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OUVRIR
Le butyrate produit par les
bactéries commensales intestinales active
Expression du TGFbeta1 par le facteur
de transcription SP1 dans les cellules
Reçu : 4 avril 2018
Accepté : 13 juin 2018
Publié: xx xx xxxx
épithéliales intestinales humaines
Camille MartinGallausiaux1,2, Fabienne BéguetCrespel 1, Ludovica Marinelli 1,2,
Alexandre Jamet1, Florence Ledue1, Hervé M. Blottière 1,3 & Nicolas Lapaque1
Le microbiote intestinal contribue au bienêtre global de son hôte par son rôle fondamental dans l'induction et le
maintien d'un système immunitaire sain. Les bactéries commensales façonnent le système immunitaire muqueux en
influençant la proportion et l'état d'activation des lymphocytes T régulateurs antiinflammatoires (Treg) par des métabolites
encore partiellement décryptés. Les membres du microbiote tels que Clostridiales fournissent un environnement riche en
facteur de croissance transformant β (TGFβ) qui favorise l'accumulation de cellules Treg dans l'intestin. Les cellules
épithéliales intestinales (IEC) jouent un rôle central dans ce processus, car elles sont une source majeure de TGFβ1 lors de
la colonisation bactérienne. Dans cette étude, nous avons recherché quelles bactéries commensales intestinales étaient
capables de réguler le promoteur humain TGFB1 dans les CEI en utilisant des surnageants de bactéries cultivées. Nous avons
signalé que les surnageants de Firmicutes et de Fusobactéries étaient les modulateurs de TGFB1 les plus puissants dans les
cellules HT29. De plus, nous avons démontré que le butyrate était le principal métabolite dans les surnageants bactériens
responsable de l'augmentation du TGFβ1. Cet effet induit par le butyrate était indépendant des récepteurs couplés aux protéines
G GPR41, GPR43 et GPR109a, du transporteur MCT1 ainsi que des facteurs de transcription NFκB et AP1 présents sur le
promoteur TGFB1 .
Fait intéressant, les inhibiteurs d'HDAC induisaient une augmentation similaire de TGFB1 , ce qui suggère que le butyrate
agissait par le biais de ses propriétés d'inhibiteur d'HDAC. Enfin, nos résultats ont montré que SP1 était le principal facteur de
transcription médiant l'effet inhibiteur d'HDAC du butyrate sur l'expression de TGFB1 . Il s'agit, à notre connaissance, de la
première caractérisation des mécanismes sousjacents à la régulation de TGFB1 dans l'IEC par des bactéries commensales
dérivées du butyrate.
Les humains sont colonisés par des bactéries, des archées, des eucaryotes et des virus, que l'on appelle collectivement le
microbiote. Ces organismes exercent diverses fonctions souvent associées à des effets physiologiques bénéfiques pour l'hôte.
De nombreuses études suggèrent que les membres indigènes du microbiote jouent un rôle central dans la régulation fine du
système immunitaire de l'hôte grâce à leur interaction intime avec l'épithélium de l'hôte1–5 . La composition du microbiote
intestinal de l'hôte façonne les réponses immunitaires muqueuses et systémiques en influant en partie sur la proportion et l'état
d'activation des sousensembles de lymphocytes T. Parmi eux, les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ intestinaux (Treg) jouent
un rôle central dans le maintien de l'homéostasie immunologique et leur proportion est fortement liée à la composition du
microbiote4,6–9 . Deux études ont montré que des mélanges complexes de bactéries Clostridiales des groupes IV et XIVa ou
d'un seul groupe d'espèces de Clostridium I, fournissent un environnement riche en facteurs de croissance transformants β1
(TGFβ1) qui favorise l'accumulation de cellules Treg induites (iTreg)4,9 . Fait intéressant, dans les maladies inflammatoires de
l'intestin (MICI) connues pour être liées à la composition des bactéries commensales, les groupes de Clostridiales IV et XIVa sont
significativement moins abondants et la pathologie a été rapportée comme étant associée à une altération de la signalisation du
TGFβ dans de nombreux types de cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T10 –16.
1 Institut Micalis, INRA, AgroParisTech, Université ParisSaclay, 78350, JouyenJosas, France. 2 Sorbonne Université,
Collège Doctoral, F75005, Paris, France. 3MetaGenoPolis, INRA, Université ParisSaclay, 78350, Jouy en Josas,
France. La correspondance et les demandes de matériel doivent être adressées à NL (email : nicolas.lapaque@inra.fr)
Rapports Scientifiques | (2018) 8:9742 | DOI :10.1038/s4159801828048y 1
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Les mécanismes moléculaires de la génération des cellules Treg par le microbiote n'ont été que partiellement élucidés4,6–9 .
