cellules prsentant une structure chromatinienne en forme dhaltres. A droite : cellules prsentant une chromatine fragmente. [N34].

Une autre analyse a permis de voir que le knock down de PLK1 augmentait de manire significative le phnomne dapoptose sur des cellules MKN45. En effet, on a pu caractriser les cellules PLK- en cous dapoptose avec de lAnnexin V. LAnnexin V est un agent qui reconnat spcifiquement la phosphatidyl srine, une protine externalise la surface cellulaire uniquement par les cellules en cours dapoptose. Les rsultats ont montr que le taux moyen dapoptose 48 heures et 72 heures aprs la transfection tait suprieur chez les cellules transfectes avec le siARN dirig contre PLK1, par rapport aux cellules contrle : 42,4% contre 21,4% et 53,8% contre32,9%. Ceci a galement t dmontr par des expriences de fluorescence. La coloration des noyaux au DAPI a rvl un nombre lev de cellules avec des noyaux en cours dapoptose. Il sagit des cellules MCF-7 qui ont t transfectes avec le siARN dirig contre PLK1. Des analyses par microscopie confocale ont montr en parallle que ces cellules prsentaient des membranes nuclaires dsintgres et une chromatine condense. Les tudes par FACS, ont quant elle mis en vidence des fragments dADN nuclaires sub-G1, caractristiques de cellules en cours dapoptose (environ 20% des cellules transfectes contre1% pour les cellules contrle) (figure 55). [N32 ; N35; N36].

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Figure 55 : Effet de la transfection de siARN dirigs contre PLK1 (siRNA4) sur lapoptose des cellules de cancer. A. Une coloration de lADN au DAPI (2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride) a t ralise sur des cellules MCF-7, 48 heures aprs la transfection avec un siARN dirig contre PLK1. Les images rvlent un phnotype apoptotique des cellules MCF-7 (indiqu par la flche blanche). B. Des analyses par microscopie confocale mettent en vidence les cellules MCF-7 apoptotiques qui prsentent des membranes nuclaires dsintgres et une chromatine condense. Les flches blanches indiquent les noyaux apoptotiques, tandis que les flches jaunes montrent les noyaux normaux.

[N36]. On a aussi pu montrer que le niveau dexpression des caspases 3 tait fortement augment dans des cellules qui prsentaient un knock down de PLK1. Ceci a t mis en vidence grce un Western blot, en utilisant des anticorps dirigs contre la caspase 3. La caspase 3 est une caspase excutrice de lapoptose, qui lorsquelle sactive conduit la mort de la cellule, par fragmentation des diffrents constituants intracellulaires. La caspase 3 sactive par clivage. Les Western blot ont donc aussi montr cette activation de la caspase 3 dans ces cellules, par clivage du long prcurseur protique (diminution du poids molculaire de la protine prcurseur). [N34]. 3.1.1.5. E6 et E7 E6 et E7 sont deux protines oncogniques exprimes fortement dans les cellules suite linfection par le papillomavirus. Linfection par ce virus induit la prolifration cellulaire par augmentation des taux de protines de la cellule hte. Les protines oncognes E6 et E7 jouent un rle important dans linduction de la carcinogense, en interfrant avec lactivit des protines rgulatrices de la cellule hte. [N50]. Les siARN conus pour teindre lexpression des oncognes E6 et E7 ciblent la rgion E7 de lARNm bicistronique contenant E6 et E7. On a observ les effets des siARN dirigs contre E7 sur les taux de rplication de lADN. Pour cela, des cellules ont t incubes avec 5 Ci de thymidine tritie/ml pendant 4 heures. Ces cellules ont ensuite t rcupres, puis laves lacide trichloractique, et lyses avec de la soude. La quantit de radioactivit incorpore dans lADN cellulaire a t mesure par scintigraphie. Les cellules ont t observes avant la transfection (contrle), et diffrents temps aprs la transfection. Les rsultats montrent que les cellules dont lexpression de E6 et E7 a t inhibe montrent un faible taux de rplication de lADN. La rduction est significative 4 jours aprs la transfection. Le taux de rplication de lADN dans ces cellules continue dcrotre pendant 76

les 12 jours qui suivent la transfection. Au bout de 12 jours dexprience, on atteint donc un taux de rplication gal 18% de celui des cellules contrle. Les siARN nont aucun effet sur la croissance des cellules de cancer cervical non infectes par le papillomavirus (figure 56).

Figure 56 : Effet des siARN dirigs contre E7 sur la synthse dADN La rplication de lADN a t mesure par incorporation de thymidine tritie dans des cellules HeLa infectes par le papillomavirus (cercles noirs) et dans des cellules contrle non infectes de type C33A (cercles blancs). Les mesures ont t faites avant et aprs transfection. Les coups par minute dans les cellules transfectes avec les siARN diriges contre E7 sont exprims en pourcentage des coups par minute dans les cellules contrle. [N38].

On a mis lhypothse que la rduction de la rplication de lADN observe sur les cellules transfectes tait srement due au dclenchement de la snescence ou lapoptose des cellules. Pour le dmontrer, des cellules transfectes avec le siARN dirig contre E7 ont t suivie pour leur viabilit, par coloration au trypan blue. On a pu observer que 97% des cellules (transfectes ou contrle) taient viables 14 jours aprs la transfection. Cette absence de mort cellulaire suggrerait que les cellules soient devenues snescentes. Cette hypothse a t confirme par des observations morphologiques des cellules transfectes qui ont rvl des changements caractristiques de cellules en tat de snescence. Ces changements sont visibles 6 7 jours aprs la transfection. Il apparat ainsi que les cellules transfectes avec le siARN dirig contre E7 sont plus grosses et plates que les cellules contrle. Elles sont trs souvent polynucles, et prsentent de longues projections cytoplasmiques. Elles sont galement plus disperses dans le milieu de culture (figure 57). [N38].

Figure 57 : Effet des siARN dirigs contre E7 sur la morphologie des cellules HeLa. Des cellules HeLa ont t transfectes avec des siARN contrle (A) ou dirigs contre E7 (B). Ces cellules ont ensuite t photographies, 14jours aprs la transfection. La barre dchelle reprsente 200 m. [N38].

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On a pu confirmer que les cellules transfectes taient devenues snescentes en dmontrant linduction de lexpression de Sa-gal. Pour cela, on a ainsi color la SenescenceAssociated -galactosidase. Cette protine a t caractrise comme tant un marqueur de la snescence des keratinocytes. On observe alors que la majorit des cellules transfectes avec le siARN dirig contre E7 montrent une intense coloration bleue. Ceci reflte des niveaux levs de Sa-gal. Au contraire, les cellules contrle ne montrent pas de coloration significative (figure 58). On a constat en parallle que les siARN spcifiques de E7 ninduisaient ni de changements morphologiques, ni de changements dans lactivit de Sa-gal dans des cellules qui nont pas t infectes par le virus, de type C33A. [N38].

Figure 58 : Les siARN dirigs contre E7 induisent lexpression de la SA-gal. Des cellules ont t transfectes avec un siARN contrle (B) ou dirig contre E7 (A). On a ensuite color ces cellules avec un agent qui reconnat spcifiquement la Sa-gal. Les cellules ont alors t photographie 12 jours aprs la transfection. La barra dchelle reprsente 200 m. [N38]. Une tude ralise trs rcemment (2006) a complt les informations dont on disposait

concernant les effets de linhibition de lexpression des oncognes E6 et E7, pat la mthode de lARN interfrence. Pour raliser des analyses in vivo, on sest donc servi de souris nude prsentant des cancers cervicaux. Des siARN dirigs contre E6 ont alors injects dans la cavit pritonale ou en sous-cutane, directement dans la tumeur. Lefficacit de ces siARN a t value par mesure de la rgression tumorale et par suivi de lapoptose des cellules tumorales. Les rsultats ont ainsi montr que le taux dapoptose des cellules CaSki 1, 2,5, ou 9 jours aprs la transfection tait de 7,7%, 11,8%, 37,4%, et 12 ,6%. Dautre part, ladministration de ces siARN induisait une inhibition significative de la croissance tumorale ainsi que la ncrose et lapoptose des cellules tumorales. [N39]. 3.1.1.6. Bcl2 Bcl-2 est une protine anti-apoptotique. Elle a pour fonction de se complexer avec des protines apoptotiques comme Bax ou APAF la caspase 9. Elle empcherait ainsi linitiation de la cascade dactivation des caspases, protines excutrices de lapoptose. Les cellules tumorales ont trs souvent des dfauts dans le contrle de la mort cellulaire et dans lapoptose. Ainsi, la surexpression dagents inhibiteurs de lapoptose, tels que Bcl-2 pourrait conduire une tumorigense. On a montr sur des diffrents types de cellules que les siARN dirigs contre Bcl-2 rduisaient effectivement lexpression de Bcl-2. Ceci a notamment t mis en vidence sur des cellules de mlanomes (A375). Ces cellules ont donc t transfectes avec 40nM de siARN dirigs contre Bcl-2 ou avec des siARN contrle. Les cellules ont t analyses 48 aprs la transfection, pour lexpression de la protine Bcl-2. Cette analyse a t faite par Western blot. Les rsultats ont montr que les siARN rduisaient lexpression de Bcl-2, un taux de plus de 60% (figure 59).

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Figure 59 : Les siARN spcifiquement dirigs contre Bcl-2 rduisent significativement lexpression de Bcl2 dans des cellules de mlanomes de type A375. Des siARN ciblant Bcl-2 et des siARN contrle (20-40nM) ont t ajouts un milieu de culture, avec un agent de transfection de type lipidique (Lipofectamine 2000, Invitrogen Inc). Les cellules ont t rcupres 48 heures aprs et des analyses par immnunoblot ont t effectues, en utilisant des anticorps spcifiques de Bcl-2. Un blot contrle a t effectu avec lactine pour vrifier que la quantit de protines charges sur le gel tait quivalente. Les rsultats montrent que les siARN inhibent effectivement lexpression de Bcl-2, un taux de 6090%. Trois expriences indpendantes ont t reproduites. [N42].

Plusieurs tudes ont t ralises pour tudier les effets de siARN dirigs contre Bcl2. Ainsi, trs rcemment, une quipe de recherche allemande a tudi de tels effets sur des cellules de cancer du pancras. Pour cela, 5 siARN diffrents ont t designs : Bcl 1, 3, 5, 8 et 11. 10 nm de ces siARN ont t transfects dans des cellules. On sest alors aperu que les siARN Bcl 1, 3, et 11 induisait un taux lev dapoptose dans les cellules YAP C, atteignant un maximum de 25,0%, 37,1%, et 15,4% respectivement, 120 heures aprs la transfection. La mise en vidence du phnomne dapoptose a t faite par caractrisation de fragments dADN nuclaires sub-G1.On a remarqu que ce niveau ntait pas augment si lon utilisait 100 nm de siARN au lieu de 10. Lapoptose reste trs faible aprs transfection des siARN Bcl 5 et 8 (8,6% et 4,5% respectivement). Aucun effet sur la mort cellulaire na t observ aprs transfection de siARN contrle (ne ciblant aucune squence endogne) (figure 60). [N42 ; N40].

Figure 60 : Induction de lapoptose par des siARN dirigs spcifiquement contre Bcl-2 dans des cellules de cancer du pancras. La figure reprsente les taux dapoptose mesurs par cytomtrie de flux aprs transfection de diffrents types de siARN dirigs contre Bcl-2. Les mesures ont t faites sur des cellules de carcinome de pancras de type DAN G, 120 heures aprs la transfection. Les valeurs indiques sont une moyenne des rsultats obtenus pour 3 expriences indpendantes. [N41].

On a suivi en parallle, les effets de siARN dirigs contre Bcl-2 sur le nombre de cellules de carcinomes de pancras, cest--dire sur la prolifration cellulaire. Les rsultats ont alors montr que tous les siARN spcifiques de Bcl-2 induisaient une rduction significative de

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la prolifration des cellules de type YAP C. Cet effet est plus prononc quand on utilise les siARN Bcl 3, 5, et 11 (rduction de plus de 70% par rapport aux cellules contrle). Dun autre ct, Bcl 1 et 8 rduisent la prolifration cellulaire denviron 50% (figure 61). La diminution de la viabilit cellulaire a t dtectable 24 heures aprs la transfection. [N41].

Figure 61 : Nombre relatif de cellules YAP C, 24 120 heures aprs la transfection des diffrents siARN. Le nombre absolu de cellules de trois expriences a t dtermin par coloration au trypan blue. Le nombre moyen de cellules contrle a t fix 100% comme rfrence. Le nombre moyen de cellules de chaque chantillon a t calcul et fix comme nombre relatif par rapport la rfrence. La figure reprsente donc la rduction de nombre relatif de cellules aprs transfection de 10 nM de siARN spcifiques de Bcl-2. [N41].

Dautre part, on a pu dmontrer lefficacit des siARN dirigs contre Bcl-2, in vivo. Ceci a t mis en vidence grce des souris nudes. Dans cette analyse 11 (pour Bcl-2) ou 8 (pour le contrle) souris nudes ont t transformes pour porter des modles xnografts de carcinomes de pancras humains. Ces souris ont t traites par injection quotidienne dans la cavit intra pritonale de siARN Bcl 5, de siARN contrle, ou de solution physiologique. Les souris ont survcu les 24 jours de traitement sans montrer de signes de toxicit quel que soit lorgane (pas darrt de la fonction hmatopotique dans la moelle osseuse, ni de ncrose au niveau du foie ou du rein). Il na pas non plus t observ de perte de poids significative, que ce soit chez les animaux traits ou non traits. Le volume tumoral moyen relative est de 519,1 mm3 chez le groupe ayant reu le siARN Bcl 5 contre 1.078,3 mm3 dans le groupe ayant reu le siARN contrle, et 1.307, 2 mm3 dans le groupe ayant reu la solution saline. Ceci reprsente donc une inhibition de 56% de la masse tumorale par rapport aux souris contrle ayant reu la solution de NaCl (figure 62). [N40].

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Figure 62 : Inhibition de la croissance de modles xnografts de cancers du pancreas sur souris nude par action de siARN dirigs contre Bcl-2. La taille de carcinomes pancratiques sous-cutans (xnografts) sur souris nude a t dtermine par des mesures quotidiennes. La figure reprsente le volume tumoral moyen danimaux traits par des injections quotidiennes de siARN Bcl 5 dans la cavit intra pritonale (200 g/kg). Deux contrles ont t effectus : injection de siARN contrle et de solution physiologique saline. [N40].

Ces dernires annes, il est apparu vident que la surexpression dagents inhibiteurs de lapoptose pouvait conduire une tumorigense et sans soute une rsistance aux agents chimiothrapeutiques. On a ainsi pu constater que Bcl-2 tait prsente des niveaux levs dans un grand nombre de cancers humains, incluant les mlanomes ou les carcinomes de la prostate. LApo2L/TRAIL est une protine trans-membranaire qui partage certaines homologies dans ses domaines extracellulaires avec des membres de la famille de TNF (Tumor Necrosis Factor). Linduction de lApo2L/TRAIL, en rponse lINF, est responsable de la mise en place de la cascade dactivation menant au processus d apoptose. Cependant, on a pu constater que la majorit des lignes de cellules de mlanomes prsentaient une certaine rsistance linduction de lapoptose par la protine Apo2L/TRAIL. Il est aussi apparu que la surexpression dinhibiteurs de lapoptose tels que Bcl-2 avait un rle dans cette rsistance. On a donc test si la down rgulation de tels inhibiteurs pouvait augmenter la sensibilit des cellules lApo2L/TRAIL. Les rsultats montrent que ces inhibiteurs de lapoptose jouent effectivement un rle dans linduction de la rsistance au ligand Apo2L/TRAIL conduisant lapoptose, cette rsistance tant reverse par down rgulation de lexpression de Bcl-2. [N42].

3.1.2. Silencing du VEGF ou de son rcepteur De nombreuses observations ont dmontr que la croissance tumorale tait trs dpendante de la capacit des tumeurs induire leur propre vascularisation. Cest le phnomne dangiogense tumorale. Il joue aussi un rle cl dans le dveloppement des mtastases. Cest ainsi que depuis quelques annes, plusieurs laboratoires ont dvelopp des molcules antiangiogniques, qui bloquent la prolifration des tumeurs, par inhibition de leur novascularisation. [N22]. Il existe naturellement dans le corps, des molcules antiangiogniques, comme la thrombospondine-1(TSP1) qui est produite par la tumeur elle-mme, mais aussi par les

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cellules normales. On peut se demander comment la tumeur va faire pour se dvelopper, si elle scrte elle-mme des facteurs visant sa rduction. En fait, les cellules tumorales scrtent une balance dinducteurs et dinhibiteurs de langiogense. Ainsi, la tumeur produit de grosse quantits dun agent spcifique : le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Il existe au moins 5 isoformes de VEGF, ayant des activits biologiques diffrentes. Il sagit dun facteur de croissance spcifique des cellules endothliales, qui induit leur migration et leur prolifration. Il va donc permettre le dveloppement dun nouvel arbre vasculaire au sein de la tumeur. Les quantits libres de ce facteur sont suffisantes pour contrebalancer et mme surpasser celles de linhibiteur TSP1. De plus, il a t dmontr que le VEGF-A augmentait la permabilit des vaisseaux, ce qui contribue aussi linduction de langiogense et la croissance tumorales. [N22, N23 ; N51]. De nombreuses tudes ont t menes, concernant linhibition de langiogense comme nouvelle thrapie anticancreuse cible (2601 rsultats trouvs en tapant sur PubMed les mots-cls angiogenesis inhibition AND cancer ). Lquipe de Florence CABON, par exemple, a beaucoup travaill sur ce sujet. Dans une tude publie en 2003, ils ont utilis un siARN dirig contre le VEGF, pour dclencher le mcanisme dARN interfrence. Les rsultats ont montr que les ces derniers inhibaient effectivement la production de VEGF et rduisaient la vascularisation et la croissance de ces tumeurs (figure 63). En parallle, ils ont pu dmontrer que ladministration de siARN ciblant le VEGF empchait lapparition de rsistance des cellules tumorales pour le facteur anti angiognique TSP1.

Figure 63 : Inhibition de la synthse du VEGF par transfection de siARN dirigs contre le VEGF. Des siARN contrle ou dirigs contre le VEGF ont t transfects dans des cellules cJ4 de fibrosarcomes de rat. Le VEGF scrts par les cellules a t quantifi dans le surnageant de culture aux temps indiqus aprs la transfection. Lexprience a t ralise trois fois, avec des rsultants similaires. Les valeurs sont exprimes en pourcentage par rapport aux cellules transfectes avec le siARN contrle. [N25]. : cellules non transfectes : cellules transfectes avec le siARN dirig contre le VEGF.

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Figure 64 : Etude du volume tumorale chez la souris. Un million de cellules cJ4 non transfectes ( ), transfectes avec un siARN contrle ( ), ou transfectes avec un siARN dirig contre le VEGF ( ) ont t injectes par administration systmique dans des souris nude. Il sagit de souris sans poils, athymiques (sans thymus). Le thymus tant le lieu de diffrenciation des cellules immunitaires, ces souris sont utiliss pour des expriences de greffes, puisquelles ne font pas de rejet. Le volume tumoral a t mesur pendant 12 jours aprs linjection. Pour les souris injectes avec des cellules non transfectes ( ), le volume tumoral passe de 0 1,5 cm3 en 12 jours. Pour les souris injectes avec des cellules transfectes avec un siARN contrle ( ), le volume tumoral est denviron 2 cm3 en fin dexprience. Enfin, pour les souris injectes avec un siARN ciblant le VEGF( ), le volume tumoral augmente moins rapidement : il passe de 0 0,5 cm3 en 12 jours. [N25].

Dans cette tude, il a galement t dmontr que les siARN et la TSP1 agissaient en synergie dans linhibition de la croissance tumorale (figure 64). Cette tude a ainsi permis de penser quil tait envisageable dutiliser les siARN in vivo, afin de maximiser les effets des traitement antiangiogniques utiliss lheure actuelle. De plus, cause de leurs effets transitoires in vivo, et de leur capacit pntrer dans les cellules tumorales quand ils sont injects par vois systmique, il serait ventuellement possible dutiliser les siARN de manire squentielle, pour cibler une aprs lautre, les diffrentes protines cls dans le dveloppement des cancers. Ceci permettrait alors de garder les tumeurs sous contrle . [N25]. De nombreuses autres recherches ont t faites sur le sujet, et ont montr des rsultats similaires. Ainsi, une tude mene tout rcemment (2006) a permis de voir que linjection de siARN dirigs contre le VEGF-A dans des cellules humaines de cancers du colon (ligne RKO) rduisait significativement lexpression du VEGF-A. Les rsultats ont en effet dmontr que les cellules transfectes prsentaient un knock-down de 94 % de lexpression du VEGF. Cette inhibition tait, de plus, corrle une diminution de 67 % de la prolifration cellulaire. [N26]. On peut donc tirer comme conclusion de ces tudes, que lutilisation de siRNA dirigs contre le VEGF constitue un outil de choix dans linhibition de langiogense tumorale et donc dans la lutte contre le cancer. Une tude a t ralise sur des cellules de sarcome humain dEwings TC71, qui surexpriment le VEGF. On a transfect ces cellules avec un vecteur dexpression contenant un siARN dirig contre le VEGF. On a lors observ une inhibition de 80% de lexpression de lisoforme VEGF 165, et une diminution de 98 % de la production de la protine VEGF. En revanche, on na observ aucun changement de lexpression du VEGF 189(figure 65). La

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transfection sest faite laide dun vecteur sous contrle du promoteur U6. Ladministration a t facilite par lutilisation dun agent de transfection : le polyethylenimine. 1 2 3 4

Figure 65 : Effet du siRNA ciblant le VEGF sur lexpression du VEGF Diffrents clones de cellules TC71 ont t transfects de manire stable avec diffrentes constructions dADN. Piste 1 : contrle ngatif. Il sagit de cellules TC71 qui nont t transfectes avec aucune construction dADN. Piste 2 : cellules transfectes avec un vecteur contrle. Piste 3 : clone cellulaire 7-1 transfect avec un vecteur contenant le siARN ciblant le VEGF. Piste 4 : clone cellulaires7-17 transfect avec un vecteur contenant le siARN ciblant le VEGF. Aprs transfection, les diffrents types cellulaires ont t isols. On alors mesur, par Western blot le niveau dexpression du VEGF165 et du VEGF 189 (niveaux dARNm). Les rsultats montrent que lexpression du VEGF 165, dans les clones 7-1 et 7-17 a t diminue de 75% et 80% respectivement, en comparaison avec les cellules sauvages ou transfectes avec un vecteur contrle. En revanche, lexpression du VEGF 189 na pas t altre. [N27].

Une autre exprience a t ralise par la mme quipe. Etant donn que les cellules TC71 expriment naturellement de grosses quantits de VEGF, ils sont partis du principe que les siARN spcifiques du VEGF devaient rduire leffet chimiotactique et mitognique du milieu de culture des cellules TC71 sur les cellules endothliales. Cest ainsi quils ont mesur la prolifration et la migration de cellules endothliales places dans un milieu de culture de diffrents types de cellules. Les rsultats ont montr que la prolifration et la migration des cellules endothliales places dans le milieu de culture des cellules transfectes avec le siARN ont t significativement rduites, par rapport aux cellules endothliales places dans un milieu optimum pour leur prolifration (figure 66). 1 2 3 4

Figure 66 : Effet du siARN dirig contre le VEGF sur la capacit du VEGF induire une migration des cellules endothliales. On a collect le surnageant de milieux de cultures de cellules TC71 non transfectes (1), transfectes avec un vecteur contrle (2) ou transfectes avec un vecteur dexpression contenant le siARN ciblant le VEGF (3, 4). On a ensuite test leur capacit induire une migration des cellules endothliales. La diffrence entre les pistes 3 et 4 est le type de clones cellulaire TC71. Les surnageants issus des cultures de cellules TC71 non transfectes ou transfectes avec un vecteur contrle induisent une forte migration des cellules endothliales. Au contraire, on observe peu de migration de la part des cellules endothliales quand elles sont places en prsence du milieu de culture des cellules transfectes avec un vecteur contenant le siARN dirig contre le VEGF. [N27].

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Cette quipe de recherche a galement ralises une injection de cellules transfectes dans des souris nude athymiques. Les rsultats ont alors montr que la croissance tumorale tait nettement rduite chez ces souris, en comparaison avec des souris injectes avec des cellules TC71 contrle. L encore, la densit en vaisseaux, dtermine par des analyses immunohistochimiques, a t grandement rduite. Des Western blot ont permis de montrer que le taux dexpression du VEGF 165 avait aussi diminu. Par cette tude, on a donc dmontr que le VEGF 165 joue un rle trs important dans la croissance des sarcomes de Ewings. Le taux de gurison pour les patients atteints de ce type de sarcome est bas, surtout pour les personnes sui prsentent de grosses tumeurs ou des tumeurs mtastases. Ce taux de survie est stagnant depuis 20 ans, malgr les traitements employs, savoir des doses agressives et intensives dagents chimiothrapeutiques, parfois mme combines des radiations, ou des actes chirurgicaux. Par consquent, lemploi de siARN dirigs contre le VEGF 165 pourrait constituer un rel espoir pour le traitement de ce type de cancers. [N27]. Malgr ces rsultats trs encouragent concernant lutilisation des siARN comme moyen dinhiber langiogense tumorale, en pratique, il reste encore quelques obstacles franchir pour rendre les expriences dARN interfrence optimum. En effet, actuellement, il reste toujours amliorer ladministration des siARN aux cellules cibles (les cellules cancreuses dans notre cas). Il faut aussi augmenter leur stabilit plasmatique et diminuer la stimulation non spcifique du systme immunitaire qui peut avoir lieu au cours des expriences dARN interfrence. Mais une quipe de recherche amricaine a commenc rsoudre ces problmes. Ainsi, en 2004, ils ont propos un modle de nano particules stabilises, adaptes aux siARN. Lassemblage de ces nano particules avec le siARN a t ralis avec un polymre RPP qui comprend trois domaines particuliers. Le PEI est un polycation qui va permettre lassemblage avec les siARN chargs ngativement Le PEG va apporter une stabilit plasmatique au complexe. Ce PEG a t conjugu avec un peptide RGD (Arg-Gly-Asp). Ce peptide va permettre la slectivit de ciblage pour les cellules tumorales. En effet, il va avoir la capacit de cibler les intgrines, pour lesquelles il est un ligand. Or, les intgrines sont exprimes au niveau des cellules endothliales en activit de prolifration, dans la vascularisation tumorale. (figure 67) Les interactions lectrostatiques entre le polymre cationique et le siARN charg ngativement vont entraner la formation dun gros complexe dune taille de 100 nm. Ce complexe est ainsi appel nanoplexe (en rfrence sa taille).

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Figure 67 : Design des nano particules. Cette figure reprsente la structure schmatique du polymre RPP. Ce polymre comprend 3 domaines fonctionnels, tous ncessaires pour obtenir un ciblage correct des cellules dintrt. Le PEI a un poids molculaire de 25 kDa (~ 581 acides amins). Il est utilis comme un polycation qui va permettre lassemblage avec les siARN charges ngativement. Le PEG a un poids molculaire moyen de 3,4 kDa (80 acides amins). Il permettra la stabilisation strique du complexe. Ce PEG est conjugu avec un peptide RGD, qui contient un pont disulfure entre 2 rsidus cystine. Il va apporter une slectivit pour les cellules tumorales. En effet, ce peptide va avoir la capacit de cibler les intgrines, pour lesquelles il est un ligand. Or, les intgrines sont exprimes au niveau des cellules endothliales en activit prolifratrice, dans la vascularisation tumorale. [N28].

Des tudes sur la stabilit plasmatique de ce complexe ont t ralises. On a ainsi compar cette stabilit dans le srum pour des siARN complexs avec le polymre RPP, ou pour des siARN libres, seulement entours dune solution aqueuse (solvats). Les rsultats ont alors montr que lincubation des siARN libres dans le srum avait pour effet une dgradation de ces oligonuclotides (diminution de la largeur de la bande sur le gel) aprs plusieurs heures. En revanche, il semblerait que les siARN complexs avec les nano particules soient protgs de cette dgradation pendant toute la dure de lexprience (24 heures). Ces rsultats suggrent donc que dans les cultures cellulaires, ou pour ladministration dans lanimal, les siARN sont exposs des nuclases plasmatiques, mais quils sont protgs de la dgradation pour des priodes assez longues (plus de 12 heures) si on les complexe avec des nano particules de type RPP. (Figure 68)

Figure 68 : Dgradation des siARN dans le srum La dgradation des siARN dans le srum a t mesure par un Western blot des nanoplexes RPP. Les rsultats sont compars avec les mmes siARN, mais qui ne sont pas complexs avec le polymre (free siRNA). Les siARN complexs ou libres ont t incubs dans du srum pendant des temps variables (de 0 24 heures). Ensuite, on a mesur par un gel dlectrophorse le taux de siARN intacts restants. Les rsultats montrent que les siARN complexs au polymre restent stables plus longtemps dans le srum. Dun autre ct, on voit que les bandes correspondent aux siARN libres diminuent avec le temps dincubation dans le srum. [N28].

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Une tude a t ralise pour voir si les siARN complexs aux nano particules taient plus susceptibles datteindre le tissu tumoral. Le complexe a t cr avec un siARN dirig contre le rcepteur au VEGF : VEGFR-2. Ladministration des siARN sest faite par une injection en intra-veineuse dans la tumeur de souris nude (neuroblastomes de type N2A). On a donc greff des molcules fluorescentes (FITC) sur les siARN pour pouvoir dterminer leur localisation tissulaire grce la microscopie fluorescence. On a ainsi compar les taux de fluorescence dans le poumon et dans le tissu tumoral. On a aussi compar ces taux pour des animaux ayant reu le siARN complex avec le polymre RPP, et pour des animaux ayant reu le siARN solvat (libre). On a constat que ladministration intraveineuse de siARN solvats ne produisait pas des niveaux de fluorescence levs au niveau de la tumeur. Ce taux de fluorescence est lgrement plus lev au niveau du poumon. Dun autre ct, les siARN complexs aux nano particules produisent des niveaux de fluorescence levs au niveau de la tumeur, mais ne semblent pas saccumuler au niveau du poumon. Ceci suggre donc que le polymre RPP rduit les interactions non spcifiques avec des tissus comme le poumon, par exemple, et favorise plutt laccumulation des siARN au niveau du tissu cible : la tumeur. Etant donn que le FITC (molcule fluorescente) est attache de faon covalente aux siARN, on est en droit de penser que la distribution de fluorescence observe dans les diffrents tissus correspond effectivement la distribution des siARN, et nest pas due une instabilit de la liaison du FITC. Les rsultats montrent donc que ladministration cible aux cellules tumorales dpend de la prsence du ligand complex au siARN. Le complexe sest rvle donc tre un trs bon moyen pour cibler la novascvularisation des tumeurs de souris, et donc inhiber le phnomne dangiogense tumorale. (Figure 69) [N28].

Figure 69 : Distribution tissulaire des siARN complexs. Des souris ont reu 40 g de siARN tiquets avec une molcule fluorescente par injection intra-veineuse. Ces siARN taient soit complexs avec le polymre RPP (colonne de gauche), soit seulement solvats (colonne de droite). Une heure aprs linjection, le poumon et le tissu tumoral de ces souris ont t dissqus et examins par microscopie fluorescence. Les photographies ont t prises aprs un mme temps dexposition la fluorescence des diffrents tissus. Les nanoplexes RPP montrent un niveau de fluorescence faible au niveau du poumon, avec une distribution ponctuelle (petits points verts). On observe aussi un niveau de fluorescence lev au niveau du tissu tumoral. Les niveaux de fluorescence aprs ladministration de siARN libres sont trs faibles, que ce soit dans le poumon ou dans la tumeur. [N28].

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Une administration intraveineuse a t ralise au niveau de la tumeur de souris. On a alors observ une absorption des siARN spcifiquement par les cellules constituant la tumeur. De plus, les siARN ont montr une rduction de lexpression de la protine VEGFR-2 spcifiquement au niveau de la tumeur. Cette diminution tait corrle avec une rduction de la croissance de la tumeur et du phnomne dangiogense (figure 70). Il semblerait de plus que les quelques vaisseaux visibles dans les tumeurs traites avec le siARN dirig contre le VEGFR-2 soient trs dsordonns et non hirarchiss. [N28].

Figure 70 : Inhibition de la croissance tumorale grce aux siARN ciblant le VEGFR-2 et compexs aux nano particules. A. inhibition de la croissance tumorale grce aux siARN complexs au polymre RPP. Des souris ont t inocules avec des cellules tumorales de type N2A, puis nont pas t traites ( ) ou ont t traites tous les 3 jours par une injection dans la tail vein de nanoplexes-RPP contenant le siLacZ ( ) ou bien avec le siVEGFR-2 ( ). Les doses taient de 40 g par souris. Le traitement a commenc lorsque les tumeurs sont devenues palpables (~ 20 mm3). Les rsultats montrent que seul le siARN dirig contre le VEGFR-2 diminue la croissance des tumeurs, alors que le siARN dirid contre LacZ naffecte pas le taux de croissance tumoral. B-D. no vascularisation des tumeurs traites avec diffrents siARN. Des tumeurs reprsentatives ont t excises la fin de cette exprience dinhibition de la croissance tumorale. Ces tumeurs ont t examines par microscopie. La trans-illumination des tumeurs et du tissu environnant montre une forte novascularisation chez les souris non traites (B) et chez les souris traites avec un nanoplexeRPP contenant le siLacZ (C). Au contraire, les souris traites avec le nanoplexe contenant le siVEGFR-2 montrent une faible novascularisation (D). E. expression du VEGFR-2 dans le tissu tumoral aprs traitement avec les diffrents complexes. Des tumeurs reprsentatives ont t rcupres en fin dexprience, et ont t homognises. Les niveaux dexpression du VEGFR-2 ont t mesurs par Western blot. Ligne 1 : tumeurs non traites. Ligne 2 : tumeurs traites avec le siARN dirig contre le VEGFR-2. Ligne 3 : tumeurs traites avec le siARN dirig contre LacZ. [N28].

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Ces rsultats ont donc prouv que le ciblage du tissu tumoral spcifiquement a t trs efficace, et ce, grce aux nano particules. Cette tude a ainsi lanc lide quil tait facilement possible damliorer ladministration tissu spcifique des siARN. [N28]. On pense aujourdhui au knock-down du VEGF surtout comme traitement anticancreux, pour les cancers fortement vasculariss, savoir les cancers mtastass du colon, ou bien le sarcome dEwings par exemple. 3.1.3. Silencing des tlomerases Les tlomerases sont des enzymes qui rparent les tlomres (extrmits des chromosomes). Ce sont en fait des reverse transcriptases qui ajoutent des squences dADN spcifiques lextrmit 3 des brins dADN. Cette squence ajoute est T T A G G G chez tous les vertbrs. La rgion tlomrique des chromosomes contient de lADN condens et rpliqu. Normalement, les tlomres seffritent au cours de la snescence (vieillissement). Les tlomerases sont donc impliqus dans le processus de cancrisation puisquelles permettent aux cellules de continuer vieillir et apportent un potentiel prolifratif. [N54]. Les tlomerases sont surexprims dans la plupart des cancers en phase avance. Des expriences base dARN interfrence et visant inhiber lactivit tlomerase ont t ralises sur diffrentes lignes cellulaires humaines. Une tude trs intressante ralise en 2005 par une quipe amricaine a apport de nombreuses informations concernant les tlomerases et leur inhibition comme moyen de lutter contre le cancer. Dans cette tude, on a commenc par mettre en vidence le knock down des tlomerases. Pour cela, des cellules SEG-1 dadnocarcinome de Barretts ont reu des siARN dirigs contre les tlomerases ou des siARN contrle. Sept jours aprs la transfection, ces cellules ont t rcupres, puis on a valu si les siARN avaient effectivement inhib lexpression des tlomerases. Cette analyse a t faite par Western blot, en utilisant un anticorps polyclonale reconnaissant spcifiquement les tlomerases. On a alors vu que lexpression des tlomerases dans les cellules traites avec le siARN spcifique des tlomerases tait rduite de plus de 95%, par comparaison avec les cellules traites avec les siARN contrle figure 71). [N43]

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Figure 71 : Effet des siARN dirigs spcifiquement contre les tlomerases sur lexpression des tlomerases dans des cellules SEG-1. Des siARN contrle (Cont) ou ciblant spcifiquement les tlomerases (Tel) ont t introduits dans des cellules SEG-1 dadnocarcinome de Barretts. Les cellules ont ensuite t analyses pour leur niveau dexpression en tlomerases, 7 jours aprs la transfection. Pour cela, on a utilis un anticorps polyclonal de lapin dirig contre la tlomerase. Cette figure reprsente donc lexpression relative en tlomerase dans des cellules contrle ou dans des cellules traites avec des siARN dirigs contre la tlomerase. On constate une diminution denviron 95% dans les cellules traites avec les siARN dirigs contre les tlomerases. [N43].

Une autre analyse a t effectue pour mettre en vidence linhibition de lactivit tlomerase. Ainsi, des cellules SEG-1 ont t traites avec des siARN ciblant spcifiquement les tlomerases (Tel), pendant diffrents temps. Lactivit tlomerases a alors t mesure par un test de type TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol). Pour cela, on utilise des primers labells avec un groupement fluorescent. Ces produits TRAP peuvent tre quantifis par un dtecteur de fluorescence. La mesure de lactivit des tlomerase a t effectue sur des lysats de cellules SEG-1 traites avec le siARN contrle ou ciblant les tlomerases. On observe alors une rduction de 77% environ de lactivit tlomerase dans les cellules ayant reu des siARN permettant le knock down des tlomerases. Dautre part, on observe une inhibition complte de lactivit tlomerases dans ces cellules, 3 jours aprs la transfection. En revanche, les siARN contrle nont pas deffets sur lactivit tlomerases des cellules SEG-1 (figure 72). [N43]

Figure 72 : Effet des siARN dirigs spcifiquement contre les tlomerases sur lactivit tlomerase dans des cellules SEG-1. Des cellules SEG-1 ont t traites avec des siARN contrle (Cont) ou dirigs spcifiquement contre les tlomerases (Tel). Les mesures de lactivit tlomerases ont t effectus 1, 3, et 5 jours aprs la transfection. Un test TRAP a t ralis sur des lysats cellulaires incubs 30 minutes 30C. Les produits de tlomerases gnrs par PCR ont t quantifis en utilisant un dtecteur de fluorescence. Lactivit tlomerase dans les cellules SEG1 traites avec des siARN contrle et dans les cellules ayant reues les siARN dirigs contre pour les jours 1, 3, et 5 est prsent en units TPG (Total Product Generated). [N43].

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En parallle, on a suivi linhibition de la croissance cellulaire suite lintroduction de siARN ciblant les tlomerases dans les cellules. Ainsi, des cellules SEG-1 ont t transfectes chaque semaine avec les 2 types de siARN (contrle ou non), puis le nombre de cellules a t compt. On a alors constat une nette rduction de la prolifration cellulaire aprs traitement avec le siARN ciblant les tlomerases. Le nombre de cellules na pas chang au cours des 7 premiers jours qui ont suivis la transfection. Aprs ces 7 jours, ce nombre a diminu de faon graduelle, jusqu atteindre un niveau de rduction de lordre de 80% au bout de 28 jours dexprience (figure 73). Les rsultats ont galement montr que lexposition de cellules normales (CRL7820) aux mmes siARN, pendant 4 semaines ne provoquait pas de changement sur la viabilit cellulaire.

Figure 73 : Effet de siARN ciblant les tlomerases sur la prolifration de cellules SEG-1. Des cellules SEG-1 dadnocarcinome de Barretts ont t transfectes avec des siARN contrle (cercles noirs) ou avec des siARN dirigs contre les tlomerases (triangles noirs). Ces cellules ont ensuite t mises en culture pendant 4 semaines. A la fin de chaque semaine de traitement, les cellules ont t rcupres, puis le nombre de cellules a t compt. [N43].

Lanalyse suivant a t le suivi de la longueur des tlomres, aprs lexposition pendant 3 semaines des cellules SEG-1 avec les siARN spcifiquement dirigs contre les tlomerases. La longueur des tlomres chromosomique a t dtermine par un test de type TelomereFISH (Fluorescent In Situ Hybridation). Dans ce test, les tlomres sont vus comme des petits points rouges, la fin de chaque chromosome. Les rsultats montrent que dans les cellules traites avec des siARN dirigs contre les tlomerases, 60% des chromosomes prsentent des extrmits tlomriques rodes. Il semblerait donc que lexposition des cellules SEG-1 aux siARN spcifiques des tlomerases pendant 3 semaines conduise une rduction marque de la longueur des tlomres (figure 74). [N43]

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Figure 74 : Rduction de la longueur des tlomres aprs traitement des cellules SEG-1 avec des siARN dirigs contre les tlomerases. A. Des cellules SEG-1 ont t transfectes avec des siARN contrle puis la longueur des tlomres a t dtermine par test FISH (Fluorescent In Situ Hybridation). Les tlomres, colors sur cette image sont visibles sur presque tous les chromosomes. B. Des cellules SEG-1 ont t transfectes avec des siARN spcifiques des tlomerases. Sur le test FISH, on voit que la majorit des chromosomes ne prsentent plus dextrmit tlomrique. De plus, les chromosomes qui possdent encore des tlomres prsentent un signal de faible intensit. Ceci est caractristique de tlomres de courte taille. C. des cellules SEG-1 ont t transfectes avec des siARN contrle (Cont) ou avec des siARN dirigs contre les tlomerases (Tel). Ces cellules ont t mises en culture pendant 3 semaines, puis lADN gnomique a t isol. La longueur moyenne des tlomres a t dtermine par hybridation southern. La taille moyenne des tlomres (TL : Telomere Length) pour chaque traitement est indique par les flches. [N43].

Il est noter que cette inhibition de lactivit tlomerase est associe une snescence des cellules. Ceci a t dmontr par suivi de lexpression de la -galactosidase, une protine caractristique des cellules en tat de snescence. Ainsi, dans cette analyse, la snescence est caractrise par une coloration bleue de cette enzyme. Cette coloration est visible dans 41% des cellules transfectes avec des siARN dirigs contre les tlomerases. On a aussi remarqu que les cellules en tat de snescence prsentaient une morphologie caractristique. Aucune cellule snescente na t observe dans le cas de cellules traites avec le siARN contrle, ou dans les cas de cellules normales, non cancreuses traites avec les 2 types de siARN (figure 75).

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Figure 75 : Effet de linhibition de lactivit tlomerase sur la snescence cellulaire. Des cellules SEG-1 ont t transfectes avec des siARN avec les 2 types de siARN et mises en culture pendant 3 semaines. Ces cellules ont ensuite t rinces au PBS, puis incubes toute une nuit en prsence de X-gal (le substrat de la -galactosidase). Lexpression de la -galactosidase a t suivie par microscopie fluorescence. I. cellules SEG-1 transfectes avec des siARN contrle II. cellules SEG-1 transfectes avec des siARN ciblant les tlomerases. III. morphologie caractristique de cellules en tat de snescence (ayant reu des siARN dirigs contre les tlomerases). [N43].

On a galement pu suivre linduction de lapoptose, suite au traitement avec des siARN. Ceci a pu tre mis en vidence par un marquage lannexin V, un marqueur de lapoptose. Les cellules traites avec des siARN spcifiques de tlomerases montrent un taux dapoptose de plus de 80%. En revanche, moins de 2% des cellules traites avec des siARN contrle dclenchent une apoptose spontane. Les cellules ayant reu les 2 types de siARN ont aussi t values pour leur niveau de PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase), une protine clive par la caspase 3 lors du phnomne dapoptose. Les fragments obtenus lors de ce clivage ont un poids molculaire de 89 et 24 kDa. Les rsultats montrent que PARP reste intact dans les cellules traites avec le contrle, avec seulement 2% de protines clives. Au contraire, dans les cellules ayant reu le siARN design contre les tlomerases, on compte prs de 55% de protines PARP clives (apparition dun fragment de 89 kDa). Ceci confirme donc linduction de lapoptose dans ces cellules, suite linhibition de lexpression des tlomerases (figure 76).

Figure 76 : Mise en vidence de lapoptose dans des cellules SEG-1 traites avec des siARN designs contre les tlomerases. Des cellules SEG-1 ont t transfectes avec des siARN contrle (Cont) ou ciblant les tlomerases (Tel), puis ont t mises en culture pendant 3 semaines. Le suivi de lapoptose a t ralis par mise en vidence du clivage de la protine PARP, un marqueur de lapoptose. PARP a t identifi par Western blot, en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirig contre PARP. [N43].

