Enhanced phytoremediation of volatile environmental

pollutants with transgenic trees

INTRODUCTION

La phytoremédiation est l’usage de plantes pour le traitement de polluants environnementaux.

Polluants acheminés, puis métabolisés, séquestrés ou volatilisés.

Bioremédiation microbienne nécessite apports en produits chimiques et en énergie

Avantages phytoremédiation : auto entretien (autotrophe), économique, meilleure approbation du
public et autres…

Populus : croissance rapide, vaste système racinaire, absorption d’eau élevée, capacité de
transformation.
Peuvent dégrader TCE et tétrachlorure de carbone de manière similaire aux mammifères
(ici hybrides P. tremula × P. alba)

Inconvénients : trop long, pendant saison de croissance

Or mesures assainissement doivent être prise pendant période de temps limitée
→ grandement amélioré par introduction de gènes impliqués dans le métabolisme de dégradation
des polluants dans d’autres organismes

Déjà réalisé : TNT, RDX, herbicides, métaux

Polluants traités : TCE (trichloroéthylène), chlorure de vinyle, chloroforme, tétrachlorure de carbone,

benzène → cancérigènes, neurotoxiques, hépatotoxiques
TCE : dégraisseur industriel ;
chlorure de vinyle : produit de la déhalorespiration (= dégradation réductive anaérobie) microbienne du TCE ;
chloroforme : sous-produit du procédé de désinfection utilisé pour traiter l'eau potable ;
tétrachlorure de carbone : utilisé comme solvant ;
benzène : associé au pétrole
Méthodes techniques pour éliminer ces polluants sont chères

Cytochrome P450 2E1 : enzyme mammifère spécifique pour les polluants environnementaux
Dans un projet de démonstration : introduction du gène CYP2E1 dans des plants de tabac a donné
des plantes avec un métabolisme de dégradation du TCE augmenté.
Objectif : présenter le développement des premiers arbres transgéniques dotés de capacités de
phytoremédiation améliorées pour enlever et dégrader plusieurs des polluants les plus répandus et
dangereux de l’eau et de l’air.

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RESULTATS

I. Augmentation de métabolisme de dégradation du TCE dans le peuplier

Développement de peupliers hybrides ayant une forte expression d’une enzyme capable de dégrader
le TCE. Un métabolite est le trichloroéthanol.
Boutures contenants le transgène CYP2E1 ou « null vector » exposées au TCE dans fioles hermétiques
Métabolisme de dégradation du TCE des boutures transgéniques ≈ 45× plus grand que pour les
boutures contrôles.
Lignes 78 et 20 ont un taux de dégradation du TCE > 100× plus grand que les contrôles.
Boutures transgéniques ont poussé normalement, sans réaction défavorable au TCE

II. Expression de l’expression du transgène CYP2E1

Quantité RT-PCR ⬄ niveau d’expression du transgène CYP2E1

WT, null vector → pas d’expression
Plantes transgéniques → expression
Ligne CYP2E1-78 → ≈ 4× + que autres plantes transgéniques
→ a montré le + haut métabolisme de dégradation dans l’étude
⇨ expression transgène en accord avec taux dégradation du TCE

III. Elimination des polluants d’une solution hydroponique

Boutures incubées dans solution hydroponique contenant du TCE, concentration en TCE surveillée.
Boutures CYP2E1 transgéniques retirent le TCE de la solution à des taux beaucoup plus élevés que les
boutures « null vector » (Table 1).
Après 1 semaine, contrôle et « null vector » ont enlevé < 3% du TCE alors que les boutures
transgéniques ont enlevé entre 51 et 91% du TCE des solutions.
Différence la plus significante entre ligne 78 et « null vector » : ligne 78 élimine 53× plus vite le TCE
que le contrôle.

Cytochrome P450 2E1 a une large spécificité de substrat, les taux d'élimination du chloroforme et du
tétrachlorure de carbone ont été déterminés.
En 1 semaine, plantes transgéniques ont retiré 99% de chloroforme de la solution comparé à 18-20%
pour les contrôles (fig. 3). Le taux d’élimination a augmenté de 0,02 µg·h-1·g-1 pour les plantes témoins
à 0,17 µg en moyenne pour les lignées transgéniques CYP2E1, une amélioration 9 fois supérieure.
Après 1 semaine, les plantes CYP2E1 ont éliminé 92-94% du tétrachlorure de carbone comparé à
10-12% par les contrôles (fig. 4).
  % d'élimination Taux
Contrôle 29% 0,61 ± 0,16
CYP2E1 line 78 49% 1,9 ± 0,4
L’augmentation du métabolisme des substrats du P450 2E1 conduit à une augmentation de
l’élimination des polluants de la solution.