Plusieurs groupes ont montré que les acides gras à chaîne courte (SCFA), tels que le butyrate, issus de la fermentation bactérienne des
fibres alimentaires favorisent la génération de cellules Treg6,8 . Le butyrate agit comme un inhibiteur des histone désacétylases (iHDAC) et
améliore par conséquent l'acétylation de l'histone H3 dans les éléments régulateurs du locus Foxp3.
Cependant, la génération de Treg in vitro n'est pas induite directement par les AGCC seuls et nécessite une stimulation du TGFβ16,8 De .
plus, le TGFβ1 est essentiel pour la différenciation des Treg par les bactéries productrices de butyrate in vivo4 .
Dans l'intestin, les cellules dendritiques (DC) et les cellules épithéliales intestinales (IEC) sont les principales sources cellulaires de TGFβ14,9,17–19.
Fait intéressant, la colonisation de souris sans germes par certains membres du microbiote conduit à une expression accrue de TGFβ1
dans les CEI et à la restauration presque complète du niveau de Treg colique4,9,20,21. Une étude récente a démontré que Clostridium
butyricum augmentait la génération d'iTreg via une induction dépendante du récepteur de type Toll 2 (TLR2) du TGFβ1 par les DC. Il
s'agissait de la première démonstration d'un mécanisme déployé par un membre du microbiote intestinal pour activer la sécrétion de TGFβ1
conduisant à la génération de cellules Treg9 .
La boucle d'autoinduction TGFB1 est bien documentée. L'ajout de TGFβ1 active le récepteur TGFβ1 conduisant à une signalisation en
aval dépendante de SMAD et MAPK22. Cependant, il n'y a que peu d'informations mécaniques sur la régulation de TGFB1 par des signaux
exogènes. En effet, l'induction du TGFβ1 par les bactéries commensales favorise la prolifération, la polarisation et la différenciation des
lymphocytes T mais les molécules ou voies impliquées sont encore inconnues4 . Nous avons donc décidé d'étudier l'impact de bactéries
commensales cultivables
les individuelles
mécanismes sur l'expression
moléculaires transcriptionnelle de TGFB1 dans un modèle IEC humain et de caractériser davantage
sousjacents.
Dans la présente étude, nous avons criblé des surnageants bactériens dérivés de plus de 120 espèces commensales sur un système
rapporteur TGFB1 et avons montré que le butyrate était le principal métabolite dérivé du microbiote induisant l'expression de TGFB1 dans
la lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine HT29. Nous avons montré que l'induction de TGFB1 par le butyrate était indépendante
des récepteurs couplés aux protéines G SCFA (GPR41, GPR43 et GPR109a) et du transporteur SCFA monocarboxylate transporter 1
(MCT1). De plus, la régulation à la hausse de TGFB1 pourrait être attribuée aux propriétés inhibitrices des HDAC des SCFA. Enfin, en
utilisant des inhibiteurs spécifiques et des mutations ponctuelles de la région promotrice de TGFB1, nous avons exclu NFκB et AP1 en tant
qu'éléments régulateurs et montré que le facteur de transcription SP1 était impliqué dans l'activation de l'expression de TGFB1 par le
butyrate.
Résultats
Des métabolites dérivés de bactéries commensales modulent l'expression de TGFβ1. L'expression de TGFβ1 est sévèrement diminuée
dans le côlon des souris sans germe par rapport aux souris colonisées, suggérant un rôle crucial du microbiote dans ce processus4 .
L'impact des métabolites bactériens est particulièrement drastique sur la production de TGFβ1 par l'IEC bien qu'aucun mécanisme n'ait été
décrit à ce jour. Ainsi, pour déchiffrer quelles bactéries commensales régulent l'expression de TGFB1 ; nous avons étudié l'activité de plus
d'une centaine d'espèces bactériennes, dont 60% des bactéries appartenant au microbiote humain, sur un système rapporteur TGFB1
exprimé dans la lignée IEC humaine HT2923. Des publications antérieures ont rapporté que les composés biologiques actifs produits par
les bactéries dans l'intestin sont susceptibles d'être de petites molécules difusibles, nous avons donc testé des surnageants bactériens sur
un système rapporteur HT29TGFprom (Fig. 1A)11,24–26. Nos résultats ont montré que les espèces appartenant aux phylums Firmicutes
et Fusobacteria étaient les principaux inducteurs de TGFB1 tandis que certains membres des Actinobacteria étaient des inhibiteurs. Au
niveau du genre, Clostridiales et Fusobacterium augmentaient fortement l'expression de TGFB1. Lactobacillus et Bifdobacterium réduisaient
l'activité de TGFB1, mais ces effets n'ont pas été trouvés chez toutes les espèces testées (Fig. 1 supplémentaire).