Pour inhiber lexpression des tlomerases, il est aussi possible de sattaquer une autre cible, savoir hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase). Il sagit de la sous

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unit catalytique des tlomerases. Cette reverse transcriptase est surexprime dans les cellules cancreuses notamment. Dans les cellules normales, son expression est normalement rprime par les diffrents suppresseurs de tumeurs intracellulaires. Plusieurs tudes se sont donc intresses cette sous unit protique. Une quipe chinoise a rcemment design 5 siARN dirigs contre hTERT. Aprs avoir vrifi lefficacit de silencing, ils ont tudi leffet de cette inhibition sur la croissance de cellules de carcinome hpatique humain (HepG2). Les rsultats ont prouv que les 5 siARN ciblant diffrentes rgions de lARNm cible montraient un effet inhibiteur sur la croissance de ces cellules. Cette inhibition est dose dpendante. [N44]. Une tude comparable a t effectue sur des cellules humaines VA13. Ces cellules ont t transfectes avec des lentivirus contenant linsert ciblant lARNm de hTERT. Le choix des cellules utilises sest port sur cette ligne car elles nexpriment naturellement pas hTERT. Ceci a donc permis de confirmer la spcificit de ciblage des ARNm de hTERT. Par consquent, une premire tape a consist transfecter ces cellules avec des vecteurs dexpression contenant la squence codant pour hTERT. Deux jours plus tard, les cellules ont reu des vecteurs exprimant les siARN ciblant les tlomerases. Ces siARN ont effectivement inhib lexpression d hTERT. On a pris soin de vrifier que cette rduction ntait pas due une diffrence dexpression des siARN dans les cellules. Ceci a t dmontr par Northern (contrle de quantit dARN). Une autre analyse a t mene pour tudier leffet des siARN sur la prolifration cellulaire. Un contrle a t fait avec un vecteur vide. Ceci a permis de vrifier que le vecteur en luimme ne provoquait pas de toxicit cellulaire. Les 2 types de vecteurs (vides ou avec insert) ont t transfects dans des cellules humaines de cancer du colon. Lefficacit dinfection du vecteur viral utilis a permis une valuation rapide des effets cellulaires. Les rsultats montrent que les siARN induisent effectivement une rapide inhibition de la croissance cellulaire (figure 77). [N46].

vecteur vide vecteur contenant le siARN dirig contre hTERT

Figure 77 : Inhibition de la croissance cellulaire induite par transfection des cellules avec un vecteur dexpression contenant le siARN dirig contre hTERT. Suivi de la croissance de cellules HCT116, infectes avec un vecteur viral vide ou contenant le siARN ciblant hTERT. Lefficacit de transfection est proche de 100%. Sur la figure, on voit que 14 jours aprs la transfection, le nombre de cellules traites avec le siARN dirig contre hTERT est de 20.000, alors quil est de 45.000 environ pour les cellules contrle traites avec le vecteur vide. [N46].

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Lanalyse suivant avait pour but de montrer que linhibition de lexpression de hTERT ninduisait pas de changements dans la structure de lADN. La premire tape a t de vrifier si lon observait un dcoiffage de lextrmit des chromosomes. De prcdents rsultats dtudes avaient en effet montr que la dpltion des tlomerases dans des levures avait entran un raccourcissement des tlomres qui passait par une tape de dcoiffage de lextrmit des chromosomes. Le dcoiffage des tlomres, caus par diffrents types de perturbations est dtectable par suivi des dommages de lADN. Ce genre danalyse peut tre effectu par immunofluorescence. On a ainsi vu que dans les cellules traites avec des siARN dirigs contre hTERT, aucun dcoiffage et aucun raccourcissement des tlomres navait lieu. Ce rsultat est en contradiction avec les preuves de dcoiffage qui ont lieu lors de dommages lADN, et qui conduisent la snescence cellulaire. Il semblerait donc que les siARN spcifiques de HTERT ninduisent pas de snescence dans les cellules traites. Par consquent, linhibition des tlomrases pourrait retarder la croissance des cellules tumorales avant de raccourcir la longueur des tlomres. [N46] . Etant donn que les effets des siARN ciblant hTERT ne passent pas par une tape de dcoiffage des extrmits chromosomiques ou par un raccourcissement des tlomres, on a essay de voir si on pouvait observer une modification de lexpression gnique dans la cellule qui pourrait expliquer les changements de croissance cellulaire. On a ainsi observ que linhibition de lexpression des tlomerases entranait une rapide modulation du profil dexpression gnique dans les cellules cancreuses. Cette analyse a t faite sur des cellules HCT116, 5 jours aprs la transfection. Aprs de nombreuses expriences, on a pu conclure que linhibition de lactivit tlomerase induisait des changements dans les profils dexpression de 73 gnes diffrents. Certains de ces gnes down rguls sont impliqus dans le cycle cellulaire, comme cest le cas par exemple de la cycline G2 ou de Cdc27. Dautres gnes jouent un rle important dans la croissance tumorale, dans le mcanisme dangiogense, ou encore dans le processus de mtastase. On peut citer par exemple les gnes codant pour lintgrine V ou pour le proto-oncogne Met. Sachant que lexpression du gne de la cycline G2 est inhibe suite lextinction de lactivit tlomerase, lquipe sest alors propos de vrifier de tels effets sur le taux de croissance cellulaire. Il est maintenant tabli que lexpression des cyclines, et notamment celle de la cycline G2 est module au cours du cycle cellulaire, et montre un pic au moment de la phase S. Il semblerait que ces cycles dexpression concident avec la synthse des tlomres au cours du cycle cellulaire. On a donc vrifi le lien qui pouvait exister entre niveau dexpression de la cycline G2 et taux de prolifration cellulaire. Cette analyse a t ralise sur des fibroblastes humains, cellules qui expriment normalement de trs faibles niveaux de tlomerases. La conclusion tire de cette analyse est que la down rgulation de la cycline G2 joue un rle important dans linhibition de la croissance cellulaire induite par lexpression de siARN dirigs contre la sous unit catalytique des tlomerases. [N46]. A ce jour, lutilisation de lARN interfrence pour traiter le cancer, nest envisageable quen combinaison avec les thrapies anti-cancreuses classiques, savoir les chimiothrapies traditionnelles. On pourrait galement penser la technique dARN interfrence pour cibler des gnes responsables de la rsistance que dveloppent les cellules cancreuses face aux agents chimiothrapeutiques. En effet, la multi rsistance aux composs administrs en chimiothrapies est un vnement non ngligeable, puisqu ce jour, 20 50% des traitements chimiothrapeutiques chouent pour cette raison. Les tudes ont montr que pour la plupart des checs, lagent responsable est une protine qui est surexprime dans les cellules cancreuses : la P-glycoprotine. Il sagit du

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produit du gne MDR1. Cette protine empcherait lagent de pntrer lintrieur de la cellule malade. Des expriences dinhibition de cette protine ont t ralises en utilisant des shARN. Ces constructions avaient pour cible le gne humain MDR1. Ces expriences ont montr une trs bonne efficacit et une spcificit du ciblage, in vivo. Linhibition de cette protine dans les cellules transfectes de manire stable a t suivie par Western blot. On a donc vu quelle tait associe un rtablissement de la sensibilit des cellules vis--vis de divers agents cytotoxiques utiliss en chimiothrapies tels que la vincristine, la paclitaxel, ou la doxorubicine. [N48 ; N49 ; N47]. 3.1.4. Silencing de p53 (et protines associes) Jusquici toutes les utilisations dARNi prsentes avaient pour but dinhiber des protines oncogniques ou responsables de la croissance tumorale. En gnral, ces protines sont surexprimes et leur inhibition entrane une baisse des caractres cancreux. Le gne p53 est un gne suppresseur de tumeur, il a donc pour but, quand il nest pas altr de rparer ou dliminer les lsions menant vers un processus de cancrisation. Les mutations de se gne sont frquemment rencontres en cas de cancer, et lorganisme ne peut alors plus se dfendre contre les lsions induisant le dveloppement de cancer. Lapproche de p53 par ARNi constitue donc une tude particulire par rapport aux autres. De simples recherches rapides sur le cancer et lARNi nous on montr que des tudes de ce type avaient t faites. Nous avons donc dcid de nous intresser au gne p53 et aux expriences dARNi pouvant tre pratiques en vue dune amlioration des traitements anticancreux. Le gne p53, nomm daprs la masse molculaire de son produit protique, est considr par plusieurs auteurs comme tant peut tre le gne le plus important du cancer de lHomme . Ce gne dit suppresseur de tumeur prsente en effet une mutation dans prs de la moiti des cancers chez lHomme.

Figure 78 : Frquences de mutation de p53 dans le cancer du poumon et dans les autres cancers (donnes : IARC p53 database). Les mutations sont classes par type : transitions ou transversions affectant les paires de bases G : C ou A : T. abrviations : C to T = transitions de GC a AT ; G to T = transversion de GC a TA ; A to C = transversion de AT a CG ; A to G = transition de AT GC ; A to T = transversion de AT a TA ; Other = insertions, dltions et mutations complexes. [M20].

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Il faut noter limportance de la frquence de mutations, mais aussi la diversit des types de mutations (figure 78). Les mutations du gne p53 sont trs tudies, en fonction de diffrents facteurs environnementaux et des diffrents types de cancers dans lesquels la mutation est observe. [M20]. Pourquoi p53 est-il si critique ? La rponse cette interrogation rside dans sa triple implication : le contrle du cycle cellulaire, lapoptose, lentretien de la stabilit gntique, Ces trois points reprsentent tous les aspects du rle fondamental de la protine p53 dans la protection de lorganisme vis--vis des lsions et troubles cellulaires. On trouve trs peu de protine p53 dans la plupart des cellules du corps dans les conditions normales. En fait, p53 nest pas ncessaire au dveloppement normal : des souris transgniques qui prsentent une inactivation totale des deux copies du gne sont tout a fait normales sauf sur un point : elle dveloppent gnralement des cancers vers lage de trois mois. Ces observations suggrent que p53 a peut tre une fonction ncessaire seulement de faon occasionnelle ou dans des circonstances particulires. En effet lorsque les cellules normales sont prives doxygne ou exposes a des traitements qui endommagent lADN, comme la lumire Ultra Violet ou les rayons , elles augmentent leur concentration en protine p53 par le ralentissement de la vitesse normale rapide de dgradation de cette molcule. La rponse par p53 sobserve galement dans les cellules o des oncognes, comme Ras et c-Myc sont actifs, et engendrent un stimulus anormal de division cellulaire. [M21]. Dans tous les cas, la forte concentration en protine p53 agit pour limiter le mal qui a t fait (activation doncognes, forte agression cancrigne extrieure). En fonction des circonstances et de la gravit des lsions, p53 peut soit entraner la cellule lse ou mutante a sengager dans un suicide par apoptose, vnement relativement peu nuisible pour lorganisme multicellulaire, soit dclencher un mcanisme qui interdit a la cellule de se diviser tant que la lsion nest pas rpare. Cette protection fournie par p53 est une partie important de la raison qui explique pourquoi les mutations qui activent les oncognes comme Ras c-Myc ne suffisent pas en elle-mme engendrer des tumeurs. De manire trs rgulire, des mutations sont responsables de lactivation doncognes et de transformations de cellules normales en cellules a caractre cancreux. Cependant, chez un patient sain, ce type de cellules est reconnu et contrls par divers facteurs ; ces cellules sont alors rpares ou limines par apoptose par des facteurs suppresseurs de tumeurs tels que p53. Chez un patient atteint dun cancer, ces mcanismes de contrle des cellules anormales (devenues mutantes ou oncogniques) est insuffisant, de par son altration ou une altration des mcanismes environnants trop importante. La protine p53 exerce ses effets sur le cycle cellulaire au moins en partie par sa fixation a lADN qui induit la transcription de p21, un gne rgulateur dont la protine se fixe sur des facteurs du ncessaires a lentre en phase S et a la progression dans cette phase. La protine p21 bloque lactivit kinase ces complexes du et empche ainsi la cellule dentrer en phase S et de rpliquer son ADN. Les cellules dficientes en protine p53 ne montrent pas ces rponses. Elles ont tendance chapper lapoptose et, si leur ADN est endommag, par radiation ou par certains autres incidents, elles continuent se diviser et plongent dans la rplication de lADN sans sarrter pour rparer les cassures ou autres lsions dADN provoques par les dommages. Il sen suit

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quelles peuvent soit mourir, soit, ce qui est encore plus grave, survivre et prolifrer avec un gnome endommag. Une des consquences frquentes est la fragmentation de ses chromosomes qui se runissent ensuite mal, et engendrent, par le biais de cycles supplmentaires de division cellulaire, un gnome de plus en plus dsorganis (figure 79). [M21].

Figure 79 : Mcanismes par lesquels la rplication de l'ADN ls peut conduire des anomalies chromosomiques, une amplification gnique et une perte de gne. Ce schma montre un des nombreux mcanismes possibles. Le processus commence par une lsion accidentelle de lADN dans une cellule dpourvue de protine p53 fonctionnelle. Au lieu de sarrter au point de contrle du cycle de division dpendant de p53, o une cellule normale avec un ADN ls sarrterait jusqu' ce quelle ait rpar la lsion, la cellule dficiente en p53 entre en phase S avec les consquences montres. Une fois quun chromosome porteur dune duplication et dpourvu de tlomre a t engendr, des cycles rpts de rplication, fusion de chromatide et coupure ingale (ce quon appelle le cycle cassure-fusion-pontage) peuvent augmenter encore plus le nombre de copies de la rgion duplique. La slection en faveur de cellules dotes dun nombre suprieur de copies dun gne dans la rgion chromosomique affecte conduit ainsi des mutants dans lesquels le gne est amplifi par un grand nombre de copies. Les multiples copies finiront par tre visible dans le chromosome sous forme dune rgion de teinture homogne ou pourront, soit par un vnement de recombinaison, soit par une cassure non rpare des brins dADN, tre excises de leur locus dorigine et apparatre ainsi sous forme de chromosomes minuscules doubles indpendants. Cette anomalie chromosomique peut aussi conduire une perte de gnes avec une slection en faveur des cellules qui ont perdu les suppresseurs de tumeurs. [M21].

Ce chaos chromosomique peut conduire la fois la perte de gnes suppresseurs de tumeurs et lactivation doncognes, par amplification gnique par exemple. Cette amplification gnique est un mcanisme important dactivation des oncognes, mais elle peut aussi permettre aux cellules de dvelopper une rsistance aux mdicaments utiliss en thrapeutique. En conclusion, on peut retenir que p53 aide lorganisme multicellulaire a faire face aux lsions de lADN e aux autres vnements cellulaires sans lui nuire, et agit en rfrnant la prolifration cellulaire dans les circonstances ou elle savre dangereuse. Beaucoup de cellules cancreuses contiennent de grandes quantit de protine p53 mutante (ou dune varit sans effet), ce qui suggre que les accidents gntiques quelles ont subi, ou le stress de leur croissance dans un environnement inappropri, ont engendr des signaux qui normalement mettent en jeu la protine p53. La perte de lactivit de p53 peut donc tre trois fois plus dangereuse du point de vue du cancer. Dabord, elle permet aux cellules mutantes dfectueuses de poursuivre leur avance dans le cycle cellulaire. Deuximement, elle leur permet dchapper lapoptose. Troisimement, elle conduit

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une instabilit gntique, caractristique des cellules cancreuses, en permettant aux cellules daccumuler dautres mutations qui favorisent le cancer lorsquelles se divisent. Beaucoup dautres mutations peuvent contribuer lun ou lautre de ces types de mauvais comportement, mais les mutations de p53 contribuent aux trois. [M21]. Par ltude de deux articles, nous allons voir deux approches diffrentes dans lesquelles les auteurs formulent lhypothse dune amlioration des thrapies anticancreuse. La premire cible la protine p53 directement par ARNi, la deuxime utilise lARNi sur certaines protines dans des cellules ou p53 est dfectueux. Des expriences dARNi sont faites sur un grand nombre de gnes impliqus dans le cancer. On trouve ainsi des tudes dinhibition de p53 par ARNi dans les articles rfrencs dans PubMed. Lutilisation de la mthode dARNi est limite dans les applications entre autre par la ncessit de gnrer un silencing long terme in vivo. De nombreuses quipes de recherche tentent dlaborer des stratgies afin de contourner ce problme. Dans un article de novembre 2005, des auteurs expliquent les stratgies utilises pour cela. Des rtrovirus et des lentivirus portant des ARNi ont ainsi t dvelopps. Dans cette tude, lquipe dcrit deux systmes rtroviraux codant pour des shARN. Ces shARN sont placs sous le contrle du promoteur H1 (promoteur humain). Le gne cibl est le gne p53. Linsertion du shARN dans les vecteurs rtroviraux ncessite quelques modifications de ces vecteurs. Ils subissent des dltions pour une meilleure adaptation au transport dARNi contre le gne p53 humain. Le promoteur est ensuite insr ainsi que le gne. (figure 80).

Figure 80 : Drivation de pXSN et pXRN pour aboutir aux vecteurs rtroviraux pLXSN et pLXRN respectivement. La dltion se fait par lutilisation denzymes de restriction appropries.

Les auteurs mettent en vidence linhibition de p53 par des analyses de Western Blot.

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Figure 81 : Diffrents niveaux dexpression du gne p53 dans des cellules 293-T. A : analyse Western Blot de lexpression de la protine p53 dans les cellules 293-T. le GADPH est utilis comme contrle. B : analyse de linhibition de lexpression de p53 par les vecteurs pXSN et pXRN avec le promoteur H1. Lignes 1 3 : cellules infectes par pXSN contenant H1 et le sh ARN ; ligne 4 et 5 : cellules contrles non infectes par un virus ; lignes 6 8 : cellules infectes par pXRN contenant H1 et le sh ARN.

Ces analyses montrent que les deux systmes rtroviraux inhibent de manire largement significative lexpression de p53 dans les cellules infectes en comparaison aux cellules contrles (figure 81). Les auteurs concluent de ces manipulations et rsultats que les vecteurs rtroviraux servant de mdiateurs aux ARNi dans le systme de transduction utilis peuvent inactiver de manire stable le gne p53 pour une longue priode. Las auteurs comparent leurs techniques celles utilisant des shARN situs en aval du promoteur U6. Ils constatent que le shARN activ par H1 rduit de manire spectaculaire lexpression de p53. Lefficacit de linhibition de p53 est pratiquement identique pour lun ou lautre des promoteurs. Les rsultats montrent que le vecteur rtroviral porteur dARNi pourrait tre un outil utile dans la gnomique fonctionnelle et la thrapie gnique. En conclusion de cet article, on note que pour faciliter linhibition stable et long terme dans les cellules (considres rfractaires aux techniques de transfert de gne), les auteurs conoivent un systme de vecteur rtroviral qui permet de vhiculer les ARNi. Les auteurs signalent que le dveloppement de systme souple de vecteurs rtroviraux permet de mettre au point un silencing par ARNi solide et a haute efficacit au sein dune large varit de lignes cellulaires. Le dveloppement de vecteurs de siARN appropris peut finalement avoir dimportantes applications (que nous avons dj cites dans le rapport). Bien quils ne soient pas dans tous les cas les vecteurs les plus appropris, les vecteurs rtroviraux montrent des avantages suprieurs dans certaines conditions pathologiques. Les vecteurs viraux combins des ARNi peuvent fournir des outils utiles pour lucider la fonction des gnes par lanalyse des phnotypes dans lesquels lexpression du gne a t inhibe. Cet article montre la possibilit et lexistence dexpriences dARNi sur le produit protique du gne p53. Cependant, mme si les auteurs formulent le terme dapplication, il

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ne montre pas lintrt de linhibition de p53 dans les cancers. En effet, p53 est un suppresseur de tumeurs, il parait donc aberrant de vouloir linhiber dans des cellules cancreuses. Cependant, si ce gne est mut dans un cancer, il peut tre intressant dinhibe la forme altre. La thrapie gnique intervient alors par ladministration dun gne p53 sain. Les auteurs semblent supposer que la combinaison de linhibition de la forme mutante par ARNi (alors spcifique de la forme mutante uniquement) et ladministration du gne normal pourrait constituer une thrapie efficace. Mas ceci ne reste quune supposition, lapplication de telles ides faisant toujours apparatre de nouveaux obstacles.

Dans un second article, des auteurs partent dun fait connu : p53 est souvent mut chez les patients atteints dun cancer de la prostate, spcialement un stade avanc de la maladie. Par consquent, llimination slective de la forme mutante de p53 a probablement un impact sur les traitements anti cancreux. Comme p53 a un rle important sur les points de contrle du cycle cellulaire, on peut sattendre ce que la modulation des voies de ces points de contrle puisse sensibiliser les cellules dfectueuses pour p53 a la chimiothrapie tout en prservant les cellules saines. [M23]. Pour vrifier cette ide, les chercheurs ont inhib le gne mut ataxia telangiectasia (ATM) par ARNi dans des cellules cancreuses prostatiques et dans des fibroblastes humains normaux (IRM90). [M23]. Linhibition de ATM dans les cellules dans lesquelles p53 est dfectueux (PC3) a acclr la transition du cycle cellulaire, augmentant lactivit E2F et lexpression dun antigne nuclaire de prolifration cellulaire (PCNA), et a compromis les points contrles du cycle cellulaire, qui sont normalement induits par une altration de lADN. En consquence, les cellules PC3 sont sensibilises aux effets mortels de la doxorubicine, une drogue altrant lADN. La combinaison de linhibition dATM avec un ihnibiteur de Chk1 (UCN-01) augmente la sensibilit la doxorubicine dans ces cellules. Au contraire, la mme stratgie ne sensibilise pas les cellules IMR90 ou dautres lignes cellulaires cancreuses prostatiques (LNCaP), dans lesquelles p53 nest pas altr. Toutefois, les cellules IMR90 et LNCaP deviennent plus sensibles la doxorubicine (ou cette drogue couple a linhibiteur UCN-01) quand les fonctions de p53 et ATM sont supprimes. De plus, linhibition de rgulateur du point G et de Chk1 sensibilise les cellules PC3 (ou p53 est dfectueux) a la doxorubicine. [M23]. Lensemble de ces donnes soutient le concept de l'limination slective des cellules mutantes pour p53 en combinant des substances chimiothrapeutiques avec des inhibiteurs de point de contrle et suggrent une nouvelle perspective dans la faon dont un tel traitement peut slectivement tuer des cellules de tumeur. [M23]. Nous avons choisi de ne pas dtailler dans notre prsentation de larticle tous les effets des manipulations effectues sur diverses molcules, car cela dpasse notre sujet. A la fin de ltude les auteurs proposent un mcanisme expliquant laugmentation de la sensibilit (figure 82).

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Figure 82 : Modle pour expliquer laugmentation de la sensibilit aux chimiotoxines aprs inhibition de la protine ATM dans les cellules dfectueuses pour p53. Les cellules sans p53 et ATM combinent des dfauts de point de contrle et une activit leve dE2F une augmentation synergique des fonctions des PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ; ceci sexplique par une inhibition dATM et une expression faible de p21, cause des mutations de p53. le mcanisme daugmentation de PCNA (aprs inhibition de ATM) est inconnu mais il pourrait impliquer E2F. lactivit de E2F peut augmenter en raison de lactivit leve de Cdk2-cyclinE rsultant des dfauts des deux influences inhibitrices. [M23].

Cet article montre une analogie avec les thrapies anti cancreuses cibles tudies au premier semestre. En effet la combinaison de lutilisation de lARNi avec la chimiothrapie permet une amlioration de lefficacit des traitements. Seuls les cancers montrant une mutation de p53 sont cibls, mais il faut noter quils reprsentent une grande partie des cancers. Ces deux articles montrent un espoir de thrapie par ARNi en visant les cellules dans lesquelles p53 est mut, ce qui reprsente selon la littrature plus de 50% des cancers. Cette approche est diffrente de celles vues avec les oncognes ou le VEGF (surexprims ou constitutifs actifs dans les cancers), et montre donc ltendue des applications possibles de lARNi dans le traitement es cancers, mme si celui-ci ne reste encore quhypothtique.

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3.2. Le VIH
Le VIH (virus de limmunodficience humaine) est un rtrovirus, cest--dire un virus ARN, et responsable du SIDA (syndrome de limmunodficience acquise). En 1983, une quipe de chercheurs dirige par Luc Montagnier linstitut Pasteur dcouvre le virus provoquant le SIDA et dcide de lappeler LAV pour Lymphadenopathy-Associated Virus [GC1]. Un an plus tard, une quipe amricaine mene par Robert Gallo confirme cette dcouverte mais la renomme HTLV-III pour Human T Lymphotropic Virus type III [GC2]. En 1986, les noms franais et amricain sont abandonns et le nom de HIV (Human Immunodeficiency Virus) est adopt. Le HIV est un lentivirus appartenant la famille des retroviridae. De nombreuses espces sont infectes par les lentivirus. Ceux-ci provoquent gnralement des maladies de longue dure associes une longue priode dincubation. [GC3]. Deux souches ont t dcouvertes : le VIH-1, qui est considr comme une pandmie, aprs avoir infect 40 millions de personnes, et le VIH-2, moins virulent et retrouv principalement en Afrique de lOuest. La forme HIV-1 a volu partir dun SIV (Simian Immunodeficiency Virus) retrouv chez les chimpanzs. Fin 2004, lUNAIDS (Joint United Nations Programme on HIV and AIDS) estimait quenviron 40 millions de personnes taient infectes par le VIH. Actuellement, on estime que 28 millions de personnes sont mortes du SIDA.

Figure 83 : Micrographie reprsentant le bourgeonnement du VIH dans les cultures de lymphocytes. [GC11].

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3.2.1. Gnralits Structure du VIH

Figure 84 : coupe schmatique du VIH. Le VIH est de forme sphrique et comporte une enveloppe et une capside. Cette capside renferme diffrentes protines, des enzymes, de linformation gntique. [GC4].

Le VIH possde une structure diffrente de celle des autres rtrovirus dcrits. Il fait environ 120 nm diamtre et est de forme sphrique. Il est compos de deux copies dARN simple brin inclus dans une capside comprenant la protine virale p24, typique des lentivirus. Le virus est dlimit par une membrane plasmique. (Figure 84). Le brin dARN est troitement li aux protines de la nuclocapside comme p7 et aux enzymes indispensables au dveloppement du virion, comme la reverse transcriptase et lintgrase. Les nuclocapsides p7 et p6 sassocient lARN gnomique et protgent lARN de la dgradation par les nuclases. Une matrice compose de protines p17 entoure la capside, assurant lintgrit du virion. Vif, Vpr, Nef, p7 et des protases sont incluses dans le virion. Lenveloppe est forme quand la capside bourgeonne, arrachant la membrane cellulaire. Lenveloppe incluse les glycoprotines gp120 et gp141. Organisation du gnome

Figure 85 : Organisation du gnome du VIH. Il comporte des gnes codant pour des protines structurales et des gnes accessoires qui du VIH. Ces gnes aident le VIH entrer dans la cellule hte et favorisent sa prolifration. Ces gnes, except tev, existent chez toutes les formes connues du VIH. [GC4].

Le gnome du VIH comporte plusieurs gnes majeurs codant pour des protines structurales retrouves chez les rtrovirus et dautres gnes accessoires qui sont spcifiques du VIH.

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Le gne gag (Group-specific Antigen) fournit linfrastructure physique basique du virus et code pour p24, p6, p7 et p17. Le gne pol permet au virus de se reproduire et code pour les enzymes virales, notamment la reverse transcriptase, lintgrase et la protase. Le gne env code pour les prcurseurs de gp120 et gp41, des protines prsentes dans lenveloppe virale qui permet au virus de sattacher et de fusionner avec les cellules cibles. Les gnes tat, rev, nef, vif, vpr, vpu codent chacun pour la protine du mme nom. Le gne tev est le rsultat de la fusion des gnes tat, env et rev et il code pour une protine ayant des proprits de Tat. Ces gnes aident le VIH entrer dans la cellule hte et favorisent sa prolifration. Bien quils puissent tre muts et altrs, ces gnes, except tev, existent chez toutes les formes connues du VIH. (Figure 85). Cycle de rplication du VIH Les cellules cibles du VIH sont essentiellement les lymphocytes T CD4+. Dans une proportion plus faible, les cellules cibles du VIH sont galement les macrophages, cellules dendritiques, cellules de Langerhans et les cellules microgliales crbrales. La rplication virale peut se faire dans de nombreux tissus : les ganglions lymphatiques, lintestin, le cerveauLes organes lymphodes tels les ganglions lymphatiques constituent les principaux sites de rplication du virus. La rplication du virus peut tre dcoupe en 12 tapes : La premire tape est la fixation du VIH sur la cellule T4. Cela repose sur la reconnaissance entre les protines de surface virales, les gp120 et les gp41, et les rcepteurs de la cellule cible. Linteraction entre la glycoprotine gp120 et le rcepteur CD4 provoque un changement conformationnel de gp120. La boucle V3 de gp 120 est expose ce qui permet la liaison avec un rcepteur aux cytokines (CCR5 ou CXCR4). Ces co-rcepteurs spcifiques de la cellule infecte permettent la reconnaissance du VIH par la cellule : ce sont les CCR5 pour les macrophages, les CXCR4 pour les LT4. Les macrophages et le LT4 ont tous deux le rcepteur CD4. Cette reconnaissance est ncessaire pour lentre du virus dans la cellule. Sans corcepteurs, la fusion na pas lieu. (Figure 86).

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Figure 86 : Fixation du VIH sur la cellule cible. Le VIH se fixe sur la cellule cible grce des interactions entre une glycoprotine appartenant au VIH, gp120, et le rcepteur CD4 prsent la surface de la cellule cible. Grce des molcules co-rceptrices, la cellule hte peut reconnatre le virus. [GC53].

La deuxime tape est la pntration du VIH dans la cellule par endocytose. Aprs avoir t reconnu par les rcepteurs de la cellule, le VIH entre dans celle-ci. La membrane lipidique et la membrane cellulaire fusionnent, afin que le matriel gntique du virus pntre dans la cellule. [GC5 ; GC6]. La dcapsidation est une tape intermdiaire au cours de laquelle le virus se spare de ses deux capsides protectrices. Les ARNm sont alors sans protection et prts pour ltape suivante. Au cours de la transcription rverse, chaque ARN viral est associ une enzyme, la RT polymrase. Elle a pour fonction dassurer la formation dun brin transcrit dADN de lARN viral. Les ADN monobrins forms vont sassocier pour former une molcule dADN provirale . Lintgration est ltape o lADN franchit la paroi nuclaire grce une endonuclase. Quand il est lintrieur du noyau, lADN se circularise et sinsert dans le programme gntique de la cellule grce une intgrase. Cest la phase latente du cycle. [GC33]. LARN polymrase spare les deux brins dADN et il y a formation dun ARNm viral. Pour activer la production de virus, la prsence de certains facteurs de transcription dans la cellule est ncessaire. Lun de ces facteurs est Nf-B qui est prsent une fois que les cellules T ont t actives. LARNm obtenu est constitu dintrons et dexons. Il va tre piss pour pouvoir tre traduit. La production du virus est rgule. Les morceaux dARN produisent les protines rgulatrices Tat (qui favorise la production de nouveaux virus) et Rev. L'accumulation de Rev inhibe lpissage de lARNm. Les protines structurales Gag et Env sont produites partir de lARNm complet. LARNm sorti du noyau est lu par les ribosomes du rticulum endoplasmique. Il y a alors traduction de cet ARNm. Les polypeptides forms ne sont pas fonctionnels, ils vont donc subir une maturation dans lappareil de Golgi. Une protase se charge de terminer la fabrication des protines ncessaires la fabrication de nouveaux virus VIH (protines de

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lenveloppe, enzymes). Les polypeptides se polymrisent entre eux et forment des polyprotines. Ensuite, des protases les scindent pour former diffrentes protines constitutives du virus. Ces diffrentes protines vont sassembler pour former de nouveaux virions. Des ARN proviraux rejoignent les enzymes virales. Les protines sassemblent et tout cela forme la capside. Cest la phase dassemblage. La glycoprotine Env (gp160) traverse le RE et est transporte vers le Golgi o elle est clive par des protases et incorpore dans les deux glycoprotines gp41 et gp120. Elles sont transportes la membrane plasmique de la cellule hte. Gag (p55) et Gag-Pol (p160) sassocient la membrane plasmique. Le bourgeonnement est la dernire tape : le capside sort de la cellule infecte en arrachant une partie de la membrane cellulaire. Le virus va alors infecter de nouvelles cellules. [GC4]. (Figure 87)

Figure 87 : Cycle de rplication du VIH. Linteraction gp120-CD4 permet la reconnaissance du virus par la cellule hte. Il y a pntration du virus dans la cellule par fusion des membranes. Puis lARN viral est rverse transcrit en ADN qui se rplique et sintgre dans le gnome de la cellule. LADN est ensuite transcrit en ARN viral, qui sort du noyau. Il y a alors traduction donc formation de protines virales. Puis, le virus bourgeonne et libre des virions hors de la cellule. [GC4].

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Fonction des protines p24, p6, p7, p17 : ces protines sont codes par gag et fournissent les lments structuraux du virus : p24 ralise la capside virale, p6 et p7 permet la formation dune nuclocapside et p17 fournit une matrice protectrice. Lorsquon ralise un Western Blot pour dtecter une infection par le VIH, p24 est lune des trois protines majeures testes, avec gp120 et gp41. Reverse transcriptase: enzyme qui transcrit lARN en ADN. Tous les rtrovirus ont une reverse transcriptase, permettant linformation gntique dtre intgre dans le gnome de la cellule hte. Cette enzyme a un fort taux derreur (environ 1 erreur toutes les 2000 bases) lorsquelle transcrit lARN en ADN. Ce taux lev permet aux rtrovirus de muter rapidement. Intgrase : lintgrase du VIH est une protine de 32 kD produite partir de lextrmit C-terminale du produit du gne pol. Elle contient 3 domaines : un domaine N-terminal en doigt de zinc responsable de la multimrisation, un domaine catalytique central et un domaine de liaison lADN en position C-terminale. Elle est responsable de lintgration de lADN proviral dans le gnome hte, essentielle la rplication virale. De plus, elle reprsente une cible potentielle pour des mdicaments anti-VIH. En novembre 2005, une tude en phase 2 concernant un inhibiteur de lintgrase a dmontr que cet inhibiteur, MK-0518, possdait une activit antivirale potentielle. La socit Merck envisage dentreprendre des tudes cliniques plus pousses. Protase : il sagit dune enzyme qui permet de cliver les protines en plusieurs fragments. Les gnes gag et pol du VIH ne produisent pas leurs protines dans leur forme finale. La protase spcifique du VIH clive ces protines en plusieurs units fonctionnelles. Gp 120 : cest une glycoprotine expose la surface de lenveloppe du VIH. Elle est ancre dans la membrane virale par des liaisons non-covalentes ainsi que gp41. Ces deux glycoprotines viennent de gp160. Gp120 infecte une cellule cible ayant un rcepteur CD4, particulirement les cellules T helper , en se liant ce rcepteur CD4. La structure de gp120 implique un domaine externe, un domaine interne et un domaine transmembranaire. Gp120 forme une sorte de coiffe pour gp41 et cela forme une sous-unit gp120/gp41. Cette coiffe empche la rponse immunitaire humaine de reconnatre le virus. Quand le virus doit se lier la cellule, gp120 change de conformation trs rapidement. Gp41 : elle fournit la seconde tape dentre du virus dans la cellule. Quand gp120 lie un rcepteur CD4, elle change de conformation exposant ainsi gp41 ce qui permet de fusionner avec la cellule hte. Tat : cest une protine de 86 101 acides amins (cela dpend du sous-type). Elle aide le VIH prolifrer en compensant les dfauts du gnome : lARN viral possde initialement une structure en pingle cheveux qui empche la transcription. Cependant, un petit nombre de transcrits seront forms, ce qui permet la production de la protine Tat. Tat se lie ensuite des facteurs cellulaires quelle phosphoryle, liminant leffet de la structure en pingle cheveux de lARN. Cela permet alors la 108

transcription de lADN viral. Tat semble jouer un rle plus direct dans le processus du VIH. La protine est libre par les cellules infectes et est retrouve dans le sang des patients infects par le VIH-1. Elle peut tre capte par les cellules non infectes et agir directement comme une toxine provoquant la mort cellulaire par apoptose des lymphocytes T. On progresse alors vers le stade SIDA. [CG7, CG9, GC33]. Rev : cette protine permet aux fragments dARN du VIH qui contiennent des lments de rponse de Rev (RRE) dtre exports du noyau dans le cytoplasme. En absence du gne rev, lpissage de lARN dans le noyau est si important que seules les protines rgulatrices les plus petites peuvent tre produites. En prsence de rev, lARN est export dans le cytoplasme avant quil puisse tre piss, ce qui permet la production des protines structurales. [CG7, GC33]. Nef : son expression prcoce dans le cycle de vie du virus assure lactivation des cellules T et ltablissement dun tat dinfection persistent. Nef permet la survie des cellules infectes en down rgulant lexpression de plusieurs molcules de surface importantes dans la fonction immunitaire de lhte. Cela inclut le complexe majeur dhistocompatibilit (CMH) de classe 1 et 2 prsents sur la cellule prsentatrice de lantigne et les cellules cibles ; cela inclut galement CD4 et Cd28 prsents sur les cellules T CD4+. [GC31]. Vif : cest une protine de 23 kD, essentielle pour la rplication virale mme si son rle exact est mal connu. Cependant, il est clair que Vif aide le virus infecter dautres cellules aprs avoir quitt la cellule hte. Vif semble inhiber une protine cellulaire qui modifie lADNc. Il empche cette protine appele APOBEC3G dentrer dans le virion. En labsence de Vif, APOBEC3G cause une hypermutation du gnome viral. APOBEC3G est donc un dfenseur de lhte face linfection rtrovirale. [CG7, GC31]. Vpr : Elle appartient une classe de protines appeles protines accessoires, que lon pensait ne pas tre indispensable pour la rplication du virus. En effet, les virus muts ou dlests de Vpr se rpliquaient bien dans les cellules T transformes. Cependant, des publications ont rvl plusieurs fonctions importantes assures par Vpr, et qui sont critiques pour la rplication du VIH in vivo. Cette protine de 10 kD joue un rle important dans la rgulation de limport nuclaire du VIH et est ncessaire pour la rplication du virus des cellules non en division. Elle induit galement un arrt du cycle cellulaire dans les cellules qui prolifrent, ce qui peut rsulter dune dysfonction immune. [CG8]. Vpr stimule la transcription du virus, et rgule lactivation et lapoptose des cellules infectes. Ces diverses fonctions sont mdies par linteraction de Vpr avec diffrentes protines cellulaires. [GC31] Vpu : il est impliqu dans le bourgeonnement du virus, favorisant la libration des virions. Deux activits distinctes ont t associes son expression. Vpu semble faciliter la libration des protines Gag. Cette fonction est assure par la protine Env pour le VIH2, qui ne possde pas le gne vpu. La seconde activit de Vpu est la capacit mdier la dgradation de CD4. Ces deux activits sont rgules par ltat de phosphorylation de la protine. La phosphorylation de Vpu est absolument ncessaire pour la dgradation de CD4 mais moins importante pour faciliter la libration de virions. [GC31].

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Transmission Trois voies principales de transmission du virus ont t identifies : Voie sexuelle : la majorit des infections par le VIH se sont effectues par des rapports sexuels non protgs. La transmission par cette voie est possible par contact entre les scrtions gnitales dune personne avec les muqueuses rectales, anales ou orales du partenaire. Voie sanguine : ce mode de transmission comprend les transmissions par voie intraveineuse et les transfusions sanguines. Voie maternelle : la transmission du virus de la mre lenfant peut arriver in utero durant les dernires semaines de la grossesse et la naissance de lenfant. Elle intervient lorsque l'intgrit du cordon ombilical est compromise. En labsence de traitement, le taux de transmission est de 25%. Cependant, avec traitement et par csarienne, ce taux a t rduit 1%. Le lait maternel prsente aussi un risque dinfection pour le bb. [GC4]. Le VIH a t trouv de trs faibles concentrations dans la salive, les larmes et lurine des personnes infectes mais le risque de transmission par ces scrtions est ngligeable. Lutilisation de prservatifs reste le seul moyen de prvention du VIH. Physiopathologie Infection primaire : ds linfection le virus se rplique activement dans l'organisme. Cette priode de rplication rapide suit immdiatement linfection par le virus. Durant cette phase, 80 90% des individus dveloppent un syndrome prsentant les mmes symptmes que ceux de la grippe, savoir de la fivre, maux de tte, pharyngite, malaises Environ 3 semaines aprs la transmission du VIH-1, une rponse spcifique apparat et provoque une sroconversion. Cette rplication se stabilise aprs quelques semaines un niveau plus ou moins important selon les sujets. [GC4]. Le systme immunitaire hyperactiv compense partiellement la destruction massive des lymphocytes T CD4+ en augmentant leur production. Cette forte rponse immunitaire rduit le nombre de particules virales, ce qui marque le dbut de la phase latente. Cependant, l'infection persiste, ce qui a pour consquence l'mergence et/ou la slection de virus mutants qui chappent la rponse immunitaire de l'hte. Les lymphocytes T CD4+ se renouvellent rapidement malgr leur destruction par le virus, jusqu' ce que l'puisement des organes lymphodes centraux (thymus) ne permette plus leur rgnration. Les lymphocytes T CD4+ sont dtruits cause de leur hyperactivation et non par une action directe du VIH. La dure de la phase latente peut varier entre 3 semaines et 20 ans. [GC4, GC32]. Aprs 10-15 ans d'volution spontane sans traitement, le sujet est immunodprim (stade sida), des pathologies infectieuses ou tumorales rares (dites opportunistes) surviennent et conduisent au dcs. [GC32] (Figure 88).

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Figure 88 : Physiopathologie du VIH. Ce graphique reprsente lvolution du nombre dARN viral et de lymphocytes T CD4+ aprs infection. Aprs infection, le nombre de LT4 diminue trs rapidement, paralllement laugmentation de VIH. Puis, lors dune phase latente, la progression du VIH car les cellules T rsistent. Cette phase peut durer plus ou moins longtemps. Puis le stock en cellules T spuisent et leur nombre diminue. Cela permet au VIH de progresser et les sujets sont victimes de maladies opportunistes car leur systme immunitaire est affaibli. Cest le stade SIDA. [GC4].

Actuellement, les traitements anti-rtroviraux empchent l'volution vers le stade Sida en maintenant une immunit correcte du sujet. L'efficacit des traitements antiviraux est value en mesurant : le niveau de rplication du virus. Cette rplication est mesure par la charge virale VIH (cest--dire le taux d'ARN plasmatique) ; le taux de lymphocytes T CD4+ (immunodpression) ; l'tat clinique du patient. Traitements En 2006, une vingtaine de mdicaments anti-rtroviraux sont disponibles. Ils agissent sur les enzymes ncessaires la rplication du virus (blocage de la transcriptase, de la protase, de sa fixation sur la cellule...) et sur les mcanismes dentre du virus dans la cellule. Ils permettent donc de contrler la rplication virale. Cependant, ils ne permettent pas llimination du virus. On constate de plus de nombreux effets indsirables. Il existe diffrents types de mdicaments : Les inhibiteurs de la reverse transcriptase : ils bloquent la synthse dADN proviral partir de lARN viral. - Les inhibiteurs nuclosidiques (INTI) : ce sont des analogues de bases nucliques. Ils constituent la premire classe danti-rtroviraux et ont t mis sur le march en 1985. Il sagit de la zidovudine (AZT), la didanosine, la zalcitabine, la stavudine, la lamivudine, lavacavir et lemtricitabine. Ils ncessitent pour tre actifs d"tre phosphoryls dans le milieu intra-cellulaire. Ils rentrent ensuite en comptition avec les substrats naturels de la reverse transcriptase et inhibent l"action de cette dernire. Ils bloquent ainsi la fabrication d"ADN pro-viral. Les mutations de la reverse transcriptase procurent aux INTI une rsistance. [CG10].

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Les inhibiteurs non nuclosidiques (INNTI) : ce sont des inhibiteurs puissants et slectifs de la reverse transcriptase. Il sagit de la nevirapine et de lefavirenz. Ils ne sont actifs que sur la forme VIH-1. - Les analogues nuclotidiques : il sagit du tnofovir, mis sur le march en 2002. Les inhibiteurs de protases : cest une classe d'anti-rtroviraux mise sur le march en 1996. Ces mdicaments agissent en bloquant l'action de la protase virale. Les virions sont alors incapables d'infecter de nouvelles cellules. Les inhibiteurs de protases sont actifs sur le VIH-1 et le VIH-2, et ne crent pas de rsistance croise avec les INTI ou les INNTI.. Les inhibiteurs de fusion et dentre : plusieurs produits sont ltude. Lenfuvirtide est actuellement sur le march. Il agit en empchant la fusion entre le virus et la cellule-cible par inhibition comptitive.