Boutures de plants CYP2E1-78 exposées à du chlorure de vinyle gazeux.

En 5 jours, les plants transgéniques ont enlevé 49% du chlorure de vinyle de l’air contre environ 29%
par les boutures témoins. Les boutures CYP2E1-78 ont un taux d’élimination de 1,9 ± 0,4 µg·h-1·g-1 en
comparaison des boutures de contrôle avec un taux de 0,61 ± 0,16 µg·h-1·g-1, soit 3× plus.
Après 7 jours d’exposition, les boutures CYP2E1 ont montré un noircissement du tissu foliaire
mésophyllique. Le cytochrome P450 2E1 (humain) catalyse l'oxydation du chlorure de vinyle (en
métabolites réactifs transitoires, qui peuvent lier les protéines et l'ADN), produit des métabolites

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toxiques du chlorure de vinyle pour les tissus des peupliers transgéniques. Cependant, les
concentrations dans l’environnement sont rarement aussi élevées que dans l’étude, donc la toxicité
du métabolisme ne devrait pas poser de problème dans les applications de terrain.

IV. Elimination des polluants de l’air

Ligne CYP3E1-78 et contrôles exposés à du TCE et benzène volatile dans des dessiccateurs.
Pour le TCE plantes entières, pour benzène boutures en solution hydroponique car bactéries du sol
métabolisent le benzène.
TCE : Plantes CYP2E1 dégradent 79% du TCE, « null vector » pas d’absorption significative (fig. 5).
Benzène : également éliminé par boutures transgéniques à une vitesse accrue (fig. 6). Plants CYP2E1
enlèvent 0.28 µg de benzène h-1·g-1 de masse de plante comparé à 0,025 µg·h-1·g-1 pour les contrôles
« null vector ». En 2 semaines, les plantes contrôles ont éliminé 13% du benzène de l’air, comparé à
36 et 46% par 2 lignes indépendantes CYP2E1

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MATERIEL ET METHODES

Construction de lignes de peupliers transgéniques

Plasmide pSLD50-6 contient ADNc CYP2E1 du lapin sous contrôle du promoteur 35S du virus de la
mosaïque du chou-fleur.
Clone hybrides de peuplier INRA 717-1B4 P. tremula × P. alba.
Plantes témoins « null vector » dérivées de transformations utilisant autre plasmide.
2 lignes indépendantes vérifiées par PCR et bouturées en milieu de culture tissulaire.

Expression du transgène CYP2E1 dans le peuplier hybride

Echantillons de feuilles ≈100 mg prélevés sur peuplier hybrides cultivés dans sol dans salle de culture.
Extraction ARN, utilisé pour synthétiser ADNc, et quantification transgène par RT-PCR.

Expériences du métabolisme de dégradation du TCE

Les plantes transgéniques ont subi 2 exams pour améliorer métabolisme de dégradation du TCE
Boutures stérilisées et placées dans flacons de VOA.
Expériences sur boutures non racinées car racines peu efficaces.
Ajout ≈50 µg/mL de TCE.
Après 1 semaine, plantes « flash frozen », réduites en poudre, et métabolites extraits.

Expériences sur l'absorption du TCE

Bouture de ≈8 cm de hauteur de lignes de contrôle « null vector » et de lignes rCYP2E1 en triple

exemplaire, stérilisées, placées dans flacons et dosées avec du TCE comme dans § précédant.
Echantillons initiaux prélevés du milieu après 4h d’équilibration.
Plantes incubées à ≈25°C pdt 7j. TCE extrait, analysé et quantifié.
Poids moyen plantes 1,1 g pour lignes témoins, 0,9 g pour ligne CYP2E1-4, 0,7 g pour la ligne 8, 1,17 g
pour la 20 et 0,74 g pour la 18.

Expériences sur l'absorption du chloroforme

Boutures de 4 à 6 feuilles en moyenne prélevées sur tige apicale de plantes de ≈8 cm de hauteur des
lignes CYP2E1-78 et 20, stérilisées et placées dans flacons comme précédemment.
Chloroforme ajouté à solution hydroponique à ≈3 µg/mL, puis extrait, concentration analysée et
quantifiée.
Au total 9 plantes et 3 échantillons de milieu analysés, expérience répétée 2×.
Poids moyen plantes (à fin de l’exp.) 1,3 g pour témoins, 1,1 g pour ligne CYP2E1-78 et 1,0 g pour
ligne 20.