Le butyrate active l'expression de TGFB1 dans la lignée cellulaire épithéliale. Une caractéristique commune aux principaux
inducteurs de TGFB1, Clostridiales et Fusobacterium, est leur capacité à dégrader les fibres alimentaires complexes par
fermentation anaérobie27. Les AGCC étant des produits finaux majeurs de cette fermentation anaérobie ayant des impacts
importants sur la santé humaine, nous avons ainsi quantifié les concentrations d'acétate, de butyrate, de propionate, de valérate
ainsi que d'isobutyrate et d'isovalérate dans les surnageants bactériens (Tableau complémentaire 1). L'analyse de corrélation
globale par composant principal (PCA) de toutes les concentrations de SCFA et de l'expression de TGFB1 a montré que le
butyrate était le seul SCFA pour lequel la concentration était corrélée à l'activité de TGFB1 (Fig. 1B). De plus, cette association
a été con frmée par une corrélation par paires de Spearman entre le butyrate et le TGFB1, sur des données classées (Fig. 1C).
Nous avons confirmé expérimentalement la corrélation observée en testant une large gamme de concentrations physiologiques d'AGCC
sur des cellules rapporteurs HT29TGFprom. Comme le montre la figure 2A, le butyrate était un puissant inducteur de TGFB1 avec un
impact significatif à une concentration commençant à 1 mM. Fait intéressant, d'autres AGCC tels que le propionate, le valérate et l'isovalérate
ont activé le TGFB1, mais dans une moindre mesure (Fig. 2A, B). Le SCFA le plus abondant produit par les bactéries intestinales, l'acétate,
n'a eu aucun impact sur l'expression de TGFB1. De plus, nous avons démontré que les SCFA augmentaient non seulement l'activité du
gène TGFB1, mais augmentaient également le niveau de protéine TGFβ1, tel que dosé par ELISA (Fig. 2C).
L'activation de TGFB1 par le butyrate est indépendante des récepteurs SCFA GPR41, GPR43, GPR109a et du transporteur SCFA MCT1.
Les AGCC induisent de nombreuses voies de signalisation par leur liaison à trois récepteurs couplés aux protéines G (GPR) différents :
GPR41, GPR43 et GPR109a. Ces récepteurs présentent des affinités pour les AGCC conduisant à des signaux cellulaires28–30. Les trois
GPR ont été trouvés exprimés dans la lignée cellulaire HT29 (Fig. 2A supplémentaire). Pour étudier le rôle potentiel de ces récepteurs sur
l'expression de TGFB1, nous avons testé des agonistes spécifiques de GPR41 (1MCPC et AR420626), GPR43 (acide tiglique et 4CMTB)
et GPR109a (niacine et MK1903) sur le système rapporteur HT29TGFprom . Aucun des agonistes n'a été capable d'imiter l'effet du butyrate
sur l'expression de TGFB1, ce qui suggère que ces GPR n'étaient pas impliqués dans ce processus (Fig. 3A). Lors de la liaison au ligand,
les GPR signalent via l'activation de deux sousunités de la protéine G : Gα/i (pour GPR41, GPR43 et GPR109a) et Gα/q (pour GPR43).
Pour confrmer notre observation, nous avons utilisé respectivement les inhibiteurs Gi/o et Gq, la toxine coquelucheuse (Ptx) et l'inhibiteur de
la phospholipase Cβ (U73122). Fait intéressant, aucun des inhibiteurs n'a été en mesure de bloquer la régulation à la hausse dépendante
du butyrate de l'expression de TGFB1 (Fig. 3B). De plus, la surexpression de GPR43 et
Figure 1. Corrélation entre la production de métabolites bactériens et l'expression du gène TGFB1. (A) Effet des surnageants
bactériens sur le système rapporteur HT29TGFprom organisé par phylum. Les surnageants de culture d'une large gamme de
bactéries commensales ont été appliqués sur le système rapporteur HT29TGFprom (10 % vol/vol). L'expression de TGFB1 a
été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée sous forme de changement de pli vers son contrôle : milieu de croissance
bactérienne utilisé dans chaque expérience et culture bactérienne. Les lignes pointillées dessinent les zones supérieures et
inférieures où TGFB1 a été considéré comme significativement modifié. (B) Analyse PCA montrant la corrélation entre les
concentrations de SCFA produites par les bactéries commensales et l'expression de TGFB1. (C) Représentation de l'expression
de TGFB1 corrélée à la concentration de butyrate dans différentes cultures bactériennes classées par ordre de valeurs (corrélation
de Spearman, r = 0,455, valeur p = 1,302e15). Actinobactéries en bleu, Bacteroidetes en jaune, Firmicutes en gris, Fusobacteria
en rouge et Verrucomicrobiea en bleu clair.