Le choix thrapeutique varie selon le patient, le stade de la maladie On peut administrer diffrentes thrapies : Trithrapie : elle est utilise en fonction du stade clinique, du taux de LT CD4+ et de la charge virale. Le traitement comprend en gnral deux inhibiteurs nuclosidiques de la reverse transcriptase et un inhibiteur des protases ou parfois un troisime inhibiteur nuclosidique de la reverse transcriptase (trithrapie). Le traitement anti-rtroviral est dbut lorsque les sujets manifestent des signes cliniques d'immunodpression ou lorsque le taux de lymphocytes T CD4+ est infrieur 200/L. [GC4]. 3.2.2. Silencer les gnes du VIH De nombreux laboratoires cherchent de nouveaux moyens pour combattre le VIH. Des tudes rcentes indiquent que le virus peut tre bloqu si lon silence ses gnes. En effet, en liminant des protines ncessaires son dveloppement, le virus est incapable de se propager. Lavantage de lARNi est que plusieurs protines sont des cibles potentielles de silencing. En effet, on peut envisager de silencer des protines importantes pour lentre du virus dans la cellule ou de perturber le cycle de vie du virus dans la cellule. Linconvnient est que la slection des cibles est difficile et que le VIH mute trs rapidement. Ainsi, une squence cible peut devenir inutile en peu de temps. Certaines protines du VIH ont t silences. Cest par exemple le cas de la protine p24 qui est une protine structurale majeure et de CD4. [GC11]. Cette stratgie altre le virus dans la cellule infecte et limite sa prolifration et linfection de cellules saines. Ainsi, la production de nouveaux virus et lapparition de nouvelles infections sont inhibes. On peut agir diffrents niveaux en silencant diverses protines impliques dans : - lentre du VIH dans la cellule ; - la rplication du VIH dans la cellule ; - la libration et la propagation du virus. Enfin, on a constat un mcanisme de rsistance lARNi de la part du VIH.

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3.2.2.1. Silencing de gnes impliqus dans lentre du VIH dans la cellule Pour voir si les siARN pouvaient inhiber lentre du VIH, lquipe de Carl D. Novina, entre autres, a cibl le principal rcepteur permettant lentre du virus dans les cellules, savoir la molcule CD4. Les cellules drives de la ligne de HeLa, les Magi-CCR5, expriment des rcepteurs au CD4, les CXCR4 et CCR5. Ces cellules ont t utilises pour montrer la capacit des siARN supprimer lentre de HIV-1. Pour cela, elles ont t transfectes ou non par diffrents siARN : des siARN spcifiques de CD4, le brin anti-sens de CD4, des siARN contrles. Lquipe de Novina a utilis la mthode de cytomtrie de flux une dimension pour compter le nombre de cellules qui expriment le CD4. Il a t que remarqu que seule la transfection des siARN CD4 spcifiques permet de rduire de 75% lexpression de CD4, alors que les autres transfections nont pas affect lexpression de la protine (qui avoisine dans les trois autres cas les 100%). Le principe de lARNi est donc utilisable pour rguler lentre du VIH mais les siARN transfects doivent tre extrmement spcifiques. [GC12]. (Figure 89).

Figure 89 : Inhibition de lexpression de CD4 par son siARN spcifique. Une tude par cytromtrie de flux permet de mesurer lexpression de CD4. Lorsque les cellules sont transfectes avec un siARN ciblant spcifiquement CD4, on voit que lexpression de cette cible natteint que 27% alors que dans les tmoins elle est de quasiment 100%. [GC12]

Par la suite, une mesure par Northern Blot du taux dARNm CD4 permet de confirmer que seul le siARN spcifique de CD4 diminue lexpression de CD4 en dtruisant directement son ARNm. En effet, lors des transfections autres que celle avec siARN CD4, la quantit dARNm codant pour CD4 nest absolument pas diminue. Alors quavec le siARN CD4, il ny a quasiment plus aucune prsence de cet ARNm dans les cellules. Ce dernier siARN permet donc de stopper lentre du virus, le VIH, en supprimant lexpression de CD4 sur la membrane des cellules ; le VIH na plus de signal pour reconnatre la cellule et donc il ne peut en aucun cas sy fixer pour y pntrer. (Figure 90).

Figure 90 : Destruction de lARNm CD4 via les siARN CD4. Le taux dARNm CD4 est quantifi dans des cellules HeLa contrles (1), ou des cellules non transfectes (2), transfectes par les siARN CD4 (3), par les asARN CD4 (4), par un siARN contrle (5). Lactine est utilise comme contrle de charge. Seul le puits 1 non infect et le puits 3 nont pas dARNm codant pour CD4. [GC12]

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Afin de mieux visualiser lentre du virus dans les cellules, une protine chimre VIHgal a t construite. Les cellules Magi-CCR5 ont intgr un gne codant pour la galactosidase. Celui-ci est exprim aprs la rgion LTR (Long Terminal Repeat), on aboutit donc une squence VIH-LTR-gal. La prsence de virus dans la cellule a t mise en vidence grce une coloration. La coloration rvle que le virus a pu pntrer lintrieur de la cellule. On remarque, l encore, que seul le siARN ciblant spcifiquement le CD4 a un effet inhibiteur sur lentre du virus, les autres transfections (4 et 5) nont pas deffet inhibiteur sur lentre du virus tant donn que la coloration est aussi intense que le contrle (2). Nanmoins, il y a des limites ; il faut constater que laction du siARN nest pas totale puisquil persiste quelques colorations, il narrive qu grandement diminuer lentre du VIH au sein de la cellule. [GC12]

Figure 91 : Mise en vidence de la prsence du VIH par coloration. Les transfections, hormis celle avec LES siARN CD4, rvlent une forte coloration, synonyme dune infection de nombreuses cellules. En revanche, avec le siARN spcifique, seules deux cellules sont contamines. [GC12]

Aprs stre intress au silencing de molcules permettant lentre du pathogne dans les cellules, on peut envisager le silencing de gnes impliqus dans la rplication du VIH. 3.2.2.2. Silencing de gnes impliqus dans la rplication du VIH Si le virus parvient pntrer dans la cellule, il va tenter de se rpliquer. Une autre mthode, pour viter la propagation du virus et ainsi le tuer, est dempcher sa rplication ; il faut silencer les gnes impliqus dans la rplication : le gne gag permet linfrastructure physique du virus. Les gnes tat et rev codent chacun pour la protine du mme nom. Ces protines sont impliques dans la prolifration du virus. On peut aussi cibler les gnes nef, vif, vpr. Ces gnes aident le VIH entrer dans la cellule hte et favorisent sa prolifration. On peut silencer des squences de rcepteurs pour empcher la prolifration du virus. On peut tout dabord sintresser au silencing de Tat et Rev. Tat et Rev sont deux protines du VIH. Des scientifiques ont cherch les parties non chevauchantes des squences codantes de Tat et Rev pour fabriquer des siARN appropris. Ces squences ont t choisies comme cibles des siARN. (Figure 92).

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Figure 92 : Les siARN inhibent lexpression des protines cibles. A. reprsentation schmatique dune partie du gnome du VIH. Les exons Tat et Rev sont reprsents par des rectangles noirs et gris respectivement. La structure des siARN spcifiques de Tat et Rev est reprsente. Les rsidus encadrs ont t muts pour tre utiliss comme contrle. B. les siARN dirigs contre Tat et Rev inhibent spcifiquement lexpression de ces protines. Des cellules humaines 293T ont t cotransfectes avec 50ng de pcTat et pcRev en labsence doligonuclotides dARN (N), ou en prsence de 0,1 M doligonuclotides antisens (AS), ou encore en prsence de 0,1M de duplexes de siARN (Si). Les lysats cellulaires ont t prpars 60h aprs la transfection et lexpression des protines a t dtermine par Western Blot avec des anticorps anti-Tat ou anti-Rev. Un contrle a t ralis avec la protine endogne TAP/NXF-1. [GC14].

Pour contrler si les siARN dirigs contre les squences de Tat et Rev bloquaient spcifiquement lexpression de Tat et Rev, les chercheurs ont transfect des cellules 293T avec des constructions pcTat et pcRev. Ces plasmides exprimant les ADNc contiennent exclusivement les squences codantes de Tat ou Rev (Figure 92A). Les cellules ont t cotransfectes avec des siARN ou comme contrle avec des ARN antisens. La figure 92B montre des analyses par Western Blot qui montrent que les siARN spcifiques de Tat bloquent lexpression de cette protine mais naffectent pas celle dune protine cellulaire irrelevante Tap. De mme, les siARN spcifiques de Rev bloquent slectivement son expression. LARN antisens seul nexerce pas deffet. [GC14]. (Figure 92). Dans certaines expriences on remarque un lger effet des siARN anti-Rev sur lexpression de Tat ou inversement. Cela peut tre d un effet inhibiteur non-spcifique, ou bien les siARN rduisent lefficacit de la transfection. Nanmoins, il est clair que les siARN peuvent bloquer spcifiquement lexpression des protines Tat ou Rev dans les cellules 293T. [GC14].

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On peut ensuite chercher dterminer si ces siARN bloquent galement la fonction des protines. Tat sert dactivateur spcifique de la transcription des gnes en se liant une squence cible spcifique appele TAR. La figure 93A montre que la protine Tat exprime sous le contrle du promoteur du cytomgalovirus (CMV) ou de la rgion LTR du VIH peut augmenter fortement lactivit de la chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Cette activation est potentiellement inhibe par la cotransfection des siARN mais pas par la cotransfection dARN sens ou antisens seul. Cette inhibition est spcifique : en effet, lactivation par la protine Tat du virus dimmunodficience bovin (bTat) avec le promoteur contenant TAR nest pas affecte. [GC14]. La figure 93B montre que les siARN dirigs contre la protine Rev peuvent galement bloquer de faon spcifique la fonction de Rev dans les cellules 293T. Dans cette exprience, on utilise une construction appele pDM128/RRE qui contient un ARNm dans lequel le gne cat gne et llment de rponse de Rev sont squestrs. Cet ARN est normalement incapable de quitter le noyau mais peut tre export dans le cytoplasme et exprim en prsence de Rev (facteur nuclaire dexportation). Linduction est bloque par le siARN spcifique de Rev mais pas par lARN sens ou antisens. De plus, cette inhibition est spcifique puisque que le siARN anti-Rev ninhibe pas lexpression de lARNm cat non piss cod par le plasmide similaire pDM128/RxRE, qui contient le virus humain de la leucmie (HTLV). [GC14].

Figure 93 : Les siARN Tat et Rev inhibent la fonction des protines Tat et Rev du VIH. A : Les siARN dirigs contre Tat inhibent Tat du VIH-1 mais pas la fonction de Tat du BIV. Les cellules 293T ont t transfectes avec 100 ng de pTAR/CAT, 50 ng de plasmide contrle pBC12/CMV/ -Gal et 0.1 ng de plasmide effecteur. Les siARN ont t cotransfects avec le gne rapporteur. Les cellules ont t rcoltes 48h aprs la tranfection, et linduction de lactivit de CAT a t mesure. La figure reprsente les moyennes de 3 expriences et les dviations standards sont reprsentes par les barres derreurs. B : Les siARN dirigs contre Rev inhibent spcifiquement Rev mais pas la fonction de Rex HTLV. Les cellules 293T ont t transfectes avec 25 ng de plasmides rapporteurs pDM128/RRE ou pDM128/RxRE, 50 ng de pBC12/CMV/-Gal, et 1 ng de plasmide effecteur. Les siARN ont t cotransfects avec le rapporteur. Les cellules ont t rcoltes 48h aprs la tranfection, et linduction de lactivit de la -galactosidase a t mesure. [GC14].

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Les cellules 293T peuvent tolrer linfection par le VIH et sa rplication si elles sont programmes pour exprimer les rcepteurs CD4 et CCR5. Les chercheurs ont dabord dtermin leffet des siARN sur le niveau dexpression des gnes viraux par les cellules 293T transfectes avec les plasmides codant pour CD4 et CCR5. La figure 94 montre que les siARN anti-Tat et les siARN anti-Rev (et la combinaison des deux) sont capables dinhiber lexpression effectivement du gne rapporteur luc dans les cellules infectes par le VIH. Au contraire, les oligonuclotides dARN anti-sens nont pas deffet spcifique. [GC14].

Figure 94 : Inhibition de la rplication dans les cellules humaines par lARNi. Les cellules 293T ont t transfectes avec des plasmides exprimant CD4 et CCR5 et des siARN (si) ou des ARN anti-sens (as) (0.1 M de chaque). Aprs 48h, les cellules CD4+ CCR5+ ont t infectes avec 50 ng dantigne p24 du virus du rapporteur lucifrase NL-luc-ADA ou par le virus NL-ADA sauvage. Lexpression des gnes viraux a t dtermine par lactivit de la lucifrase 48h aprs linfection (A), alors que la rplication virale a t mesure par la production dantigne Gag p24 60h aprs la transfection (B). Les cellules 293T ngatives pour CD4 et CCR5 ont servi de contrle ngatif (NEG), alors que les cellules 293T CD4+ CCR5+ infectes en labsence de siARN ont servi de contrle positif (POS). [GC14].

Les chercheurs ont ensuite voulu savoir les siARN taient capables dinhiber la libration de particules virales. La figure 94 montre que les deux siARN, seuls ou combins, sont en effet capables dinhiber effectivement la production de virions. Encore une fois, les ARN anti-sens ont peu ou pas deffet. Ainsi, les siARN sont capables dinhiber lexpression des gnes du VIH et sa rplication dans les cellules infectes 293T CD4+ CCR5+.

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Bien que les siARN utiliss taient dirigs contre les gnes Tat et Rev, qui sont cods par des petits ARNm, les siARN rduiraient aussi lexpression dARNm non pisss. Cela peut tre montr directement, puisque beaucoup de ces ARNm maintiennent les squences Tat et Rev sans leur rgion 3UTR ou indirectement, en bloquant leur production en interfrant avec la synthse de Tat et/ou Rev. La figure 95 montre une rduction marque dans le niveau dexpression des trois classes dARNm dans les cellules infectes CD4+ CCR5+. [GC14].

Figure 95 : Analyse de lexpression des ARNm du VIH. Ces analyses rvlent que les siARN dirigs contre tat et rev peuvent rduire lexpression des trois classes dARNm du VIH. Les cellules 293T ont t cotransfects avec les siARN (si) ou avec les ARN antisens (as) (0.1 M de chaque). Les cellules CD4+ CCR5+ ont t infectes avec 50 ng dantigne p24. 48h aprs linfection, lARN total a t extrait des cellules infectes et soumis une analyse par Northern. LARNr 18S fait office de contrle. [GC14].

Les siARN pourraient bloquer directement linfection en induisant la dgradation dARN prsent dans les virions avant la reverse transcription. Pour vrifier cette possibilit, les chercheurs ont quantifi l niveau de production dADN proviral dans les cellules 293T CD4+ CCR5+ par Southern blot (Figure 96). Le gne de la -globine est utilis comme contrle.

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Figure 96 : Les siARN dirigs contre tat et rev peuvent initier la dgradation de lARN du VIH -1 avant la reverse transcription. Les cellules 293T ont t transfectes avec des siARN (si) ou des ARN antisens (as). Les cellules CD4+ CCR5+ ont t infectes avec 50 ng de p24. 48h aprs, lADN total a t extrait des cellules 293T infectes, dnatur dans 0.2 M de NaOH, transfr sur une membrane de nylon. Des quantits dADN quivalentes ont t sondes avec de la -globine marque au 32P. Les cellules 293T ont t traites avec 0.1 M dAZT, qui est un inhibiteur de la reverse transcriptase. LADN isol des cellules non infectes sert de contrle ngatif (NEG), alors que les cellules CD4+ CCR5+ infectes en labsence de siARN servent de contrle positif (POS). [GC14].

La figure 96 montre que lon peut dtecter lADN proviral dans les cellules 293T CD4+ CCR5+ mais pas dans les cellules ngatives pour CD4 etCCR5. Le niveau de production dADN proviral a t rduit mais pas totalement limin dans les cellules CD4+ CCR5+ traites lAZT. Les siARN peuvent inhiber linfection par le VIH, probablement en induisant la dgradation de lARNm viral. [GC14]. Les expriences prcdentes ont utilis les cellules humaines 293T comme systme exprimental. Les cellules 293T sont trs comptentes pour permettre linfection par le VIH. Cependant, ces cellules ne sont pas reprsentatives des tissus infects par le VIH. Pour examiner si lARNi pouvait inhiber la rplication dans les cellules T humaines, les chercheurs ont dtermin les effets des siARN sur la rplication du VIH dans les cellules T CD4+ Jurkat. Daprs la figure 97, on observe une inhibition significative de la libration de virus. Concernant les lymphocytes priphriques, les siARN Tat et Rev produisent une diminution importante de la libration de virions (Figure 97).Ainsi, lARNi est fonctionnel dans les cellules dorigine lymphode et peut tre utilis pour inhiber la rplication du VIH-1 dans les cellules T humaines en culture. [GC14].

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Figure 97 : Inhibition de la rplication du VIH dans les cellules T. (A) Les cellules T Jurkat ont t transfectes avec 12 M de chaque siARN. Les cellules non infectes servent de contrle (POS). 24h aprs, les cellules transfectes ont t infectes avec VSV-G-pseudotype NL-ADA. La production virale a t dtermine en mesurant la production de p24 Gag production 48h aprs linfection. (B) Des PBMC humaines ont t transfectes avec la forme sauvage ou mutante des siARN Tat et Rev par lectroporation et ont t infectes avec la forme R5-tropic NL-ADA 24h plus tard. La production de virus a t mesure 48h aprs linfection par ELISA. [GC14].

Ainsi, lARNi induit par transfection de siARN peut effectivement protger les cellules T humaines du VIH. LARN est capable de dinhiber spcifiquement lexpression du VIH et sa rplication en inhibant linfection virale (Figure 96) et en rduisant le niveau dexpression dARNm viral (Figure 95). Ces rsultats indiquent que lARNi a le potentiel de protger les cellules contre linfection et dempcher la propagation du virus. [GC14 ; GC24].

On peut ensuite silenc le gne p21. Le gne p21 est un gne exprim aprs la liaison du virus la cellule. Il est galement connu sous le nom de Cip (Cdk interacting protein). Le profil dexpression particulier de ce gne a conduit des chercheurs a examin si la modulation de ce transcrit affecte le cycle de vie du VIH.

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Figure 98 : Les macrophages infects expriment plus p21. (A) Images confocales (1 et 4) et immunofluorescence pour p21 dans les cellules non infectes (1, 2 et 3) et dans les cellules infectes par le virus (4, 5 et 6). (B) Analyse dintensit de fluorescence (FI). (C) Augmentation de la presence de p21 dans les macrophages infects (12 jours) par immunoprcipitation. [GC23].

Puisque Vpr facilite la rplication virale dans les cellules non en division et est ncessaire pour la production efficace de VIH, les chercheurs ont tudi la contribution potentielle de Vpr la mdiation de lexpression de p21. Les macrophages, traits avec Vpr pendant 3h mais pas avec gp120, ont non seulement montr une transcription de p21 plus importante (Figure 99A) mais ont eu galement une augmentation de lexpression de la protine p21 (Figure 99B). Ensuite, des macrophages ont t infects avec des virus muts pour Vpr. On observe alors une rduction de la rplication virale (Figure 99C) avec peu ou pas damlioration de la transcription de p21 (Figure 99D). [GC23].

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Figure 99 : Induction de lexpression de p21 par Vpr. Les cellules traites avec Vpr (6 g/ml) pendant 3h montrent une augmentation de la transcription gnique (A) et de lexpression des protines (B) pour p21. (C) Les macrophages ont t traits avec un surnageant contrle venant de cellules non infectes (D) LARN total est analys par PCR. [GC23].

Les macrophages ont t traits avec des oligonuclotides anti-sens pour supprimer lexpression de p21 dans les cellules exposs au VIH. Les oligonuclotides spcifiques de p21 rduisent la rplication virale, alors que le contrle ngatif na pas deffet (Figure 100A). La suppression de p21 par des siARN spcifiques de p21 inhibe aussi la rplication du VIH.(Figure 100B), ce qui confirme le rle essentiel de p21 dans le cycle du VIH. Les siARN bloquent p21 et par consquent rduisent la rplication virale (Figure 100C).

Figure 100 : Linhibition de p21 rduit la rplication du VIH. (A) Des oligonuclotides spcifiques de p21-specific (1 et 2, 50 nM), mais pas loligonuclotide contrle (3), inhibent la croissance du VIH. (B) Des macrophages traits avec des siARN p 21 (5 nM) 5 jours avant linfection par le VIH (% de contrles positifs au VIH). Les pourcentages dinfection du VIH ont t dtermins en comparant les niveaux de p24. (C) Les cellules traites au p21 sont analyses par cytomtrie de flux pour lexpression de CD4 et CCR5. (D) PCR ralise pour dtecter lADN proviral. [GC23].

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- Voyons maintenant le silencing de Nef. Le gne Nef est uniquement conserv dans le VIH-1, le VIH-2 et le SIV (simian immunodeficiency virus) et nest pas essentiel la rplication virale mais est tout de mme important. Il est exprim durant linfection par le VIH et reprsente jusqu 80% des ARN transcrits au cours des premires tapes du VIH. Des variants dfectueux de Nef contenant les rgions 3UTR inhibent en fait la transcription du VIH. De plus, le gne Nef F12 induit un blocage de la rplication virale. Il a t suggr que lARN Nef pouvait tre un facteur de rgulation de la rplication du VIH. Des chercheurs ont tent dtablir le lien entre les miARN et les infections par le VIH en dmontrant que les miARN drivs de Nef sont produits dans les cellules infectes. [GC25]. Pour examiner linhibition de lexpression de Nef par le miARN Nef, les chercheurs ont construit des shARN (Figure 101A). Ils ont essay de savoir si les shARN pouvaient rduire effectivement lexpression de Nef ou pas (Figure 101C et 101D). Les contrles taient les gnes egfp ou luc. Les plasmides exprimant les shARN ont t cotransfects dans des cellules T Jurkat et la fluorescence cellulaire a t quantifie par cytomtrie de flux. Les siNef 176, 190, 367/miR-N367 et les contrles ont montr des rductions efficaces, mais les siNef 007, 084, 299, 468 et 580 ont montr des rductions modestes. Aucune suppression na t observe avec si (-) et Luc (Figure 101D). Des analyses par immunoblot ont aussi confirm linhibition de Nef par les siNef 176, 190 et 367/miR-N367 (Figure 101E). [GC25].

Figure 101 : Dtection des miARN Nef et inhibition de lexpression de Nef par les ARN Nef. (A) Reprsentation schmatique de Nef et des sondes dADN utilises. (B) LARN total a t extrait de cellules MT-4 T puis soumis un Northern blot. Lexpression relative (%) des ARN nef est en bas de la figure. (C) Reprsentation schmatique des (D) Inhibition par les siNef de lexpression de Nef-EGFP. Chaque siNef, siLuc ou siEGFPa t transfect dans des cellules T Jurkat. 36h aprs la transfection, les cellules positives pour EGFP ont t dnombres par cytomtrie de flux. (E) Immunoblot montrant linhibition de lexpression par diffrents shARN nef. Les cellules T Jurakat T ont t transfectes avec les plasmides pYM2.2 et pH1/siNef ou siLuc. Les lysats cellulaires ont t prpars 48h aprs transfection. [GC25].

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Les chercheurs ont construit un prototype de vecteur viral PFV. Ce vecteur exprime le gne Nef. (Figure 102A).

Figure 102 : Inhibition de lexpression de Nef dans les cellules T humaines par les siARN Nef. Reprsentation schmatique des shRNA exprimant le vecteur STYLE. [GC25].

Les constructions pPFV/Nef ont t transfectes dans des cellules BGHK avec un inhibiteur des histones dactylases, la trichostatine A. Le surnageant viral, contenant environs 5 106 units infectieuses, a t collect 72h aprs la transfection. Le gne Env a t remplac par un shARN sous le contrle du promoteur H1. Cela a form un vecteur pSTYLE. Lexpression dARNm viraux de PFV/Nef ou STYLE a t confirme par linfection de cellules T Jurkat. Ces ARNm viraux ont t extraits des cellules infectes 2 semaines aprs linfection. Les constructions exprimant les ARNm de Gag et Nef ont t dtectes aprs amplification par Rt-PCR. Lintgration dADN dans le gnome de cellules T Jurkat a t confirme par PCR. (Figure 103). [GC25].

Figure 103 : Inhibition de lexpression de Nef dans les cellules T humaines par les siARN Nef. Dtection de lexpression de lARNm nef et integration des vecteurs. STYLE, SKY3.0, PFV/nef, PFV ou mock sont utilises pour infecter les cellules T Jurkat. Les cellules infectes ont t cultives pendant deux semaines. Lexpression des ARNm de gag et nef est mesure par RT-PCR. La -actine est utilise comme contrle. [GC25].

Pour valuer si le vecteur STYLE codant pour le siARN peut inhiber lexpression du gne nef dans les cellules T humaines, pYM2.2 a t transfect dans chaque cellule T infecte. Les vecteurs les plus efficaces pour la rduction de lexpression de nef ont t slectionns. Les cellules positives pour EGFP ont t dnombres par cytomtrie de flux 48h aprs la 124

transfection. Lexpression de la protine de fusion Nef-EGFP a t trs rduite aprs le traitement avec soit STYLE-176 (74 + 3.2) soit 190 (51 + 4.2) ou 367/miR-N367 (32 + 2.3%). (Figure 104).

Figure 104 : Inhibition de lexpression de Nef-EGFP par les cellules T exprimant les siARN nef. pYM2.2 a t transfect dans chaque cellule et les cellules exprimant EGFP ont t comptes par cytomtrie de flux 48h aprs la transfection. La figure reprsente lactivit relative des cellules positives pour EGFP, o le pourcentage des cellules positives dans les chantillons transfects avec pYM2.2 tait de 100%. [GC25].

- On peut galement silencer PARP-1. PARP-1 est une enzyme nuclaire abondante qui catalyse le transfert dADP-ribose de NAD+ sur diffrentes protines nuclaires, y compris elle-mme. [GC27]. Des cellules dans lesquelles il y a eu inhibition de lexpression de PARP1 (PARP-1/) montrent que PARP-1 est ncessaire pour lactivation de gnes cibles dpendant de NF- B, y compris le VIH. De plus, lintgration du VIH est aboli dans les cellules PARP-1/, suggrant que PARP-1 joue un rle dans lintgration du VIH [GC28]. PARP-1 est probablement un important facteur cellulaire impliqu dans la rplication du VIH. Pourtant, la fonction de PARP-1 dans la rplication du VIH reste floue. Pour vrifier limportance de PARP-1 dans la rplication, les chercheurs ont dvelopp des siARN dirigs contre PARP-1 et ont examin les effets des siARN sur lexpression gnique du VIH et sur sa rplication dans les cellules humaines. Pour examiner les effets des siARN sur lexpression de PARP-1, les cellules HeLa (Figure105B) et J111 (ligne cellulaire provenant de leucmie) (Figure 105C) ont t utilises et transfectes avec des siARN contre PARP-1 (143nM). 48h aprs la transfection, les cellules ont t lyses dans un milieu contenant du SDS. Les chantillons ont t spars laide dune lectrophorse PAGE-SDS et transfrs sur une membrane. Puis, un immunoblot pour PARP-1 et la -actine a t ralis. Daprs les figures 105B et 105C, on constate que lexpression de PARP-1 dans les cellules transfectes avec les siARN2, 3, 4 ou 5 a t rduite de faon significative compar aux cellules contrle (ligne 8). Les siARN1 et les contrles (lignes 6 et 7) nont eu presquaucun effet sur le niveau de PARP-1. De plus, le niveau de -actine tait modrment rduit dans les cellules transfectes avec les siARN dirigs contre la -actine (Figure 105B et C ligne 6). 4 siARN (lignes 2 5) ont rduit lexpression de PARP-1 plus efficacement dans les cellules HeLa (Figure 105B) que dans les cellules J111 (Figure 105C). Cela est peut-tre d au niveau endogne lev de PARP1 dans les cellules J111, plus que dans les cellules HeLa ou cause dune transfection moins efficace dans les cellules J111. [GC26]. En fait, une faible concentration (72 nM) de siARN5 supprime efficacement lexpression de PARP-1 dans les cellules HeLa, mais pas dans les cellules J111. 125

Les siARN4 et 5 suppriment efficacement lexpression de PARP-A dans les cellules HeLa (figure 105B). Ainsi, ce sont ces siARN qui ont t utiliss pour les expriences suivantes.

Figure 105 : Illustrations schmatiques de domaines fonctionnels de PARP-1. F1 et F2 : domaines de liaison lADN; NLS : signal de localisation nuclaire; BRCT, BRCA1 domaines Cterminaux. Les flches reprsentent les sites cibles des siARN dsigns dans lexprience. (B et C) Immunoblot des cellules transfectes avec les siARN. Les cellules HeLa (B) et J111 (C) ont t transfectes avec des siARN (143 nM) (lignes 1 7) ou non transfectes (ligne 8). 48h aprs transfection, les cellules ont t rcoltes. Puis les chantillons ont t immunoprcipits avec des anticorps polyclonaux anti-PARP ou avec un anticorps monoclonal anti--actine. Aprs incubation des chantillons avec des anticorps secondaires tiquets, limmuncomplexe a t visualis. [GC26].

Les chercheurs ont ensuite examin lefficacit de la rplication du virus dans des cellules transfectes avec des siARN dirigs contre PARP-1. Pour cela, des glycoprotines virales (VSVG) et des plasmides pNL-Luc ont t prpars en transfectant des cellules 293T avec une construction provirale pNL4-3 comprenant le gne rapporteur Lucifrase la place du gne Nef, pNL-Luc-E-R+ et le vecteur dexpression de VSVG, pHIT/G. La concentration dantigne p24 libr dans le milieu de culture 48h aprs la transfection a t dtermine par immunoassay. Ainsi, lefficacit des phases de rplication du virus (reverse transcription, intgration, transcription et traduction) a pu tre suivie en mesurant lactivit de la lucifrase dans les cellules infectes. Les cellules HeLa (Figure 106A) et J111 (Figure 106B) ont t transfectes avec les siARN (143 nM). Puis les cellules ont t infectes avec pNL-Luc (50ng de p24). 48h aprs linfection, lactivit de la lucifrase dans les cellules infectes a t mesure. Daprs la figure 106A, lactivit de la lucifrase dans les cellules HeLa transfectes avec le siARN4 (ligne 1) ou 5 (ligne 2) tait diminue de 6% par rapport aux cellules non tranfectes (ligne 5) ou transfectes avec les siARN contrles (lignes 3 et 4).

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De plus, les niveaux dactivit de la lucifrase dans les cellules J111 transfectes avec les siARN4 (ligne 1) ou les siARN5 (ligne 2) taient plus faibles denviron 37 et 24% respectivement, par rapport aux cellules non transfectes (ligne 5) (Figure 106B). Ces rsultats suggrent que les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment de faon significative la rplication du VIH dans les cellules HeLa et J111. Les siARN suppriment la rplication du virus rapporteur de faon plus efficace dans les cellules HeLa que dans les cellules J111. Cela est peut-tre du aux siARN4 et 5 qui suppriment les niveaux de PARP-1 plus efficacement dans les cellules HeLa que dans les cellules J111. (Figures 106B et C). [GC26].

Figure 106 : Les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment la rplication du VIH. Les cellules HeLa (A) et J111 (B) ont t transfectes avec les siARN indiqus (143 nM) (lignes 1 4) ou non (lignes 5 et 6). 24h aprs la transfection, les cellules ont t infectes (lignes 1 5) ou non avec pNL-Luc (50 ng de p24) (ligne 6). 48h aprs infection, les cellules ont t lyses et lactivit de la lucifrase a t dtermine. Puis, lactivit relative de la lucifrase a t calcule en comparant avec lactivit de la lucifrase non transfecte. [GC26].

Les chercheurs ont voulu savoir si les siARN dirigs contre PARP-1 supprimaient lactivation du promoteur du VIH. Les cellules sont traites avec du TNF- (tumor necrosis factor alpha) ou du PMA. Le niveau dactivit de la -galactosidase tait augment (Figure 107 ligne 5) dans les cellules non tranfectes ou avec les siARN contrles. Au contraire, TNF- et le PMA augmentent lgrement seulement lactivit de la -galactosidase dans les cellules tranfectes avec les siARN anti PARP-1 (Figure 107, lignes 1 et 2). Ces rsultats suggrent que lactivation du promoteur est supprime dans les cellules transfectes avec les siARN dirigs contre PARP-1.

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Figure 107 : Les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment lactivation du promoteur du VIH. Les cellules ont t transfectes avec les siARN indiqus (36 nM) (lignes 1 to 4) ou non transfectes (ligne 5). 42h aprs transfection, les cellules ont t traites ou non avec TNF- (10 ng/ml) ou PMA (100 nM) pendant 6h. Puis les cellules ont t lyses et lactivit de la -galactosidase a t dtermine. [GC26].

Dans cette tude, il a ainsi montr que les siARN rduisent efficacement lexpression de PARP-1 (Figure 105). Les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment de faon significative la rplication du VIH (Figure 106) ainsi que lactivation du promoteur (Figure 107). PARP-1 est ncessaire pour lactivation des gnes dpendant de NF- B et pourrait tre un important cofacteur pour lefficacit de lexpression du VIH dans les cellules humaines. Les siARN dirigs contre PARP-1 sont ainsi utiles pour comprendre le mcanisme par lequel PARP-1 rgule la rplication du VIH dans les cellules humaines. De plus, PARP-1 pourrait tre une cible thrapeutique pour le dveloppement de drogues anti-VIH. [GC27]. - On peut galement silenc dautres gnes de la rplication tel que vif. A nouveau, des siARN de 21 nuclotides ont t injects pour cibler diffrents domaines du VIH dont celui incluant le LTR. Les siARN ont t co-transfects avec un clone VIHNL-GFP dans des cellules Magi, c'est--dire HeLa CD4+. La transfection de ces cellules avec le clone infectieux dclenche le cycle viral ; la production dARN viral a donc lieu aboutissant des protines puis des virions. La production de ce virus a t mesure 24h aprs transfection. 9 siARN ont donc t transfects, ils ciblent chacun une squence diffrente sur le clone VIHNL-GFP . La faible activit de la rverse transcriptase permet de conclure que le virus se rplique trs peu. Il utilise peu la machinerie cellulaire. Donc de nombreux siARN russissent bloquer la rplication du VIH. Ces siARN doivent, comme prcdemment, avoir une certaine spcificit, aucune variabilit dans la squence du siARN nest permise. Lorsquun siARN est trop variable, comme M98 qui cible vif, lactivit de la rverse transcriptase slve toujours plus de 7 cpm/mlx1O^6. Le tmoin ayant une activit 8 cpm/mlx1O^6, on en conclut que le M98 du fait de ces mutations, et donc de sa non spcificit, nest plus capable deffectuer sa fonction antivirale. [GC20] (Figure 108).

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Figure 108 : Inhibition de la rplication du VIH par des siARN. Lactivit de la Rverse Transcriptase est fortement rduite en prsence de siARN ; except pour M98 qui a subi des mutations. Cette activit traduit le fait que le VIH utilise la machinerie cellulaire pour se rpliquer. Mais lors de transfection de siARN, cette activit diminue, les siARN stoppent donc la rplication du VIH. [GC20]

- Voyons maintenant le silencing de Gag. Comme il a t dit prcdemment, gag est un gne constituant le gnome du virus VIH-1. Il code pour les protines p24, p6, p7, p17 ayant un rle structural. On a cherch dans la mme ide que prcdemment, dinhiber la rplication de p24, une protine primordiale dans la formation de la capside. [GC12] Lquipe de Novina sest intresse au marquage du gne gag. Ce gne, dgrad dans sa rgion codant pour p24, pourrait inhiber la fois laccumulation de lARN gnomique viral et la production de p24. Des cellules HeLa exprimant CD4 ont, pour cela, t transfectes avec p24-siARN 24h avant leur infection avec HIVIIIB. Les rsultats obtenus aprs deux jours dinfection sont reprsents dans la figure 109.

Figure 109 : Inhibition de p24 spcifiquement par son siARN associ (dtection par la mthode de FACS une dimension). On peut noter que lors de la transfection des siARN p24, le pourcentage de p24 dtect est diminu de 5 fois environ alors que lors des autres transfections ce pourcentage ne varie pas significativement

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Figure 110 : Inhibition de p24 spcifiquement par son siARN associ. Dtection par Northern Blot de lexpression de p24 dans des cellules non transfectes (1), transfectes avec mock (2), avec des siARN p24 (3), avec le brin antisens des siARN p24 (4) ou avec un siARN contrle (5). Lactine est un marqueur de charge. Seuls les puits 1 et 3 sont pauvres en p24. [GC12]

Grce la cytomtrie de flux ainsi qu un Northern Blot, on sait dtecter la prsence de p24 dans nos cellules. Lorsquelles sont non infectes, les cellules ne synthtisent pas de p24, le FACS nen rvle que 0,2% et le Northern est vide. En revanche, lors dune infection, p24 est scrt. En prsence uniquement des siARN p24, on observe une diminution du taux dARNm codant p24, le puits 3 est vide et p24 ne reprsente que 4,2% alors quen condition contrle, il atteint les 20%. Le silencing du gne gag a un effet sur la rplication de la protine p24, il russit la rduire dun facteur 5. Il a galement t dmontr par les mmes procds que prcdemment, que leffet inhibiteur du siARN spcifique perdurait toujours au bout de 5 jours dinfection. Par lintermdiaire de siARN, on russit galement teindre lactivit prolifrative du virus trs tt dans la phase de linfection et celle-ci persiste au fur et mesure des jours. [GC12] A ce stade, on est en droit de se demander si tous les nuclotides du siARN sont aussi importants les uns que les autres. Des chercheurs ont voulu savoir si les siARN devaient tre parfaitement homologues leur cible, ou bien si certaines mutations taient permises. Une mutation dans un siARN ciblant gag entrane-t-elle un changement significatif dans son activit antivirale ? Elbashir a montr que la simple mutation du 10me ou 11me nuclotide abolissait le silencing du gne [GC51]. Par contre, Zeng et Cullen ont trouv que cette mutation naltrait pas la fonction antivirale du miARN [GC52] Lquipe de O. Pusch sest intresse aux effets que provoquent les mutations dans les siARN gag. Aprs avoir construit et amplifi gag et les mutants de siARN par PCR partir dun ADN gnomique extrait de cellules HeLa, les cellules ont prolifr dans un vecteur pCMV-MCS auquel le promoteur SV40 a t ajout. Les siARN se composent de 21 nuclotides. Chacun des 21 nuclotides a t mut un un, cela aboutissant ainsi vingt et un mutants et un contrle. Les 293 cellules ont ensuite t co-transfectes avec un clone infectieux de VIH-1 NL4,3 et avec lun des mutants ou le contrle. Le taux dantigne p24 a t quantifi 48h aprs la transfection. Un contrle ngatif a intgr de la lucifrase la place de siARN (Figure 111).

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Figure 111 : Inhibition de lactivit antivirale des siARN due une mutation. Aprs transfection du VIH et de siARN, la quantit de p24 du VIH-1 reflte directement lefficacit du siARN dtruire lARNm. Selon le nuclotide mut, le siARN a une activit antivirale plus ou moins diminue comparativement au contrle. Les mutations dans les parties centrales sont trs nfastes alors que les mutations sur les extrmits aboutissent une activit est proche de celle du tmoin. [GC 50]

Les rsultats montrent une baisse de lactivit antivirale des siARN mutants en comparaison avec le siARN contrle (Figure 111). De plus, il existe une relle diffrence dinhibition de cette activit selon la rgion mute. En effet, les mutations 4, 9 et 10 aboutissent une efficacit antivirale ne dpassant pas les 1%, la fonction destructrice du siARN a donc t supprime plus de 99%. Les mutations dans ces rgions centrales sont donc trs mal tolres ; elles aboutissent un siARN inefficace. En revanche les mutants 19, 20 et 21 sont beaucoup plus efficaces, ils ne rduisent leffet viral que de 18 60%. Ceci permet donc de prsager des zones o lhomologie est un critre primordial pour un rel fonctionnement. [GC 50] Dans dautres cellules HeLa identiques aux prcdentes, on a ralis nouveau des transfections avec les siARN muts. Un Northern permet de dvoiler la quantit dARNm du virus infectieux. Puis paralllement, on reprsente la rduction de la quantit de cet ARNm. [GC50].

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Figure 112 : Reprsentation de la rduction de la quantit dARNm. (a) Influence dune mutation sur le siARN ciblant lARNm du VIH-1 sur la quantit de cet ARNm. On mesure par Northern Blot la quantit de lARN HIV-1, le pathogne, aprs une injection de plusieurs mutants de siARN visant cet ARNm. Plus il y a dARNm, moins le siARN a t efficace donc la mutation rvle limportance toute particulire de ce nuclotide dans le rle effecteur du siARN. (b) Rduction en pourcentage de lactivit antivirale des siARN mutants en fonction du tmoin. On estime que la destruction maximale de lARNm se fait lors de la prsence du siARN tmoin (100% de linhibition). A partir de l, lactivit des mutants a t value, leffet inhibiteur est directement exprim en pourcentage relativement au tmoin. Cette activit diminue principalement pour les mutants 4, 8, 10 et 18. [GC 50]

On voit apparatre une corrlation ngative entre ces deux prcdentes figures (Figure 112) ; alors que le taux dARNm (a) est plus fort que celui du tmoin, la rduction de VIH (b) diminue, cela sexplique par le fait que plus il y a dARNm, moins le siARN na t efficace donc la mutation rvle limportance toute particulire de ce nuclotide dans le rle effecteur du siARN. Le cas le plus remarquable est celui du mutant 10. Lors de sa transfection, le taux dARNm mesur par Northern Blot est trs lev ; la fonction destructrice du siARN na donc pas t mise en place. Une mutation dans la partie centrale (mut-10) du siARN provoque une perte quasi-totale de son activit sur la dgradation de lARNm HIV-1. Tandis que des mutations sur les extrmits permettent une dgradation de lARNm suprieure 77% en comparaison avec le contrle. Ceci permet de conclure que le siARN doit conserver une parfaite homologie avec lARNm quil cible. La moindre mutation dans le domaine centrale (principalement le dixime nuclotide) peut provoquer une

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perte totale du rle du siARN. Seules les mutations dans les extrmits sont tolres. [GC 50] Enfin, le groupe de Carl D. Novina a pu suggrer trois mcanismes utilisant lARNi. Tout dabord, le siARN cible directement lARN gnomique lorsque le virus entre dans la cellule et tente de faire exprimer tous les transcrits de VIH-1. Le second mcanisme consiste en linhibition des pr-ARNm non encore pisss qui rsident encore dans le noyau. Troisimement, le siARN bloque de faon tardive lexpression de gag lors du cycle viral en ciblant directement le gnome viral et en dgradant les protines impliques dans le synthse de la capside du virus, telle que p24 comme nous lavons vu ci-dessus [GC12]. (Figure 113).

Figure 113 : Diffrentes voies daction des ARNi pour inhiber la prolifration du VIH. Etape 1 : le siARN CD4 empche la prolifration du virus en bloquant directement lentre du virus. Etape 2 : Le siARN p24 empche la rplication de lARNm viral. Etape 3 : Le siARN p24 supprime la formation de capside et donc la naissance de nouveaux virions. [GC54].

- On peut silencer des corcepteurs important pour le VIH. CCR5 est un corcepteur majeur du VIH dans les macrophages. Le gne structural viral qui code pour p24 et CCR5 peuvent tre cibls sparment ou en combinaison. Les macrophages reprsentent une cible cl du VIH in vivo. Bien que le nombre absolu de macrophages infects est relativement faible compar celui des cellules T CD4, la dynamique de la rplication du VIH dans ces cellules en fait un formidable rservoir viral [GC29]. Ils sont aussi les premires cibles du VIH dans le systme nerveux [GC29]. On retrouve les macrophages infects par le VIH dans le sang et les tissus ders patients sropositifs ayant reu une thrapie anti-rtrovirale.

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Cela permet de suggrer que la production du virus nest pas contrle de faon efficace par ce type de thrapie. [GC13]. Pour dterminer lefficacit de la libration des siARN dans les macrophages, les chercheurs ont transfect les cellules avec des siARN dirigs contre p24 tiquets avec Cy5. 24h aprs la transfection, 86% des macrophages CD14+ taient Cy5+ par cytomtrie de flux (Figure 114), efficacit de transfection comparable celle observe avec les cellules HeLa. Les siARN nont pas t incorpor efficacement par les phagocytes non spcifiques, parce quen labsence doligofectamine, moins de 6% des monocytes taient Cy5+. [GC13].

Figure 114 : Incorporation efficace des siARN tiquets dans les macrophages. Les macrophages ont t transfects ou exposs aux siARN p24 tiquets Cy5 en prsence ou en absence dagent de transfection. Aprs 24h de culture, les cellules sont dtectes par un anticorps anti-CD14-FITC, et analyses par cytomtrie de flux. Le pourcentage de cellules Cy5+ est indiqu dans chaque cadre. [GC13].

Les siARN CCR5 et p24 inhibent la rplication du VIH dans les macrophages pendant des priodes prolonges, et quand ils sont utiliss ensemble, ils suppriment compltement linfection. Pour connatre les effets antiviraux des siARN, les macrophages ont t transfects avec soit les siARN CCR5 soit les siARN p24 suivant une chelle de concentrations (0.2 2 M) et infects par un virus typique des macrophages, le R5 BAL 2 jours plus tard. Les cellules ont t mises en culture pendant 7 jours et la rduction de la production de particules virales a t montre par un test ELISA p24. Les concentrations en p24 ont t rduites la fois dans les macrophages contenant les siARN p24 et les siARN CCR5., avec un maximum dinhibition 1 M (Figure 115). Aucune rduction dans les niveaux de p24 na t observe dans les macrophages tranfects avec 2 M de siARN GFP. [GC13].