Expériences sur l'absorption du tétrachlorure de carbone

Boutures de 4 à 6 feuilles en moyenne prélevées sur tige apicale de plantes de 7 à 8 cm de hauteur,

traitées comme précédemment.
Tétrachlorure de carbone ajouté à solution hydroponique à 1,6 µg/mL, puis extrait, analysé.
Au total 9 plantes et 3 échantillons de milieu analysés, expérience répétée 2×.
Poids moyen plantes 1,0 g pour témoins, 1,4 g pour ligne CYP2E1-78 et 1,6 g pour ligne 20.

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Volatil expériences TCE

Petits peupliers enracinés en pots de 4 pouces contenant du ProMix 1:1 et de la perlite incubés dans
des dessiccateurs.
Dessiccateurs scellés avec de la graisse Fluorolube. Orifices d'échantillonnage munis d'une vanne et
d'un joint d'étanchéité en caoutchouc fermés de sorte que les septums été exposés que pendant
prélèvement échantillon.
82 µL d’eau saturée en TCE dans bécher placée dans dessiccateurs. Scellés, incubés à T° ambiante
avec photopériode de 16h.
Concentration TCE mesurée quotidiennement en prélevant 500 µL d'air de l'orifice d'échantillonnage
grâce à seringue étanche au gaz et en l'injectant manuellement.
Analyses quotidiennes réalisées 3×.
Dessiccateurs scellés pendant toute période d'incubation.
Au total, 4 boutures de ligne CYP2E1-78 et 3 KH200 (« null vector ») évaluées, chacune dans son
propre dessiccateur scellé.

Volatil benzène expériences

Boutures des extrémités apicales placées dans 225 mL de solution hydroponique stérile dans fioles.
Embouchure fioles bouchées avec coton autour tiges, le tout recouvert d’alu.
Boutures transférées dans dessiccateurs.
200 μL d'eau saturée en benzène placée dans bécher à intérieur dessiccateur. Dessiccateurs scellés
incubés à T° ambiante avec photopériode de 16h.
Air dessiccateur analysé comme précédemment. Echantillon de 500µL injecté dans détecteur à
ionisation de flamme.
Masse moyenne 1,5g pour boutures témoins et 1,6 g pour ligne CYP2E1-78.
Au total, 4 boutures de ligne CYP2E1-78 et 3 KH200 (« null vector ») évaluées.

Expériences sur le chlorure de vinyle

Boutures des extrémités apicales prélevées sur peuplier non transgénique et sur peuplier
transgénique CYP2E1 ligne 78, stérilisés comme précédemment.
Transférées dans flacons VOA, dosé avec ≈35Og de chlorure de vinyle.
Gaz laissé à s’équilibrer pdt au – 12h avant échantillonnage.
Flacons incubés à T° ambiante avec photopériode de 16h
Espace de tête du flacon a été analysé en prélevant 150 μL et en injectant dans un détecteur à
ionisation de flamme
Injections réalisées 3×. Exp réalisée avec 3 boutures témoins et 3 transgéniques. Ensemble réalisé 2×.
Masse moyenne 2,1 g pour boutures témoins et 1,4 g pour ligne CYP2E1-78.

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DISCUSSION

1er dév d’arbres transgénique pour augmenter retrait de nbx polluants

Utilisation OGM / plantes transgéniques permet surmonter bcp des obstacles de phyto tradi :
- Plantes peuvent juste déplacer polluants du sol à air
- Polluants souvent phytotoxiques
- Environnement souvent contaminé par de nbx produits chimiques

Enzymes du peuplier assez similaires à celles de mammifère pour fonctionnement cytochrome P450
2E1.
Stratégie surexprimer gène responsable largement applicable à de nbx polluants.

Faible absorption du TCE des peupliers non transgéniques inattendue,

Cependant études précédentes réalisées avec boutures racinées et feuillues, ou arbres entiers, alors
qu’ici boutures non racinées.
Pour cela, manque de retrait de TCE par peuplier contrôle peut-être dû à différents génotypes ou au
concept expérimental.
Besoin études de champs avec arbres CYP2E1-78 et non transgéniques.

Pas d’élimination du dibromure d'éthylène contrairement à étude précédente probablement car

origine gène utilisé différente (humain, [ici] lapin), => spécificité des substrats différentes.
Nécessite réglementation et surveillance fédérale.
Nécessite études complémentaires pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet indésirables sur organisme
non ciblés.
Plantes transgéniques ne doivent pas devenir communes dans les populations sauvages.
Forts niveaux de confinement peuvent être nécessaires, possible à réaliser (manuellement ou
contrôle génétique de floraison).