Le GPR109a dans les cellules rapporteurs HT29TGFprom n'a pas eu d'impact sur l'activation dépendante du butyrate de
l'expression de TGFB1, renforçant l'hypothèse d'un mécanisme indépendant du GPR (Fig. 2B et C supplémentaires).
Le transporteur de monocarboxylate 1 (MCT1) a été décrit comme le principal transporteur de butyrate dans le côlon et est
largement exprimé dans les cellules HT29 (Fig. 2A supplémentaire)31,32. Nous avons donc étudié si l'absorption de butyrate par le
transporteur de monocarboxylate 1 (MCT1) était impliquée dans la régulation à la hausse de TGFB1. L'incubation de cellules HT29
TGFprom avec deux inhibiteurs de MCT1 différents, pCMB et ARC15858, n'a eu aucun impact sur l'activation de TGFB1 induite par
le butyrate, ce qui suggère que MCT1 n'était pas impliqué dans la régulation à la hausse de TGFB1 induite par le butyrate ( figure 3C).
Le butyrate induit l'expression de TGFB1 via sa propriété d'inhibiteur d'HDAC. Il est bien établi que les SCFA, et le
butyrate en particulier, s'appuient sur leur propriété d'inhibition de la lysine et de l'histone désacétylase (HDACi) pour
moduler l'acétylation des histones, l'acétylation et la liaison des facteurs de transcription, et par conséquent l'expression
des gènes5,33–35. Le butyrate cible les HDAC de classe I et de classe II et module ainsi l'expression d'un large éventail de gènes36.
Pour évaluer si la propriété butyrate HDACi était impliquée dans la régulation à la hausse de TGFB1, nous avons testé deux HDACi
ciblant les familles d'HDAC de classe I et II dépendantes du zinc. Nous avons traité des cellules rapporteurs HT29TGFprom avec
de la trichostatine A (TSA) et du vorinostat (SAHA) partageant tous deux une structure d'acide hydroxynamique, différente du butyrate
qui appartient à la famille aliphatique33,36 . Fait intéressant, TSA et SAHA imitaient l'effet butyrate en augmentant l'activité de TGFB1,
Figure 2. Impact des SCFA sur l'expression de TGFB1. (A) Les cellules rapporteurs HT29TGFprom ont été incubées pendant 24 h
avec une gamme de concentrations d'acétate, de propionate et de butyrate (0, 5, 1, 2, 4, 8 mM). (B) Les cellules rapporteurs HT29
TGFprom ont été incubées pendant 24 h avec une gamme de concentrations d'isobutyrate, d'isovalérate et de valérate (0, 5, 1, 2, 4,
8 mM). L'expression de TGFB1 a été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée comme la moyenne ± SD du changement de
pli vers les cellules non stimulées, N≥3, (C) Les cellules HT29 ont été incubées pendant 24h avec IL1β (10ng/ml), butyrate 2mM,
propionate 4 mM ou acétate 8 mM. Les niveaux actifs et latents de TGFβ1 ont été mesurés par ELISA et exprimés en médianes ±
quartiles, exprimées en pg/ml. N=3, test t, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
suggérant que la régulation à la hausse de TGFB1 induite par le butyrate pourrait être une conséquence de ses propriétés inhibitrices de
HDAC (Fig. 4).
L'expression de TGFB1 induite par le butyrate est indépendante de NFκB et AP1 et repose sur SP1.
La régulation de la transcription des gènes par le butyrate implique un large éventail de facteurs de transcription. Pour déterminer quels
facteurs de transcription (TF) sont ciblés par le butyrate et pourraient avoir un impact direct sur l'expression de TGFB1, nous avons analysé
la séquence du promoteur TGFB1 humain. Comme prévu dans les publications précédentes, nous avons trouvé plusieurs sites de liaison
pour les facteurs de transcription impliqués dans l'expression des gènes régulés par les HDACi et le butyrate, notamment les boîtes riches
en GC de liaison à la protéine Specifcity1 (SP1), la protéine activatrice 1 (AP1) et la réponse au NFκB. éléments (tableau 1)37–45. Des
travaux antérieurs ont rapporté que certains de ces sites de liaison étaient fonctionnels. En effet, les sites de liaison AP1 et SP1 ont été
décrits comme les principaux régulateurs de l'activité du gène TGFB1 dans différents types cellulaires à l'état d'équilibre et lors de l'
infection46,47. Il a été démontré que NFκB augmentait l'expression de TGFB1 en coopération avec AP148.