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Figure 115 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. (a) Les macrophages ont t transfects avec des doses de siARN CCR5 ( ) ou de siARN p24 ( ) et infects 2 jours plus tard avec le HIV Bal. La production de virus a t mesure 7 jours aprs linfection par un test ELISA. [GC13].

Pour valuer la stabilit de la suppression virale, les macrophages ont t transfects avec des siARN CCR5 ou p24 une concentration de 1 M seuls ou en combinaison. Puis ils ont t infects par le virus R5 BAL. Un test ELISA a rvl une forte rduction de la production de p24 la fois dans les cellules contenant les siARN CCR5 et p24, compar aux contrles contenant les siARN GFP pendant la dure totale de lexprience (Figure 116). [GC14].

Figure 116 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Les macrophages ont t tranfects avec les siARN GFP ( ), les siARN p24 ( ), les siARN CCR5 (x) ou non transfects ( ), ou encore tranfects avec les siARN p24 et CCR5 (*). Puis ils ont t infects 2 jours aprs avec le VIH BAL et la production de virus a t mesure par ELISA. [GC13].

De faon similaire, une analyse par cytomtrie de flux de lexpression de p24 expression a dmontr une forte rduction de lexpression de p24 avec soit les siARN CCR5 soit les siARN p24 compars aux contrles (Figure 117). [GC13].

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Figure 117 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Les siARN des cellules transfectes ont t colors avec des anticorps anti-p24-FITC 15 jours aprs linfection et analyss par cytomtrie de flux. [GC13].

Des analyses de fluorescence in situ des cultures 7 jours aprs linfection ont rvl une rduction de lARN HIV-1 dans les cellules tranfectes avec des siARN CCR5 ou p24 (Figure 118).

Figure 118 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Les macrophages transfects avec les siARN et infects par le VIH BAL ont t marques pour effectuer des expriences dhybridation in situ avec un oligonuclotide gag-pol tiquet la fluorescine 7 jours aprs linfection. La microscopie fluorescence a t utilise pour valuer les signaux fluorescents pour les ARN du VIH (ligne infrieure). [GC13].

Ainsi, la co-transfection avec chacun des siARN est capable de supprimer linfection par le VIH au long des 15 jours dobservation (Figures 116,117 et 118). Les siARN peuvent fournir une protection durable contre le VIH dans les macrophages.

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Il semble que les siARN ont la capacit dempcher linfection par le VIH. Toutefois, il est important que les siARN persistent dans la cellule assez longtemps avant linfection. Pour examiner cela, cette quipe a tudi la persistance intracellulaire des siARN CCR5 et p24 transfects dans des macrophages non infects. La rtention de siARN p24 et CCR5 introduits dans les macrophages non infects a t value par Northern Blot sur des chantillons dARN diffrents temps aprs la tranfection. On a utilis pour cela des siARN CCR5 et p24 marqus au -32P comme sonde. Des ARN avec une mobilit relative de 20 23 pb doligonuclotides ont t visualiss un niveau de sensibilit de 10-fmol (Figure 119). [GC13].

Figure 119 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Des analyses par Northern blot montrent des niveaux de siARN CCR5 et p24 dans les macrophages. Les chantillons ont t normaliss pour le contenu en ARN total. Le brin sens de chaque siARN a t marqu au 32 P et utilis comme sonde. [GC13].

Les signaux dhybridation pour CCR5 et p24 sont similaires au niveau de lintensit e premier jour. Cependant, le jour 7, le signal p24 devient plus faible et est compltement perdu au bout de 15 jours, alors que le signal CCR5 se maintient. Aucun signal nest dtect dans les chantillons non transfects utilises comme contrles. Ces rsultats suggrent que les siARN p24 doivent avoir une dure de vie relativement courte en labsence dinfection, alors que les siARN CCR5 persistent sous ses conditions. La stabilit du silencing mdi par les siARN CCR5 est aussi analyse en parallle par cytomtrie de flux de lexpression de CCR5 endogne. Compar aux cellules non transfectes, les cellules transfectes avec les siARN CCR5 maintiennent une rduction de 70 80% de lintensit de la fluorescence de CCR5 1 20 jours aprs la transfection (Figure 119). [GC13].

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Figure 120 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Les macrophages transfects avec les siARN CCR5 (en haut) et les siARN GFP (en bas) ont t examins pour lexpression de CCR5 au cours du temps. [GC13].

LARNm de CCR5 est indtectable par des analyses de RT-PCR 1, 4, 7 et 15 jours aprs la transfection des siARN CCR5 (Figure 120).

Figure 121 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Des expriences de RT-PCR ont t effectues pour analyser lexpression des ARNm de CCR5 et de la -actine laide de cellules non transfectes (lignes 2 5) et transfectes avec des siARN CCR5 (lignes 6 9) au bout des jours 1 (lignes 2 et 6), 4 (lignes 3 et 7), 7 (lignes 4 et 8) et 15 (lignes 5 et 9) aprs la transfection. La ligne 1 reprsente le contrle ngatif. [GC13].

Pour contrler si ces diffrences de persistance intracellulaire refltent aussi des diffrences de capacits effectuer la suppression du virus, les chercheurs ont transfect les macrophages avec les siARN CCR5 et p24 et ont provoqu des infections diffrents temps croissants aprs linfection. La rplication virale a t mesure par cytomtrie de flux pour analyser lexpression de p24 10 jours aprs linfection. Les siARN CCR5 fournissent une protection si les cellules sont infectes 2 15 jours aprs la transfection (Figure 122). [GC13].

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Figure 122 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, confrent aux cellules une protection uniforme quand les macrophages sont infects des intervalles croissants aprs la transfection. Les macrophages ont t transfects avec des siARN GFP (en haut), siARN p24 (milieu) ou des siARN CCR5 (bas) et infects avec le VIHBAL diffrents temps aprs la transfection. Les cellules ont t analyses 10 jours aprs linfection par cytomtrie de flux. [GC13].

De plus, les siARN p24 fournissent une protection maximale quand les cellules sont infectes 5 jours aprs la transfection, mais le niveau de protection diminue graduellement quand lintervalle entre la transfection et linfection est plus grand. Le gne CCR5 est un gne exprim de faon endogne alors que le gne codant pour p24 nest exprim quaprs linfection. Les siARN doivent avoir besoin de la prsence de cible dARNm intracellulaire pour prolonger le silencing. [GC13]. Pour tester si les siARN peuvent supprimer le VIH de faon stable dans des macrophages infects, les chercheurs ont utilis des siARN p24 et CCR5 pour leur capacit supprimer la rplication virale. Les macrophages ont t transfects avec des siARN CCR5 ou p24 16 jours aprs linfection avec le virus VIHBAL. La suppression de la rplication virale aprs la transfection tait suivie en valuant lexpression intracellulaire de p24. Comme prvu, le blocage de CCR5 na pas rduit de faon significative la rplication du virus (Figure 123). [GC13].

Figure 123 : Les siARN p24, mais pas les siARN CCR5, suppriment la rplication du VIH. Les macrophages infects par le VIHBAL pendant 16 jours (>90% des macrophages taient p24+) ont t transfects avec des siARN CCR5 et examins 3 jours plus tard. Le pourcentage de cellules p24+ est reprsent. [GC13].

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Au contraire, les siARN p24 sont capables de rduire la rplication virale dans les cellules infectes environ 90% 3 jours aprs la transfection (Figure 124) [GC13].

Figure 124 : Les siARN p24, mais pas les siARN CCR5, suppriment la rplication du VIH. Les macrophages infects pendant 16 jours ont t transfects avec des siARN p24 ou des siARN contrles et examins pour lexpression de p24 diffrents jours aprs la transfection.

Les siARN p24 transfects aprs linfection sont capables de supprimer la rplication virale jusqu 15 jours aprs linfection. Ainsi, la suppression durable peut tre ralise avec des siARN p24 dans des macrophages infects. Ces rsultats sont importants car ils reprsentent une nouvelle tape dans la thrapie du VIH : une seule application des siARN est capable de raliser une suppression durable du VIH. Dans des macrophages primaires, les siARN empchent non seulement linfection mais aussi suppriment la rplication virale quand linfection sest tablie. Des tudes prcdentes ont montr que les siARN avaient une action transitoire qui durait 4 7 jours. [GC12]. Cela tait en partie d la dilution des siARN dans les cellules en division. Les siARN CCR5 sont prsents pendant une longue priode aprs la transfection. Les siARN p24 ne persistent que 7 jours aprs. Ainsi, la dgradation des siARN peut contribuer leur perte. .Les siARN p24 sont rapidement dgrads dans les cellules non infectes, mais ils suppriment la rplication virale dans des cellules infectes. [GC13]. La prsence ou labsence dARNm cible peut dterminer si le siARN est persistant ou dgrad. De plus, les siARN CCR5 sont capables de supprimer lexpression du gne CCR5 endogne aussi bien que dempcher lentre du virus. Ainsi, la prsence continue dARNm cible est ncessaire pour la conservation intracellulaire des siARN. Etant donn le taux lev de mutations dans le VIH, il est peut-tre prfrable de cibler les rgions hautement conserves dans le gnome viral et dutiliser des combinaisons de siARN. Les gnes de la cellule hte pouvant interrompre le cycle de vie du VIH peuvent reprsenter des cibles particulirement intressantes. Des traitements combinant des siARN CCR5 et p24 liminent compltement la rplication du VIH dans les macrophages : les siARN CCR5 bloquent lentre du virus dans la cellule et les siARN p24 dtruisent le virus. [GC13].

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3.2.2.3. Silencing au niveau des cellules dendritiques Plusieurs chercheurs ont utilis des siARN spcifiques des gnes du VIH pour inhiber la rplication du virus [GC20, GC14, GC12]. Cependant, tant donn la diversit des squences du gnome du VIH dans les sujets infects, il est difficile de cibler des squences spcifiques. Cest pourquoi certains chercheurs se sont tourns vers le ciblage de gnes critiques de lhte impliqus dans la pathogense de linfection, tels les rcepteurs CD4 et les co-rcepteurs du VIH, CXCR4 et CCR5. Ces expriences ont montr des rsultats positifs dans linhibition de la rplication du VIH. Les cellules dendritiques (DC) ont des Rcepteurs Lectiniques des Cellules dendritiques, DC-SIGN et jouent un rle cl dans la dfense primaire contre linfection par le VIH mais aussi dans la dissmination du VIH par les CD. Les lectines sont des protines pouvant se lier aux sucres prsents la surface des cellules ou des virus. Les glucides de gp120 du VIH peuvent tre reconnus par des lectines des cellules dendritiques qui sont prsentes dans les muqueuses humaines. Au lieu de dtruire le virus, ces cellules vont le transporter vers les cellules T et dbuter le cycle d'infection. DC-SIGN est utilis par le VIH comme porte d'entre dans le systme immunitaire. [GC21]. Les DC sont essentielles pour les vnements prcoces de la rponse immunitaire. Des systmes modles de transmission du VIH par voie sexuelle ont montr des DC exprimant la capture de DC-SIGN et linternalisation du VIH. De plus, les DC transfrent efficacement le VIH aux cellules T CD4+ dans les organes lymphodes, o une rplication virale plus importante a lieu. Les DC rgulent galement lexpression la surface des molcules co-stimulatrices B7-1 et B7-2 (CD80 et CD86), qui engagent la molcule CD28 sur la cellule T. Lactivation optimale des cellules T apparat quand la cellule T nave reoit 2 signaux : un signal primaire par lintermdiaire du rcepteur de la cellule T qui reconnat les antignes, et un second signal par linteraction B7-CD28. Un tel stimulus active une cascade de gnes, tels NFB et des MAPK, ce qui conduit une expansion clonale de cellules T spcifiques dun antigne. Les tudes ont t faites pour dterminer si le silencing de DC-SIGN modifie lexpression des molcules de surface co-stimulatrices des DC. Dans cette tude, des DC matures ont t transfectes avec des siARN spcifiques de DCSIGN. Les cintiques de suppression du gne DC-SIGN ont t tudies, ainsi que les effets de ce silencing sur les molcules co-stimulatrices. [GC22]. Afin dtudier la cintique du silencing de DC-SIGN, les DC ont t transfectes avec des siARN contre DC-SIGN. Puis les cellules ont t rcoltes et lARN a t extrait 24, 48 et 72 heures aprs la transfection. Lexpression du gne DC-SIGN a t dtermine en utilisant la PCR semi-quantitative. Les rsultats reflte laccumulation de transcrit (TAI), tout en respectant le contrle non transfect.

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Figure 125 : Cintiques de la transfection des siARN DC-SIGN avec les DC. Les DC (1 x 105 cellules/mL) sont cultives en absence ou en prsence de siARN DC-SIGN (50nM) pendant 24, 48 et 72 heures. LARN est extrait puis reverse transcrit, et lexpression de DC-SIGN est analyse par PCR quantitative. [GC19].

La figure 125 montre respectivement 76%, 66% et 53% dinhibition de lexpression de DC-SIGN dans les DC transfectes 24, 48 et 72 heures, compars au contrle. Ces rsultats montrent ainsi que les siARN sont efficaces dans le silencing de lexpression des gnes de faon temps-dpendant. [GC19]. Pour tudier cela, les chercheurs ont transfect les DC avec les siARN DC-SIGN. Ensuite, lARN a t extrait et lexpression de CD40, CD80 et CD86 a t dtermin. La figure 126 montre que 24 heures aprs la transfection avec les siARN spcifiques de DCSIGN, lexpression de CD40 tait inhibe de 43% alors quelle nest que de 12% aprs 48 et 72h. Concernant CD80, son expression est inhibe de 48% au bout de 24 heures et de 4% 48h. Cependant, plus aucune inhibition nest observe 72h, ce qui est comparable aux rsultats du contrle. Et pour CD86, son expression tait diminue de 26%, de 14% et de 18% au bout de 24, 48 et 72h respectivement. On peut donc en conclure que le silencing de lexpression de DC-SIGN avec les siARN diminuent aussi lexpression gnique des molcules co-stimulatrices, CD40, CD80 et CD86. [GC19]

Figure 126 : Cintique de lexpression des molcules co-stimulatrices aprs transfection des DC avec les siARN DC-SIGN. Les DC (1 105 cellules/mL) ont t mis en culture avec ou sans des siARN DC-SIGN (50 nM) pendant 24, 48, et 72h. LARN a t extrait puis reverse transcrit, et lexpression des molcules CD40, CD80 et CD86 a t analyse par PCR quantitative. [GC19].

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Il faut ensuite savoir si ce silencing module lexpression de la protine de signalisation intracellulaire p38 MAPK dans les DC. La figure C montre leffet des siARN spcifiques de DC-SIGN sur lexpression gnique de p38 24, 48 et 72h et cela est dtermin par PCR semi-quantitative. On constate ainsi que linhibition de lexpression gnique de p38 est de 31% 24h et 28% 48h. A 72h, lexpression de p38 est comparable celle du contrle non transfect. Ceci dmontre que le silencing de DC-SIGN diminue galement lexpression de la molcule de signalisation p38. [GC19].

Figure 127 : Cintique de lexpression de p38 aprs transfection des DC avec les siARN DC-SIGN. Les DC (1 105 cellules/mL) ont t mis en culture avec ou sans des siARN DC-SIGN (50 nM) pendant 24, 48, et 72h. LARN a t extrait puis reverse transcrit, et lexpression de p38 a t analyse par PCR quantitative. [GC19]

On peut ensuite examiner si les siARN permettent de diminuer les taux de production de p24 et lexpression de HIV-LTR dans les cellules infectes par le VIH. Pour cela, les DC sont tranfectes avec les siARN DC-SIGN pendant 24h, puis infectes par le VIH -1BA-L. 24h aprs linfection, les surnageants de culture ont t analyss en utilisant la technique ELISA et lexpression gnique de la rgion HIV-LTR-R/U5 a t analyse par PCR semi-quantitative. La figure 128 montre 76% dinhibition des taux de p24 aprs le silencing de DC-SIGN dans les surnageants de culture (3.95 pg/mL), compar aux cultures contrle non transfectes (17.4 pg/mL). De plus, la figure 128 montre que le silencing de DC-SIGN inhibe significativement (86%) lexpression gnique de HIV-LTR-R/U5. Ces rsultats montrent ainsi que les siARN spcifiques de DC-SIGN sont capables dinhiber de faon significative la production de VIH par les DC infectes, comme le dmontrent la diminution de production de p24 et la diminution dexpression de HIV-LTRR/U5. [GC19].

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Figure 128 : Effets de la transfection des siARN DC-SIGN sur les taux de p24 et lexpression de HIVLTR-R/U5 par les DC. Les DC (1 105 cellules/mL) ont t tranfectes avec ou sans des siARN DC-SIGN (50 nM) pendant 24h. Ensuite, les DC ont t infectes avec le VIH Ba-L pendant 3h 37C, laves et mises en culture pendant encore 24h. (A) Les surnageants de culture ont t collectes et analyses. (B) LARN a t extrait des cellules et lexpression de HIV-LTR-R/U5 a t analyse par PCR quantitative. [GC19].

Ainsi, DC-SIGN est une molcule qui facilite linfection par le VIH et qui peut donc tre une cible trs intressante pour lARNi. [GC23]. En effet, des DC ngatives pour DC-SIGN sont incapables de transfrer le VIH aux cellules T, dmontrant ainsi le rle essentiel de DC-SIGN dans la progression de linfection par le VIH. [GC21]. De plus, la diminution de lexpression de DC-SIGN peut aussi altrer lexpression des molcules co-stimulatrices, do inhiber les interactions entre les DC et les cellules T et la progression du VIH. En effet, nous avons vu que le silencing de DC-SIGN diminue lexpression gnique des molcules costimulatrices CD40 CD80et CD86. Lexprience a montr que linhibition des molcules co-stimulatrices et de la rplication virale pouvait tre mdie par linhibition de p38. Le knock-down de DC-SIGN par les siARN dans les DC empche slectivement la formation de synapses infectieuses entre les DC et les cellules CD4+. DC-SIGN est requis en aval de la capture virale pour la formation de ces synapses. Ainsi, le rle de DC-SIGN dans le transfert du VIH des DC aux cellules T, tape cruciale dans la transmission du VIH et sa pathogense, est tabli. [GC21]. On peut envisager de designer des drogues spcifiques de DC-SIGN, ce qui inhiberait linfection par le VIH. [GC22].

144

3.2.2.4. Rsistance du VIH Toutefois, il a t dmontr rcemment que certaines formes du virus chappaient lARNi. Par exemple, la squence cible des siARN Nef dans ces virus rsistants tait partiellement ou compltement supprime, ou encore modifie par des substitutions de nuclotides. On peut ainsi analyser les changements de squence chez ces virus mutants et raliser des expriences pour tudier le mcanisme de rsistance. On observe ainsi une forte corrlation entre la stabilit du complexe siARN-cible et le niveau de rsistance lARNi. De plus, on a dcouvert deux virus qui chappaient lARNi par des mutations induisant une structure secondaire de lARN cible alternative. Une occlusion des squences cibles des siARN par une structure secondaire rduit lefficacit de lARNi. De plus, le VIH est trs versatile et est capable dvoluer pour chapper lARNi. [GC30]. Des chercheurs ont utilis des siARN dirigs contre le gne Nef. La squence cible de ces siARN est localise au niveau de la rgion 3 du gnome viral (Figure 129A). Le blocage de la rplication par ces siARN nest pas absolu et certains variants du VIH apparaissent aprs plusieurs semaines de culture. Certains variants ont t analyss par RT-PCR du segment de Nef (Figure 129B). La substitution dun seul nuclotide a t observe dans les squences cibles de trois virus mutants (R3, R6, R9). Des dltions partielles ou compltes des cibles de Nef ont t observes dans 5 cultures (R1, R2, R4, R5, R7). Ces modifications affectent le cadre de lecture de Nef, ce qui aboutit la synthse dune protine Nef contenant une dltion interne ou une troncature de la protine. La protine Nef ntant pas essentielle la rplication du virus, ces mutations nont pas un impact majeur sur la rplication du virus. Le virus R8 na pas de mutation dans la squence cible de Nef, mais la place il prsente une substitution dun nuclotide en amont de la squence cible. [GC30].

Figure 129 : Certaines formes du VIH rsistent linhibition par les siARN dirigs contre Nef. (A) Reprsentation schmatique du gnome du VIH. La position de la squence cible du siARN Nef est indique par la flche. (B) Les variants rsistant aux siARN Nef ont t slectionns dans 9 cultures indpendantes. La squence cible (lencadr gris indique les nuclotides 164 182 du gne Nef) est reprsente pour la forme sauvage (LAI) et pour les virus rsistants (R1R9). Le jour o les variants ont t squencs est indiqu. Les dltions sont reprsentes par des tirets, les substitutions sont soulignes et en gras. Dans le virus R1, les nuclotides 125 230 du gne Nef sont supprims. Dans le virus R5, les nuclotides 179 241 sont supprims. Dans le virus R7, ce sont les nuclotides 44 268 qui le sont et il y a une substitution en position 269. [GC30].

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Pour vrifier que les mutations observes proximit des squences cibles influent le phnotype des virus rsistants, les chercheurs ont introduit les squences de Nef mutantes dans un clone de VIH sauvage. Les cellules exprimant le siARN Nef ont t infectes avec le virus sauvage ou mutant. Le virus sauvage est inhib fortement par les siARN Nef et ne provoquent pas une propagation de linfection (Figure 130). Au contraire, les virus mutants se rpliquent, dmontrant que les mutations observes dans le gne Nef confrent une rsistance contre les siARN Nef. Les diffrents mutants semblent se rpliquer avec une efficacit diffrente. Par exemple, R3 est plus efficace que R3 donc on peut supposer quune mutation supplmentaire dans la squence cible fournit un niveau de rsistance plus lev. [GC30].

Figure 130 : Les mutations de Nef confrent une rsistance contre les siARN Nef. Les squences de Nef mutes reprsentes dans la figure 130 ont t transfectes dans un clone de VIH sauvage. Les stocks de virus ont t produits de faon transitoire dans les cellules C33A et ont t utiliss pour infecter des cellules exprimant de faon stable les siARN Nef. La rplication du virus a t suivie pour dterminer le niveau de p24 dans le surnageant de culture. Le variant R7 a t exclus des analyses car il contient une dltion complte de la squence cible trs similaire celle du variant R1. [GC30].

Pour quantifier le niveau de rsistance lARNi, les chercheurs ont utilis des gnes rapporteurs dans lesquels ils ont plac les squences cibles de Nef, sauvages ou mutantes, en aval du gne de la lucifrase (Figure 131A). Ces constructions ont t co-transfectes avec des quantits croissantes de siARN Nef dans des cellules C33A. La production de la lucifrase a t mesure aprs 48h (Figure 131B). [GC30].

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Figure 131 : Quantification du niveau de rsistance lARNi. (A) Un fragment Nef de 250 pb (nuclotides 84488698 dans le gnome sauvage) a t clon en aval du gne de la lucifrase dans un plasmide rapporteur pGL3. Ces constructions ont t cotransfects dans des cellules C33A. (B) Lexpression de la lucifrase a t observe aprs la transfection des constructions avec des quantits croissantes de pBS-siARN Nef. Le niveau dexpression observe en absence de siARN Nef tait de 100% pour chaque construction. Ce taux ne variait pas significativement dune construction une autre. [GC30].

Lexpression du gne rapporteur est rduite de faon significative par co-transfection avec 0,5 ng de pBS-siARN Nef et une inhibition presque complte a t obtenue avec des quantits plus importantes de siARN Nef. Lexpression du gne rapporteur dans lequel la squence cible est compltement supprime (R1) nest pas inhibe par les siARN Nef, ce qui dmontre une rsistance complte. Les constructions prsentant des dltions partielles de la squence cible ont manifest une rsistance complte (R2) ou partielle (R4 et R5) contre les siARN Nef. Les constructions prsentant une seule substitution de nuclotides manifestent des rsistances partielles (R3 et R9) ou presque compltes (R6). Lacquisition dune seconde mutation dans le virus R3 (R3') naugmente que lgrement le niveau de rsistance. [GC30]. Les chercheurs ont calcul la stabilit thermodynamique ( G) de linteraction entre les siARN et la cible pour les formes sauvages et mutantes (Figure 132). Le siARN Nef forme un duplexe parfait avec la squence cible sauvage ( G = 26.1 kcal/mol), cohrent avec linhibition efficace par le siARN (18% de rsistance). La substitution et la dltion chez les mutants provoquent une rduction de la stabilit du complexe siARN-cible, ce qui est corrl une augmentation de la rsistance (Figure 132). Cependant, deux variants (R6 et R8) ne suivent pas le profil gnral et manifestent un taux exceptionnellement lev de rsistance. La substitution de nuclotides dans R8 est localise en amont de la squence cible. Ainsi, la stabilit du complexe siARN-cible nest pas affecte pour ce mutant puisquil est trs rsistant. [GC30].

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Figure 132 : La rsistance lARNi est due la stabilit du duplexe siARN-cible. La stabilit thermodynamique ( G) du duplexe siARN Nef/cible est calcule avec un programme dhybridation. Le niveau lev de rsistance des mutants R8 et R6 ne correspond pas leur stabilit prdite. [GC30].

La liaison des siARN Nef leur squence cible peut tre galement empche par laccessibilit de la squence cible, cest--dire par la structure locale de lARN. La rsistance de R6 et R8 ne peut pas tre explique par une stabilit altre du complexe, donc les chercheurs ont examin les effets de ces mutations sur la structure locale de lARN. Ils ont dabord imagin la structure secondaire du sauvage grce un programme. La structure de lARN la plus nergtiquement favorable ( G = 17.9 kcal/mol) est une structure en pingle cheveux qui recouvre partiellement lextrmit de la squence cible du siARN (Figure 133). [GC30].

Figure 133 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. La squence cible est colore en gris. La substitution en amont de la squence cible dans R8 est encercle. Cette mutation perturbe la forme la plus sensible (S) ( G = 17.9 G = 13.0 kcal/mol), provoquant une conformation plus stable ( G = 15.0 kcal/mol). [GC30].

La mutation dans R6 ne rduit pas la stabilit de la forme S, mais elle stabilise beaucoup la forme alternative R (Figure 134; G = 21.3 kcal/mol). La substitution dans la squence cible permet la formation de deux paires de base dans cette pingle cheveux. Ainsi, le taux lev de rsistance de R6 est probablement d une occlusion de la squence cible dans la structure stable. [GC30].

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Figure 134 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. La substitution dans la squence cible de R6 est indique. Cette mutation naffecte pas la forme S, mais stabilise la forme R par la formation de deux paires de bases additionnelles ( G = 17.9 G = 21.3 kcal/mol). [GC30].

Dans la figure 135, la stabilit de la forme sensible lARNi (S) et celle rsistante (R) pour la forme sauvage (wt), R6 et R8 sont reprsentes. Dans la forme sauvage, la structure S est favorise car elle est plus stable que la forme R. La conformation S est dstabilise (S') chez le mutant R8 et devient moins nergtiquement favorable par rapport la conformation R. [GC30].

Figure 135 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. La stabilit thermodynamique ( G) des conformations S et R) est indique pour le sauvage (wt) et les mutant (R6 et R8). Chez le sauvage, la structure S ( G = 17.9 kcal/mol) est plus stable que la structure R ( G = 15.1 kcal/mol). Chez le mutant R8, la structure S est dstabilise (S'; G = 13.0 kcal/mol) et nergtiquement moins favorable que la structure rsistante ( G = 15.0 kcal/mol). La stabilisation de la forme R dans le mutant R6 rend cette conformation (R'; G = 21.3 kcal/mol) plus favorable que la conformation sensible (S; G = 17.9 kcal/mol). [GC30].

Pour dmontrer que la structure alternative forme par lARN R8 ne masque pas la squence cible de Nef, les chercheurs ont ralis des expriences de liaison. Un nuclotide correspondant au brin anti-sens a t marqu radioactivement, incub temprature ambiante avec des quantits croissantes dARN sauvage et dARN R8. Puis, ils ont ralis des expriences dEMSA (electrophoretic mobility shift assay). (Figure 136). [GC30].

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Figure 136 La structure de lARN cible peut inhiber la liaison avec le siARN. Un oligonuclotide marqu radioactivement stimulant le brin sens du siARN Nef a t incub avec des quantits croissantes dARN sauvage ou R8. La formation du duplexe siARN-cible a t analyse par EMSA. [GC30].

La liaison du siARN lARN cible rsulte dun grand dplacement sur le gel non dnaturant. Les bandes ses siARN Nef libres et le duplexe siARN-cible ont t quantifies pour calculer le pourcentage de liaison (Figure 137). [GC30].

Figure 137 : La structure de lARN cible peut inhiber la liaison avec le siARN. Les siARN libres et lis ont t quantifis pour calculer le taux de formation du duplexe (siARN li/libre + siARN li). [GC30].

Les siARN Nef se lient moins efficacement lARN R8 qu lARN sauvage. Alors que presque tous les siARN se dplacent des forts niveaux dARN sauvage, la mme quantit dARN R8 nest pas capable de dplacer plus de 39% des siARN Nef. Parce que les structures dARN sont sensibles la temprature, les chercheurs ont aussi ralis des expriences temprature leve. En effet, le dfaut de liaison du mutant R8 a t diminu dans de telles conditions. De plus, des expriences de cintique avec un excs de siARN Nef ont montr que la liaison lARN sauvage est significativement plus rapide que celle lARN R8. Ces rsultats montrent que la structure alternative de R8 prive la squence cible dinteragir avec les siARN Nef. [GC30]. En conclusion, mme si, lheure actuelle, aucune thrapie nutilise les siARN, ils constituent

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une nouvelle technologie qui aide les chercheurs tudier la biologie de linfection par le VIH. Cela permet galement denvisager le design de nouvelles drogues.

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4. Matriel et mthodes
Le but de notre travail tait de constituer un rapport sur le thme de lARN interfrence. Nous avons essay de mettre en pratique ce qui nous a t enseign lors de nos cours sur la recherche scientifique en rseau. Notre choix na pas t de rassembler toutes les informations possibles sur le sujet, mais plutt doprer un travail de slection. Nous voulions en effet, ne garder que les articles scientifiques qui prsentaient un rel intrt du point de vue de la pertinence des rsultats quils mettaient en vidence. Nous nous sommes servi de trs peu de sites internet, car nous avons choisi de constituer un rapport ayant de solides bases scientifiques et de constituer une bibliographie la plus srieuse possible. Cest pourquoi, nous avons choisi de privilgier les articles et revues scientifiques. Dans un premier temps, nous avons donc consult un grand nombre darticles grce de performants outils de recherche bibliographiques : Google Biology, Google Scholar, Scirus, et surtout PubMed. Ceci nous a permis de nous constituer une culture dans le domaine, mais aussi de choisir les diffrents chapitres que nous voulions aborder. Cette premire recherche rapide nous a galement permis de dfinir les mots-cl qui nous serviront pour la suite de nos recherches. Rapidement, nous avons galement pris contact avec notre tuteur, M. Pages, afin quil nous oriente dans nos recherches.

4.1. Matriel et mthodes de la partie Historique

Pour rdiger une partie rsumant lhistorique des ARNi, nous avons au pralable fait des recherches sur Wikipedia et Google. Ces recherches ont permis dacqurir une culture gnrale sur le sujet et de retenir des noms dauteurs. Sur Wikipedia, nous avons pu dterminer les points-cl de lhistorique de lARNi. En apprenant que la dcouverte du phnomne sest faite sur les ptunias, ou encore que des expriences historiques avaient t effectues sur les nmatodes ou la drosophile, nous avons tabli une liste de mots-cl sur lhistorique : ARNi, co-suppression, post transcriptional gene silencing, petunia, drosophila, C. elegans, mammalian... Une bonne combinaison de ces mots cls permet une recherche intressante. Nous avons retenu de la recherche sur Google quelques sites intressants tels que ambion.com qui, mme sils sont des .com , constituent des sources dinformations. En effet, le site Ambion est le site de la socit leader de confection des siRNA. Tout en prenant en compte que ce site est un site commercial et donc quil nest pas forcment objectif, on peut le considrer comme une source valable. Le site Biotech Mdecine est le site dune revue scientifique dite avec le soutien du laboratoire Amgen pour une contribution la recherche mdicale, il est ddi aux biotechnologies ainsi qu'aux innovations en immunothrapie, thrapie gnique et cellulaire. On peut donc retenir ce site. Il consacre entre autre un paragraphe sur lARN interfrence et le cancer. De mme on considre lINRA et Nature comme des sources valables. De plus, ces sites (mais aussi dautres) ont des rfrences bibliographiques scientifiques varies. Grce la bibliographie de ces sites, on peut retirer quelques articles, dont certains se sont avrs intressants dans le cadre de lhistorique.

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Site dorigine http://www.biotechmedecine.com/

Rfrences semblant intressantes de ce site S.M.ELBASHIR,J.HARBORTH,W.LENDECKEL.(2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411 (494-8). M.T.McMANUS,P.A.SHARP.(2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet 3 (737-47). http://www.ambion.com/ C.COGONI,G.MACINO.(2000). Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Genes Development. 10 (638-643). T..GURU.(2000). A silence that speaks volumes. Nature. 404 (804808). A.FIRE, S.XU, M.K.MONTGOMERY,S.A.KOSTAS, S.E.DRIVER, C.C.MELLO. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391: (806811). J.R.KENNERDELL, R.W.CARTHEW.(2000) Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nature Biotech 18: (896-898). http://www.eleves.ens.fr/ A.FIRE, S.XU, M.K.MONTGOMERY,S.A.KOSTAS, S.E.DRIVER, C.C.MELLO. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391: (806811). T.DALMAY.(2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell. 101 (543 553).

Ces sites et articles permettent dapprendre que la dcouverte du phnomne avait t faite par lquipe de Jorgensen en 1990 sur les ptunias, nous avons donc tap sur PubMed les mots cls R. Jorgensen petunia . Nous avons ainsi trouv larticle o lauteur explique sa dcouverte et les expriences faites suite celle-ci. Recherche effectue R. Jorgensen petunia Article intressant C. NAPOLI, C. LEMIEUX, R. JORGENSEN. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible CoSuppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell. 2 (279-289).

Cet article explique les manipulations faites par lquipe de Jorgensen qui voulait intensifier la couleur des ptunias. Ces manipulations reprsentent la premire manifestation du phnomne. En introduisant une copie du gne ils observent des fleurs dcolores. Ils effectuent alors dautres expriences telles que ltude des ARNm du gne concern. De mme, sachant que lobservation du phnomne chez les mammifres avait t dcrite dans un article de Nature en 2001, nous avons tap ARNi mammalian en limitant la recherche lanne 2001 et en classant les articles par journaux, ainsi nous avons rapidement trouv larticle dintrt.

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Recherche effectue ARNi mammalian

Article intressant S. M. ELBASHIR, J. HARBORTH, W. LENDECKEL, A. YALCIN, K. WEBER, T. TUSCHL. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (494-498).

Cet article explique les travaux qui ont prouv lexistence du phnomne dARNi chez les mammifres. Lquipe effectue des expriences en parallle chez la drosophile et sur des lignes de cellules mammifres. Les rsultats obtenus montrent lexistence du phnomne mais moins quantitatif que chez le drosophile Les sites Internet analyss sur Google en particulier indiquant de nombreuses expriences sur la drosophile et les nmatodes enrichissent la comprhension du mcanisme dARNi (en particulier la fin des annes 1990). Ils donnent aussi des noms dauteurs notamment A. Fire et R. W. Carthew. Nous avons donc effectu le mme type de recherches sur PubMed en utilisant les mots cls ARNi Fire ou ARNi drosophila ou ARNi C. elegans . Cependant les articles relevs ne sont pas intressants ou napportent pas un grand nombre de donnes dans le cadre de lhistorique. On effectue alors la mme recherche sur les Books, les expriences historiques tant assez anciennes pour tre dcrites dans les livres. Comme pour PubMed, les rsultats trouvs ne sont pas intressants. En effet, ils dcrivent des expriences dans lesquelles on utilise lARNi afin de comprendre la fonction des gnes par exemple, mais dans ces expriences, lARNi est un outil et la comprhension du phnomne nest pas le centre du sujet. Aprs des recherches approfondies sur ce sujet, on ne relve que peu dinformations intressantes et nous dcidons alors de ne pas dvelopper cette partie dans lhistorique. On ne fera donc quune brve explication des travaux faits sur ces espces qui ont permis une meilleure comprhension de lARNi. On relve tout de mme quelques articles jugs assez intressants pour apparatre dans la bibliographie : A.FIRE, S.XU, M.K.MONTGOMERY, S.A.KOSTAS, S.E.DRIVER, C.C MELLO. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (744-746) Dans cet article, les chercheurs comparent lefficacit de l4ARN bicatnaire et du ARN simple brin. Ils remarquent que les simples brins ont tout au plus un effet modle, alors que les mlanges dARN bicatnaire ont induit un phnomne dinterfrence efficace et spcifique. Ces expriences sont faites sur les nmatodes. Cet article ne concerne pas directement lhistorique de lARNi mais il apporte quelques informations sur les expriences faites sur les nmatodes. J.R.KENNERDELL, R.W.CARTHEW. (1998). Use of ARNdb-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 : (1017-26). Cette quipe a fait des expriences chez la drosophile. Il concerne le mme sujet que larticle prcdant mais comme celui-ci, il apporte quelques donnes pour lhistorique. C.COGONI,G.MACINO.(2000). Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Genes Development. 10 (638-643). Cet article a pour sujet le caractre universel du phnomne dARNi.

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J.R.KENNERDELL, R.W.CARTHEW.(2000) Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nature Biotech 18: (896-898). Dans cet article, le phnomne dARNi et la capacit dune cellule hriter de celui-ci sont tudis. Ces expriences sont faites dans le but dune inhibition stable du gne cibl.

4.2. Matriel et mthodes de la partie Mcanisme

- Nous avons en premier lieu fait des recherches sur Wikipedia. Larticle sur lARN interfrence donne une explication trs gnrale du principe, aborde son historique et explique le phnomne de knockdown. Cet article comprend galement un paragraphe sur le rle ventuel de lARNi en mdecine. Wikipedia est donc utile pour les recherches prliminaires mais le manque de dtails et dexplications du fait de la nouveaut du domaine tudi nous pousse effectuer dautres recherches. - En tapant RNA interference dans les books, on obtient 51 articles dans diffrents livres : 10 dans Genome et 5 dans Molecular Biology of the Cell. Ces articles restent gnraux, cela dit certains sont utiles pour se familiariser avec la mthode. Basic Genetic Mechanisms Control of gene Molecular Biology of the Cell expression. [G1]. Genomes Studying Genomes Understand a genome sequence Determining the Functions of Individual Genes . [G2].

- Nous dcidons ensuite de poursuivre nos recherches en utilisant Google. Les mots-cls ont tout dabord t trs gnraux puis au fur et mesure des recherches, nous les avons affin. En effet, en tapant RNA interference mechanism on trouve 1 900 000 rponses. On tente alors de combiner plusieurs mots-cls (le nom de chaque tape du mcanisme, les protines qui interviennent) trouvs grce aux recherches dans Wikipedia et les Books. Recherche effectue Nombre de rponses RNA interference mechanism siRNA miRNA dicer drosha 784

Nous visitons un site qui appartient the institute of cancer research et qui aborde lARNi et le silencing des gnes. Il dtaille la structure des protines Argonaute. Il donne galement des informations cristallographiques. http://www.icr.ac.uk [G3]. http://www.icr.ac.uk/research/research_sections/structural_biology/teams/barford_tea m/RNA%20Interference%20and%20RNA%20Silencing/index.shtml

http://www.biosci.ohiou.edu/mcb/RNAi%20Huang.ppt [G4]. Il sagit dune introduction sur lARN interfrence qui est trs complte puisquelle traite la dcouverte du phnomne, le mcanisme en lui-mme et les enzymes et molcules qui interviennent. Elle aborde aussi lamplification du principe par RdRP, la structure des protines du complexe RISC, la synthse et le design de siARN et enfin un exemple dapplication.

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R. F. KETTING, E.J. FISCHER, E. BERNSTEIN, T..SIJEN, J.GREGORY, H.A. PLASTERK. (2001). Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. Elegans . Genes and Development. 15 : 2654-2659. [G5]. Cet article, datant de 2001, montre que des ARNdb peuvent supprimer lexpression de gnes homolgues par lintermdiaire dun processus conserv travers lvolution : lARN interfrence (ARNi) ou silencing gnique post-transcriptionnel (PTGS). Ce mcanisme implique la dgradation dARNm cible par un complexe, qui contient des siARN denviron 22 nuclotides. Ce complexe guide la slection du substrat. Une nuclase Dicer est implique dans la formation de siARN. http://www.biochemj.org/bj/387/0561/3870561.pdf [G6]. Cet article traite la formation du complexe de RISC, sa composition et il contient plusieurs illustrations trs intressantes. http://www.biotech-medecine.com/archives/review27/actu [G7]. Comme dit prcdemment, ce site a le soutien dun laboratoire. Il possde donc une valeur scientifique. Ce site donne une approche gnrale du principe de lARNi, ainsi quun historique et le principe de la conception des siARN. http://ist.inserm.fr/basismedsci/2004/ms_4_2004/P399-01.pdf [G8] Il sagit dun site rdig par le laboratoire de biologie molculaire de Toulouse. Il contient de trs nombreuses rfrences bibliographiques. Il dcrit les miARN, donne des dfinitions et traite leur biosynthse et maturation.

Recherche effectue RNAse III drosha miRNA

Nombre de rponses 91

Y. ZENG, R.YI, B.R. CULLEN. (2005). Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha.. EMBO Journal. 24 : 138-148. [G34].

Une tape critique Durant la maturation des miARN est le processing des miARN primaires transcrits par la RNAse nuclaire Drosha. Elle gnre des prcurseurs des miARN faisant environ 60 nuclotides et en forme dpingle cheveux. La faon dont Drosha reconnat les substrats des ARN primaires et slectionne les sites de clivage nest toujours pas comprise. Dans cet article, les auteurs montrent que Drosha clive slectivement les ARN au niveau dune boucle terminale.

Recherche effectue Nombre de rponses RNA interference piwi Ribonuclase III 897

N.TAHBAZ, F.A. KOLB, H.ZHANG, K.JARONCZYK, W. FILIPOWICZ, T.C. HOBMAN. (2004). Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer. EMBO reports. 5 :189-94 [G10].

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Le domaine PAZ PIWI (PPD), avec les produits de clivage de lARN, forme une ribonucloprotine appele RISC. On pensait que le domaine PAZ et les protines de Dicer modulaient la liaison entre les protines PPD et Dicer. Cet article montre que le domaine PAZ nest pas ncessaire pour les interactions entre la protine PPD et Dicer. En fait, la liaison des protines de PPD Dicer inhibe lactivit ARNase de cette enzyme in vitro. On retrouve galement la rfrence G5. K. JARONCZYK, J.B. CARMICHAEL, T.C. HOBMAN. (2005). Exploring the functions of RNA interference pathway proteins. Biochemistry Journal. 387 : 567571. [G11]. Cet article parle des diffrents protines composant le domaine PPD, de son rle dans la voie des siARN et miARN. Il aborde galement le rle de la ribonuclase III. Enfin, il dcrit le complexe RISC. http://www.biochimie.univ-paris7.fr/master/pdf/tot_revues_2005_2006.pdf [G12]. Cest le site de linstitut de Paris de lanne 2005-2006. Il a une bibliographie importante et il informe sur limplication de Dicer et RISC dans les deux phases de lARNi. Il renseigne galement sur limplication de lARNi dans la lutte contre le VIH. Recherche effectue Dicer-1 Dicer-2 Nombre de rponses 523

LEE YS, NAKAHARA K, PHAM JW, KIM K, HE Z, SONTHEIMEREJ, CARTHEW RW.(2004). Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell.117(1):69-81 [G14].

La mutation de Dicer-1 bloque la voie des miARN alors que les mutants de Dicer-2 ne produit pas de siARN fonctionnels. Lenzyme RNase III Dicer clive lARN en siARN et miARN, ce qui induit un complexe RISC capable de provoquer le silencing. Ce complexe clive lARNm ou bloque sa transcription. Cette quipe a caractris des mutations dans les gnes dicer-1 et dicer-2 de la drosophile. La mutation de Dicer-1 bloque la formation de prcurseurs de miARN, alors que les mutants Dicer-2 sont dfectueux pour la formation de siARN fonctionnels. Il a rcemment t dcouvert que chaque Dicer se fixe un complexe RISC spcifique : siRISC ou miRISC. Dicer-1 et Dicer-2 sont ncessaires pour le clivage de lARNm.

Recherche effectue RLC RISC dicer

Nombre de rponses 161

http ://www.igmors.u-psud.fr/BBT/BBT04/BBT-12-04.pdf [G15]. Il sagit de courts extraits tous trs bien rfrencs. On y trouve la description de Dicer avec les protines Ago et les diffrents domaines ainsi que la description du complexe de Drosha.

157

Recherche effectue Protein RISC tudor-sn

Nombre de rponses 330

A.D. SCADDEN. (2005). The RISC subunit Tudor-SN binds to hyper-edited double-stranded RNA and promotes its cleavage. Nature structural and molecular biology. 12 : 489-496. [G16].

LARNi peut dclencher le phnomne dARNi ce qui provoque un silencing de lARN cible. Cet article montre une nouvelle interaction entre les composants dADAR et la voie de lARNi. Tudor-SN est une sous-unit de RISC, jouant un rle cl dans lARNi. Tudor-SN interagit spcifiquement avec un promoteur. Pour en savoir plus sur une ventuelle amplification du phnomne dARNi, nous entrons les mots-cls suivant sur Google : Recherche effectue RNAi amplification RdRP Nombre de rponses 971

P.STEIN, P.SVOBODA, M.ANGER, R.M. SCHULTZ. (2003). RNAi: Mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase. RNA. 9:187-192. [G20].

Des tudes sur des organismes mutants incapables dARNi ou de silencing montrent limplication dune polymerase dpendante de la lARN : RdRp. Cependant, des homologies de squence de ces RdRp nont pas t trouves dans des organismes coelomates comme la Drosophile ou les mammifres. Ce manque dhomologie nexclus pas des fonctions de RdRp dans lARNi dans ces organismes car RdRp peut tre acquise par transfert horizontal par un virus ARN. Le site de science direct nous permet de lire un article entier paru dans Cell. T. SIJEN, J. FLEENOR, F. SIMMER, K. L. THIJSSEN, S. PARRISH, L. TIMMONS, R. A. PLASTERK , A. FIRE. (2001). On the Role of RNA Amplification in dsRNA-Triggered Gene Silencing . Cell. 107 : 465-476 [G21]. Cest principalement daprs cet article que les informations ont t extraites. Ces chercheurs ont cherch comprendre le rle de lamplification pendant lARN interfrence dans Caenorhabditis elegans. Des analyses de siARN produits durant lARNi ont rvl une fraction substantielle qui ne peut pas driver directement de lintroduction dARNdb. Une population de siARN (appels siARN secondaires) drivent de laction de RdRP cellulaire. La distribution de siARN secondaires montre une polarit distincte (53 sur le brin antisens), suggrant un processus damplification cyclique. J.Y.ROIGNANT, C.CARRE, B.MUGAT, D.SZYMCZAK, J.A. LEPESANT, C. ANTONIEWSKI. (2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cellspecific and isoform-specific RNAi in Drosophila. RNA. 9;299-308. [G22].

158

En utilisant des transgnes exprimant des ARNdb, les chercheurs se sont demands si lARNi transitoire apparat chez la drosophile. Lexpression spcifique dARNdb mdie lARNi. Ces rsultats mettent en vidence le fait que lARNi nest pas conserv chez la drosophile.

- Nous effectuons quelques recherches sur Scirus (moteur de recherche plus scientifique que Google). En entrant les mmes mots-cls que sur Google, le nombre de rponses est plus restreint. Recherche effectue RNA interference siRNA miRNA Nombre de rponses mechanism 201 (articles de journaux)

Z.L. MA, H.Y. YANG, P.TIEN. (2003). Progress of miRNA and ist functions in eukaryotes. Yi Chuan Xue Bao. 30 : 693-696. [G23]. Cet article sintresse aux miARN et aux siARN. Diffrents miARN et certaines protines sassemblent dans un complexe miRNP, et les siARN dirige lARNm cible dans un phnomne dARNi. Des diffrences distinctes existent entre les miARN et les siARN. La rgulation du mcanisme des miARN peut tre conserve chez les eucaryotes. Ces sites ont t choisis en tudiant leur provenance ; en effet, nous avons tudi la pertinence des sites et nous nous sommes intresss uniquement aux sites de valeur scientifique reconnue. Ainsi tous les sites des instituts tels lInserm sont jugs srieux. Le site Biotech Mdecine est le site dune revue scientifique dite avec le soutien du laboratoire Amgen, il a donc une valeur scientifique sure. Dautre part, il arrive que les mots cls soient trop vastes, il a donc fallu amliorer la recherche. Google offre de nombreux sites classs par ordre de popularit. Parfois ces sites ne sont pas adapts au sujet trait. On trouve donc travers ce serveur de nombreux sites et non des articles scientifiques. En ce qui concerne le serveur Scirus, les sites trouvs ont t beaucoup plus intressants dans le sens o Scirus proposait de nombreux sites anglais dits par Pubmed ou bien par Science Direct. Sur ce dernier site, on trouve gnralement des dossiers complets sur une exprience prcise avec les photos des rsultats exprimentaux. - Nous effectuons quelques recherches sur PubMed pour complter notre rdaction : Recherche effectue Nombre de rponses targeted mRNA degradation double stranded RNA 14

T.TUSCHL, P.D ZAMOR, R LEHMANN, D.P BARTEL, P.A SHARP. (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro . Genes and development. 13 : 3191-3197. [G31].

Cest le dbut de lARNi. Le mcanisme est encore inconnu. On observe la dgradation dun ARNm spcifique par lintermdiaire dun ARN double brin et non un simple brin.

159

D. BANERJEE, F. SLACK. (2002). Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioaasays. 24 : 119-129. [G35].

Des gnes htrochroniques contrlent la dure des programmes de dveloppement. Dans C. elegans, deux gnes cls, lin-4 and let-7, codent pour des small temporal ARN (stARN) qui ne sont pas traduits en protines. Ces stARN exercent une rgulation post-transcriptionelle ngative en se liant des squences complmentaires dans la region 3UTR des gnes cibles. Les stARN sont transcrits en des ARN prcurseurs transforms par la RNase Dicer/DCR-1. Recherche effectue cleavage RNA ATP RNAi Nombre de rponses 10

P.D. ZAMORE, T. TUSCHL, P.A SHARP, D.P. BARTEL. (2000). RNAi : doublestranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 101(1): 2533. [G33]. En utilisant un systme in vitro chez la Drosophile, il a t remarqu que le clivage de lARNdb en squences de 21 23 nuclotides ncessite de lATP. Ensuite ces courts fragments guident vers le clivage de lARNm cible. NYKANEN A, HALEY B, ZAMORE PD. 2001. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell. 107 : 309-21.

Cet article tudie le rle de lATP dans lARNi. Il existe deux tapes ATP-dpendante et larticle suggre que lARNi comprend 4 phases : processing ATP-dpendant des ARNdb en siARN ; incorporation des siARN dans un complexe inactif ; transformation du complexe en un complexe actif et reconnaissance ATP-indpendante puis clivage de lARNm cible. Recherche effectue Dicer-1 miRNA Nombre de rponses 41

F.JIANG, X.YE, X.LIU, L.FINCHER, D.McKEARIN, Q.LIU. (2005). Dicer-1 and R3D1-L catalyze microRNA maturation in Drosophila . Genes and Devlopment. 19:1674-1679. [G24]. Cette tude rapporte trois informations importantes : les chercheurs ont tabli par reconstitution que les enzymes Dicer-1 et Dicer-2 de la drosophile possdent des spcificits de substrat et des besoins en ATP diffrents ; ils ont identifi une nouvelle protine se liant lARN, quils ont appele R3D1-L et qui fonctionne comme un cofacteur pour Dicer-1 ; enfin, ils ont montr que la dficience de R3D1 cause un dfaut dans le miARN. Ces rsultats indiquent que R3D1-L fonctionne en concert avec Dicer-1 en catalysant la maturation des miARN et quil est ncessaire pour le dveloppement de la Drosophile. On retrouve la rfrence G14.

160

CHEN CZ, LI L, LODISH HF, BARTEL DP. (2004) MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science. 303: 83-86. [G36].

Trois miARN ont t identifis dans des cellules hmatopotiques. Lune dentre elles, miR181, semble tre prfrentiellement tre exprime dans les lymphocyte B de la moelle osseuse de souris. Les rsultats montrent que ces miARN contrlent lexpression de protines hmatopotiques et suggre que dautres miARN doivent avoir un rle similaire dans le dveloppement des vertbrs. BRENNECKE J, HIPFNER DR, STARK A, et al. (2003). Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell. 113: 25-36. [G37].

Cette quipe a identifi que le gne pro-apoptotique hid pouvait tre inhib par le miARN batam.

Recherche effectue Protein RISC

Nombre de rponses 133

C.MATRANGA, Y.TOMARI, C.SHIN, D.P.BARTEL, P.D.ZAMORE. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes.. Cell Press. 123(4):607-20 [G17]

Les siARN dirigent la protine Argonaute2 (Ago2) pour cliver les ARNm cible correspondants, puis silencer leur expression. Ago2 est le composant catalytique du complexe enzymatique RISC. Pour chaque duplexe de siARN, seul un brin est assembl dans le RISC actif; lautre brin, le passager, est dtruit. Une hlicase ATP-dpendante a t dabord propose pour sparer les brins des siARN, puis le brin rsultant est guid pour se lier Ago2. cette tude montre que Ago2 reoit directement le siARN double brin de la machinerie RISC. Ago2 clive ensuite le brin passager du siARN. E.MANIATAKI, Z.MOURELATOS. (2005). A human, ATP-independent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes Development. 19 : 2979-2990. [G18].

LARNi est module par RISC qui est guide par des miARN ou des siARN pour cliver lARN cible. Chez lhomme, la partie catalytique de RISC est une ribonucloprotine forme par Ago2 et soit des miARN (miRNP) soit des siARN (siRNP). La nuclase Dicer produit des siARN et des miARN matures partir de pr-miARN et dARNdb. Cet article tudie lassemblage de RISC. H. KAVI, R.FERNANDEZ, W.XIE, J.A.BIRCHLER. 2005. RNA silencing in Drosophila. FEBS Letters. 579: 5940-5949. [G19]. Cet article donne des informations sur le mcanisme de la phase effectrice de la conception des siARN.

161

Recherche effectue RNAi initiation step

Nombre de rponses 12

BERNSTEIN E, CAUDY AA, HAMMOND SM, HANNON GJ. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 : 363366. [G25]. Ces chercheurs identifient lenzyme Dicer, membre de la famille des RNase III. Elle clive spcifiquement les ARNdb. Elle est compose de plusieurs domaines. Elle est trs conserve chez toutes les espces. Pour connatre la structure et les caractristiques biologiques de Dicer, nous entrons les motscls suivants : Recherche effectue Nombre de rponses Dicer structure 50 J.BLASZCZYK, J.E. TROPEA, M. BUBUNENKO, K.M. ROUTZAHN, D.S. WAUGH, D.L.COURT. ((2001) Crystallographic and modeling studies of RNase III suggest a mechanism for double-stranded RNA cleavage. Cell Press. 9: 12251236 [G26].

Dicer est tudie grce la cristallographie ; on y dcouvre ces deux domaines principalement hydrophobes. Elle cre une valle dans laquelle le substrat, lARNdb, peut venir se loger pour ensuite tre cliv par la fonction endonuclasique de lenzyme.

Pour avoir des informations complmentaires sur les miARN, nous effectuons la recherche suivante : Recherche effectue Nombre de rponses MiRNAs mechanism 115 V.N. KIM, J.W. NAM. (2006). Genomics of microRNA. Trends in Genetics. 22 : 163-173 [G27].

Dcouverts il y a tout juste une dizaine dannes, les miARN sont reconnus comme lune des familles de gnes rgulateurs chez les cellules eucaryotes. Des centaines de miARN ont t dcouverts chez les animaux, les plantes, les virus et dautres sont encore dcouvrir. Ils induisent la dgradation de lARNm ou une rpression ou les deux. Un miARN peut cibler plusieurs ARNm. Dans cet article, lquipe rsume le statut actuel des miARN et leur profil dexpression. Elle sintresse galement la structure gnique des miARN et au mcanisme de biogense. BRENNECKE J, HIPFNER DR, STARK A, et al. (2003). Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell ; 113: 25-36. [G30]. Cette quipe a identifi que le gne pro-apoptotique hid pouvait tre inhib par le miARN batam.

162

Nous faisons galement des recherches sur lamplification de lARNi dans PubMed. Recherche effectue RNA-directed RNA RNAi Nombre de rponses polymerase 51

K. NISHIKURA. (2001) A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 107 : 415-8. [G28].

Il donne une preuve supplmentaire de limplication de la RdRP dans le phnomne dARNi. Il y a une maturation aboutissant des siARN secondaires. Cette dcouverte permet de dfinir un nouveau modle dARNi dont la biosynthse empreinte une voie semblable une PCR dgnrative. Pour tre encore plus prcis, nous ajoutons un autre mot-cl : amplification. Recherche effectue RNA-directed RNA RNAi amplification Nombre de rponses polymerase 4

T. SIJEN, J. FLEENOR, F. SIMMER, K. L. THUJSSEN, S. PARRISH, L. TIMMONS, R. H. A. PLASTERK, A FIRE. (2001). On the role of RNA amplification in dsRNA-Triggered gene silencing. Cell. Vol 107. pp 465-476. [G29].

Chez C. Elegans le mcanisme damplification des siARN et miARN est compris. Lanalyse des siARN produits rvle quune partie ne drive pas directement de lARNdb introduit. En effet, une seconde gnration de siARN est produite grce laction de la RdRP. Le siARN sert de brin anti-sens la polymrase.

4.3. Matriel et mthodes de la partie Techniques de laboratoire

Pour dmarrer nos recherches sur ce sujet, nous nous sommes dabord servis du rpertoire Google Biology. Il sagit dun moteur de recherche faisant partie de Google (spcialisation de Google). La recherche se fait par catgorie Nous avons suivi le protocole suivant : Biochemistry & Molecular Biology Gene Expression RNA interference Nous avons obtenu 59 rsultats. Le site le plus pertinent est celui de la socit Ambion. N1 : http://www.ambion.com/

Ce site est sans aucun doute un site de trs grande qualit, puisque cest le site de la socit Ambion, une compagnie actuellement leader mondial dans le design et la conception des siRNA. Elle est galement leader sur le march en ce qui concerne le dveloppement et la distribution de produits innovants destins aux recherches en science de la vie bases sur 163

lARN, et la biologie molculaire. On y trouve des informations concernant plusieurs des grands chapitres que nous voulons traiter, savoir le mcanisme, lhistorique, et les techniques de laboratoires. Il nous a permis davoir une vue densemble des principes gnraux de lARN interfrence et par consquent, de dfinir les mots cls dont nous nous sommes servis par la suite. Puisque ce site nous parat tre d'un grand intrt, nous dcidons donc de nous pencher vers ses rfrences bibliographiques N2 : FIRE, S. XU, M.K. MONTGOMERY, S.A. KOSTAS, S.E. DRIVER, C.C. MELLO. (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature. 391 (6669): 806-811.

Il s'agit d'un article qui relate une exprience d'introduction d'ARN dans des cellules. On y prcise que cette technique ne peut-tre applique que dans certains systmes biologiques afin d'interfrer avec la fonction d'un gne endogne. Le mcanisme d'ARN interfrence a beaucoup t utilis chez ces nmatodes pour manipuler l'expression des gnes. Dans cet article, on nous dcrit les conditions ncessaires pour construire et administrer les ARN interfrents. Cette quipe de recherche a t trs surprise de dcouvrir que des ARN doubles brins taient significativement plus efficaces dans le mcanisme d'ARN interfrence que les ARN simples brins anti-sens. Aprs injection dans des animaux adultes, ils ont en effet dcouvert que les ARN simples brins avaient un effet plus modr que les mlanges d'ARN double. Les effets de cette interfrence taient aussi vidents chez les animaux adultes que pour leurs descendants. De plus, seulement quelques molcules d'ARN db sont ncessaires pour affecter la cellule. Ceci suggrerait donc qu'il y aurait un compos catalytique ou amplificateur dans le processus d'ARN interfrence. N3 : S.M. ELBASHIR, J. MARTINEZ, A. PATKANIOWSKA, W. LENDECKEL, T. TUSCHL. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. The European Molecular Biology Organization Journal. 20(23): 6877-6888.

Cet article dcrit notamment les diffrentes caractristiques que doit possder un siRNA pour tre le plus efficace possible (en terme de longueur, de structure, de composition chimique et de squence). On voit ainsi que les duplexes de 21 nuclotides possdant un dbordement en 3 de 2 nuclotides sont les plus efficaces dans le dclenchement de la dgradation des ARNm endognes. Dautre part, la reconnaissance de la cible est hautement spcifique, mais toutes les rgions du siRNA ne contribuent pas de la mme faon cette reconnaissance. Ainsi, au niveau du centre du siRNA, un mis matche empcherait le clivage de lARNm cible. Ce sont de nombreuses observations (et lemploi des statistiques) qui ont permis dnoncer ces rgles de base , concernant le choix de la cible des siRNA, et la conception de ces derniers. Ces observations ont t faites sur des lysats dembryons de drosophile. N4 : A.L. JACKSON, S.R. BARTZ, J. SCHLTER, S.V. KOBAYASHI, J. BURCHARD, M. MAO, L. B. CAVET, G. CAVET, P.S. LINSLEY. (2003). Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nature Biotechnology. 21(6): 6357.

Cet article nous a permis de voir que dans le mcanisme dARN interfrence, il est ncessaire que le siRNA et lARNm endogne correspondant partagent une trs forte 164

identit. Cette tude, ralise sur des cultures cellulaires humaines, avait pour but de caractriser la spcificit du silencing de lexpression gnique. Les profils de transcrits ont alors rvl quon pouvait assister un silencing de gnes non-cibls contenant seulement 11 nuclotides contigus identiques au siRNA. Ces rsultats dmontrent que les siRNA ne peuvent tre utiliss que pour des cibles ne prsentant pas de trop fortes similarits avec dautres gnes. Cette possibilit deffets non spcifiques doit donc tre prise en compte lors du design des siRNA. N5 : S.P. PERSENGIEV, X. ZHU, M.R. GREEN. (2004). Non-specific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA. 10(1):1218.

Cet article nous apprend que le plus souvent, on cr des siRNA de moins 30 paires de bases, pour viter les effets non spcifiques. De plus, il semblerait que les effets sur lexpression gnique soient dpendants de la concentration en siRNA et que les siRNA restent stables tout au long de lexprience dARN interfrence. N6 : Editors of Nature Cell Biology. (2003). Whither RNAi?. Nature Cell Biology. 5 :489-490.

Dans cet article, on voit entre autres que les siRNA sont plus efficaces que les ARN antisens dans la dgradation des ARNm cibles. Par consquent, la technique dARN interfrence est devenue rapidement la mthode de choix dans les expriences de perte de fonction . Figurent aussi dans cet article les diffrents contrles que lon peut raliser pour valider les rsultats dexpriences dARN interfrence. N7 : G. SUI, C. SOOHOO, E.B. AFFAR, F. GAY, Y. SHI, W.C. FORRESTER, Y. SHI. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(8):5515-5520.

Il sagit dun article trs intressant et qui apparat dans les rfrences de nombreux ouvrages scientifiques. On y apprend que lun des obstacles que lon peut rencontrer pour dclencher lARN interfrence dans des cellules mammifres est lactivation dune rponse anti-virale de type interfron. Celle-ci peut sobserver lorsquon utilise des dsRNA de plus de 30 nuclotides. Ceci conduit donc la dgradation non spcifique des ARNm et une rduction gnrale de la traduction protique au sein de la cellule. En consquence, les longs dsRNA ne produisent pas dactivit dARN interfrence. On y apprend aussi qu lpoque (2002), on venait juste de rsoudre ce problme, grce aux dcouvertes de Tuschl et al. Cette quipe venait, en effet de dmontrer que le silencing spcifique de gnes dans les cellules mammifres pouvait tre dclench par des siRNA synthtiss in vitro. Dans cet article, on nous dcrit donc une approche dadministration de ces siRNA base sur des vecteurs. N8 : J.Y. YU, S.L. DERUITER, D.L. TURNER. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(9):6047-6052.

Dans cette tude, les siRNA ont t synthtiss par transcription in vitro, avec la T7 RNA polymrase. Cette technique est apparemment moins coteuse que la synthse chimique des siRNA.

165

N9 : C.P. PAUL, P.D. GOOD, I. WINER, D.R. ENGELKE. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology. 20:505-508.

Dans cette tude, ont t explores les diffrentes stratgies pour exprimer un mme duplexe de siRNA, dans des cellules, partir dune construction dADN. Ces techniques permettent une expression long terme des siRNA, et donc une suppression du gne cible long terme. Le siRNA produit par un vecteurs dexpression a une structure particulire : 19 paires de base constituent la tige de la structure en tte dpingle, ces deux brins tant relis par une structure en boucle, et un dbordement se situe lextrmit 3 du brin antisens. La technique de cassette dexpression tant trs simple, et la transcription de ces produits de PCR tant rpandue dans les cellules humaines, on est en droit de penser que ce mode dadministration des siRNA puisse tre utilis pour supprimer lexpression de nombreux gnes. N10 : M. MIYAGISHI, K. TAIRA. (2002). U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3 overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells . Nature Biotechnology. 20:497-500.

Dans cet article, on apprend que si les siRNA de 21 ou 22 nuclotides avec un dbordement de 2 nuclotides en 3 provoquent effectivement un mcanisme dARN interfrence dans les cellules mammifres, cest parce que ces derniers ne sont pas reconnus par le systme immunitaire de la cellule hte comme tant des lments viraux. Dautre part, les mthodes dintroduction des siRNA synthtiques par lipofection semblent limiter lampleur du mcanisme dARN interfrence, cause de la faible efficacit de transfection dans certains types cellulaires et car les effets de silencing ne se poursuivent qu court terme. Dans cette tude, on utilise un vecteur dexpression avec un promoteur U6. N12 : S.J. REICH, J. FOSNOT, A. KUROKI, W. TANG. X. YANG, A.M. MAGUIRE, J. BENNETT, M.J. TOLENTINO. (2003). Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molecular vision. 9:210-216

Dans cette tude, on a ralis un silencing du gne du VEGF, via des siRNA introduits directement dans des cellules de rtine. Pour cela, on a ralis une co-injection dun virus recombinant contenant lADNc du VEGF, et dun autre contenant le siRNA appropri. Les effets de ce traitement in vivo (sur la vascularisation de la rtine) ont t mesurs par ophtalmoscopie. En parallle, on a ralis une tude histologique de la rtine, et les niveaux de VEGF ont t dtermins sur rtine intacte par la technique de lELISA. Les rsultats de cette tude ont t assez spectaculaires. En effet, le succs de ladministration des siRNA dans lespace subrtinien a t confirm par visualisation dune rduction significative des niveaux dEGFP dans les yeux traits de la mme manire quavec le VEGF (vecteur contenant lEGFP + vecteur contenant son siRNA correspondant). Les siRNA dirigs contre le VEGF ont effectivement rduit lexpression du transgne in vivo. Cette tude a donc permis de conclure que les siRNA pouvait tre utiliss in vitro et in vivo pour cibler un ARNm spcifique et pour rduire les niveaux de la protine dans les cellules cibles. Ce travail a donc suggr que lARN interfrence pouvait tre potentiellement utilise pour le traitement de maladies rtiniennes, notamment celles impliquant une vascularisation anormale. 166

N13 : G. DORN, S. PATEL, G. WOTHERSPOON, M. HEMMINGSMIESZCZAK, J. BARCLAY, F.J. NATT, P. MARTIN, S. BEVAN, A. FOX, P. GANJU, W. WISHART, J. HALL. (2004). siRNA relieves chronic neuropathic pain . Nucleic Acids Research. 32(5) :e49.

Dans cette tude, nous avons pu voir que lARN interfrence pouvait bloquer une douleur physiopathologique, par down rgulation dun gne endogne, exprim au niveau des neurones. Dans lexprience ralise, les siRNA ont t dlivrs avec succs dans les cerveaux des rats, via une infusion intrathcale. Ces siRNA taient dirigs spcifiquement contre le canal cationique P2X3 mut, et responsable de la douleur. Cette forme dadministration ne provoque apparemment pas deffets secondaires. N14 : E. SONG, S.K. LEE, J. WANG, N. INCE, N. OUYANG, J. MIN, J. CHEN, P. SHANKAR, J. LIEBERMAN. (2003). RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nature Medicine. 9(3):347-351.

Lapoptose mdie par Fas est responsable dun certain nombre de maladies du foie. Cette tude avait pour but dutiliser in vivo des siRNA ciblant le gne Fas, afin de protger les souris de dfaillances au niveau du foie, dans deux modles dhpatite auto-immune. Ladministration des siRNA sest faite par injection hydrodynamique. Lquipe a donc observ un silencing de Fas dans les hpatocytes de souris, et ce pour une priode de 10 jours. De plus, les hpatocytes isols de souris traites avec ce siARN semblent rsistants lapoptose quand on expose ces cellules un anticorps anti-rcepteur Fas ou quon place les cellules dans un milieu de culture avec de la concanavaline A. Dans le cas dhpatite fulminante, induite par injection danticorps dirig contre Fas, 82 % des souris traites avec le siRNa de Fas survivent + de 10 jours, alors que les souris contrle non traites meurent au bout de 3 jours. N15 : B.J. LI, Q. TANG, D. CHENG, C. QIN, F.Y. XIE, Q. WEI, J. XU, Y. LIU, B.J. ZHENG, M.C. WOODLE, N. ZHONG, P.Y. LU. (2005). Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nature Medicine. 11(9):944-951

Cette quipe de chercheurs travaille sur les infections virales qui provoquent le SARS (Severe Acute Respiratiry Syndrome). Il semblerait que lARN interfrence soit un moyen de lutte efficace de cette maladie. De puissants siRNA dirigs contre lARNm de SCV (SARS CoronaVirus) ont t designs in vitro et ont t utiliss sur le singe Rhsus macaque (Macaca mulatta). Ils ont t trs efficaces dans le silencing de ce gne. N16 : J. SOUTSCHEK, A. AKINC, B. BRAMLAGE, K. CHARISSE, R. CONSTIEN, M. DONOGHUE, S. ELBASHIR, A. GEICK, P. HADWIGER, J. HARBORTH, M. JOHN. (2004). Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432(7014):173-178.

Dans cet article, on apprend que le principal obstacle dans le silencing de gne in vivo par lARN interfrence est le moyen dadministration du siRNA. Dans cette tude, on a ralis un silencing de lexpression du gne codant pour lapolipoprotine B, grce linjection de siRNA par intraveineuse chez la souris. Lexpression de lapoB est rduite dans le foie et le jjunum. De plus, les taux plasmatiques de la protine sont diminus. Dans cette tude,

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on a aussi montr que les siRNA pouvaient silencer lapoB humaine dans des modles de souris transgniques. N17 : R.M. SCHIFFELERS, A. ANSARI, J. XU, Q. ZHOU, Q. TANG, G. STORM, G. MOLEMA, P.Y. LU, P.V. SCARIA, M.C. WOODLE. (2004). Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids research. 32(19):e149.

Les expriences dARN interfrence sont limites entre autres par la faible stabilit des siRNA dans le sang. Pour rsoudre ce problme, on a donc combin les siRNA des nano particules. Il sagit en fait dune modification chimique du siRNA. Cette technique permet daugmenter le taux dadressage correct des siRNA. Dans cette exprience, lquipe a tent de cibler la no vascularisation de tumeurs, via des siRNA ciblant le rcepteur au VEGF (Vascular Endothelial Growtn Factor). Ladministration sest faite par injection en intraveineuse au sein de la masse tumorale. Les rsultats ont montr une inhibition de langiogense tumorale et du taux de croissance de la tumeur. La plupart des autres sites que lon trouve grce Google Biology sont des sites dentreprises qui sont spcialises dans le design de kits qui permettent de raliser des expriences dARN interfrence. Ces sites napportent pas vraiment dinformations supplmentaires par rapport au site dAmbion, leader mondial dans ce domaine. Nous dcidons donc de ne pas nous servir de ces sites. Dautres sites sont trs intressants, mais ne nous donnent pas de vritables informations sur lutilisation concrte de lARN interfrence en laboratoire. Scirus est un moteur de recherche spcialis dans les sciences. Il nous a permis de combiner les mots-cls grce aux recherches avances. On peut lui demander de chercher seulement dans ses sources de journaux scientifiques ou dans toutes les pages Web quil rpertorie. Il a constitu pour nous un outil trs efficace de recherche. Nous dcidons de limiter nos recherches aux seules rfrences tires de journaux. En effet, notre but est de constituer une solide bibliographie scientifique, nous excluons donc les sites internet. Mots-cls entrs RNA experiments Nombre de rsultats (journaux) 2731 Rfrences les plus pertinentes

Le nombre de rsultats trouvs tant trs grand, on ne peut dire que notre recherche soit pertinente. En effet, avec un tel nombre de journaux, il est vident que nous ne pouvons pas tout consulter. Par consquent, nous pouvons passer ct de LA rfrence la plus approprie pour cette partie. On constate que si lon slectionne loption exact phrase , le nombre de rsultats diminue nettement et passe 350 articles. Ce chiffre reste cependant beaucoup trop lev. Il semble donc vident que nous devons affiner notre recherche en redfinissant de nouveaux mots-cls plus prcis.

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siRNA experiments

74

N18 : A.M. CHALK, C. WAHLESTEDT, E.L. SONNHAMMER. (2004). Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 319(1):264-274.

Ce rsultat est nettement plus correct. Cependant, le nombre de journaux trouvs reste trop grand. Nous regardons le premier article cit par curiosit et il nous parat trs intressant. Nous le retenons donc pour notre bibliographie. Dautre part, nous nous servons de loutil similar results pour obtenir des articles apparents celui-ci. Dans cet article, on voit que le succs des expriences dARN interfrence est dpendant du choix de la squence que lon veut cibler dans le gne. On y dcrit aussi les rgles de base pour designer un siARN efficace, comme par exemple la ncessit de dbordement en 3 dun dinuclotide ou encore un faible contenu en rsidus GC. Cette quipe de recherche a galement constitu une base de donnes, ralises partir de 30 tudes, et rpertoriant 398 siARN ciblant 92 gnes. Ils ont utilis cette base de donnes pour dfinir les rgles de design. De nombreux calculs et lemploi de statistiques ont t ncessaires pour prdire lefficacit de le siARN. Grce ces rgles, ils ont obtenu une rduction de plus de 50% de lexpression de 91 gnes et une rduction de plus de 90% pour 52 de ces gnes. Grce loutil similar results nous obtenons alors 12 articles apparents au premier. Certains dentre eux sont trs intressants et seront retenus pour constituer notre bibliographie. N19 : M. AMARZGUIOUI, J. J. ROSSI, D. KIM. (2005). Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.. FEBS letters. Vol. 579, issue 26, 5974-5981.

Il sagit dun article qui dcrit les diffrentes techniques dadministration des siARN dans les cellules mammifres. Les ARN si peuvent donc tre synthtiss de manire chimique ou par raction enzymatique (transcription in vitro) On peut aussi introduire directement des siARN ou bien des ARNsh, via des vecteurs dexpression. On nous dcrit les stratgies de design adopter pour concevoir de parfaits substrats pour lenzyme Dicer. On nous dcrit aussi les diffrentes limites ou contraintes lies chaque type de stratgie. N20 : B. G. COCKS, T.P. THERIAULT. (2004). Developments in effective application of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. Grug Discovery Today : TARGETS. Vol.3 Issue 4, 165-171.

Dans cet article, on traite entre autres des expriences dARN interfrence ralises in vivo. On voit ainsi que ce genre dexpriences commence par une manipulation des cellules souches embryonnaires. On introduit directement les siARN dans ces cellules. On obtient alors un knock-down maintenu de lexpression des gnes. Cette administration directe de siARN (ou de vecteurs contenant le siARN) dans lanimal est donc un puissant moyen dvaluer la fonction des gnes.

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On nous dcrit dans cet article, les principaux avantages et dsavantages des diffrentes techniques pour raliser des expriences dARN interfrence. On pourra galement se servir de cet article pour notre partie concernant les contraintes et limites des expriences dARN interfrence.

siRNA experiment delivery AND in vivo

AND

146

N21 : M.C. LUO, D.Q. ZHANG, S.W. MA, Y.Y. HUANG, S.J. SHUSTER, F. PORRECA, J. LAI. (2005). An efficient intrathecal delivery of small interfering RNA to the spinal cord and peripheral neurons. Molecular Pain. 1:29.

Il semblerait que cette quipe ait dvelopp une mthode trs efficace pour le silencing de gnes in vivo. Cette technique consiste en une injection dans la moelle pinire ou dans les ganglions de la racine dorsale de siARN complexs un lipide cationique. Pour cela, on a implant un cathter dans la rgion lombaire de moelle pinire de rats. C.DEMETERCO, P.ITKIN-ANSARI, B.TYRBEG, L.P.FORD, R.A. JARVIS, F.LEVINE.(2002) c-Myc controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells . The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 87 (3475-85). [C1].

A partir de lignes cellulaires endocrines pancratiques, cette quipe a montr que la diffrentiation en cellules exprimant des hormones ncessite un contact intercellulaire. Bien que la diffrentiation soit associe une diminution de la prolifration, les mcanismes de cette relation de sont pas connus. En utilisant TRM-6, une ligne cellulaire delta, et betalox5, a ligne cellulaire beta, cette quipe a montr que le contact intercellulaire et la diffrenciation endocrine menait une down-rgulation du proto-oncogne c-myc. La surexpression de c-Myc obtenu avec une protine de fusion c-Myc-oestrogene inductible provoque une augmentation de la prolifration cellulaire et une suppression de lexpression hormonale. De plus, c-Myc est exprime dans certaines cellules du pancras foetal et adulte mais est absent dans les cellules endocrines diffrencies. Le mcanisme par lequel c-Myc interfre avec lexpression hormonale peut se faire par des effets sur lhomodomaine du facteur de transcription PDX-1. Ces rsultats suggrent que c-Myc joue un rle dans le mcanisme de contact entre les cellules, par lequel la division cellulaire et la diffrenciation sont dtermines. S.M.ELBASHIR, J.HARBORTH, W.LENDECKEL, A.YALCIN, K.WEBER, T.TUSCHL.(2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (494-498). [C2].

Cet article relate les expriences qui ont prouv lexistence du phnomne dARNi chez les mammifres. Les rsultats obtenus montrent lexistence du phnomne mais moins quantitatif que chez le drosophile. Cet article a dj utilis pour lhistorique de lARNi.

T.TUSCHL, P.D.ZAMORE, R.LEHMANN, D.P.BARTEL, P.A.SHARP (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes and Development. 13 (3191-3197). [C3]

Les ARNdb dirigent le phnomne de silencing de faon gne-spcifique. Dans cette tude, 170

les chercheurs dcrivent le dveloppement dun systme cellulaire provenant dembryons de drosophile qui rcapitule certaines proprits de lARNi. Linterfrence observe dans cette reaction est squence spcifique. De plus, la princubation de lARNdb potentialise son activit. Ces rsultats dmontrent que lARNi peut tre mdie de faon squence-spcifique. Pour avoir un esprit plus critique sur le sujet nous dcidons de tourner nos recherches vers les limites que lon peut rencontrer concernant les expriences dARN interfrence. Dans Google, nous avons tout dabord entr la recherche suivante : siRNA efficiency pour tenter de trouver les problmes gnraux rencontrs lors dexpriences avec les siARN. Nous obtenons 246 000 rponses, mais nous consultons le premier lien car il sagit dun article scientifique [C4]. Recherche effectue siRNA efficiency Nombre de rsultats 246 000

N.SMART, P.J.SCAMBLER, P.R.RILEY. (2004). A rapid and sensitive assay for quantification of siRNA efficiency and specificity. Biological Procedures Online. Volume 7 ;1 :7. [C4].

Dans cet article, une quipe de chercheurs sinterroge sur le fait que plusieurs gnes peuvent tre simultanment cibls par les siARN, et cela peut compromettre linterprtation correcte de la fonction des gnes cause de la non-spcificit de la raction. Ils ralisent des expriences intressantes pour tester la spcificit des siARN. Nous dcidons ensuite deffectuer nos recherches laide de PubMed car les autres rsultats trouvs avec Google ne sont que des sites .com auxquels on ne peut pas se fier. En entrant la recherche suivante dans PubMed siRNA disadvantages , nous obtenons 7 rponses. Nous dcidons alors de consulter les articles pour tablir quelques limites des siARN auxquelles des chercheurs ont ventuellement du faire face. Recherche effectue siRNA disadvantages Nombre rsultats 7 de Articles intressants C5 : I.MALIK, M.GARRIDO, M.BAHR, S.KUGLER, U.MICHEL. (2006). Comparison of test systems for RNAinterference. Biochemical and Biophysical Research Communications. 341: (245-256). C6 : X.TIAN, P.ZHANG, M.J.ZAMECKGLISZCZYNSKI, K.L.BROUWER. (2005). Knocking down transport: applications of RNA interference in the study of drug transport proteins. Drug Metabolism Review. 37:705-723. C7 : B.R.CULLEN. (2004). Derivation and function of small interfering RNAs and microRNAs. Virus research. 102 (3-9)

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Un premier article [C5] montre quune diffrence de seulement quelques nuclotides dans la squence de lARN cible peut modifier lefficacit dun siARN et teste diffrentes combinaisons de promoteurs, rapporteurs et squences cibles. Le second article sintresse lapplication de lARNi dans le transport de protines et value les avantages et dfauts de cette technologie. [C6]. Le troisime article ne se rvle pas tre intressant pour notre sujet car il traite des caractristiques physico-chimiques doligonuclotides dalbumine en tant que systme de dlivrance. Le quatrime article fait une comparaison entre 3 techniques : l'utilisation dun inhibiteur ZM447439, lARN interfrence et la surexpression dun mutant catalytique pour inhiber une protine. Il ne traite donc pas spcifiquement du phnomne dARNi. Le cinquime article semble intressant car il traite la fois des siARN et des miARN en tudiant leur fonction. Il analyse les avantages et dfauts de chacun de ses outils. [C7]. Le sixime article se focalise sur les modifications chimiques susceptibles daugmenter lefficacit des siARN, des oligo anti-sens. Cet article se rvle trop complexe car nous ne possdons pas suffisamment de connaissances en matire de chimie, synthse organique Le dernier article concerne lutilisation des rtrovirus pour introduire les siARN, dont un en particulier mais il ne se rvle pas assez intressant.

Nous dcidons deffectuer la mme recherche sur Scirus pour tenter dobtenir dautres articles intressants. Nous obtenons 84 articles scientifiques. 1 article dans la premire page semble tre intressant. Recherche effectue siRNA disadvantages Nombre de rsultats 84

C.MARK.(2003).RNA interference: a practical approach. The Journal of Surgical research. 117(2):339-44 [C15].

De nouvelles techniques de biologie molculaire ont volu pour trouver une approche pratique de lARNi. Cet article prsente un guide pratique pour designer et raliser des expriences dARNi. Il rsume les mcanismes utilisant lARNi dans les cellules de mammifres et suggre des critres pour faciliter la slection de squences cibles. Nous tapons ensuite dans Scirus siRNA non-efficiency pour trouver des cas o les siARN ne fonctionnent pas. Nous obtenons 563 rponses. Un article semble intressant car il liste des facteurs qui affectent lefficacit des siARN. Recherche effectue Nombre de rsultats siRNA non- 563 efficiency P.PANCOSKA,Z.MORAVEK,U.M.MOLL.(2004). Efficient RNA interference depends on global context of the target sequence: quantitative analysis of silencing efficiency using Eulerian graph representation of siRNA. Nucleic Acids Research. 32 : 1469-1479. [C8].

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Plusieurs aspects du silencing par les duplexes siARN influencent lefficacit du silencing. Ils peuvent tre diviss en 2 catgories, une incluant des facteurs-cellulaires spcifiques et des facteurs molculaires de lARNi. Lhybridation thermodynamique est le facteur dominant. Cet article utilise une reprsentation eulrienne des siARN. Cette mthode reprsente une volution du design des siARN. Cet article fait rfrence dautres articles scientifiques, dont un de Elbashir. Connaissant limportance des travaux de ce chercheur, nous dcidons de lire cet article. Il sagit de larticle suivant : J.HARBORTH, S.M.ELBASHIR, K.VANDERBURGH, H.MANNINGA, S.A.SCARINGE, K.WEBER,T.TUSCHL.(2003). Sequence, chemical and structural variation of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing. Antisense Nucleic Acid Drug Development. 13 : 83105. [C12].

Cet article traite dune exprience de silencing chez lhomme et chez la souris et montre quil y a des diffrences de rduction dexpression de la protine selon le type de lignes cellulaires utilises. Larticle [C8] renvoie un autre article intressant qui sinterroge sur lefficacit des siARN selon la mthode de transfection. [C13]. Nous effectuons des recherches sur le site de John Libbey. En tapant siRNA limitation , nous obtenons un article trs complet sur linactivation des gnes par ARN interfrence. Il sagit dun article publi dans Hmatologie. A.CHAUCHEREAU, A.HAREL-BELLAN.(2004). Inactivation fonctionnelle des gnes par ARN interfrence . Hmatologie. 10(1) :68-79. [C9]. Une partie sur les limitations des siARN est aborde. Cet article possde des rfrences intressantes : A.J.BRIDGE, S.PEBERNARD, A.DUCRAUX, A.L.NICOULAZ, R.IGGO.(2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nature Genetics; 34: (263-4). [C10]. Les vecteurs ADN expriment des shARN pour des promoteurs de Pol III sont un outil prometteur pour rduire lexpression des gnes dans les cellules de mammifres. Les shARN sont transforms en siARN de 21 nuclotides qui guide le clivage dARNm. Bien quon pense que les siARN sont trop courts pour induire une rponse interfron, dans cette tude, un nombre non ngligeable de vecteurs shARN peut dclencher une rponse de ce genre. C.A.SLEDA, M.HOLKO, M.J.DE VEER, R.H.SILVERMAN, B.R.WILLIAMS. (2003). Activation of the interferon system by short-interfering RNA . Nature Cell Biology. 5 : (834-9). [C11].

Dans cette tude, les chercheurs trouvent que la transfection des siARN rsulte en une activation interfron de la voie Jak-Stat et une uprgulation globale de gnes stimuls par IFN. Cet effet est mdi par une protine kinase dpendante des ARNdb, PKR, active par des siARN et ncessaire pour luprgulation de IFN-beta. De plus, en utilisant des lignes

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cellulaires dficitaires en composants spcifiques de IFN, le mcanisme est indpendant du systme interfron. En lisant un des articles, nous avons trouv un autre synonyme de limits ou disadvantages , il sagit de constrictions . Nous tapons donc ce terme dans Scirus et nous obtenons 7 rponses. Recherche effectue siRNA constrictions Nombre de rsultats 7

M.AMARZGUIOUI, J.ROSSI, K.DONGHO. (2005). Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS letters. 579 (26) : 5974-5981 [C16]. Les chercheurs ont labor les stratgies rationnelles que des ARNdb de 27 paires qui sont des substrats de Dicer. Lexpression de shARN ou de siARN dans des cellules de mammifres peut tre ralise travers la transcription des promoteurs de Pol II ou Pol III. Il existe certaines contraintes dans le design de tels vecteurs, qui sont dcrites dans cet article. Cet article fournit une approche possible pour optimiser lARNi. Il est hautement probable que certaines approches dcrites seront applicables linhibition par lARNi et le silencing.

4.4. Matriel et mthodes de la partie Applications Cancer

Nous avons dbut nos recherches sur les applications possibles de lARN interfrence dans le domaine du cancer, en nous servant de loutil Google Biology. Nous avons suivi le protocole suivant : Biochemistry & Molecular Biology Gene Expression RNA interference On obtient alors 60 rsultats, soit un de plus que lors de notre dernire recherche sur Google biology pour les techniques de laboratoire. Aucun rsultat ne nous parat intressant, puisque tous le sites traitent du mcanisme dARN interfrence en gnral, mais pas des applications possibles en terme de thrapie anticancreuse. Nous utilisons par la suite le moteur de recherche Google, pour aller sur le site du NCI (National Cancer Institute), spcialis dans le domaine du cancer. En tapant les mots-cls siRNA cancer target , nous obtenons 42 rponses. Notre but est davoir un aperu gnral sur les cibles potentielles de lARN interfrence qui sont impliques dans le phnomne de cancrisation. Parmi les sites renvoys, 1 seul correspond notre recherche. http://ccr.cancer.gov/news/frontiers/march2005/print_carcin.html

Il sagit dun site trs intressant qui nous dcrit le rle de la Thymidylate Synthase (TS) dans ltiologie des cancers. Cette enzyme est implique dans la synthse de lADN. Des

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tudes ont montr que la surexpression de cette enzyme tait corrle une croissance cellulaire anarchique, et donc la formation de tumeurs. Il semblerait donc que cette enzyme puisse constituer une cible de choix pour le mcanisme dARN interfrence. Les autres rfrences ne correspondent pas vraiment ce que nous attendons. Beaucoup dentre elles traitent des techniques qui amliorent la transfection des siARN, notamment via les nano particules, mais ne nous donnent pas vraiment des cibles potentielles contre lesquels peuvent tre dirigs des siRNA. Nous dcidons alors deffectuer une recherche plus gnraliste sur Scirus. Nous commenons par limiter nos recherches aux sources internet (Preferred Web Sources), afin dobtenir des informations plutt gnrales sur le sujet. Recherche effectue siRNA cancer target knockdown therapy Nombre de resultats trouvs 415

Le nombre de rsultats est relativement lev, mais il ne sagit l que de premires recherches destines nous apporter une culture de base sur le sujet. Nous effectuons en parallle la mme requte sur Google Scholar. A ce stade, notre stratgie est de visionner un maximum de sources, afin de constituer une liste non exhaustive de gnes qui pourraient tre cibls par le mcanisme dARN interfrence, dans le cadre du traitement du cancer. Grce cette recherche, nous slectionnons quelques darticles, qui proposent des cibles potentielles pour lARN interfrence. Notre choix sest port sur ces articles car ils sont reprsentatifs de lensemble des sources renvoyes par cette requte, en dautres termes, ils traitent des principales cibles potentielles du cancer qui sont tudies lheure actuelle. M. JIANG, J. MILNER. (2002). Selective silencing of viral gene expression in HPV- positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference . Oncogene. Vol.21, n39, 6041-6048. L. ZHANG, N. YANG, A. MOHAMED-HADLEY, S.C. RUBIN, G. COUKOS. (2003). Vector-based RNAi, a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 303(4):1169-1178. L. KONNIKOVA, M. KOTECKI, M.M. KRUGER, B.H. COCHRAN. (2003) Knockdown of STAT3 expression by RNAi induces apoptosis in astrocytoma cells. BMC Cancer. 3:23. Y.H. WANG, S. LIU, G. ZHANG, C.Q. ZHOU, H.X. ZHU, X.B. ZHOU, L.P. QUAN, J.F. BAI, N.Z. XU. (2005). Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research. 7(2):R220-R228. K.C. GOH, H. WANG, N. YU, Y. ZHOU, Y. ZHENG, Z.Y. LIM, K. SANGTHONGPITAG, L. FANG, M. DU, X. WANG, A.B. JEFFERSON, J. ROSE.