Pour déterminer quel facteur de transcription contrôle la régulation à la hausse induite par le butyrate de TGFB1, nous avons d'abord
traité les cellules rapporteurs HT29TGFprom avec un inhibiteur spécifique de l'AP1 (SR11302) en présence ou en l'absence de butyrate
(Fig. 5A). L'inhibiteur de Te AP1 n'a pas été en mesure de bloquer l'augmentation de TGFB1 induite par le butyrate, ce qui suggère que ce
Figure 3. L'impact médié par le butyrate sur TGFB1 est indépendant des récepteurs GPR41, GPR43, GPR109a et du
transporteur MCT1. (A) Les cellules rapporteurs HT29TGFprom ont été incubées pendant 24h avec des agonistes sélectifs
du GPR : GPR41 : AR420626 (1 μM) et 1MCPC (1 mM) ; GPR43 : 4CMTB (1 μM) et acide tiglique (1 mM) ; GPR109a : Niacine
(1mM) et MK1903 (1μM) ou avec DMSO (véhicule) ou butyrate (2mM). (B) Les cellules rapporteurs HT29TGFprom ont été
incubées avec des inhibiteurs de sousunités GPR : la toxine de la coqueluche 2 h avant (Ptx, 0,2 μg/ml) et U73122 (10 μM) avant
la stimulation du butyrate 2 mM et lef pour un total de 24 h d'incubation. (C), les cellules rapporteurs HT29TGFprom ont été
incubées pendant 24h avec des inhibiteurs sélectifs de MCT1 : pCMB (100 μM) et ARC155858 (400 nM).
L'expression de TGFB1 a été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée sous forme de médiane ± quartiles de
changement de pli vers des cellules non stimulées. N≥3, test de Wilcoxon, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
facteur de transcription n'a pas été impliqué. Dix, nous avons traité les cellules rapporteurs HT29TGFprom avec un inhibiteur de NF
κB (BAY 117082) avant la stimulation au butyrate (Fig. 5B). Nous avons observé que l'inhibition de NFκB n'avait pas d'impact
significatif sur l'amélioration du butyrate de TGFB1. Fait intéressant, le butyrate n'a pas activé la voie NFκB dans un système
rapporteur HT29 NFκB confirmant que ce facteur de transcription n'avait aucun rôle dans l'induction de TGFB1 dépendant du
butyrate (Fig. 3A supplémentaire). Pour explorer l'implication de SP1 dans l'induction de TGFB1 dans notre modèle, nous avons
incubé des cellules rapporteurs HT29TGFprom avec du butyrate ou HDACi en présence de mithramycine A, un inhibiteur compétitif
de SP1/SP3. L'inhibition de la liaison à la séquence riche en GC par la mithramycine A a considérablement inhibé la régulation à la
hausse de TGFB1 par le butyrate (Fig. 5C). Nous avons également observé une diminution de l'activation dépendante du butyrate de
TGFB1 en inhibant l'expression de SP1 par l'ARNsi renforçant ainsi notre résultat précédent (Fig. 3B supplémentaire). Ces résultats
suggèrent que l'induction de l'expression de TGFB1 par le butyrate est médiée par la liaison de SP1 à l'élément de réponse riche en
GC. De plus, les impacts de la TSA et de la SAHA sur l'expression de TGFB1 ont également été abrogés par l'inactivation de SP1 ou
la compétition de la mithramycine A (Fig. 5C et Fig. 3B supplémentaire).
Nous avons en outre caractérisé quelle région du promoteur TGFB1 était responsable de l'activation dépendante du butyrate de
TGFB1. Deux constructions de promoteur TGFB1 tronquées ont été générées et transfectées de manière stable dans des cellules
HT29. Les cellules rapporteurs HT29TGF1362/+11 et HT29TGF453/+11 ont été traitées avec des inhibiteurs de butyrate et d'HDAC
Figure 4. L'inhibiteur d'HDAC imite l'activation dépendante du butyrate de l'expression de TGFB1. Les cellules rapporteurs HT29
TGFprom ont été incubées avec du butyrate (2 mM), du SAHA (5 μM), de la trichostatine A (TSA, 1 μM) ou des témoins (DMSO et
RPMI). L'expression de TGFB1 a été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée sous la forme d'une multiplication par rapport
au contrôle : cellules non stimulées. Les données sont représentées sous forme de médiane ± quartiles de changement de pli vers
des cellules non stimulées. N≥3, test de Wilcoxon, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Transcription
Facteur Postes mutation Références
AP1 −820 ; − 418 ; −371 ; +159 −416/−415 ; −371/−370 Kim et al. 38, Lee et al. 48, Weigert et al. 46Kim et

SP1 −236 ; −220 ; −120 ; −108 ; −79 ; −43 ; +175 −216/−215 coll. 38, Lee et al. 48, Weigert et al. 46
NFκB −1267 ; −1174 ; +52 Lee et al. 48
Tableau 1. Sélection des motifs de liaison au facteur de transcription dans le promoteur TGFB1 humain, y compris la localisation des
mutations AP1 et SP1.