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(2004). PLK1 as a potential drug target in cancer therapy. Drug Development Research. Vol.62, Issue 4, 349-361. Aprs cette consultation rapide de ce qui pouvait se faire en terme de thrapie anticancreuse base dARN interfrence, nous choisissons donc les cibles potentielles pour le mcanisme dARN interfrence que nous allons dvelopper. Nous divisons alors notre travail venir en quatre principales parties : - les oncognes - p53 mut - les tlomerases - le VEGF (facteur de croissance des cellules endothliales) le VEGF Pour nous faire une ide de la fonction prcise du VEGF dans le phnomne dangiogense tumorale, et donc dans le processus de cancrisation, nous commenons par lancer une requte gnrale sur le VEGF. Nous utilisons pour cela loutil PubMed, hberg par le serveur du NCBI (National Center for Biotechnology Information). Il sagit dun outil de recherche bibliographique trs puissant. Grce cet outil, il est possible de rechercher avec un nom dauteur particulier ou dans un journal prcis. Ceci se fait grce longlet Limits . Dans ce mme onglet, nous avons galement pu choisir seulement les articles qui contenaient les mots cls dans le titre ou labstract. Longlet Details est galement trs intressant, puisquil permet de vrifier comment notre requte a t interprte. Pour combiner nos diffrentes recherches, nous nous sommes servis de longlet History .

Recherche effectue #1 : VEGF function #2 : VEGF function angiogenesis #3 : cancer #2 AND #3

Nombre de rsultats trouvs 14.071 6.732 1.840.844 3.452

Malgr cette stratgie, il reste toujours trop de rsultats. Nous dcidons alors dimposer une limite. En effet, dans notre rapport du premier semestre sur les thrapies anticancreuses cibles, nous avons pu constater que Judah FOLKMAN tait lun des chercheurs les plus minents dans le domaine de langiogense tumorale. Il semblerait donc judicieux de limiter notre dernire requte (#2 AND #3) aux seules publications de cet auteur. Recherche effectue #2 AND #3 AND (Folkman, Judah[Auth]) Nombre de rsultats trouvs 22

Nous obtenons alors 22 rsultats. Daprs les titres des articles, nous arrivons facilement ne slectionner que ceux qui nous intressent. Nous ne garderons quun seul article qui traite du VEGF et de son rle dans la prolifration des cellules endothliales. N22 : R.A. ROSENTHAL, J.F. MEGYESI, W.J. HENZEL, N. FERRARA, J. FOLKMAN. (1990). Conditioned medium from mouse sarcoma 180 cells contains vascular endothelial growth factor. Growth Factors. 4(1):53-59. 176

Il sagit dune tude o il a t dmontr que des cellules de sarcome 180 places dans un milieu de culture adquat, en prsence de cellules endothliales, induisaient la prolifration de ces cellules endothliales. On a ainsi mis en vidence le facteur de croissance libr par ces cellules de sarcome de souris, le VEGF. Il a depuis t caractris comme tant un facteur de croissance spcifique des cellules endothliales. Ce facteur est donc scrt par les cellules cancreuses, libr dans le milieu, puis va effectuer son action sur les cellules endothliales en se fixant sur son rcepteur spcifique. Nous effectuons alors la mme recherche, en prenant cette fois pour limite le nom de lauteur N. FERRARA, un autre chercheur qui a aussi beaucoup travaill sur le VEGF et son implication dans langiogense tumorale. Recherche effectue #2 AND #3 AND (Ferrara N[Auth]) Nombre de rsultats trouvs 38

Cette recherche nous permet de slectionner 2 articles de lauteur qui nous permettront de rdiger notre introduction sur le VEGF, facteur de croissance des cellules endothliales. N23 : N. FERRARA. (2004). Vascular endothelial growth factor as a target for anticancer therapy .Oncologist. 9, suppl 1: 2-10.

Dans cette tude, on voit que le dveloppement des mtastases est dpendant de la mise en place de nouveaux vaisseaux sanguins au sein de la tumeur. Parmi tous les facteurs de croissance qui rgulent langiogense normale et tumorale, le VEGF semble jouer un rle cl. Dailleurs, sa surexpression dans des cellules cancreuses est corrle un mauvais pronostic. Cette tude avait donc pour but de dmontrer que le VEGF pourrait constituer une cible de choix pour des thrapies anti-cancreuses cibles. N24 : N. FERRARA. (2002). Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis : therapeutic implications . Seminars in oncology. 29(6 Suppl 16):10-4.

On apprend dans cette tude que les cellules endothliales expriment un fort taux de rcepteurs au VEGF. La liaison du VEGF ces rcepteurs induit la prolifration, et la migration des cellules endothliales. Ce sont dailleurs deux vnements cls dans le dveloppement de no-vaisseaux, et par la suite de tumeurs. De plus, il a t dmontr que le VEGF-A augmentait la permabilit des vaisseaux, ce qui contribue aussi linduction de langiogense et la croissance tumorales. Nous utilisons par la suite loutil Google Scholar. Cest un trs bon outil de recherche bibliographique puisquil nous permet davoir accs un nombre non ngligeable darticles entiers, et gratuits. Un des principaux atouts de Google Scholar est son lien Cited By, situ en dessous de chaque rfrence renvoye. Ce lien nous permet donc daccder dautres articles qui ont cit cet article dans leurs rfrences bibliographiques. Ceci fournit donc un gage de qualit pour la rfrence slectionne. La nouvelle version Beta a une mthode de classement des rfrences par ordre de pertinence Recherche effectue siRNA cancer VEGF Nombre de rsultats trouvs 1.650

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Le nombre de rsultats trouvs est lev. La recherche effectue nest, par consquent pas stratgique. Grce loutil Advanced Scholar Search , nous dcidons de relancer cette requte, en la limitant avec un nom dauteur, celui de Florence CABON. En effet, notre tuteur, M. PAGES, nous a indiqu, lors dun prcdent entretien, quil serait judicieux de chercher les publications de cet auteur, car elle est une rfrence dans le domaine de linhibition de langiogense comme thrapie anticancreuse cible. Nous obtenons ainsi 4 articles de Florence Cabon. Recherche effectue siRNA cancer VEGF author:Cabon Nombre de rsultats trouvs 4

N25 : S. FILLEUR, A. COURTIN, S. AIT-SI-ALI, J. GUGLIELMI, C. MERLE, A. HAREL-BELLAN, P. CLEZARDIN, F. CABON. (2003). SiRNA-mediated Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor Severely Limits Tumor Resistance to Antiangiogenic Thrombospondine-1 and Slows Tumor Vascularization and Growth. Cancer Research. 63, 3919-3922.

Cet article est cit par 8 autres articles scientifiques. Ceci prouve donc de la qualit des rsultats qui y ont t dmontrs. Dans cet article, on voit que depuis quelques annes, plusieurs laboratoires ont dvelopp des molcules antiangiogniques, qui bloquent la prolifration des tumeurs, par inhibition de leur no-vascularisation. Il existe naturellement dans le corps, des molcules antiangiogniques, comme la thrombospondine-1(TSP1) qui est produite par la tumeur ellemme, mais aussi par les cellules normales. On peut se demander comment la tumeur va faire pour se dvelopper, si elle scrte elle-mme des facteurs visant sa rduction. En fait, les cellules tumorales scrtent une balance dinducteurs et dinhibiteurs de langiogense. Ainsi, la tumeur produit de grosse quantits dun agent spcifique : le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Il sagit dun facteur de croissance des cellules endothliales, qui va donc permettre le dveloppement dun nouvel arbre vasculaire au sein de la tumeur. Les quantits libres de ce facteur sont suffisantes pour contrebalancer et mme surpasser celles de linhibiteur TSP1. Dans cette tude, on a utilis un siARN dirig contre le VEGF, pour dclencher le mcanisme dARN interfrence. Lquipe de recherche sest galement demande si une inhibition de la production de VEGF (via lARNi) tait corrle une prvention du dveloppement de rsistance la TSP1. Ladministration des siARN sest faite par injection systmique dans des cellules de fibrosarcomes. Les rsultats ont montr que les siARN rduisaient effectivement la croissance de ces tumeurs. Dautre part, on a constat que ladministration de siARN ciblant le VEGF empchait lapparition de rsistance des cellules tumorales pour le facteur TSP1. Les 3 autres articles sont trs intressants, mais ne correspondant pas notre sujet. Il sagit en fait dtudes fondamentales ralises sur le VEGF et la TSP1, deux facteurs cls dans le phnomne dangiogense tumorale. Ces tudes ne traitent cependant pas de lARN interfrence comme application thrapeutique contre le cancer. Nous nous servons ensuite de loutil PubMed, afin de trouver dautres tudes qui ont montr des rsultats intressants concernant le ciblage du VEGF comme moyen dinhiber la croissance tumorale.

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Recherche effectue siRNA VEGF cancer

Nombre de rsultats trouvs 81

Le premier article est une tude qui ressemble beaucoup celle mene par lquipe de Florence CABON. Les rsultats de ces deux tudes sont comparables. N26 : A.L. MULKEEN, T. SILVA, P.S. YOO, J.C. SCHMITZ, E. UCHIO, E. CHU, C. CHA. (2006). Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor: effects on cellular proliferation in colon cancer cells . Archives of Surgery. 141(4): 367-374.

Dans cette tude, on transfect des cellules humaines de cancers du colon (ligne cellulaire RKO) avec un siARN dirig contre le VEGF-A. On a alors valu lexpression du VEGF et de son rcepteur (VEGFR-2) dans ces cellules. Les rsultats ont montr que naturellement, les cellules RKO du cancer du colon exprimaient la fois le VEGF et son rcepteur. Ces mmes cellules transfectes avec le siARN ciblant le VEGF ont montr un knock-down de 94 % de lexpression du VEGF, et une diminution de 67 % de la prolifration cellulaire. Quand on regarde la liste des 80 autres articles, on saperoit trs vite que beaucoup dentre eux ne concernent pas vraiment notre sujet, car il sagit dtudes fondamentales mens sur le VEGF et de stratgies dinhibition de langiogense qui ne font pas appel au mcanisme dARN interfrence. Nous dcidons donc dadopter une nouvelle stratgie, afin de ne garder que les articles qui traitent de lARN interfrence. Pour cela, nous lanons 2 requtes en parallle : Recherche effectue #1 : siRNA VEGF #2 : targeted therapy cancer #1 AND #2 Nombre de rsultats trouvs 158 7.604 8

Puis, grce loutil History , nous combinons nos deux dernires requtes. Nous obtenons un rsultat trs satisfaisant, puisque seulement 8 articles nous sont renvoys. Le premier article est celui de Mulkeen et al. dont nous avons dj parl. Puis nous trouvons 2 articles intressants. N27 : H. GUAN, Z. ZHOU, H. WANG, S.F. JIA, W. LIU, E.S. KLEINERMAN. (2005). A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor inhibits Ewings sarcoma growth in a xenograft model. Clinical Cancer Research. 11(7):2662-2669.

Langiogense tumorale joue un rle cl dans le dveloppement des mtastases. Son inhibition est actuellement une thrapie anticancreuse trs prometteuse. Cette tude a t ralise sur des cellules de sarcome humain dEwings TC71 qui surexpriment le VEGF. On a transfect ces cellules avec un vecteur dexpression contenant un siARN dirig contre le VEGF. On a lors observ une inhibition de 80% de lexpression de lisoforme VEGF 165, et une diminution de 98 % de la production de la protine VEGF. En revanche, on na observ aucun changement de lexpression du VEGF 189. Dautre part, la prolifration et la migration de cellules endothliales places dans un milieu de culture contenant le lysat

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des cellules transfectes avec le siARN ont t significativement rduites, par rapport aux cellules endothliales places dans un milieu optimum pour leur prolifration. Cette quipe de recherche a galement ralises une injection de cellules transfectes dans des souris nude athymiques. Les rsultats ont alors montr que la croissance tumorale tait nettement rduite chez ces souris, en comparaison avec des souris injectes avec des cellules TC71 contrle. L encore, la densit en vaisseaux, dtermine par des analyses immunohistochimiques, a t grandement rduite. Des Western blot ont permis de montrer que le taux dexpression du VEGF 165 avait aussi diminu.

N28 : R.M SCHIFFELERS, A. ANSARI, J. XU, Q. ZHOU, Q. TANG, G. STORM, G. MOLEMA, P.Y. LU, P.V. SCARIA, M.C. WOODLE. (2004). Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Research. 32(19):e149.

Cet article est trs intressant. Il sagit dune tude qui avait pour but damliorer ladministration des siARN aux cellules cibles (dans ce cas, les cellules cancreuses), daugmenter leur stabilit plasmatique, et de diminuer les stimulations non-spcifiques du systme immunitaire (rponse interfron). En effet, ces paramtres sont actuellement les obstacles qui restent franchir pour rendre les expriences dARN interfrence optimum. Pour rsoudre ces problmes, lquipe de recherche a propos un modle de nano particules stabilises adaptes aux siARN. Cet assemblage sest fait avec un siARN dirig contre le rcepteur au VEGF : VEGFR-2. Le complexe sest rvl tre un trs bon moyen pour cibler la novascvularisation des tumeurs, et donc inhiber le phnomne dangiogense tumorale. Les rsultats ont montr que ladministration cible aux cellules tumorales dpendait de la prsence du ligand complex au siARN. Une administration intraveineuse a t ralise au niveau de la tumeur de souris. On a alors observ une absorption des siARN spcifiquement par les cellules constituant la tumeur. De plus, les siARN ont montr une rduction de lexpression de la protine VEGFR-2 spcifiquement au niveau de la tumeur. Enfin, cette diminution tait corrle avec une rduction de la croissance de la tumeur et du phnomne dangiogense. Ces rsultats ont donc prouv que le ciblage du tissu tumoral spcifiquement a t trs efficace, et ce, grce aux nano particules. Cette tude a ainsi lanc lide quil tait facilement possible damliorer ladministration tissu spcifique des siARN. Enfin, nous avons recours loutil Scirus. Nous dcidons dimposer une limite pour la requte que nous lanons. Ainsi, nous dcidons de limiter les rsultats renvoys aux seuls articles qui contiennent les mots cls entrs dans le titre de larticle. Dautre part, nous limitons la recherche aux articles scientifiques, et liminons les pages internet (cases dcoches). Recherche effectue title:siRNA AND (title:VEGF OR title:VEGFR) Nombre de rsultats trouvs 5

Nous obtenons grce cette stratgie 5 articles qui sont tous trs intressants. Cependant, certains dentre eux traitent de problmes oculaires lis une no vascularisation anarchique, et pas du cancer. Nous gardons par consquent 1 seul de ces 5 articles pour constituer notre bibliographie.

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N29 : F. NIOLA, C. EVANGELISTI, L. CAMPAGNOLO, S. MASSALINI, M.C. BUE, A. MANGIOLA, A. MASOTTI, G. MAIRA, M.G. FARACE, S.A. CIAFRE. (2006). A plasmid-encoded VEGF siRNA reduces glioblastoma angiogenesis an dits combination with interleukin-4 blocks tumor growth in a xenograft mouse model . Cancer Biology and Thearpy. 5(2):174-179.

Cette tude a t ralise sur des cellules de glioblastomes, dont le dveloppement biologique et la progression est dpendante du phnomne dangiogense. On a utilis un siARN dirig contre le VEGF afin de diminuer la scrtion de ce facteur de croissance par les cellules. Ladministration sest faite grce un vecteur dexpression. Lefficacit dadministration au sein de la tumeur a t augmente par lutilisation dune nano particule, le PEI. Les rsultats ont montr que ces agents permettaient de rduire significativement la vascularisation de tumeurs xnogreffes sur des souris. On na cependant pas not de rduction de la croissance tumorale. Cette quipe a ensuite tent de renforcer leffet in vivo des siARN, en les combinant un traitement un agent anti-angiognique bien connu : linterleukine 4 de souris (mIL4). On a donc ralis des co-transfections dans des cellules U87. Les rsultats montrent alors une diminution nette de la croissance tumorale sur des tumeurs greffs en sous-cutane sur des souris.

les oncognes Nous dbutons nos recherches, en nous servant de loutil PubMed. #1 : siRNA oncogene #2 : targeted therapy cancer #1 AND #2 910 7.613 30

Sur les 30 articles renvoys, nous en slectionnons certains qui cadrent plus dans le type de rsultats dtudes que nous recherchons. N30 : Y.H. WANG, S. LIU, G. ZHANG, C.Q. ZHOU, H.X. ZHU, X.B. ZHOU, L.P. QUAN, J.F. BAI, N.Z. XU. (2005). Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research. 7(2):R220-228.

Il sagit dune tude trs intressante qui a t ralise sur des cellules de cancers du sein (MCF-7). On a remarqu une forte expression de loncogne c-Myc dans ce type de cancer. Pour mieux comprendre le rle de cet oncogne dans le maintien du phnotype malin, cette quipe de recherche a ralis une exprience dARN interfrence. Pour cela, ils ont conu des siARN dirigs contre c-Myc. Le but de cette tude tait donc dexaminer les effets antitumoraux de cette stratgie, visant rduire les niveaux de la protine c-Myc dans des cellules MCF-7. Ladministration des siARN sest faite laide dun vecteur dexpression contenant le promoteur Pol III. Des Western blot ont t raliss afin de quantifier les niveaux de la protine c-Myc. Les effets du silencing de c-Myc sur la croissance tumorale ont t dtermins grce des expriences in vivo ralises sur la souris nude. Des analyses de fluorescence ont permis de visualiser le phnomne dapoptose des cellules. Les rsultats ont montr que les siARN dirigs contre c-Myc permettaient une rduction significative (plus de 80%) de lexpression de c-Myc dans les cellules MCF-7. On a observ

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en parallle une diminution du taux de croissance de ces cellules et une inhibition de la croissance tumorale dans la souris nude. Ces rsultats ont permis de conclure que c-Myc avait un rle primordial dans le dveloppement des cancers du sein. Afin dobtenir de plus amples informations sur loncogne c-Myc et sur la possibilit de son knock down pour rduire la croissance tumorale, nous lanons une autre recherche en parallle. Recherch effectue siRNA c-Myc cancer therapy Nombre de rsultats trouvs 18

Sur ces 18 articles renvoys, seul deux dentre eux correspondent effectivement des expriences de silencing de loncogne c-Myc. Nous slectionnons lun dentre eux pour constituer notre bibliographie. N31 : R. PONZIELLI, S. KATZ, D. BARSYTE-LOVEJOY, L.Z. PENN. (2005). Cancer therapeutics : targeting the dark side of Myc . European Journal of Cancer. 41(16):2485-2501.

Cette revue rsume les rcents progrs qui ont t fait rcemment concernant la comprhension de la function de c-Myc, en tant que facteur de transcription, ainsi que ses interactions avec des protines cl. On y dcrit aussi limplication de sa forme oncognique dans la tumorigense. Cette revue dcrit en parallle les diffrents outils dont on dispose lheure actuelle pour inhiber lexpression de c-Myc, et notamment le mcanisme de lARN interfrence. Si lon revient sur notre prcdente recherche effectue sur PubMed concernant le ciblage des oncognes par lARN interfrence : #1 : siRNA oncogene #2 : targeted therapy cancer #1 AND #2 910 7.613 30

On trouve un autre type doncogne qui constitue une potentielle cible : PLK1.

N32 : X.H. CHEN, B. LAN, Y. QU, X.Q. ZHANG, Q. CAI, B.Y. LIU, Z.G. ZHU. (2006). Inhibitory effect of Polo-like kinase 1 depletion on mitosis and apoptosis of gastric cancer cells. World Journal of Gastroenterology. 12(1):29-35.

Il sagit dune tude trs rcente ralise par une quipe de recherche chinoise sur loncogne PLK1 (Polo-Like Kinase 1). Il sagit dune srine/thronine kinase qui joue un rle important dans de multiples phases du processus de mitose des cellules de cancer gastrique. On a cherch dans cette tude observer les effets de linhibition de lexpression de PLK1 sur la mitose et sur lapoptose des cellules de cancer gastrique. Pour cela, lquipe a bloqu lexpression de PLK1 par la technique de lARN interfrence. Les niveaux dexpression de PLK1, cdc2, de la cycline B et de la caspase 3 ont t dtects par Western blot. Les rsultats ont montr que le knock-down de PLK1 tait corrl une rduction de la prolifration cellulaire et une augmentation du phnomne dapoptose. Cette tude a 182

permis de conclure que PLK1 tait potentiellement utilisable comme agent thrapeutique pour cibler les cancers gastriques. Afin davoir quelques informations supplmentaires sur loncogne PLK1, nous lanons donc en parallle une recherche sur Scirus. Pour cela, nous limitons notre recherche aux seuls articles de journaux. PLK1 oncogene deregulation cancer 16

Un de ces articles nous semble trs intressant et nous apporte les informations que nous recherchions. N33 : F. ECKERDT, J. YUAN, K. STREBHARDT. (2005). Polo-like kinases and oncogenesis. Oncogene. 24(2):267-276.

Dans cet article, on apprend que les Polo-like Kinases sont une famille multi gnique compose de plusieurs membres, PLK1 tant ce jour le membre le mieux caractris de la famille. Les PLK jouent un rle important dans la rgulation du cycle cellulaire, et favorisent la progression de cellules vers le processus de mitose. De plus, on a dcouvert que PLK1 tait surexprim dans un grand nombre de tumeurs humaines, et son expression semble corrle une prolifration cellulaire et un pronostic tumoral. Les PLK partagent deux domaines conservs : le domaine Ser/Thr Kinase lextrmit Nterminale, et un domaine de la rgion C-terminale, le polo-box motif. Pourtant, la fonction des diffrents membres de la famille diverge considrablement. Alors que PLK1 est un oncogne, PLK2 et PLK3 semblent inhiber la transformation oncognique. Par consquent, la drgulation de lactivit de PLK1 contribue crer une instabilit gntique qui provoque une transformation oncognique. Au contraire, PKL2 et PLK3 son impliqus dans larrt du cycle cellulaire. Dans cette revue, on discute donc de la possibilit de cibler PLK1 comme thrapie anti-cancreuse. Nous trouvons galement un deuxime article qui traite de linhibition de lexpression de PLK1 comme mthode de thrapie anti-cancreuse cible. N34 : X. LIU, R. L. ERIKSON. (2003). Polo-like kinase (Plk) 1 depletion induces apoptosis in cancer cells. PNAS. Vol.100, n10, 5789-5794

PLK1 a t propos comme nouveau marqueur de diagnostic de plusieurs types de tumeurs. Dans cette tude on a utilis la technique dARN interfrence pour teindre lexpression de PLK1 dans des cellules cancreuses. On a ainsi montr quune telle inhibition entranait une rduction significative de la prolifration cellulaire, une rduction de la viabilit des cellules, et provoquait larrt du cycle cellulaire. On a en effet remarqu que les cellules qui prsentaient un knock down de PLK1 avaient une structure chromatinienne en forme dhaltres. Ceci suggre donc que de telles cellules sont incapables, lors de la mitose de se sparer de leur cellule sur. La dpltion de PLK1 induit lapoptose. Ceci a t dmontr par diverses analyses : apparition dADN sub-G1 et visualisation sur FACS, activation des caspases 3, formation de fragments nuclaires. Cette induction de lapoptose est partiellement reverse si on co-transfecte dans les cellules des constructions dADN contenant PLK1.

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Nous relanons galement une requte sur PubMed afin de complter nos informations concernant les diffrentes tudes qui ont t faites concernant linhibition de lexpression de PLK1 et les rsultats qui ont pu tre observs. PLK1 cancer siRNA 10

Sur ces 10 rsultats obtenus, nous retenons 3 articles trs intressants. N35 : S. REAGAN-SHAW, N. AHMAD. (2005). Silencing of Polo-like kinase (Plk) 1 via siRNA causes induction of apoptosis and impairment of mitosis machinery in human prostate cancer cells : implications for the treatment of prostate cancer. FASEBJ. 19(6):611-613.

Il sagit dune tude ralise sur des cellules de cancer de la prostate. Des analyses dimmuno blot ont montr une expression leve de PLK1 dans des cellules de cancer de la prostate de type LNCaP, DU145, et PC3. En revanche, PLK1 nest pas dtectable dans des cellules normales de type PrEC. On a ralis des expriences de transfection de siARN dirigs contre PLK1 dans ce type de cellules. On a alors observ une diminution de la viabilit cellulaire et une induction de lapoptose. On a aussi pu remarquer un arrt du cycle cellulaire. Les rsultats tirs de cette tude sont que PLK1 semble jouer un rle important dans le dveloppement des cancers de la prostate et que des approches thrapeutiques gniques visant PLK1 pourrait constituer un outil de choix pour le traitement des cancers de la prostate. N36 : B. SPANKUCH-SCHMITT, J. BEREITER-HAHN, M. KAUFMANN, K. STREBHARDT. (2002). Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells. J Natl Cancer Inst. 94(24):1863-1877.

Dans cette tude, on a transfect diffrents lignes cellulaires (cellules de cancer du sein de type MCF-7, cellules de cancer cervical de type HeLa S3, cellules de cancer du colon de type SW-480, cellules de cancer du poumon de type A549) avec des siARN dirigs contre PLK1. Le siARN A4 a le pouvoir inhibiteur le plus fort et rduit les niveaux dARN de PLK1 de plus de 70% dans les cellules MCF-7, et les niveaux de protines de plus de 95%. La prolifration cellulaire a t rduite de 66% 99% 48 heures aprs la transfection. Dautre part, lapoptose a augment de 5 50% dans les cellules transfectes. N37 : R. GUAN, P. TAPANG, J.D. LEVERSON, D. ALBERT, V.L. GIRANDA, Y. LUO. (2005). Small interfering RNA-mediated Polo-like kinase 1 depletion preferentially reduces the survival of p53-defective, oncogenic transformed cells and inhibits tumor growth in animals. Cancer Research. 65(7):2698-2704.

Dans cette tude, on sest aussi aperu que les siARN dirigs contre PLK1 permettaient dinhiber la formation de colonies cellulaires dans lagar mou et rduisaient la tumorigense dans le modle HT1080 xenograft de souris (in vivo). Cette rduction est dose dpendante. Nous revenons sur une prcdente recherche que nous avons effectue sur PubMed, avec laquelle nous avions trouv 30 rsultats.

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#1 : siRNA oncogene #2 : targeted therapy cancer #1 AND #2

910 7.613 30

Nous consultons lensemble des articles auxquels nous pouvons avoir accs. Nous relevons 2 autres types doncognes qui peuvent tre cibls par lARN interfrence et que nous choisissons de dvelopper dans notre rapport, savoir les oncognes E6 et E7 et Bcl2. Nous relanons donc une requte sur PubMed, afin de trouver les diffrents types dexpriences qui ont t ralises sur le sujet. siRNA oncogene E6 E7 18

N38 : A.H. HALL, K.A. ALEXANDER. (2003). RNA interference of human papillomavirus type 18 E6 and E7 induces senescence in HeLa cells. J Virol. 77(10): 6066-6069

Il sagit dune tude ralise sur les protines oncognes E6 et E7. Ces oncognes sont exprims dans la cellule, suite linfection par le papillomavirus. Ils induisent une prolifration cellulaire et contribuent la carcinogense en interfrant avec lactivit des suppresseurs de tumeurs. Dans cette tude, on a inhib lexpression de ces oncognes grce des siARN dirigs contre la rgion E7 de lARNm bicistronique E6 et E7. On a ainsi rduit lexpression de E6 et E7 dans des cellules HeLa. LARN interfrence contre E6 et E7 rduit galement la synthse dADN et induit des changements morphologiques et biochimiques caractristiques des cellules en tat de snescence. Ces rsultats semblent suggrer que la rduction des niveaux de E6 et E7 dans la cellule suffise induire la snescence. N39 : X.Y. NIU, Z.L. PENG, W.Q. DUAN, H. WANG, P. WANG. (2006). Inhibition of HPV 16 E6 oncogene expression by RNA interference in vitro and in vivo. Int J Gynecol Cancer. 16(2):743-751.

Plusieurs tudes ont dmontr que la linitiation et la progression des cancers cervicaux est troitement lie aux oncognes E6 et E7, dont lexpression est induite par linfection au papillomavirus humain (HPV). Dans cette tude, on a observ les effets in vitro et in vivo de linhibition de lexpression de E6 par la technique dARN interfrence dans des cellules de cancer cervical de type CaSki. Le nombre de cellules apoptotiques, les niveaux dARNm E6 et de protine E6 ont t mesurs avant et aprs transfection. Ces mesures ont t faites par cytomtrie de flux, RT-PCR et Western blot. On a galement inject des siARN dirigs contre E6 dans des souris nude prsentant des cancers cervicaux. Linjection sest faite dans la cavit pritonale ou en sous-cutane, directement dans la tumeur. Lefficacit des siARN a t value par mesure du volume tumoral et par suivi de lapoptose des cellules tumorales. Le taux dapoptose des cellules CaSki 1, 2, 5, et 9 jours aprs la transfection a t de 7,7%, 11,8%, 37,4% et 12,6% respectivement. Il est apparu quin vivo, ladministration de siARN dirigs contre E6 entranait une diminution de la croissance tumorale et induisait une ncrose et une apoptose des cellules tumorales. Nous nous intressons maintenant loncogne Bcl2. Nous lanons donc une recherche sur PubMed.

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siRNA Bcl2 cancer

18

Nous obtenons sur ces 18 rsultats articles trs intressants. N40 : M. OCKER, D. NEUREITER, M. LUEDERS, S. ZOPF, M. GANSLMAYER, E.G. HAHN, C. HEROLD, D. SCHUPPAN. (2005). Variants of bcl-2 specific siRNA for silencing antiapoptotic bcl-2 in pancreatic cancer. Gut. 54(9):1298-1308.

Cette tude est partie de lobservation faite que le cancer pancratique est une pathologie trs srieuse dont le taux de gurison est trs faible et pour laquelle les options thrapeutiques restent limites. Ainsi, dans cette tude, diffrents siARN dirigs contre Bcl-2 ont t designs contre deux rgions diffrentes de la protine. Ces siARN ont ensuite t transfects dans des lignes cellulaires de carcinome du pancras de type YAP Cet DAN G ainsi que dans des fibroblastes de prpuce humain. Lefficacit de la transfection a t mesure en utilisant des siARN labells au FITC et grce la microscopie fluorescence. La survie cellulaire ainsi que lapoptose ont t quantifies 24 120 heures aprs la transfection. Des modles xnografts de cancers pancratiques ont t raliss dans des souris nude. Ces tumeurs ont t traites par injection dans la cavit intra pritonale de siARN dirigs contre Bcl-2. Les injections ont t quotidiennes, et ont t faites pendant 24 jours. Les rsultats ont montr que les siARN ciblant Bcl-2 inhibaient lexpression du gne cible in vitro et in vivo. On a aussi observ des effets anti-prolifratifs et pro apoptotiques dans les cellules tumorales. Ces mmes effets nont pas t observs sur des fibroblastes ou sur des tissus non cancreux. Il semblerait donc que les siARN ciblant Bcl-2 soient un traitement prometteur pour soigner les carcinomes du pancras. N41 : V. WACHECK, D. LOSERT, P. GUNSBERG, H.P. VORNLOCHER, P. HADWIGER, A. GEICK, H. PEHAMBERGER, M. MULLER, B. JANSEN. (2003). Small interfering RNA targeting bcl-2 sensitizes malignant melanoma. Oligonucleotides. 13(5):393-100.

Les mlanomes malins sont un exemple de tumeurs rsistantes au traitement. Mme avec les nouveaux traitements, on observe un taux de rponse faible et la dure de la rponse est trs courte. Il semblerait que plus de 90% des mlanomes expriment la protine antiapoptotique Bcl-2. Le but de cette tude tait de dmontrer que les siARN dirigs contre Bcl2 pouvaient constituer une nouvelle approche pour down rguler lexpression de Bcl-2 dans des cellules de mlanomes. Les rsultats ont montr une rduction de plus de 19 fois des niveaux dARNm. On a de plus constat que les niveaux de protine Bcl-2 taient trs faibles : de lordre du nano molaire. Linhibition de lexpression de Bcl-2 dans des cellules de mlanomes entrane une augmentation modre du phnomne dapoptose et une inhibition de la prolifration cellulaire. Cependant, il semblerait que lorsquon combine le traitement avec un siARN spcifique de Bcl-2 avec un agent chimiothrapeutique induisant lapoptose comme le cis platine, on observe une augmentation massive du taux de cellules apoptotiques. La combinaison de ces deux agents provoque par consquent un effet supra additif, puisquon obtient une suppression quasi complte de la croissance cellulaire (96%). En comparaison, quand on traite les cellules avec seulement du cis platine, le taux de rduction est alors de 25%. Ces dcouvertes soulignent le rle cl que pourrait jouer Bcl-2 en confrant aux cellules de mlanomes une rsistance aux agents chimiothrapeutiques. On envisagerait alors le ciblage de Bcl-2 comme nouvelle thrapie anti-cancreuse ciblant les mlanomes malins.

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N42 : M. CHAWLA-SARKAR, S.I. BAE, F.J. REU, B.S. JACOBS, D.J. LINDNER, E.C. BORDEN. (2004). Downregulation of Bcl-2, FLIP or IAPs (XIAP and survivin) by siRNAs sensitizes resistant melanoma cells to Apo2L/TRAIL-induced apoptosis . Cell Death Differ. 11(8):915-923.

Il sagit dune tude ralise sur les cellules de mlanomes. Ces cellules sont particulirement rsistantes lApo2L/TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). On a donc mis lhypothse que cette rsistance tait due une expression leve dinhibiteurs de lapoptose, comme Bcl-2, FLIP (FLICE-like inhibitory protein), or IAP. Cette analyse a ainsi permis de voir que lutilisation de siARN dirigs contre ces diffrents inhibiteurs, suivie de linduction de lapoptose des cellules par Apo2L/TRAIL, augmentait de faon significative le taux dapoptose sur des cellules de mlanomes. Il semblerait que les siARN dirigs contre IAP soient plus puissants que ceux ciblant Bcl-2 ou FLIP. Il semblerait aussi que lactivation par Apo2L/TRAIL sur des cellules qui prsentent une down rgulation de IAP, soit suivie du clivage de Bid, de lactivation de la caspase 9, puis du clivage de PARP (poly ADP-ribose polymerase). Donc, la rsistance lactivation par Apo2L/TRAIL pourrait tre empche en interfrant avec lexpression dinhibiteurs de lapoptose. Les recherches sur la protine Ras ont t effectues sur le projet du premier semestre, nous avons adapt ce que nous avions fait au projet de ce semestre, et nous nous sommes servi des connaissances acquises au cours de lanne. Nous avons ensuite immdiatement effectu nos recherches sur PubMed : Mots cls Nombre de rponses 43 Articles intressants

RNAi cancer Ras

RNAi 5 cancer Ras "cancer therapy"

Identification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette Molecular Consequences of Silencing Mutant K-ras in Pancreatic Cancer Cells: Justification for K-rasDirected Therapy K-ras as a target for cancer therapy Reversal of the phenotype by K-rasval12 silencing mediated by adenovirus-delivered siRNA in human pancreatic cancer cell line Panc-1

En lisant les rsums des articles, il est relativement facile de cibler les articles paraissant entrer dans le sujet et apportant des informations supplmentaires nos recherches. Ces deux recherches nous ont permis de slectionner quatre articles nous paraissant intressants : M16 : W. WANG, C. Y. WANG, J. H. DONG, X. CHEN, M ; ZHANG, G. ZHAO. Identification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette Cet article dcrit des expriences faites sur Ras en utilisant des ARNi et montre les methods dtudes classiques de ce type dexprience. Il met par ailleurs en vidence linefficacit de 187

certaines squences dARNi. Il laisse prsager dune thrapie cible sur Ras par utilisation de lARNi. M17 :L. M. CHEN, H. Y. LE, R. Y. QIN, M. KUMAR, Z. Y. DU, R. J. XIA, J. DENG. Reversal of the phenotype by K-rasval12 silencing mediated by adenovirus-delivered siRNA in human pancreatic cancer cell line Panc-1. Cet article est similaire au premier mais montre un moyen dadministration des ARNi different. M18 : J. FLEMING, G. L. SHEN, S. E. HOLLOWAY, M. DAVIS, R. A. BREKKEN. (2005). Molecular Consequences of Silencing Mutant K-ras in Pancreatic Cancer Cells: Justification for K-rasDirected Therapy. Lintrt de cet article consiste en lexplication des consquences de linhibition de Ras, qui amne aussi a comprendre quels sont les partenaires de K-Ras mut dans une cellule cancreuse. M19 : B. B. FRIDAY, A. A. ADJEI. (2005). K-ras as a target for cancer therapy. Cet article met lhypothse dune thrapie cible sur K-Ras en expliquant les raisons du choix de cette cible et les stratgies envisageables dans le cadre dune thrapie. Malheureusement, de trop nombreux articles dont nous avons relev le rsum comme intressant nous sont indisponibles. Cet obstacle limite nos recherches. On rencontre aussi une difficult par la similitude des informations releves dans les diffrents articles. Cette recherche permet tout de mme de cerner les partenaires de Ras, dont la fonction est modifie lors de linhibition de lexpression de loncogne. Elle permet aussi de se familiariser avec les techniques utilises pour montrer les rsultats aprs inhibition par lARNi. Nous limitons nos recherches PubMed. En effet, les articles slectionns datent de 2005 ou au plus de 2004. Les informations qui nous intressent sont donc indisponibles dans les Books. Par ailleurs, nous navons pas utilis les moteurs de recherche (sauf pour informations gnrales concernant la protine) car les informations retenues de PubMed sont plus fiables et claires. Nous navons donc pas prouv le besoin de complter nos recherches par des outils moins fiables que PubMed. Par ailleurs, BioMail nous a aid slectionner quelques articles intressants, en particulier sur Ras. Ces articles ont t retrouvs lors des recherches sur PubMed. Mais le manque de spcificit de la recherche demande sur BioMail a aboutit la slection de nombreux articles non intressants dans le cadre de notre projet. Il aurait t intressant deffectuer de nouvelles demandes de recherches sur BioMail plus cibles, mais nous ne lavons pas fait, par manque de temps en grande partie.

Pour les recherches concernant STAT3 et lARNi, nous avons dabord effectu quelques recherches sur Google pour trouver des informations gnrales sur la protine STAT3 et son rle dans le cancer. Nous effectuons nos recherches en regardant les adresses des pages sur lesquelles Google nous renvoie. En effet, nous vitons ainsi les pages non fiables.

188

Mots cls

Options

STAT3 cancer RNAi STAT3 52 cancer ARNi STAT3 Franais 4 cancer uniquement ARNi

Nombre Sites intressants de rponses 34100 http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/STAT3ID444.html

http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/STAT3ID444.html

http://ist.inserm.fr/BASIS/medsci/fqmb/medsci/DDD/2643.pdf

Cette recherche nous permet lacquisition de la culture ncessaire la comprhension des tudes faites sur la protine dans PubMed, qui prsente en cas gnral des tudes plus prcises et plus fines, do la ncessit dune certaine connaissance au pralable. On obtient avec la premire recherche (sans limites) 34100 rponses. On regarde encore ici les adresses des pages pour ne relever que des sites fiables. Ainsi on relve une page sur le site de Infobiogen. Ce site nous a paru trs intressant dans le cadre dinformations gnrales sur STAT3. Certaines informations restaient cependant incomprises, nous avons donc dcid dappuyer nos recherches par des donnes en Franais qui confirmeraient celles trouves dans la page Web du site de Infobiogen. Par ailleurs, Google proposait en haut de page loption rponses en Franais uniquement . Nous avons consult la page de lInserm en Franais qui a confirm les donnes d'Infobiogen comme prvu et qui nous a apport des informations en parallle. Ces sites nous donnent des informations gnrales sur la protine STAT3 et ses domaines, ce qui permettra de comprendre ou se font les mutations, quels domaines sont altrs Ici les deux pages slectionnes sont considres comme fiables : Infobiogen est un site dont on trouve le lien sur bioinfo.unice.fr et lInserm est un institut officiel de recherche mdicale. Ces pages nous donnent des informations gnrales permettant de cerner le rle et la structure de STAT3. Seules les premires pages (pour la premire recherche) ont t tudies. Apres avoir trouv ces informations sur la protine, nous avons rcolt assez dinformations pour effectuer des recherches sur PubMed et comprendre les informations ainsi trouves : Mots cls Nombre de rponses 7 Articles intressants Knockdown of STAT3 expression by RNA interference inhibits the induction of breast tumors in immunocompetent mice. [M12]. Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells. [M13]. Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3 (TFF3) -- and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion 189

STAT3 cancer RNAi

and tumor growth. [M14]. RNA interference targeting Stat3 inhibits growth and induces apoptosis of human prostate cancer cells. [M15].

Les recherches sur PubMed apportent des articles inintressants : ceux-ci utilisent le principe dARNi, mais ceci nest quun dtail dans larticle et non le sujet du papier. M12 : C. RIVAT, S. RODRIGUEZ, E. BRUYNEEL, A. ROBERT, G. REDEUILH, M. BRACKE, C. GESPACH, S. ATTOUB. (2005). Knockdown of STAT3 expression by RNA interference inhibits the induction of breast tumors in immunocompetent mice. Ce premier article explique les observations de linhibition de STAT3 par ARNi. Celles-ci montrent une inhibition de linduction des tumeurs mammaires chez des souris immunocomptentes. Il est paru dans Cancer Research en avril 2005, et a t crit par X. Ling et R. B. premire Cet article montre un intrt car il met en valeur une action de STAT3 sur linvasion tumorale (action empche par ARNi), mais pas sur la prolifration ou le cycle cellulaire. M13: L. F. GAO, D. Q. XU, L.J. WEN, X.Y. ZHANG, Y.T. SHAO, X.J. ZHAO. (2005). Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells. Le second article dcrit une tude utilisant lARNi pour inhiber lexpression de STAT3 dans des cellules cancreuses de larynx. Il est paru dans Acta Pharmacol Sinica en mars 2005. Cet article est intressant car ltude est faite sur des cellules humaines. Il montre donc une avance de la recherche sur le cancer du larynx chez lHumain. Le passage de ltude de lanimal a lhumain est souvent dlicate do la considration que lon peut porter cet article. Les rsultats montrent par ailleurs une implication de STAT3 dans la croissance et lapoptose, et sur plusieurs protines impliques dans ces mcanismes. Par ailleurs, cet article met lhypothse dune nouvelle approche thrapeutique utilisant lARNi contre le cancer du larynx. Aujourdhui, de nombreuses tudes sont faites dans le cadre de la recherche sur le cancer avec lARNi, mais lapproche thrapeutique nest pas encore envisage de par les limites rencontres avec lARNi. Cet article offre donc une ouverture vers un traitement lARNi. M14 : C. RIVAT, S. RODRIGUEZ, E. BRUYNEEL, A. ROBERT, G. REDEUILH, M. BRACKE, C. GESPACH, S. ATTOUB. (2005). Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3 (TFF3) -- and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion and tumor growth. Le troisime article est paru dans Cancer Research en janvier 2005. Il dcrit des tudes faites en janvier 2005 sur le cancer du colon et limplication de STAT3. cet article montre la contribution de STAT3 aux activits des facteurs TFF et du VEGF. Il montre donc les interactions possibles entre les diffrentes molcules impliques dans les processus de cancrisation, et particulirement la contribution de STAT3 au phnomne dangiogense par lintermdiaire de STAT3. cependant, cet article donne des informations sur le rle de STA3 dans le cancer du colon, mais il nest pas le sujet de lexprience, il est utilis comme outil et cet article ne nous montre pas rellement la puissance de lARN dans ltude et le traitement des cancers. Nous navons donc pas pouss lanalyse du document .