(Fig. 6A, B). L'effet du butyrate et de l'HDACi sur l'expression de la luciférase a été observé dans les deux constructions suggérant
une activité d'élément cisrégulateur présent dans le promoteur central, proche de la région 5 'UTR (Fig. 6B).
Comme le montre la figure 6A, plusieurs éléments réactifs fonctionnels AP1 (416, 370) et SP1 (216) ont été identifiés dans le
promoteur central de TGFB1. Pour évaluer le rôle des sites de liaison AP1 (416, 370) et SP1 (216), nous avons transfecté de manière
stable des cellules HT29 avec le système rapporteur TGF453/+11 avec une double mutation de l'AP 1 motifs ou une seule mutation
sur le motif SP1 (HT29TGF453/+11AP1 et HT29TGF453/+11SP1 respectivement, Fig. 6A). Les mutations des motifs AP1 n'ont
pas empêché l'activation par le butyrate et d'autres HDACi confirmant nos résultats avec l'inhibiteur d'AP1 (Fig. 4 supplémentaire). La
mutation d'un site de liaison SP1 était suffisante pour réduire considérablement l'activation du promoteur TGFB1 par le butyrate et
HDACi, confirmant que SP1 est impliqué dans ce processus (Fig. 6B). Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que le butyrate et
HDACi induisent une régulation à la hausse de TGFB1 indépendamment de NFκB et AP1 et via le site 216 SP1.
L'induction bactérienne de TGFB1 est butyrate et SP1dépendante. L'objectif principal de cette étude était d'étudier le
mécanisme moléculaire par lequel les bactéries commensales induisent l'expression de TGFB1 dans les cellules épithéliales.
Nous avons ainsi incubé une sélection de surnageants bactériens inducteurs de TGFB1 sur des cellules HT29TGFprom en présence
d'inhibiteur de SP1/SP3 (mithramycine A). Comme le montre la figure 7, l'inhibition des motifs de liaison SP1 / SP3 a eu un impact
similaire sur le butyrate et la régulation à la hausse induite par les bactéries de TGFB1. Les bactéries commensales sélectionnées tout
au long de notre criblage en raison de leur capacité à augmenter le TGFB1 étaient toutes des bactéries productrices de butyrate. Nos
résultats démontrent le rôle crucial de SP1 dans l'expression de TGFB1 induite par le butyrate de bactéries commensales.
Discussion
TGFβ1 est une cytokine pléiotrope hautement conservée chez les métazoaires et sécrétée sous sa forme latente. Produit par de
nombreux types de cellules et de tissus, le TGFβ1 est impliqué dans diverses fonctions biologiques, notamment la pluripotence, la
morphogenèse tissulaire, la différenciation cellulaire et la régénération49. En tant que cytokine cruciale de l'homéostasie tissulaire, les
dérèglements du TGFβ sont impliqués dans de nombreuses pathologies telles que le cancer, la fbrose, l'asthme, les infections et les
maladies inflammatoires. Plus précisément, le TGFβ1, l'isoforme de TGFβ le plus abondant, joue des rôles complexes dans la régulation
de la réponse immunitaire intestinale50.
Plusieurs études ont souligné l'importance du TGFβ1 en tant que régulateur négatif des réponses infammatoires muqueuses et ont
montré que des défauts dans son expression ou sa signalisation conduisent à des colites4,9,13–15. Chez l'homme, SMAD3, une
molécule intracellulaire impliquée dans la voie de signalisation du TGFβ, fait partie des locus associés à une sensibilité élevée aux MICI22,51.
Figure 5. Expression de TGFB1 activée par le butyrate d'une manière indépendante de NFκB et indépendante de AP1. (A) Les cellules
rapporteurs HT 29TGFprom ont été stimulées pendant 24 h avec SR11302 (10 µM), un inhibiteur spécifique de l'AP1 en présence ou
en l'absence de butyrate (Mais 2 mM). Test de Wilcoxon, N=4 ; (B) Les cellules HT29TGFprom ont été incubées avec BAY117082 40
µM 2h d'incubation préalable avec du butyrate (Mais 2 mM) ou des contrôles. test T, N = 3 ; (C) Les cellules HT29TGFprom ont été
incubées pendant 24 h avec de la mithramycine A (100 nM) et du butyrate ou HDACi, test t, N≥3. L'expression de TGFB1 a été mesurée
par l'activité de la luciférase et exprimée sous la forme d'une multiplication par rapport aux cellules non stimulées. Les données sont
représentées sous forme de médiane ± quartiles de changement de pli. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
De plus, la signalisation défectueuse du TGFβ1 chez les patients atteints de MICI a été associée à une expression élevée de SMAD7, un
inhibiteur de la phosphorylation de SMAD2/3. Les effets délétères de SMAD7 peuvent être inversés par un traitement avec un nucléotide
antisens SMAD713–15. De nombreuses études ont démontré l'implication du microbiote intestinal dans le développement du système
. l'intestin,
immunitaire local et systémique notamment par la modifcation de la différenciation des lymphocytes T régulateurs (Treg)4,6–9 Dans
les
cellules dendritiques (DC) et les cellules épithéliales intestinales (CEI ) sont les principales sources cellulaires de TGFβ1 induit par le
microbiote qui est essentiel à la génération de cellules Treg4,9,17,20. Bien que les IEC ne soient pas les principaux producteurs de TGFβ1 en soi,
Figure 6. La régulation à la hausse de TGFB1 par le butyrate et HDACi dépend de SP1 (A) Représentation schématique du promoteur TGFB1 humain
avec une sélection de motifs de liaison37,38,46,47. Les sites de début de traduction (ATG) et de transcription (+1) ont été définis par65,66. Les
mutations des boîtes AP1 et SP1 sur HT29TGF453/+11 sont représentées.
(B) Les cellules rapporteuses HT29TGF1362/+11, HT29TGF453/+11, HT29TGF453/+11SP1 ont été stimulées pendant 24h
avec du butyrate (4mM), TSA (1µM ) ou SAHA (5 µM). L'expression de TGFB1 a été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée
sous la forme d'une multiplication par rapport aux cellules non stimulées. Les données sont représentées sous forme de médiane ±
quartiles de changement de pli. N≥3, test t, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Figure 7. La mithramycine, un inhibiteur de SP1, a inhibé l'induction de TGFB1 par les bactéries productrices de butyrate. Les cellules HT29
TGFprom ont été incubées pendant 24 h avec des surnageants bactériens (10 % (v/v)) ou du butyrate (Mais 2 mM) ± mithramycine A (100 nM).
L'expression de TGFB1 a été mesurée par l'activité de la luciférase et exprimée sous la forme d'une multiplication par rapport aux cellules non
stimulées. Les données sont représentées sous forme de médiane ± quartiles de changement de pli.
pourtant, ils sont une source importante de cette cytokine si l'on considère le grand nombre de cellules qu'ils représentent dans l' intestin19. De plus,
les IEC se situent à l'interface entre le microbiote et la lamina propria et sont donc plus susceptibles d'être influencées par les bactéries commensales
notamment en faisant de l'intestin un environnement riche en TGFβ117,52.
Ici, nous avons démontré que, parmi les métabolites microbiens produits par les bactéries commensales testées, les acides gras à
chaîne courte (SCFA), et plus particulièrement le butyrate, avaient un impact majeur sur l'expression du TGFB1 humain dans les CEI (Fig.
1). Nous avons montré que des concentrations physiologiques de butyrate régulaient à la hausse l'expression de TGFB1 dans HT29 (Fig.
2). Nos résultats ont confirmé des études antérieures montrant que le butyrate est un puissant inducteur de TGFB1 dans divers types de
cellules, y compris les CEI4,53–55. Nous avons étudié le mécanisme d'induction de TGFB1 induite par le butyrate. Dans des essais utilisant
des ligands de GPR, des inhibiteurs de sousunités de la protéine G et la surexpression de GPR, nous avons établi que l'impact du butyrate
sur TGFB1 était indépendant de GPR43, GPR41 et GPR109a. De même, l'inhibition du transporteur MCT1 n'a pas abrogé l'effet du butyrate,
soulignant que l'absorption du butyrate par MCT1 était superflue (Fig. 3). Pourtant, MCT1 appartient à une grande famille de transporteurs
(MCT) médiant l'absorption de monocarboxylate de la lumière intestinale au cytoplasme cellulaire. Parmi les MCT, MCT1 est le plus exprimé
dans le gros intestin humain, mais nous ne pouvons pas exclure que d'autres isoformes exprimées telles que MCT4 puissent être impliquées
dans le transport du butyrate56,57. Il est également possible que le butyrate pénètre dans la cellule par transport passif ou difusion31,32,56,57.