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M15 : S. O. LEE, W. LOU, K. M. QURESHI, F. MEHRAEIN-GHOMI, D. L. TRUMP, A. C. GAO. (2005). RNA interference targeting Stat3 inhibits growth and induces apoptosis of human prostate cancer cells. Le quatrime article est une tude parue dans Prostate en septembre 2004. Elle explique que le "silencing" de STAT3 par une ARNi inhibe la croissance et induit lapoptose dans des cellules prostatiques cancreuses humaines. Ici encore, ltude est effectue sur des cellules humaines, ce qui nous amne se pencher sur les expriences faites. Dans cet article aussi, la notion de thrapie est formule. Ces articles apportent chacun une information sur le rle de la forme oncognique de STAT3 dans diffrents cancers. Les autres articles ne sont pas aussi intressants car ils nentrent pas dans le cadre du sujet. Ils utilisent lARNi mais il nest pas loutil principal de ltude. Par ailleurs, de nombreux articles nous sont inaccessibles, seul le rsum est alors prsent, cela a limit nos recherches.

les tlomerases

Nous lanons notre recherche sur PubMed. siRNA telomerase cancer 41

On trouve, dans ces rsultats plusieurs articles trs intressants traitant des tlomerases et de leur inhibition comme moyen de lutter contre le cancer. N43 : M.A. SHAMMAS, H. KOLEY, R.B. BATCHU, R.C. BERTHEAU, A. PROTOPOPOV, N.C. MUNSHI, R.K. GOYAL. (2005). Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barretts adenocarcinoma cells: mechanism and therapeutic potential . Mol Cancer. 4:24.

Dans les cellules cancreuses, linduction des tlomerases permet de maintenir constante la longueur des tlomres et donc empche la snescence. Dautre part, les tlomerases apportent aux cellules un potentiel prolifratif. Cette quipe de recherche a donc design des siARN dirigs spcifiquement contre 2 rgions diffrentes du gne des tlomerases. On a ensuite valu les effets de ces siARN sur la longueur des tlomres chromosomiques, sur le potentiel prolifratif et sur lexpression gnique dans des cellules SEG-1 dadnocarcinome de Barretts. Les rsultats ont montr que linhibition des tlomerases tait possible partir dune quantit de siARN de lordre du nano molaire. Cette inhibition est visible ds le premier jour aprs la transfection, et est complte au bout de 3 jours. Cette inhibition de lactivit des tlomerases est associe une rduction significative de la longueur des tlomres et mme une perte complte des tlomres dans plus de 50% des cellules traites. Cette perte des tlomres induit, en retour, la snescence pour 40% des cellules ou lapoptose, dans 86% des cas. On observe en parallle, une lvation des niveaux transcriptionnels de FasL, Fas et de la caspase 8, conduisant lapoptose des cellules. Des contrles ont donc permis de vrifier quaucun effet ntait observable sur des cellules normales non cancreuses.

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N44 : Y. XIA, R.X. LIN, S.J. ZHENG, Y. YANG, X.C. BO, D.Y. ZHU, S.Q. WANG. (2005). Effective siRNA targets screening for human telomerase reverse transcriptase . World J Gastroenterology. 11(16):2497-2501.

Il sagit dune tude ralise sur la protine hTERT, la sous unit catalytique des tlomerases. Pour cela, 5 siARN ont t designs, et ciblent diffrentes rgions de la squence de lARNm cible. Ces siARN ont t transfectes dans des cellules de carcinome hpatique humain (HepG2), laide dun agent de transfection de type lipidique. 48 72 heures aprs la transfection, des analyses ont permis de suivre les effets des siARN sur la croissance cellulaire, et les niveaux dexpression de lARNm et de la protine hTERT. Les cellules traites avec les siARN dirigs contre hTERT montrent une inhibition de la prolifration cellulaire, par comparaison avec les cellules contrle. Cette inhibition est dose dpendante. N45 : Y. GUO, J. LIU, Y.H. LI, T.B. SONG, J. WU, C.X. ZENG, C.F. XUE. (2005). Effect of vector-expressed shRNAs on hTERT expression . World J Gastroenterology. 11(19):2912-2915.

Il sagit dune tude base des expriences dARN interfrence. Le but tait dtudier leffet de shARN ciblant hTERT, exprim partir de vecteurs dexpression. Ces vecteurs ont ensuite t introduits dans des cellules HepG2, en utilisant un agent de transfection de type lipidique. Un contrle a t fait laide de siARN dirigs contre la protine GFP. Les niveaux dARNm dhTERT ont t quantifis grce la technique de RT-PCR. On a alors observ que ces shARN rduisaient effectivement les niveaux dARNm (diminution de lordre de 40%). N46 : S. LI, J. CROTHERS, C.M. HAQQ, E.H. BLACKBURN. (2005). Cellular and gene expression responses involved in the rapid growth inhibition of human cancer cells by RNA interference-mediated depletion of telomerase RNA. J Biol Chem. 280(25) : 23709-23717.

Nous avons vu que des prcdentes tudes ont montr que linhibition de lactivit tlomerase dans des cellules cancreuses ralentit la croissance cellulaire. Ceci est du au raccourcissement des extrmits tlomriques des chromosomes. Dans cette tude, on sintresse dmontrer que le knock down de lactivit tlomerase dans des cellules cancreuses induit des changements dans le profil dexpression gnique de la cellule traite. Ceci indique que des voies de signalisation spcifiques se mettent en place suite linhibition de lexpression des tlomerases dans les cellules. On a ainsi remarqu que lexpression de gnes impliqus dans langiogense et dans le processus de mtastase tait diminue. Ceci semble suggrer que les cellules cancreuses sont dpendantes de lactivit des tlomerases. Par consquent, les tlomerases seraient ncessaires la croissance et la progression tumorale. Nous avions appris, par ailleurs, lors dun de nos entretiens avec notre tuteur, qu ce jour la technique dARN interfrence ntait envisageable comme moyen de lutte contre le cancer quen combinaison avec les thrapies anticancreuses traditionnelles, savoir les chimiothrapies. Nous voulions donc ouvrir notre conclusion sur lapplication de lARN interfrence dans le domaine du cancer sur cette ide. Nous savions galement, grce notre prcdent projet dont le thme tait les thrapies anti-cancreuses cibles, que lagent responsable de la plupart des checs thrapeutiques tait une protine surexprime, la P-

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glycoprotine. Nous avons donc effectu quelques recherches en consquence. Ces recherches ont t orientes par les informations que nous possdions dj. siRNA P-glycoprotein cancer chemotherapy 14

Nous obtenons 3 articles qui nous apportent les informations que nous recherchions, savoir des informations gnrales qui nous permettraient de faire une conclusion sur lassociation possible entre la technique de lARN interfrence et les chimiothrapies traditionnelles. N47 : D. XU, D. MCCARTY, A. FERNANDES, M. FISHER, R.J. SAMULSKI, R.L. JULIANO. (2005). Delivery of MDR-1 small interfering RNA by selfcomplementary recombinant adeno-associated virus vector. Mol Ther. 11(4):523530.

Dans cette tude, on utilise la technique de lARN interfrence pour silencer lexpression du gne MDR1 dans des cellules multidrug resistant de cancer du sein ou du colon. On obtient effectivement une rduction des niveaux de protines. Dautre part, on arrive ainsi rverser le phnotype de rsistance aux agents chimiothrapeutiques. N48 : Z. SHI, Y.J. LIANG, Z.S. CHEN, X.W. WANG, W.H. WANG, Y. DING, L.M. CHEN, X.P. YANG, L.W. FU. (2006). Reversal of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by vector-based RNA interference in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther. 5(1): 39-47.

Il sagit dune exprience dARN interfrence qui a t ralise, avec pour cible, le gne MDR1 codant pour la P-glycoprotine. Les rsultats ont montr que linhibition de lexpression de cette P-glycoprotine entranait une diminution de la rsistance des cellules traites la vincristine, ou la doxorubicin. En parallle, il semblerait que ces agents chimiothrapeutiques aient plus tendance saccumuler dans les cellules ayant reu le siARN. In vivo, on a pu montrer dans la souris nude, avec un modle de xnogreffe, que la vincristine retrouvait sa capacit inhiber la croissance tumorale dans le cas de cellules traites avec les siARN. Cette tude semble donc suggrer que ladministration de siARN ciblant le gne MDR1 pourrait effectivement rverser son effet, que ce soit in vitro, ou in vivo. N49 : E. YAGUE, C.F. HIGGINS, S. RAGUZ. (2004). Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1. Gene Ther. 11(14):1170-1174.

Il sagit dune tude ralise sur des cellules leucmiques K562 rsistantes la doxorubicine. Ladministration de siARN rverse compltement la rsistance de ces cellules. Le supresseur de tumeur p 53 Les recherches concernant les applications de lARNi en rapport avec p53 sont plus dlicates que pour les autres gnes. En effet, on peut premire vue se demander quel peut

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tre lintrt dinhiber un suppresseur de tumeur. Il y a pour cette raison un nombre relativement faible darticles dtaillant des expriences dARNi sur p53. Nous avons dabord effectu quelques recherches sur Google pour obtenir des informations gnrales. Mots cls p53 cancer p53 cancer p53 mutation cancer Franais uniquement Limites Nombre de rponses 4 010 000 58 900 35 800 Sites intressants

Cependant, Google noffrant pas des informations automatiquement fiables et prsentant de nombreux sites dont on ne peut pas rellement connatre la provenance, nous navons pas pouss nos recherches. De plus limportance du nombre de rponses sur Google amne ne pas sintresser aux pages pertinentes qui peuvent ne pas tre dans les premires pages, Google classant les rponses par popularit. Ne considrant pas Google comme un outil de recherche appropri nos recherches, nous avons dcid de rorienter nos recherches. Loption Franais uniquement tait automatiquement propose par Google, le vocabulaire tant aussi bien anglais que franais. Nous avons ainsi effectu quelques recherches dans les Books du NCBI pour obtenir des informations sur p53. En effet les Books nous on sembl un bon outil de recherches pour des informations sur p53, ce gne tant trs tudi dans le cadre du cancer, et ce depuis de nombreuses annes. Mots cls Nombre Livres et paragraphes selectionns de rponses P53 545 (et 74 Molecular Biology of the Cell : Mutations in the p53 Gene Allow cancer figures) Cancer Cells to Survive and Proliferate Despite DNA Damage. Nous avons ainsi trouv dans The Cell un chapitre sur le cancer. Une partie de celui-ci est consacre p53. Nous nous sommes inspir de celle-ci pour la partie concernant les gnralits sur p53. Pour illustrer les donnes et les points expliqus, nous avons dcid deffectuer une recherche dimages sur google. Mots cls p53 mutation cancer Limites images Nombre de rponses 37 Sites intressants
ehp.niehs.nih.gov

Les images utilises proviennent de ce site. Il est li au site du NIH et est alors considr comme fiable. Les chiffres quil utilise proviennent de la IARC p53 Database.

Apres ces recherches nous effectuons des recherches sur PubMed afin de trouver des expriences dARNi concernant p53. Nos recherches se font en plusieurs tapes. 194

Mots cls RNAi p53 cancer

Limites

Nombre de rponses 97

Sites intressants

Cette recherche nous offre un nombre correct de rponses. Cependant nous la considrons comme peu spcifique car elle ne prsente que peu darticles caractristiques de lutilisation dARNi. Nous lanons une autre recherche. Nous slectionnons dans les limites loption links to free full text pour ne slectionner que les articles exploitables de ce point de vue. Nous reprenons les mmes mots cls. Mots cls RNAi p53 cancer Limites links to free full text Nombre de rponses 26 Sites intressants

Cette recherche montre le mme inconvnient que la premire, elle prsente dailleurs 26 articles dj prsents lors de la premire recherche, mais le nombre relativement limit de rponses permet de regarder tous les articles pour viter de passer cot dun article intressant. Nous effectuons une recherche qui nous donne les mmes rsultats : Mots cls Limites Nombre de Sites intressants rponses RNAi p53 links to 26 Knockdown of human p53 gene free full expression in 293-T cells by retroviral text vector-mediated short hairpin RNA. La dernire recherche effectue nous permet de slectionner un deuxime article intressant rapidement : Mots cls Nombre rponses RNAi p53 links to 6 mutation free full cancer text Limites de Sites intressants RNA silencing of checkpoint regulators sensitizes p53-defective prostate cancer cells to chemotherapy while sparing normal cells.

M22 : D. L. HAO, C. M. LIU, W. J. DONG, H. GONG, X. S. LIU, C. C. LIANG. (2005). Knockdown of human p53 gene expression in 293-T cells by retroviral vector-mediated short hairpin RNA. Ce premier article dcrit une exprience dARNi contre p53. Nous lavons slectionn comme larticle correspondant le mieux ce que nous cherchions au premier abord. M23 : U. K. MUKHOPADHYAY, A. M. SENDEROWICZ, G. FERBEYRE. (2005). RNA silencing of checkpoint regulators sensitizes p53-defective prostate cancer cells to chemotherapy while sparing normal cells. Le second article explique que linhibition par ARNi de certains facteurs dans des cellules cancreuses prsentant une mutation sur le gene p53 offre une amlioration des traitements anti cancreux quand elle est associe une toxine utilise en chimiothrapie. Cet article nous

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a donc paru fort intressant dans le cadre des applications thrapeutiques de lARNi dans le cancer. Pour ces raisons nous avons slectionn ces deux articles pour la partie concernant p53. Les recherches sur ce gne sont restreintes car p53 nest pas un oncogne ou une protine surexprime dans les cancers. Cest justement labsence de fonction de ce gne qui induit le processus tumoral. On comprend par l la restriction des tudes dARNi sur p53, quel est en effet au premier abord lintrt dinhiber une protine dont la mutation entrane labsence de fonction ncessaire au combat anti cancreux de lorganisme. Il reste cependant une cible potentielle dans un traitement contre le cancer, do le choix dtude de p53.

4.5. Matriel et mthodes de la partie Applications du VIH

Avant dtudier le silencing du VIH, nous souhaitons comprendre le mcanisme du VIH et les protines impliques dans le cycle de ce virus. Nous dcidons de consulter lencyclopdie Wikipedia qui donne une vue gnrale du VIH [GC4]. Son article sur le VIH permet de trouver des mots-cls prcis et renvoie de nombreuses rfrences srieuses et riches dun point de vue scientifique. En effet, lune des rfrences est larticle de lquipe de Luc Montagnier qui a dcouvert le VIH. [GC1, GC2]. F.BARRE-SINOUSSI, J.C.CHERMANN, F.REY, M.T.NUGEYRE, S.CHAMARET, J.GRUEST, C.DAUGUET, C.AXLER-BLIN, F.VEZINET-BRUN, C.ROUZIOUX, W.ROZENBAUM, L.MONTAGNIER.(1983)."Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)". Science.220 (4599): 868-871. [GC1]

Un rtrovirus appartenant la famille de virus de leucmies des cellules T (HTLV), mais clairement distinct des prcdents virus identifis, a t isol partir dun patient qui prsentait des signes et des symptmes qui prcdent souvent le syndrome dimmunodficience acquise (AIDS). Les anticorps prsents dans le srum des patients ragissent des protines des virus HTLV-I, mais les anticorps de HTLV-I ne prcipitent pas les protines du nouveau virus isol. Le virus de ce patient a t transmis aux lymphocytes. R.C.GALLO, P.S.SARIN, E.P.GELMANN, M.ROBERT-GUROFF, E.RICHARDSON, V.ALYANARAMAN, D.MANN, G.D.SIDHU, R.E.STAHL, S.ZOLLA-PAZNER.(1983). Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science. 220, 865-867 [GC2].

Des virus HTLV-III isols indpendamment ont t obtenus dans ce laboratoire, en collaboration avec plusieurs groupes cliniques. Les virus isols provenaient de lymphocytes T du sang, mais certains taient obtenus partir de la moelle osseuse, des nuds lymphodes, du cerveauLe virus a t isol partir denviron 50% des patients atteints du SIDA. Les groupes risque incluent les homosexuels, les toxicomanes, les gens transfuss On a observ une grande corrlation entre les niveaux persistants danticorps dans le srum et la capacit isoler le virus partir de donneurs de leucocytes ou de patients. De plus, Wikipedia indique les rfrences utilises pour dcrire le mcanisme de rplication du VIH, sa physiopathologie

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J.A.LEVY.(1993). "HIV pathogenesis and long-term survival". AIDS. 7 (11): 14011410 [GC3].

Cet article traite des lentivirus. Ces virus ont des caractristiques morphologiques et des proprits biologiques communes. De nombreuses espces sont infectes par les lentivirus, qui sont responsable de longues maladies associes de longues priodes dincubation. D.CHAN, P.S.KIM.(1998). "HIV entry and its inhibition". Cell 93 (5): 681-684. [GC5]. Le changement de forme de gp120 expose une partie de la glycoprotine gp41, qui tait pralablement enfouie dans la membrane virale. Lenveloppe virale et lenveloppe de la cellule cible fusionnent, ce qui permet la capside dentrer dans la cellule cible. Le mcanisme exact par lequel gp41 provoque cette fusion reste largement mal connu. R.WYATT, J.SODROSKI.(1998). "The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens". Science 280 (5371): 1884-1888 [GC6].

Les glycoprotines de lenveloppe du VIH-1 interagissent avec les rcepteurs prsents sur la cellule cible et modulent lentre du virus en fusionnant les membranes virale et cellulaire. La structure des glycoprotines de lenveloppe a volu pour remplir ces fonctions et chapper la neutralisation par les anticorps. Wikipedia rfrence galement des articles concernant les protines du VIH, qui peuvent ventuellement tre les cibles du silencing : Vif, Tat et Ref. [GC7]. Dautres rfrences permettent de comprendre la fonction des protines du VIH : M.BUKRINSKY, A.ADZHUBEI.(1999). Viral protein R of HIV-1. The Indian journal of medical research. 9, 39-49 [GC8].

Cet article dcrit la protine Vpr du VIH. Elle appartient une classe de protines appeles protines accessoires. Vpr joue un rle important dans la rgulation de limport nuclaire du VIH, et est ncessaire pour la rplication du virus dans les cellules non en division. H.XIAO, C.NEUVEUT, H.L.TIFFANY, M.BENKIRANE, E.A.RICH, P.M.MURPHY,K.T.JEANG. (2000) Selective CXCR4 antagonism by Tat: implications for in vivo expansion of coreceptor use by HIV-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 97, 11466-11471. [GC9].

Cet article traite des chemokines et de leurs rcepteurs. En effet, ils jouent un rle important dans linfection par le VIH. CCR5 est le corcepteur majeur de macrophages alors que CXCR4 (rcepteur aux chemokines CXC) remplit une fonction homologue pour les cellules T. On ne sait toujours pas pourquoi seul le VIH-1-R5 est initialement dtect chez les sropositifs qui sont exposs aux virus R5 et X4. En effet, le virus X4 apparat chez une minorit de patients et seulement au dernier stade de la maladie, suggrant quune slection ngative prcoce contre les interactions entre le VIH et CXCR4 a t faite. Dans cette exprience, les chercheurs montrent que la protine Tat du VIH, scrte par les cellules infectes, est un antagoniste de CXCR4. Tat soluble inhibe slectivement lentre et la rplication de X4, mais pas de R5. Une consquence fonctionnelle de Tat est donc de slectionner les virus X4, donc influencer lavance prcoce du VIH in vivo.

197

 http://www.chups.jussieu.fr/polys/pharmaco/poly/antiretroviraux.html [GC10]. Ce site rpertorie les diffrentes molcules antirtrovirales utilises pour lutter contre le VIH. Nous dcidons ensuite deffectuer nos recherches dans les Books. Cet outil nous permet de consulter tous les chapitres des livres scientifiques en ligne et concernant un sujet particulier. Ce nest pas loutil dont nous nous servis le plus dans nos recherches car nos recherches sur lARNi taient tournes sur un domaine relativement nouveau. Or, les livres ne contiennent que des informations s bien tablies et approuves par la communaut scientifique. Ils sont donc utilisables pour les gnralits du VIH. Nous effectuons une recherche globale en tapant HIV . Nous obtenons un grand nombre de rsultats, donc nous dcidons daffiner notre recherche en tapant HIV mechanism . Nous obtenons des rponses intressantes. Retroviruses Synthesis, Assembly, and Processing of Viral Proteins [GC31]. Ce chapitre traite des protines accessoires du VIH comme Vif, Vpu, Vpr Retroviruses Pathogenesis of HIV and SIV [GC32] Ce chapitre aborde la physiopathologie du VIH, la phase latente, la dclaration du stade SIDA Retroviruses Immunological and Pharmacological Approaches to the Control of Retroviral Infections [GC33] Cet article aborde le cycle de rplication du VIH et les diffrents agents pharmacologiques pouvant tre utiliss. Il dcrit galement les protines Tat et Rev. Nous effectuons nos recherches dans Google Biology pour se familiariser avec la technique du silencing concernant le VIH. Nous effectuons une premire recherche en tapant gene silencing HIV Recherche Nombre de Sites intressants effectue rsultats gene silencing 16 http://www.genomenewsnetwork.org/articles/06_02/hiv.shtml HIV [GC11] http://www.genomenewsnetwork.org/articles/06_02/hiv.shtml Cet article dcrit le mcanisme de silencing des gnes et explique comment cette technique peut tre applique au VIH. Il relate limpact que pourrait avoir lARNi sur le design de nouvelles drogues. Cet article est trs enrichissant car il cite une quipe qui a ralis des expriences de silencing. Nous pourrons alors lire plus prcisment ses articles. Il sagit de lquipe de P.A. Sharp, Novina Lieberman.[GC12] . C.D.NOVINA, M.F.MURRAY, D.M.DYKXHOORN, P.J.BERESFORD, J.RIESS, S.K.LEE, R.G. COLLMAN, J.LIEBERMAN, P.SHANKAR, P.A.SHARP. (2002). siRNA-directed inhibition of HIV1-infection. Nature Medicine. 8(7):681-6 [GC12].

Cet article rapporte que les siARN inhibent la production du virus en ciblant les ARN de CD4, Gag et de Nef. Ces protines sont essentielles pour le dveloppement du virus. Les siARN inhibent avant et / ou aprs lintgration de linformation gntique dans le cycle viral.

198

Les autres sites relats par Google Biology explique le principe de lARNi en gnral ou ne sont que des interviews de chercheurs. On retrouve les mmes sites en tapant RNAi HIV ou siRNA HIV . Nous effectuons ensuite nos recherches dans PubMed. Puisque nous avons trouv auparavant le nom de chercheurs (Sharp) travaillant sur le VIH et utilisant lARNi, nous effectuons la recherche suivante : Recherche effectue P.A.Sharp HIV Nombre de rsultats 17

E.SONG, S.K.LEE, D.M.DYKXHOORN, C.NOVINA, D.ZHANG, K.CRAWFORD, J.CERNY, P.A.SHARP, J.LIEBERMAN, N.MANJUNATH, P.SHANKAR. (2003). Sustained small interfering RNA-mediated human immunodeficiency virus type 1 inhibition in primary macrophages. Journal of Virology. 77(13):7174-81. [GC13].

Dans cet article, lquipe de chercheurs tente de savoir si des siARN mdis contre le VIH sont efficaces dans le silencing des macrophages diffrencis, qui constituent un rservoir important de VIH in vivo. CCR5, le co-rcepteur majeur du VIH dans les macrophages et p24 ont t cibles sparment ou en combinaison. Aprs transfection, les si ARN CCR5 et p24 ont effectivement rduit linfection par le VIH et en combinaison, ils ont aboli linfection. Lquipe a aussi test la capacit des siARN p24 stabiliser le VIH silenc. Cet article donne une rfrence intressante sur le rle des macrophages dans le VIH : S.AQUARO, R.CALIO, J.BALZARINI, M.C.BELLOCCHI, E.GARACI, C.F.PERNO. (2002). Macrophages and HIV infection: therapeutical approaches toward this strategic virus reservoir. Antiviral Research. 55:209-225. [GC29].

Connaissant les gnes du VIH, nous pouvons raliser des recherches sur le silencing de ces ventuels gnes. Au cours de prcdentes recherches sur les applications ventuelles de lARNi, nous avions relev le nom dun chercheur travillant sur le silencing du VIH. Il sagit de Brian Cullen. Nous utilisons donc PubMed et effectuons la recherche siRNA Tat Rev et nous utilisons les Limits pour rechercher seulement les articles de ce chercheur :

Recherche effectue siRNA Tat Rev

Nombre rsultats 1

de

G.A.COBURN, B.R.CULLEN. (2002). Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference.. Journal of Virology. 76(18):9225-31. [GC14].

Les siARN induisent la dgradation dARNm cibles spcifiques dans les cellules humaines en provoquant le phnomne dARNi. Dans cet article, Cullen dmontre que les duplexes de siARN cibls spcifiquement contre les protines rgulatrices Tat et Rev peuvent bloquer spcifiquement lexpression et la fonction de Tat et Rev. De plus, ces siARN peuvent inhiber efficacement lexpression des gnes du VIH et la rplication, y compris celle des cellules T humaines et des lymphocytes primaires. Des observations ont effectivement montr que lARNi peut bloquer la rplication virale dans les cellules humaines et augmenter la 199

possibilit que lARNi puisse fournir une importante raction protectrice, en particulier contre les virus qui expriment les ARNdb. Pour avoir dautres points de vue, nous effectuons la recherche suivante : Recherche effectue siRNA tat Nombre de rsultats 38

H.J.UNWALLA, M.J.LI, J.D.KIM, H.T.LI, A.EHSANI, J.ALLUIN, J.J.ROSSI. (2004). Negative feedback inhibition of HIV-1 by TAT-inducible expression of siRNA.. Nature Biotechnology. 22(12) : 1573-8. [GC24]

Cet article montre que un shARN anti-VIH inhibe lexpression de gnes du VIH dans les cellules de mammifres. Lquipe utilise un systme de promoteur dans lequel la rgion LTR du VIH est fusionne au promoteur de la protine HSP70 de drosophile. Ce systme est inductible par HIV-1 TAT, qui exerce un feedback pour activer la transcription dun shARN dirig contre Rev. Le systme de fusion de promoteurs peut tre plus sr que des systmes utilisant des drogues comme induction. D.BODEN, O.PUSCH, R.SILBERMANN, F.LEE, L.TUCKER, B.RAMRATNAM. (2004). Enhanced gene silencing of HIV-1 specific siRNA using microRNA designed hairpins. Nucleic Acids Research. 13;32(3):1154-8. [GC15]

Linhibition post-transcriptionnelle de la rplication du VIH peut tre ralise par lARNi. Lexpression cellulaire de siARN ou de shARN homologues de certaines rgions du gnome du VIH diminue la rplication virale en dgradant slectivement lARNm. Dans cet article, des miARN peuvent tre utiliss pour dlivrer lARNi. En incorporant des squences codant pour des siARN ciblant la protine Tat du VIH, les siARN Tat ont pu tre exprims dans les cellules. Le siARN Tat dlivr en tant que pre-miARN est plus efficace 80% dans la rduction de production de p24. Recherche effectue Silencing HIV Nombre de rsultats trouvs 173

S.NEKHAI, M.JEREBTSOVA. (2006). Therapies for HIV with RNAi.. Current opinions in molecular therapeutics. 8(1):52-61. [GC17].

LARNi a t utilise avec succs diffrentes tapes de la rplication du VIH. Cet article dcrit des cibles virales et cellulaires utilises pour inhiber le VIH. Il traite galement de la difficult de dlivrance de lARNi et des diffrentes stratgies utilises par le VIH pour chapper linhibition par lARNi. M.L.YEUNG, Y.BENNASSER, S.Y.LE, K.T.JEANG. (2005). siRNA, miRNA and HIV : promises and challenges. Cell Research. 15(11-12):935-46. [GC18].

Cet article parle de la capacit du VIH chapper au silencing en mutant la squence cible contre laquelle sont dirigs les siARN ou en codant pour une partie suppresseur de lARNi. Il

200

passe en revue les diffrents stratagmes utiliss par divers virus pour se dfendre contre les siARN ou les miARN. M.P.NAIR, J.L.REYNOLDS, S.D.MAHAJAN, S.A.SCHWARTZ, R.AALINKEEL, B.BINDUKUMAR, D.SYKES. (2005). RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: prospects for HIV-1 therapy. The AAPS journal. 7(3):E572-8. [GC19].

Cet article explique que tant donn la diversit des squences des gnomes infects par le VIH, il est difficile de cibler une squence spcifique du VIH. Ainsi, cibler des rcepteurs du VIH non variables sur des cellules htes potentielles peut tre une alternative intressante pour cibler le virus lui-mme. Les siARN dirigs contre DC-SIGN prsent sur les cellules dendritiques. Cet effet peut tre mdi par le mitogne p38. Cet article renvoie des rfrences intressantes qui traitent du silencing de Tat, Rev Nous en avions dj trouv certaines mais nous de lire les articles que nous navions pas relever pour complter nos recherches : J.M.JACQUE, K.TRIQUES, M.STEVENSON. (2002). Modulation replication by RNA interference. Nature.418:435-438. [GC20]. of HIV-1

Cet article dcrit linhibition par des siARN des tapes prcoces et tardives de la rplication du VIH dans les cellules humaines et dans les lignes de lymphocytes. Les siARN inhibent linfection du VIH en dgradant spcifiquement lARN viral, et en empchant la formation dADNc viral. Ces rsultats montrent lutilit de lARNi pour moduler le cycle de rplication du VIH.

J.F.ARRIGHI, M.PION, E.GARCIA. (2004). DC-SIGN-mediated infectious synapse formation enhances X4 HIV-1 transmission from dendritic cells to T cells. The journal of experimental medicine. 200:1279-1288. [GC21]. Des systmes modles de la transmission sexuelle du VIH ont montr que les cellules dendritiques exprimant le DC-SIGN capturer et internaliser le VIH et transfrer le VIH aux cellules T CD4+ dans les nuds lymphodes, o la rplication virale avait lieu. Les chercheurs ont tudi le rle de DC-SIGN sur les cellules dendritiques primaires. Le knockdown de DCSIGN altre slectivement la formation de synapses infectieuses entre les cellules dendritiques et les cellules T CD4+. DC-SIGN est ncessaire pour la capture virale et pour la formation de ces synapses. R.M.STEINMAN. (2000). DC-SIGN: a guide to some mysteries of dendritic cells. Cell. 100:491-494 [GC22].

DC-SIGN est fortement exprim sur les cellules dendritiques et se lie gp120. DC-SIGN ne fonctionne pas comme un rcepteur pour lentre virale dans les cellules dendritiques mais permet une infection efficace des cellules exprimant CD4 et des rcepteurs aux chemokines. DC-SIGN capture efficacement le VIH la priphrie et facilite son transport vers les organes lymphodes secondaires riches en cellules T.

201

Nous recherchons dans PubMed si dautres silencing ont t effectus sur les gnes du VIH. Nous effectuons donc les recherches suivantes : Recherche effectue siRNA vpr Nombre de rsultats trouvs 5

N.VASQUEZ, T.GREENWELL-WILD, N.J.MARINOS, W.D.SWAIM, S.NARES, D.E.OTT, U.SCHUBERT, P.HENKLEIN, J.M.ORENSTEIN, M.B.SPORN, S.M.WAHL. (2005). Human immunodeficiency virus type 1-induced macrophage gene expression includes the p21 gene, a target for viral regulation.. Journal of Virology. 79(7):4479-91 [GC23].

Cet article parle dun gne p21 qui est exprim aprs infection par le VIH et qui est mdi par la protine Vpr. Vpr facilite la rplication virale. Les chercheurs ont tent dinhiber le gne p21 et constat des effets inhibiteurs sur la rplication du VIH, offrant ainsi de nouvelles opportunits thrapeutiques.

Nous dcidons ensuite deffectuer nos recherches sur Scirus car sur PubMed beaucoup darticles ne sont pas disponibles. Or Scirus est un moteur de recherche de grande qualit scientifique et donne parfois accs des articles. Recherche effectue siRNA nef HIV Nombre de rsultats trouvs 53

S.OMOTO, M.ITO, Y.TSUTSUMI, Y.ICHIKAWA, H.OKUYAMA, E.A.BRISIBE, N.K.SAKSENA, Y.R.FUJII. (2004). HIV-1 nef suppression by virally encoded microRNA Retrovirology. .1186/1742-4690-1-44. [GC25].

Ces chercheurs montrent la possibilit pour des miARN de bloquer lexpression de Nef dans le VIH. M.KAMEOKA, S.NUKUZUMA, A.ITAYA, Y.TANAKA, K.OTA, K.IKUTA, K.YOSHIHARA. (2004). RNA Interference Directed against Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 Efficiently Suppresses Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication in Human Cells. Journal of Virology. 16: (8931-8934 ). [GC26].

Les siARN dirigs contre PARP-1rduisent effectivement lexpression de PARP-1 dans deux lignes humaines cellulaires. Ces siARN suppriment de faon significative la rplication du VIH. Ces rsultats montrent que PARP-1 est ncessaire pour une rplication efficace du VIH dans les cellules humaines. PARP-1 peut servir de cible cellulaire pour lARN interfrence pour inhiber la rplication du VIH. Cet article donne des rfrences intressantes : D.D'AMOURS, S.DESNOYERS, I. D'SILVA, G.G.POIRIER. (1999). Poly(ADPribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochemistry. 342:249268. [GC27].

202

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification a post-transcriptionnelle des protines. Durant ce processus, des molcules dADP-ribose sont ajoutes successivement sur des accepteurs de protines pour former des polymres. Cette modification est transitoire mais tendue in vivo, les chanes de polymres peuvent atteindre plus de 200 units sur les accepteurs de protines. Limportance de la synthse de la poly(ADP-ribose) a t tablie dans beaucoup de processus cellulaires. H.HA, C.K. JULURI, Y. ZHOU, S. LEUNG, M. HERMANKOVA, S. H. SNYDER. (2001). Poly(ADP-ribose) polymerase-1 is required for efficient HIV-1 integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3364-3368. [GC28].

PARP-1 est une enzyme nuclaire abondante, active par lADN pour attacher des groupes dADP-ribose aux protines nuclaires. Comme une infection rtrovirale ncessite une intgrase, ces chercheurs ont examin linfection dun pseudo type de VIH dans des fibroblastes de souris avec une dltion cible de PARP-1. Linfection virale est Presque totalement supprime dans les fibroblastes PARP-1 -/-. Cette protection de linfection reflte lempchement de lintgration du virus dans le gnome hte. Ces rsultats suggrent un potentiel pour les inhibiteurs de dans la thrapie du VIH. S.AQUARO, R.CALIO, J.BALZARINI, M.C.BELLOCCHI, E.GARACI, C.F.PERNO. (2002). Macrophages and HIV infection: therapeutical approaches toward this strategic virus reservoir. Antiviral Research. 55:209-225 [GC29].

Les macrophages reprsentent une cibl cl du VIH en plus des lymphocytes CD4. Les macrophages infects sont capables de recruter et dactiver des lymphocytes CD4 par la production de chemokines et de protines virales telles que nef. De plus, lactivation de la voie oxidative dans les macrophages infects peut conduire la mort apoptotique par un effet bystander . Les macrophages sont la cible la plus importante du VIH dans le systme nerveux central. Laltration du mtabolisme neuronal induit par les macrophages infects joue un rle crucial dans la pathogense de lencphalopathie relie au VIH. Ces rsultats montrent que des stratgies thrapeutiques peuvent interfrer avec le VIH. E.M.WESTERHOUT, M.OOMS, M.VINK, A.T.DAS, B.BERKOUT. (2005). HIV1 can escape from RNA interference by evolving an alternative structure in its RNA genome. Nucleic Acids Research. 33(2):796-804. [GC30]. Il a t dmontr rcemment que certaines formes du virus chappaient lARNi. On peut analyser les changements de squence chez ces virus mutants et raliser des expriences pour tudier le mcanisme de rsistance. Il existe une forte corrlation entre la stabilit du complexe siARN-cible et le niveau de rsistance lARNi. Une occlusion des squences cibles des siARN par une structure secondaire rduit lefficacit de lARNi. De plus, le VIH est trs versatile et est capable dvoluer pour chapper lARNi. Recherche effectue Silencing RNAi Nombre de rsultats trouvs gag 95

C.D.NOVINA, M.F.MURRAY, D.M.DYKXHOORN, P.J.BERESFORD, J.RIESS, S.K.LEE, R.G. COLLMAN, J.LIEBERMAN, P.SHANKAR, P.A.SHARP. (2002). siRNA-directed inhibition of HIV1-infection. Nature Medicine. 8(7):681-6 [GC12] 203

Cet article a dj t rfrenc.

J.M.JACQUE, K.TRIQUES, M.STEVENSON. (2002). Modulation replication by RNA interference. Nature.418:435-438.[GC20] Cet article a dj t rfrenc.

of

HIV-1

O. PUSCH, D. BODEN, R. SILBERMANN, F. LEE, L. TUCKER, B. RAMRATNAM. (2003) Nucleotide sequence homology requirements of HIV-1specific short hairpin RNA. Nucleis Acids Res. 31(22): 64446449. [GC50] Cet article permet de dcouvrir que de rcents rapports ont dmontr que le nombre et la localisation de mauvais nuclotides affectaient lactivit des siARN. Des shARN spcifiques du gne gag ont t muts. Leur activit savre moins performante que celle du contrle. Principalement si les mutations touchent la rgion centrale (9 et 11 positions) ou 5 du shARN. Un silencing optimal ncessite donc une homologie parfaite entre le shARN et la rgion cible du gne.

204

Annexes
Annexe 1

Synthse chimique 4 jours 2 semaines*

Transcription in vitro 24h + temps de synthse des oligo 2 oligo dARN de type 29 mers oui oui

Digestion dun ARNdb Vecteur dexpression par Dicer/RNaseIII 1 jour + temps de prparation de la transcription 1 rgion de transcription (200-800 pb), flanque de promoteurs non oui 5 jours + temps de synthse des oligo 2 oligo dARN de type 55-60mer oui non

Cassette dexpression PCR 6h + temps de synthse des oligo 2 oligo dARN de type 50mers oui non

Temps ncessaire

Elments ncessaires

2 oligo dARN de type 21mers non oui

Besoin de designer les siARN ? Possibilit de greffer un groupe fluorescent sur le siARN? Facilit dadministration ? Ncessit de slection (ex par des antibiotiques) ? Utilis pour des tudes long terme ? Possibilit de scale up la synthse ? Ncessit de mesurer lefficacit de transfection sur la population entire ? Cot $$$

oui non

oui non

oui non

modre oui

modre non

non oui non

non limite non

non limite non

oui (mais avec pression de slection) oui oui

non limite non

$$

$$

$$ 205

Annexe 2 : Diagramme schmatique reprsentant les diffrents vnements qui surviennent aprs une infection par le VIH. [GC4].

206

Fiche temps :
Sujet Historique Temps de Temps Temps de rdaction Temps total recherche danalyse 1h + 2h 2h 1h + 2h (problme 8h (correction) informatique + correction) 2h + 3h 4h 2h + 5h (correction) 16h (correction) 4h 3h 2h 16h 7h 3h 12h 6h 2h 32h 16h 7h

Mcanisme Techniques de laboratoire Conception, administration des siARN Visualisation de lARNi Limites et contraintes de lARNi Cancer : Oncognes VEGF Tlomrases P53 VIH : Gnralits Silencing Matriel et Mthodes Historique Mcanisme Techniques de laboratoire Applications Cancer Applications VIH

7h 3h 3h 5h 2h 6h

8h 4h 4h 2h 5h 17h

11h 3h 3h 5h 6h 15h

26h 10h 10h 12h 13h 38h 1h 1h + 6h (correction) 11h 11h 8h

207

5. Bibliographie
5.1. Partie historique
M1 : C. NAPOLI, C. LEMIEUX, R. JORGENSEN. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant Cell. 2 (279-289). M2 : A.FIRE, S.XU, M.K.MONTGOMERY, S.A.KOSTAS, S.E.DRIVER, C.C MELLO. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (744-746). M3 : S. M. ELBASHIR, J. HARBORTH, W. LENDECKEL, A. YALCIN, K. WEBER, T. TUSCHL. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (494-498). M4: J.R.KENNERDELL, R.W.CARTHEW. (1998). Use of ARNdb-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 : (1017-26). M5 : M.T.McMANUS,P.A.SHARP.(2002). Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet 3 (737-47). M6 : C.COGONI,G.MACINO.(2000). Post-transcriptional kingdoms. Genes Development. 10 (638-643). gene silencing across

M7 : T..GURU.(2000). A silence that speaks volumes. Nature. 404 (804-808). M8 : J.R.KENNERDELL, R.W.CARTHEW.(2000) Heritable gene silencing in Drosophila using double-stranded RNA. Nature Biotech 18: (896-898). M9 : T.DALMAY.(2000). An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell. 101 (543553).

5.2. Partie Mcanisme

G1 : Molecular Biology of the Cell expression. G2 : Genomes Studying Genomes Functions of Individual Genes . Basic Genetic Mechanisms Control of gene

Understand a genome sequence

Determining the

G3 : http://www.icr.ac.uk http://www.icr.ac.uk/research/research_sections/structural_biology/teams/barford_team/RNA %20Interference%20and%20RNA%20Silencing/index.shtml G4 : http://www.biosci.ohiou.edu/mcb/RNAi%20Huang.ppt

208

G5 : R. F. KETTING, E.J. FISCHER, E. BERNSTEIN, T..SIJEN, J.GREGORY, H.A. PLASTERK. (2001). Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. Elegans . Genes and Development. 15 : 2654-2659. G6 : http://www.biochemj.org/bj/387/0561/3870561.pdf G7 : http://www.biotech-medecine.com/archives/review27/actu G8 : http://ist.inserm.fr/basismedsci/2004/ms_4_2004/P399-01.pdf G10 : N.TAHBAZ, F.A. KOLB, H.ZHANG, K.JARONCZYK, W. FILIPOWICZ, T.C. HOBMAN. (2004). Characterization of the interactions between mammalian PAZ PIWI domain proteins and Dicer. EMBO reports. 5 :189-94 G11 : K. JARONCZYK, J.B. CARMICHAEL, T.C. HOBMAN. (2005). Exploring the functions of RNA interference pathway proteins. Biochemistry Journal. 387 : 567-571. G12 : http://www.biochimie.univ-paris7.fr/master/pdf/tot_revues_2005_2006.pdf G14 : LEE YS, NAKAHARA K, PHAM JW, KIM K, HE Z, SONTHEIMEREJ, CARTHEW RW.(2004). Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell.117(1):69-81. G15 : http ://www.igmors.u-psud.fr/BBT/BBT04/BBT-12-04.pdf . G16 : A.D. SCADDEN. (2005). The RISC subunit Tudor-SN binds to hyper-edited doublestranded RNA and promotes its cleavage. Nature structural and molecular biology. 12 : 489496. G17 : C.MATRANGA, Y.TOMARI, C.SHIN, D.P.BARTEL, P.D.ZAMORE. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes.. Cell Press. 123(4):607-20 [G17] G18 : E.MANIATAKI, Z.MOURELATOS. (2005). A human, ATP-independent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes Development. 19 : 2979-2990. G19 : H. KAVI, R.FERNANDEZ, W.XIE, J.A.BIRCHLER. 2005. RNA silencing in Drosophila. FEBS Letters. 579: 5940-5949. G20: P.STEIN, P.SVOBODA, M.ANGER, R.M. SCHULTZ. (2003). RNAi: Mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase. RNA. 9:187-192. G21 : T. SIJEN, J. FLEENOR, F. SIMMER, K. L. THIJSSEN, S. PARRISH, L. TIMMONS, R. A. PLASTERK , A. FIRE. (2001). On the Role of RNA Amplification in dsRNATriggered Gene Silencing . Cell. 107 : 465-476. G22 : J.Y.ROIGNANT, C.CARRE, B.MUGAT, D.SZYMCZAK, J.A. LEPESANT, C. ANTONIEWSKI. (2003). Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila. RNA. 9;299-308.

209

G23 : Z.L. MA, H.Y. YANG, P.TIEN. (2003). Progress of miRNA and ist functions in eukaryotes. Yi Chuan Xue Bao. 30 : 693-696. G24 : F.JIANG, X.YE, X.LIU, L.FINCHER, D.McKEARIN, Q.LIU. (2005). Dicer-1 and R3D1-L catalyze microRNA maturation in Drosophila . Genes and Devlopment. 19:16741679. G25 : BERNSTEIN E, CAUDY AA, HAMMOND SM, HANNON GJ. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 : 363-366. G26 : J.BLASZCZYK, J.E. TROPEA, M. BUBUNENKO, K.M. ROUTZAHN, D.S. WAUGH, D.L.COURT. ((2001) Crystallographic and modeling studies of RNase III suggest a mechanism for double-stranded RNA cleavage. Cell Press. 9: 12251236. G27 : V.N. KIM, J.W. NAM. (2006). Genomics of microRNA. Trends in Genetics. 22 : 163-173. G28 : K. NISHIKURA. (2001) A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 107 : 415-8. G29 : T. SIJEN, J. FLEENOR, F. SIMMER, K. L. THUJSSEN, S. PARRISH, L. TIMMONS, R. H. A. PLASTERK, A FIRE. (2001). On the role of RNA amplification in dsRNA-Triggered gene silencing. Cell. Vol 107. pp 465-476. G30 : BRENNECKE J, HIPFNER DR, STARK A, et al. (2003). Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell ; 113: 25-36. G31 : T.TUSCHL, P.D ZAMORE, R LEHMANN, D.P BARTEL, P.A SHARP. (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro . Genes and development. 13 : 3191-3197. G33 : P.D. ZAMORE, T. TUSCHL, P.A SHARP, D.P. BARTEL. (2000). RNAi : doublestranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 101(1): 2533. G34 : Y. ZENG, R.YI, B.R. CULLEN. (2005). Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha.. EMBO Journal. 24 : 138148. G35 : D. BANERJEE, F. SLACK. (2002). Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioaasays. 24 : 119-129. G36 : CHEN CZ, LI L, LODISH HF, BARTEL DP. (2004) MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science. 303: 83-86 G37 : BRENNECKE J, HIPFNER DR, STARK A, et al. (2003). Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell. 113: 25-36.

210

5.3. Partie Techniques de Laboratoire

N1 : www.ambion.com N2 : FIRE, S. XU, M.K. MONTGOMERY, S.A. KOSTAS, S.E. DRIVER, C.C. MELLO. (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature. 391 (6669): 806-811. N3 : S.M. ELBASHIR, J. MARTINEZ, A. PATKANIOWSKA, W. LENDECKEL, T. TUSCHL. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. The European Molecular Biology Organization Journal. 20(23): 6877-6888. N4 : A.L. JACKSON, S.R. BARTZ, J. SCHLTER, S.V. KOBAYASHI, J. BURCHARD, M. MAO, L. B. CAVET, G. CAVET, P.S. LINSLEY. (2003). Expression profiling reveals offtarget gene regulation by RNAi. Nature Biotechnology. 21(6): 6357. N5 : S.P. PERSENGIEV, X. ZHU, M.R. GREEN. (2004). Non-specific, concentrationdependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA. 10(1):1218. N6 : Editors of Nature Cell Biology. (2003). Whither RNAi?. Nature Cell Biology. 5 :489490. N7 : G. SUI, C. SOOHOO, E.B. AFFAR, F. GAY, Y. SHI, W.C. FORRESTER, Y. SHI. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(8):5515-5520. N8 : J.Y. YU, S.L. DERUITER, D.L. TURNER. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(9):6047-6052. N9 : C.P. PAUL, P.D. GOOD, I. WINER, D.R. ENGELKE. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology. 20:505-508. N10 : M. MIYAGISHI, K. TAIRA. (2002). U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3 overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells . Nature Biotechnology. 20:497-500. N11 : P.J. PADDISON, A.A. CAUDY, E. BERSTEIN, G.J. HANNON, D.S. CONKLIN. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes and development. 16:948-958.

211

N12 : S.J. REICH, J. FOSNOT, A. KUROKI, W. TANG. X. YANG, A.M. MAGUIRE, J. BENNETT, M.J. TOLENTINO. (2003). Small interfering RNA (siRNA) targeting VEGF effectively inhibits ocular neovascularization in a mouse model. Molecular vision. 9:210-216. N13 : G. DORN, S. PATEL, G. WOTHERSPOON, M. HEMMINGS-MIESZCZAK, J. BARCLAY, F.J. NATT, P. MARTIN, S. BEVAN, A. FOX, P. GANJU, W. WISHART, J. HALL. (2004). siRNA relieves chronic neuropathic pain . Nucleic Acids Research. 32(5) :e49. N14 : E. SONG, S.K. LEE, J. WANG, N. INCE, N. OUYANG, J. MIN, J. CHEN, P. SHANKAR, J. LIEBERMAN. (2003). RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nature Medicine. 9(3):347-351. N15 : B.J. LI, Q. TANG, D. CHENG, C. QIN, F.Y. XIE, Q. WEI, J. XU, Y. LIU, B.J. ZHENG, M.C. WOODLE, N. ZHONG, P.Y. LU. (2005). Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nature Medicine. 11(9):944-951. N16 : J. SOUTSCHEK, A. AKINC, B. BRAMLAGE, K. CHARISSE, R. CONSTIEN, M. DONOGHUE, S. ELBASHIR, A. GEICK, P. HADWIGER, J. HARBORTH, M. JOHN. (2004). Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432(7014):173-178. N17 : R.M. SCHIFFELERS, A. ANSARI, J. XU, Q. ZHOU, Q. TANG, G. STORM, G. MOLEMA, P.Y. LU, P.V. SCARIA, M.C. WOODLE. (2004). Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids research. 32(19):e149. N18 : A.M. CHALK, C. WAHLESTEDT, E.L. SONNHAMMER. (2004). Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 319(1):264-274. N19 : M. AMARZGUIOUI, J. J. ROSSI, D. KIM. (2005). Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.. FEBS letters. Vol. 579, issue 26, 59745981. N20: B. G. COCKS, T.P. THERIAULT. (2004). Developments in effective application of small inhibitory RNA (siRNA) technology in mammalian cells. Grug Discovery Today : TARGETS. Vol.3 Issue 4, 165-171. N21 : M.C. LUO, D.Q. ZHANG, S.W. MA, Y.Y. HUANG, S.J. SHUSTER, F. PORRECA, J. LAI. (2005). An efficient intrathecal delivery of small interfering RNA to the spinal cord and peripheral neurons. Molecular Pain. 1:29.

212

C1 : C.DEMETERCO, P.ITKIN-ANSARI, B.TYRBEG, L.P.FORD, R.A. JARVIS, F.LEVINE.(2002) c-Myc controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells . The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 87 (3475-85). C2 : S.M.ELBASHIR, J.HARBORTH, W.LENDECKEL, A.YALCIN, K.WEBER, T.TUSCHL.(2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (494-498). C3 : T.TUSCHL, P.D.ZAMORE, R.LEHMANN, D.P.BARTEL, P.A.SHARP (1999). Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes and Development. 13 (3191-3197). C4 : N.SMART, P.J.SCAMBLER, P.R.RILEY. (2004). A rapid and sensitive assay for quantification of siRNA efficiency and specificity. Biological Procedures Online. Volume 7 ;1 :7. C5 : I.MALIK, M.GARRIDO, M.BAHR, S.KUGLER, U.MICHEL. (2006). Comparison of test systems for RNAinterference. Biochemicak and Biophysical Research Communications. 341: (245-256). C6 : X.TIAN, P.ZHANG, M.J.ZAMECK-GLISZCZYNSKI, K.L.BROUWER. (2005). Knocking down transport: applications of RNA interference in the study of drug transport proteins. Drug Metabolism Review. 37:705-723. C7 : B.R.CULLEN. (2004). Derivation and function of small interfering RNAs and microRNAs. Virus research. 102 (3-9) C8 : P.PANCOSKA,Z.MORAVEK,U.MOLL.(2004). Efficient RNA interference depends on global context of the target sequence: quantitative analysis of silencing efficiency. Nucleic Acids Research. 32 (1469-1479).

C9 : A.CHAUCHEREAU,A.HAREL-BELLAN.(2004). Inactivation fonctionnelle des gnes par ARN interfrence . Hmatologie. 10(1) :68-79. C10 : A.J.BRIDGE,S.PEBERNARD,A.DUCRAUX,A.L.NICOULAZ,R.IGGO.(2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nature Genetics; 34: (263-4). C11 : C.A.SLEDA, M.HOLKO, M.J.DE VEER, R.H.SILVERMAN, B.R.WILLIAMS. (2003). Activation of the interferon system by short-interfering RNA . Nature Cell Biology. 5 : (834-9). C12 : J.HARBORTH, S.M.ELBASHIR, K.VANDERBURGH, H.MANNINGA, S.A.SCARINGE, K.WEBER,T.TUSCHL.(2003). Sequence, chemical and structural variation of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing. Antisense Nucleic Acid Drug Development. 13 : 83105

213

C13 : D.K.WALTERS, D.F.JELINEK. (2002) The effectiveness of double-stranded short inhibitory RNAs (siRNAs) may depend on the method of transfection. Antisense Nucleic Acid Drug Development. 12: 411418. C14 : F.CZAUDERNA, M.FECHTNER, S.DAMES, H.AYGUN, A.KLIPPEL, G.J.PRONK, K.GIESE,J.KAUFMANN.(2003). Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Research, 31: 27052716. C15 : C.MARK.(2003).RNA interference: a practical approach. The Journal of Surgical research. 117(2):339-44. C16 : M.AMARZGUIOUI, J.ROSSI, K.DONGHO. (2005). Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS letters. 579 (26) : 5974-5981.

5.4. Partie Applications Cancer

N22 : R.A. ROSENTHAL, J.F. MEGYESI, W.J. HENZEL, N. FERRARA, J. FOLKMAN. (1990). Conditioned medium from mouse sarcoma 180 cells contains vascular endothelial growth factor. Growth Factors. 4(1):53-59. N23 : N. FERRARA. (2004). Vascular endothelial growth factor as a target for anticancer therapy .Oncologist. 9, suppl 1: 2-10. N24 : N. FERRARA. (2002). Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis : therapeutic implications . Seminars in oncology. 29(6 Suppl 16):10-4. N25 : S. FILLEUR, A. COURTIN, S. AIT-SI-ALI, J. GUGLIELMI, C. MERLE, A. HARELBELLAN, P. CLEZARDIN, F. CABON. (2003). SiRNA-mediated Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor Severely Limits Tumor Resistance to Antiangiogenic Thrombospondine-1 and Slows Tumor Vascularization and Growth. Cancer Research. 63, 3919-3922. N26 : A.L. MULKEEN, T. SILVA, P.S. YOO, J.C. SCHMITZ, E. UCHIO, E. CHU, C. CHA. (2006). Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor : effects on cellular proliferation in colon cancer cells . Archives of Surgery. 141(4) : 367-374. N27 : H. GUAN, Z. ZHOU, H. WANG, S.F. JIA, W. LIU, E.S. KLEINERMAN. (2005). A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor inhibits Ewings sarcoma growth in a xenograft model. Clinical Cancer Research. 11(7):2662-2669. N28 : R.M SCHIFFELERS, A. ANSARI, J. XU, Q. ZHOU, Q. TANG, G. STORM, G. MOLEMA, P.Y. LU, P.V. SCARIA, M.C. WOODLE. (2004). Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Research. 32(19):e149. N29 : F. NIOLA, C. EVANGELISTI, L. CAMPAGNOLO, S. MASSALINI, M.C. BUE, A. MANGIOLA, A. MASOTTI, G. MAIRA, M.G. FARACE, S.A. CIAFRE. (2006). A plasmid-encoded VEGF siRNA reduces glioblastoma angiogenesis an dits combination with 214

interleukin-4 blocks tumor growth in a xenograft mouse model . Cancer Biology and Thearpy. 5(2):174-179. N30 : Y.H. WANG, S. LIU, G. ZHANG, C.Q. ZHOU, H.X. ZHU, X.B. ZHOU, L.P. QUAN, J.F. BAI, N.Z. XU. (2005). Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research. 7(2):R220-228. N31 : R. PONZIELLI, S. KATZ, D. BARSYTE-LOVEJOY, L.Z. PENN. (2005). Cancer therapeutics : targeting the dark side of Myc . European Journal of Cancer. 41(16):24852501. N32 : X.H. CHEN, B. LAN, Y. QU, X.Q. ZHANG, Q. CAI, B.Y. LIU, Z.G. ZHU. (2006). Inhibitory effect of Polo-like kinase 1 depletion on mitosis and apoptosis of gastric cancer cells. World Journal of Gastroenterology. 12(1):29-35. N33 : F. ECKERDT, J. YUAN, K. STREBHARDT. (2005). Polo-like kinases and oncogenesis. Oncogene. 24(2):267-276. N34 : X. LIU, R. L. ERIKSON. (2003). Polo-like kinase (Plk) 1 depletion induces apoptosis in cancer cells. PNAS. Vol.100, n10, 5789-5794 N35 : S. REAGAN-SHAW, N. AHMAD. (2005). Silencing of Polo-like kinase (Plk) 1 via siRNA causes induction of apoptosis and impairment of mitosis machinery in human prostate cancer cells : implications for the treatment of prostate cancer. FASEBJ. 19(6):611-613. N36 : B. SPANKUCH-SCHMITT, J. BEREITER-HAHN, M. KAUFMANN, K. STREBHARDT. (2002). Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells. J Natl Cancer Inst. 94(24):1863-1877. N37 : R. GUAN, P. TAPANG, J.D. LEVERSON, D. ALBERT, V.L. GIRANDA, Y. LUO. (2005). Small interfering RNA-mediated Polo-like kinase 1 depletion preferentially reduces the survival of p53-defective, oncogenic transformed cells and inhibits tumor growth in animals. Cancer Research. 65(7):2698-2704. N38 : A.H. HALL, K.A. ALEXANDER. (2003). RNA interference of human papillomavirus type 18 E6 and E7 induces senescence in HeLa cells. J Virol. 77(10): 6066-6069 N39 : X.Y. NIU, Z.L. PENG, W.Q. DUAN, H. WANG, P. WANG. (2006). Inhibition of HPV 16 E6 oncogene expression by RNA interference in vitro and in vivo. Int J Gynecol Cancer. 16(2):743-751. N40 : M. OCKER, D. NEUREITER, M. LUEDERS, S. ZOPF, M. GANSLMAYER, E.G. HAHN, C. HEROLD, D. SCHUPPAN. (2005). Variants of bcl-2 specific siRNA for silencing antiapoptotic bcl-2 in pancreatic cancer. Gut. 54(9):1298-1308. N41 : V. WACHECK, D. LOSERT, P. GUNSBERG, H.P. VORNLOCHER, P. HADWIGER, A. GEICK, H. PEHAMBERGER, M. MULLER, B. JANSEN. (2003). Small interfering RNA targeting bcl-2 sensitizes malignant melanoma. Oligonucleotides. 13(5):393-100.

215

N42 : M. CHAWLA-SARKAR, S.I. BAE, F.J. REU, B.S. JACOBS, D.J. LINDNER, E.C. BORDEN. (2004). Downregulation of Bcl-2, FLIP or IAPs (XIAP and survivin) by siRNAs sensitizes resistant melanoma cells to Apo2L/TRAIL-induced apoptosis . Cell Death Differ. 11(8):915-923. N43 : M.A. SHAMMAS, H. KOLEY, R.B. BATCHU, R.C. BERTHEAU, A. PROTOPOPOV, N.C. MUNSHI, R.K. GOYAL. (2005). Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barretts adenocarcinoma cells: mechanism and therapeutic potential . Mol Cancer. 4:24. N44 : Y. XIA, R.X. LIN, S.J. ZHENG, Y. YANG, X.C. BO, D.Y. ZHU, S.Q. WANG. (2005). Effective siRNA targets screening for human telomerase reverse transcriptase . World J Gastroenterology. 11(16):2497-2501. N45 : Y. GUO, J. LIU, Y.H. LI, T.B. SONG, J. WU, C.X. ZENG, C.F. XUE. (2005). Effect of vector-expressed shRNAs on hTERT expression . World J Gastroenterology. 11(19):2912-2915. N46 : S. LI, J. CROTHERS, C.M. HAQQ, E.H. BLACKBURN. (2005). Cellular and gene expression responses involved in the rapid growth inhibition of human cancer cells by RNA interference-mediated depletion of telomerase RNA. J Biol Chem. 280(25) : 23709-23717. N47 : D. XU, D. MCCARTY, A. FERNANDES, M. FISHER, R.J. SAMULSKI, R.L. JULIANO. (2005). Delivery of MDR-1 small interfering RNA by self-complementary recombinant adeno-associated virus vector. Mol Ther. 11(4):523-530. N48 : Z. SHI, Y.J. LIANG, Z.S. CHEN, X.W. WANG, W.H. WANG, Y. DING, L.M. CHEN, X.P. YANG, L.W. FU. (2006). Reversal of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by vector-based RNA interference in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther. 5(1): 39-47. N49 : E. YAGUE, C.F. HIGGINS, S. RAGUZ. (2004). Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1. Gene Ther. 11(14):1170-1174. N50 : M. JIANG, J. MILNER. (2002). Selective silencing of viral gene expression in HPVpositive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference . Oncogene. Vol.21, n39, 6041-6048. N51 : L. ZHANG, N. YANG, A. MOHAMED-HADLEY, S.C. RUBIN, G. COUKOS. (2003). Vector-based RNAi, a novel tool for isoform-specific knock-down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 303(4):1169-1178. N52 :H. WANG, S. LIU, G. ZHANG, C.Q. ZHOU, H.X. ZHU, X.B. ZHOU, L.P. QUAN, J.F. BAI, N.Z. XU. (2005). Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research. 7(2):R220-R228. N53 : K.C. GOH, H. WANG, N. YU, Y. ZHOU, Y. ZHENG, Z.Y. LIM, K. SANGTHONGPITAG, L. FANG, M. DU, X. WANG, A.B. JEFFERSON, J. ROSE. (2004).

216

PLK1 as a potential drug target in cancer therapy. Drug Development Research. Vol.62, Issue 4, 349-361. N54 : http://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase

M10 : http://www.infobiogen.fr/ http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/Genes/STAT3ID444.html M11: http://ist.inserm.fr http://ist.inserm.fr/BASIS/medsci/fqmb/medsci/DDD/2643.pdf M12 : C. RIVAT, S. RODRIGUEZ, E. BRUYNEEL, A. ROBERT, G. REDEUILH, M. BRACKE, C. GESPACH, S. ATTOUB. (2005). Knockdown of STAT3 expression by RNA interference inhibits the induction of breast tumors in immunocompetent mice. Cancer Research. 65 (195-202). M13: L. F. GAO, D. Q. XU, L.J. WEN, X.Y. ZHANG, Y.T. SHAO, X.J. ZHAO. (2005). Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells. Acta Pharmacol Sinica. 26 (377-83). M14 : C. RIVAT, S. RODRIGUEZ, E. BRUYNEEL, A. ROBERT, G. REDEUILH, M. BRACKE, C. GESPACH, S. ATTOUB. (2005). Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3 (TFF3) -- and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion and tumor growth. Cancer Research. 15. 65(6). M15 : S. O. LEE, W. LOU, K. M. QURESHI, F. MEHRAEIN-GHOMI, D. L. TRUMP, A. C. GAO. (2005). RNA interference targeting Stat3 inhibits growth and induces apoptosis of human prostate cancer cells. Prostate. 60. (303-309). M16 : W. WANG, C. Y. WANG, J. H. DONG, X. CHEN, M ; ZHANG, G. ZHAO. (2005). Identification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic cancer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette. World Journal of Gastroenterology. 11. (20262031). M17 : L. M. CHEN, H. Y. LE, R. Y. QIN, M. KUMAR, Z. Y. DU, R. J. XIA, J. DENG. (2005). Reversal of the phenotype by K-rasval12 silencing mediated by adenovirus-delivered siRNA in human pancreatic cancer cell line Panc-1. World Journal of Gastroenterology. 11. (831-838). M18 : J. FLEMING, G. L. SHEN, S. E. HOLLOWAY, M. DAVIS, R. A. BREKKEN. (2005). Molecular Consequences of Silencing Mutant K-ras in Pancreatic Cancer Cells: Justification for K-rasDirected Therapy. Molecular Cancer Research. 3 (413-423). M19 : B. B. FRIDAY, A. A. ADJEI. (2005). K-ras as a target for cancer therapy. Biochimica and Biophysica Acta. 1756 (127-144). M20 : http://www.ehponline.org/ http://www.ehponline.org/members/1998/106p385-391hernandez/hernandez-full.html

217

M21: ALBERTS, JOHNSON, LEWIS, RAFF, ROBERTS, WALTER. Molecular Biology of The Cell. 1344-1345. M22 : D. L. HAO, C. M. LIU, W. J. DONG, H. GONG, X. S. LIU, C. C. LIANG. (2005). Knockdown of human p53 gene expression in 293-T cells by retroviral vector-mediated short hairpin RNA. Acta Biochimica & Biophysica Sinica. 37 (:779-783). M23 : U. K. MUKHOPADHYAY, A. M. SENDEROWICZ, G. FERBEYRE. (2005). RNA silencing of checkpoint regulators sensitizes p53-defective prostate cancer cells to chemotherapy while sparing normal cells. Cancer Research. 65 (2872-2881). M24 : rapport sur les therapies anticancreuses cibles http://bioinfo.unice.fr/enseignements/EPU_2005/2005_UET1/RAPPORT_FINAL_IMPRESS ION3_3_02_2006.pdf

5.5. Partie Applications VIH

GC1 : F.BARRE-SINOUSSI, J.C.CHERMANN, F.REY, M.T.NUGEYRE, S.CHAMARET, J.GRUEST, C.DAUGUET, C.AXLER-BLIN, F.VEZINET-BRUN, C.ROUZIOUX, W.ROZENBAUM, L.MONTAGNIER.(1983)."Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)". Science.220 (4599): 868871. GC2 : R. C. GALLO, P. S. SARIN, E. P. GELMANN, M. ROBERT-GUROFF, E. RICHARDSON, V. KALYANARAMAN,D.MANN,G.D.SIDHU,R.E.STAHL,S.ZOLLAPAZNER.(1983). Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science. 220, 865-867. GC3 : J.A.LEVY.(1993). "HIV pathogenesis and long-term survival". AIDS. 7 (11): 14011410 GC4 : http://en.wikipedia.org/wiki/Hiv#Replication_cycle_of_HIV GC5 : D.CHAN, P.S.KIM.(1998). "HIV entry and its inhibition". Cell 93 (5): 681-684. GC6 : R.WYATT, J.SODROSKI.(1998). "The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens". Science 280 (5371): 1884-1888 GC7 : K.STREBEL. (2003) Virus-host interactions: role of HIV proteins Vif, Tat, and Rev. AIDS. 17 Suppl 4, S25-S34 GC8 : M.BUKRINSKY, A.ADZHUBEI.(1999). Viral protein R of HIV-1. The Indian journal of medical research. 9, 39-49 GC9 : H.XIAO, C.NEUVEUT, H.L.TIFFANY, M.BENKIRANE, E.A.RICH, P.M.MURPHY,K.T.JEANG. (2000) Selective CXCR4 antagonism by Tat: implications for in vivo expansion of coreceptor use by HIV-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 97, 11466-11471. GC10 : http://www.chups.jussieu.fr/polys/pharmaco/poly/antiretroviraux.html

218

GC11 : http://www.genomenewsnetwork.org/articles/06_02/hiv.shtml GC12 : C.D.NOVINA, M.F.MURRAY, D.M.DYKXHOORN, P.J.BERESFORD, J.RIESS, S.K.LEE, R.G. COLLMAN, J.LIEBERMAN, P.SHANKAR, P.A.SHARP. (2002). siRNAdirected inhibition of HIV1-infection. Nature Medicine. 8(7):681-6 GC13 : E.SONG, S.K.LEE, D.M.DYKXHOORN, C.NOVINA, D.ZHANG, K.CRAWFORD, J.CERNY, P.A.SHARP, J.LIEBERMAN, N.MANJUNATH, P.SHANKAR. (2003). Sustained small interfering RNA-mediated human immunodeficiency virus type 1 inhibition in primary macrophages. Journal of Virology. 77(13):7174-81. GC14 : G.A.COBURN, B.R.CULLEN. (2002). Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference.. Journal of Virology. 76(18):9225-31. GC15 : D.BODEN, O.PUSCH, R.SILBERMANN, F.LEE, L.TUCKER, B.RAMRATNAM. (2004). Enhanced gene silencing of HIV-1 specific siRNA using microRNA designed hairpins. Nucleic Acids Research. 13;32(3):1154-8. GC17 : S.NEKHAI, M.JEREBTSOVA. (2006). Therapies for HIV with RNAi.. Current opinions in molecular therapeutics. 8(1):52-61. [GC17]. GC18 : M.L.YEUNG, Y.BENNASSER, S.Y.LE, K.T.JEANG. (2005). siRNA, miRNA and HIV : promises and challenges. Cell Research. 15(11-12):935-46. [GC18]. GC19 : M.P.NAIR, J.L.REYNOLDS, S.D.MAHAJAN, S.A.SCHWARTZ, R.AALINKEEL, B.BINDUKUMAR, D.SYKES. (2005). RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: prospects for HIV-1 therapy. The AAPS journal. 7(3):E572-8. GC20 : J.M.JACQUE, K.TRIQUES, M.STEVENSON. (2002). Modulation replication by RNA interference. Nature.418:435-438. of HIV-1

GC21 : J.F.ARRIGHI, M.PION, E.GARCIA. (2004). DC-SIGN-mediated infectious synapse formation enhances X4 HIV-1 transmission from dendritic cells to T cells. The journal of experimental medicine. 200:1279-1288. GC22 : R.M.STEINMAN. (2000). DC-SIGN: a guide to some mysteries of dendritic cells. Cell. 100:491-494 GC23 : N.VASQUEZ, T.GREENWELL-WILD, N.J.MARINOS, W.D.SWAIM, S.NARES, D.E.OTT, U.SCHUBERT, P.HENKLEIN, J.M.ORENSTEIN, M.B.SPORN, S.M.WAHL. (2005). Human immunodeficiency virus type 1-induced macrophage gene expression includes the p21 gene, a target for viral regulation.. Journal of Virology. 79(7):4479-91 GC24 : H.J.UNWALLA, M.J.LI, J.D.KIM, H.T.LI, A.EHSANI, J.ALLUIN, J.J.ROSSI. (2004). Negative feedback inhibition of HIV-1 by TAT-inducible expression of siRNA.. Nature Biotechnology. 22(12) : 1573-8. GC25 : S.OMOTO, M.ITO, Y.TSUTSUMI, Y.ICHIKAWA, H.OKUYAMA, E.A.BRISIBE, N.K.SAKSENA, Y.R.FUJII. (2004). HIV-1 nef suppression by virally encoded microRNA Retrovirology. .1186/1742-4690-1-44.

219

GC26 : M.KAMEOKA, S.NUKUZUMA, A.ITAYA, Y.TANAKA, K.OTA, K.IKUTA, K.YOSHIHARA. (2004). RNA Interference Directed against Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 Efficiently Suppresses Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication in Human Cells. Journal of Virology. 16: (8931-8934). GC27 : D.D'AMOURS, S.DESNOYERS, I. D'SILVA, G.G.POIRIER. (1999). Poly(ADPribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochemistry. 342:249-268. GC28 : H.HA, C.K. JULURI, Y. ZHOU, S. LEUNG, M. HERMANKOVA, S. H. SNYDER. (2001). Poly(ADP-ribose) polymerase-1 is required for efficient HIV-1 integration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3364-3368. GC29 : S.AQUARO, R.CALIO, J.BALZARINI, M.C.BELLOCCHI, E.GARACI, C.F.PERNO. (2002). Macrophages and HIV infection: therapeutical approaches toward this strategic virus reservoir. Antiviral Research. 55:209-225 GC30 : E.M.WESTERHOUT, M.OOMS, M.VINK, A.T.DAS, B.BERKOUT. (2005). HIV1 can escape from RNA interference by evolving an alternative structure in its RNA genome. Nucleic Acids Research. 33(2):796-804. GC31 : Retroviruses GC32 : Retroviruses GC33 : Retroviruses Retroviral Infections Synthesis, Assembly, and Processing of Viral Proteins Pathogenesis of HIV and SIV Immunological and Pharmacological Approaches to the Control of

GC 50 : O. PUSCH, D. BODEN, R. SILBERMANN, F. LEE, L. TUCKER, B. RAMRATNAM. (2003) Nucleotide sequence homology requirements of HIV-1-specific short hairpin RNA. Nucleis Acids Research. 31(22): 64446449. GC 51 : S.M. ELBASHIR, J. MARTINEZ, A. PATKANIOWSKA, W. LENDECKEL, T. TUSCHL. (2001) Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. Journal of embryoloy, 20,68776888. GC 52 : Y. ZENG, B.R. CULLEN. (2003). Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA, 9, 112123. GC53 : http://www.prn.org/images/prn_nb_cntnt_images/vol7num1/eron_fig1a.gif GC54 : http://medicine.nature.com

Liste des figures

220

Figure 138 : Phnotypes de la plante sauvage et des plantes transgniques obtenues aprs introduction du gne CHS. Figure 139 : Profil dexpression de lARN de CHS introduit et celui de CHS endogne. Figure 140 : Structure de lenzyme Dicer. Figure 141 : Deux voies de lARNi : par les siARN ou par les miARN. Figure 142 : Biosynthse des miARN. Figure 143 : Exemples de miARN dont la fonction biologique et /ou les cibles ARNm sont caractrises. Figure 144 : Mode dactivation du complexe RISC. Figure 145 : Comparaison des mcanismes daction des siARN et des miARN. Figure 146 : Fonctionnement classique de la machinerie de lARN interfrence Figure 147 : Amplification des siARN grce RdRP. Deux diffrentes voies impliques dans le phnomne dARNi. Figure 11 : Deux protocoles diffrents suivre pour raliser des expriences dARN interfrence sur cellules mammifres ou non-mammifres. Figure 12 : Efficacit des siARN crs par Cenix Figure 13 : Efficacit de diffrents siARN valids et utiliss diffrentes concentrations. Figure 14 : Exprience de silencing du gne Ku-70. Figure 15 : Schma dun Small Hairpin RNA produit par un vecteur dexpression siARN. Figure 16 : Tableau qui rpertorie les diffrentes longueurs et squences de boucles efficaces. Figure 1487 : Vecteur dexpression de siARN de type pSilencer. Figure 18 : Insert cr pour le vecteur pSilencer 1.0-U6. Figure 19 : Insert cr pour le vecteur pSilencer adeno 1.0-CMV. Figure 20 : Mcanisme qui se droule dans la cellule suite lexpression de siARN via un vecteur dexpression. Figure 21 : Rduction diffrentielle dans lexpression du gne cible, en utilisant des SECs avec diffrents promoteurs. Figure 22 : Les siARN tiquets sont fonctionnels. Figure 23: Silencing de lexpression du gne GAPDH. Figure 24 : Sparation des brins du siARN. Figure 149 : Distribution In Vivo de siARN. Figure 26 : Induction et Dure de lARNi provoqu par les siARN. Figure 1507 : Distribution des siARN dans les cellules HeLa S3 en division. Figure 28 : siARN associs aux noyaux des cellules en division. Figure 29 : Utilisation de cellules (Cells-to-cDNA II-96 Automated Kit) et de RT-PCR pour mesurer le silencing. Figure 30 : Cells-to-Signal Procedure. Figure 31 : Mesure du knock-down de lexpression gnique induit par siARN. Figure 32 : Mesure de lexpression gnique du knock-down par les siARN avec SYBR Green. Figure 33 : Down-regulation de c-Myc par ARN interfrence. Figure 34 : Stratgies dadministration des molcules de siARN in vivo. Figure 35 : Effets de l'ARN interfrence de mex-3 sur les niveaux d'ARNm endognes. Figure 151 : Dtermination de la spcificit de lARNi laide de constructions. Figure 152 : Utilisation du gne rapporteur de la lucifrase pour dterminer la spcificit des shARN T4. Figure 38 : La voie Erk. Figure 39 : Dtection de l'inhibition de l'expression de l'ARNm de K-Ras dans les cellules MiaPaCa-2 par RT-PCR.

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Figure 40 : Dtection de l'inhibition de l'expression de la protine K-Ras par immunofluorescence dans les cellules MiaPaCa-2. Figure 41 : Analyse par FACS du taux d'apoptose dans les cellules transfectes par le siARN contre K-Ras Val 12. Figure 42 : Schma reprsentant les grandes tapes de l'expression du siARN. Figure 43 : Reprsentation schmatique du vecteur dexpression pSilener 1.0 U6. Figure 44 : Les siARN dirigs contre c-Myc permettent de rduire le taux de croissance cellulaire. Figure 45 : Le Knock down de la protine c-Myc par lARN interfrence rduit la formation de colonies. Figure 46 : La down rgulation de c-Myc dans les cellules MCF-7 induit un phnomne dapoptose aprs la privation en srum. Figure 47 : Essai TUNEL qui permet de dtecter les cellules apoptotiques in situ. Figure 48 : Domaines notables de la protine STAT3. Figure 49 : Construction du shARN contre STAT3 dans le gnome d'un lentivirus. Figure 50 : Rsultats de linhibition de STAT3 bans les cellules 4T1 da cancer du sein de la souris. Figure 51 : Effet du knock down de PLK1 sur la prolifration cellulaire. Figure 52 : PLK est ncessaire la survie cellulaire. Figure 53 : Effet des siARN spcifiques de PLK1 sur le phnotype mitotique de cellules MKN45 Figure 54 : Analyse de la structure chromatinienne de trois populations cellulaires diffrentes. Figure 55 : Effet de la transfection de siARN dirigs contre PLK1 (siRNA4) sur lapoptose des cellules de cancer. Figure 56 : Effet des siARN dirigs contre E7 sur la synthse dADN Figure 57 : Effet des siARN dirigs contre E7 sur la morphologie des cellules HeLa. Figure 58 : Les siARN dirigs contre E7 induisent lexpression de la SA-gal. Figure 59 : Les siARN spcifiquement dirigs contre Bcl-2 rduisent significativement lexpression de Bcl-2 dans des cellules de mlanomes de type A375. Figure 60 : Induction de lapoptose par des siARN dirigs spcifiquement contre Bcl-2 dans des cellules de cancer du pancras. Figure 61 : Nombre relatif de cellules YAP C, 24 120 heures aprs la transfection des diffrents siARN. Figure 62 : Inhibition de la croissance de modles xnografts de cancers du pancreas sur souris nude par action de siARN dirigs contre Bcl-2. Figure 63 : Inhibition de la synthse duVEGF par transfection de siARN dirigs contre le VEGF. Figure 64 : Etude du volume tumorale chez la souris. Figure 65 : Effet du siRNA ciblant le VEGF sur lexpression du VEGF Figure 66 : Effet du siARN dirig contre le VEGF sur la capacit du VEGF induire une migration des cellules endothliales. Figure 67 : Design des nano particules. Figure 68 : Dgradation des siARN dans le srum Figure 69 : Distribution tissulaire des siARN complexs. Figure 70 : Inhibition de la croissance tumorale grce aux siARN ciblant le VEGFR-2 et compexs aux nano particules. Figure 71 : Effet des siARN dirigs spcifiquement contre les tlomerases sur lexpression des tlomerases dans des cellules SEG-1.

222

Figure 72 : Effet des siARN dirigs spcifiquement contre les tlomerases sur lactivit tlomerase dans des cellules SEG-1. Figure 73 : Effet de siARN ciblant les tlomerases sur la prolifration de cellules SEG-1. Figure 74 : Rduction de la longueur des tlomres aprs traitement des cellules SEG-1 avec des siARN dirigs contre les tlomerases. Figure 75 : Effet de linhibition de lactivit tlomerase sur la snescence cellulaire. Figure 76 : Mise en vidence de lapoptose dans des cellules SEG-1 traites avec des siARN designs contre les tlomerases. Figure 77 : Inhibition de la croissance cellulaire induite par transfection des cellules avec un vecteur dexpression contenant le siARN dirig contre hTERT. Figure 78 : Frquences de mutation de p53 dans le cancer du poumon et dans les autres cancers (donnes : IARC p53 database). Figure 79 : Mcanismes par lesquels la rplication de l'ADN ls peut conduire des anomalies chromosomiques, une amplification gnique et une perte de gne. Figure 80 : Drivation de pXSN et pXRN pour aboutir aux vecteurs rtroviraux pLXSN et pLXRN respectivement Figure 81 : Diffrents niveaux dexpression du gne p53 dans des cellules 293-T. Figure 82 : Modle pour expliquer laugmentation de la sensibilit aux chimiotoxines aprs inhibition de la protine ATM dans les cellules dfectueuses pour p53. Figure 83 : Micrographie reprsentant le bourgeonnement du VIH dans les cultures de lymphocytes. [GC11]. Figure 84 : coupe schmatique du VIH. Figure 85 : Organisation du gnome du VIH. Il comporte des gnes codant pour des protines structurales et des gnes accessoires qui du VIH. Figure 86 : Fixation du VIH sur la cellule cible. Figure 87 : Cycle de rplication du VIH. Figure 88 : Physiopathologie du VIH. Figure 89 : Inhibition de lexpression de CD4 par son siARN spcifique. Figure 90 : Destruction de lARNm CD4 via les siARN CD4. Figure 91 : Mise en vidence de la prsence du VIH par coloration. Figure 92 : Les siARN inhibent lexpression des protines cibles. Figure 93 : Les siARN Tat et Rev inhibent la fonction des protines Tat et Rev du VIH. Figure 94 : Inhibition de la rplication dans les cellules humaines par lARNi. Figure 95 : Analyse de lexpression des ARNm du VIH. Figure 96 : Les siARN dirigs contre tat et rev peuvent initier la dgradation de lARN du VIH -1 avant la reverse transcription. Figure 97 : Inhibition de la rplication du VIH dans les cellules T. Figure 98: Les macrophages infects expriment plus p21. Figure 99 : Induction de lexpression de p21 par Vpr. Figure 100 : Linhibition de p21 rduit la rplication du VIH. Figure 101 : Dtection des miARN Nef et inhibition de lexpression de Nef par les ARN Nef. Figure 102 : Inhibition de lexpression de Nef dans les cellules T humaines par les siARN Nef. Figure 103 : Inhibition de lexpression de Nef dans les cellules T humaines par les siARN Nef. Figure 104 : Inhibition de lexpression de Nef-EGFP par les cellules T exprimant les siARN nef. Figure 105 : Illustrations schmatiques de domaines fonctionnels de PARP-1. Figure 106 : Les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment la rplication du VIH.

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Figure 107 : Les siARN dirigs contre PARP-1 suppriment lactivation du promoteur du VIH. Figure 108 : Inhibition de la rplication du VIH par des siARN. Figure 109 : Inhibition de p24 spcifiquement par son siARN associ (dtection par la mthode de FACS une dimension). Figure 110: Inhibition de p24 spcifiquement par son siARN associ. Figure 111 : Inhibition de lactivit antivirale des siARN due une mutation. Figure 112 : Reprsentation de la rduction de la quantit dARNm. Figure 113 : Diffrentes voies daction des ARNi pour inhiber la prolifration du VIH. Figure 114 : Incorporation efficace des siARN tiquets dans les macrophages. Figure 115 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Figure 116 Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Figure 117 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Figure 118 : Les siARN CCR5 et p24 inhibent linfection par le VIH dans les macrophages. Figure 119 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Figure 120 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Figure 121 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, persistent dans les macrophages non transfects. Figure 122 : Les siARN CCR5, mais pas les siARN p24, confrent aux cellules une protection uniforme quand les macrophages sont infects des intervalles croissants aprs la transfection. Figure 123 : Les siARN p24, mais pas les siARN CCR5, suppriment la rplication du VIH. Figure 124 : Les siARN p24, mais pas les siARN CCR5, suppriment la rplication du VIH. Figure 125 : Cintiques de la transfection des siARN DC-SIGN avec les DC. Figure 126 : Cintique de lexpression des molcules co-stimulatrices aprs transfection des DC avec les siARN DC-SIGN. Figure 127 : Cintique de lexpression de p38 aprs transfection des DC avec les siARN DCSIGN. Figure 128 : Effets de la transfection des siARN DC-SIGN sur les taux de p24 et lexpression de HIV-LTR-R/U5 par les DC. Figure 129 : Certaines formes du VIH rsistent linhibition par les siARN dirigs contre Nef. Figure 130 : Les mutations de Nef confrent une rsistance contre les siARN Nef. Figure 131 : Quantification du niveau de rsistance lARNi. Figure 132: La rsistance lARNi est due la stabilit du duplexe siARN-cible. Figure 133 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. Figure 134 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. Figure 135 : La structure de lARN peut provoquer une rsistance envers lARNi. Figure 136 : La structure de lARN cible peut inhiber la liaison avec le siARN. Figure 137 : La structure de lARN cible peut inhiber la liaison avec le siARN.

224

Conclusion
LARNi est un outil prometteur pour les annes venir. Cependant, il nest, aujourdhui, exploit quau stade de la recherche et il nest pas utilis en thrapie. En effet, le simple fait dadministrer de lARN dans un organisme vgtal ou animal soulve un certain nombre de problmes. Si des obstacles sont dj rencontrs lors des recherches fondamentales sur des organismes non humains , quen sera-t-il chez lHomme dans le cadre dune thrapie ? Ces recherches sont en perptuelle volution et extrmement rcentes (depuis 2001 chez les mammifres). Ltude de lARNi est trs abondante surtout depuis cinq ans. Ceci explique en partie limperfection de notre rapport. Nous navons pas en outre assez de recul sur le sujet. De plus, ce thme est vaste et nous navons pas pu aborder tous les aspects possibles notamment par manque de temps et de connaissances scientifiques. Il faut noter que les informations quapporte notre rapport ne montrent pas compltement la complexit et la diversit des travaux effectus sur ces sujets. Au pralable, nous avions dcid daxer nos recherches sur les applications thrapeutiques de lARNi dans le cadre du cancer et du SIDA, mais en approfondissant, nous nous sommes rendus compte que les applications sur ces pathologies ne concernent pour linstant que le stade de recherche. Un problme thique pourrait alors se poser : en effet, en agissant directement au niveau du gnome, on modifie le systme dexpression de linformation gntique naturel de lhomme. Dautre part, ladministration des ARNi nest encore pas matrise et dautres difficults sont prendre en compte : Le VIH est un virus forte capacit de mutation et dadaptation. Ainsi, les ARNi utiliss seront rendus inefficaces par leur caractre squence spcifique. Le cancer est une pathologie complexe. Chez un patient atteint dun type de cancer, plusieurs proto-oncognes sont muts. Il faudrait donc vrifier si linhibition dun ou de tous ces gnes est ncessaire ; dans le deuxime cas, il faudrait introduire plusieurs types dARNi. En dfinitive, lARNi reprsente un outil fort intressant dans la recherche fondamentale, tant pour la comprhension de gnomes (drosophile, plantes, vers) que pour la comprhension des pathologies humaines. Cependant, pour le moment, lARNi ne reste quun espoir de traitement dun grand nombre de maladies, mais il nous est impossible de conclure sur une possible utilisation dun ARNi thrapeutique dans les prochaines annes, de par le manque de matrise du phnomne et la complexit des pathologies vises.

225

Rsum
LARNi est un phnomne naturel mis en vidence pour la premire fois en 1990 chez les plantes et dcouvert chez les mammifres en 2001. Ce processus implique une tape dinitiation dans laquelle les siARN et les miARN sont gnrs et une tape effectrice qui consiste cliver lARNm contre lequel le siARN tait dirig. On peut recrer/reproduire ce phnomne en laboratoire. Pour cela, le chercheur dispose de plusieurs mthodes de conception et dadministration des siARN (synthse chimique, transcription in vitro, expression via un plasmide). On peut vrifier la prsence des siARN dans la cellule par fluorescence, RT-PCR Cependant, les expriences dARNi rencontrent encore de nombreux obstacles : induction dune rponse interfron, existence de gnes homologues, variabilit de la squence cible Nous avons choisi de traiter deux applications possibles de lARNi dans un but thrapeutique : le cancer et linfection par le VIH. En ce qui concerne le cancer, il est envisageable de cibler toute protine surexprime ou mute, responsable du processus de cancrisation. Nous avons slectionn quatre cibles potentielles : les oncognes, p53 mut, les tlomrases et le VEGF. Par ailleurs, de nombreuses protines du VIH ont t identifies et permettent la rplication du virus ou sa propagation. On peut donc agir sur les gnes viraux : certains permettent lentre du virus dans la cellule, dautres sont impliqus dans sa rplication et sa propagation. En revanche, le VIH est versatile et donc peut chapper au phnomne dARNi. Actuellement, le principe de lARNi est utilis dans les domaines de la recherche fondamentale et de la thrapeutique ; toutefois, il nest encore pas applicable au traitement de pathologies chez lhomme (cest en 2004 que lARNi a t test chez lhumain pour la premire fois). Mots-cls : ARNi, siARN, silencing, thrapie, cancer, VIH.

Summary
RNAi is a natural phenomenon, revealed for the first time in 1990 in plants and discovered in mammalians cells in 2001. This process implies a stage of initiation, in which siRNAs and miRNAs are generated, and a stage effector which cleaves RNAm targeted by the siRNA. This phenomenon can be reproduced in laboratory. With this aim, the researcher has at his disposal several methods of design and administration of siRNAs (chemical synthesis, in vitro translation, expression via a plasmid). We can check that the siRNAs are effectively in the cell by using fluorescence, RT-PCR Nevertheless, RNAi experiments face a lot of obstacles : induction of an interferon response, existence of homologous genes, variability of the target sequence We have chosen to deal with two possible applications of RNAi in a therapeutic aim : cancer and infection by the HIV-1. Concerning cancer, it is conceivable to target every protein overexpressed or mutated, responsible for the process of cancer. We have selected four potential targets : oncogenes, p53 muted, telomerases and the VEGF. Moreover, a lot of HIV proteins have been identified and allow the virus replication or its propagation. Thus, we can work on the viral genes: some of them allow the enter of the virus in the cell, others are involved in its replication and its propagation. On the other hand, HIV is versatile and so can escape from RNAi mechanism. Currently, the principle of the RNAi is used in fundamental and therapeutic research; however, it is still not applicable for the diseases treatment on Humans (its only in 2004 that RNAi have been tested on Human for the first time). Key-words : RNAi, siRNA, silencing, therapy, cancer, HIV.

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