Les AGCC, en particulier le butyrate, impactent les réponses biologiques de l'hôte par la régulation directe de la transcription des gènes via
leurs propriétés d'inhibiteurs d'histone désacétylase (HDACi) qui favorisent par conséquent l'acétylation des histones5,34,35,58. Nous
démontrons que deux inhibiteurs de HDAC structurellement et métaboliquement non liés aux AGCC induisaient l'expression de TGFB1 de la
même manière que le butyrate. Ainsi, il est probable que la régulation à la hausse de TGFB1 induite par le butyrate était une conséquence
de ses propriétés inhibitrices de HDAC.
À notre connaissance, la régulation à la hausse de l'expression de TGFB1 par HDACi n'a jamais été signalée, en particulier dans les CEI.
La régulation de la transcription génique par HDACi implique un large éventail de facteurs de transcription qui peuvent se lier au
promoteur TGFB1 et qui comprend NFκB, AP1 et SP140,42–45. Plusieurs éléments sensibles de ces facteurs de transcription se sont
révélés être impliqués dans l'induction de TGFB1 par différents stimuli. En effet, il a été décrit que des signaux immunitaires tels que IL1β,
TNFα et les ligands des récepteurs de type Toll peuvent activer la transcription de TGFB1 via l'activation de NFκB9,48. Deux motifs AP1 se
sont avérés fonctionnels dans les cellules hépatiques et mésangiales et confirmés dans notre étude en utilisant l'ester de phorbol46,47,59
(Fig. 4 supplémentaire). De plus, des publications antérieures ont démontré que les motifs de liaison à la protéine Specifc 1 (SP1) sont
particulièrement enrichis en promoteur TGFB1 et que l'un d'eux module l'expression de TGFB1 dans divers modèles, à l'état d'équilibre et
lors de l'infection. Nous avons étudié le rôle de ces facteurs de transcription dans la régulation à la hausse de TGFB1 par le butyrate. Les
inhibiteurs de NFκB et AP1 n'ont pas eu d'impact sur la régulation à la hausse de TGFB1 induite par le butyrate, ce qui suggère que ces
deux facteurs de transcription n'étaient pas impliqués.
Ces résultats ont été confirmés par le fait que le butyrate n'a pas activé de système rapporteur NFκB dans HT29 et qu'une construction de
promoteur TGFB1 muté pour les 2 motifs AP1 fonctionnels a répondu au butyrate de la même manière que le promoteur TGFB1 de type
sauvage. Le promoteur TGFB1 possède un nombre élevé de motifs riches en GC qui sont des cibles potentielles pour les facteurs de
transcription SP1 et SP3. En utilisant un inhibiteur de SP1 / SP3 et en inhibant l'expression de SP1 par l'ARNsi, nous avons montré un rôle
central de SP1 dans l'induction de butyrate et de HDACi de l'expression de TGFB1 (Fig. 6 et Fig. 3B supplémentaire). De plus, en mutant le
motif SP1 fonctionnel dans le promoteur central de TGFB1 (TGF453/+11SP1), ni le butyrate ni l'HDACi n'étaient plus capables de moduler
l'expression de TGFB1. Ce résultat a confirmé que le butyrate améliorait la transcription de TGFB1 via la liaison de SP1 sur le promoteur
principal. Finalement, nous avons confirmé que la liaison de SP1 au promoteur TGFB1 était également essentielle pour l'induction de TGFB1
médiée par le surnageant bactérien.
Récemment, le groupe de Yoshimori a démontré que Clostridium butyricum augmente le TGFβ1 via un mécanisme spécifique impliquant
une signalisation dépendante du récepteur de type Toll2 (TLR2) et une boucle d'autoinduction SMAD dans les cellules dendritiques (DC)
présentes dans la lamina propria9 . Cette génération dépendante de TLR2 de DC tolérogènes favorise l'induction de cellules T régulatrices,
ce qui est similaire à ce qui a été rapporté pour Bacteroides fragilis suggérant un mécanisme plus général utilisé par plusieurs bactéries
commensales60,61. Le laboratoire de Kenya Honda a également signalé qu'un mélange de bactéries Clostridiales des groupes
phylogénétiques IV et XIVa est sufsant pour restaurer le Treg colique chez des souris sans germes et que ce phénotype était dépendant du
TGFβ1 produit par les IEC4,21. De manière frappante, la propriété immunosuppressive de ces Clostridiales était indépendante de plusieurs
voies de signalisation associées aux récepteurs de reconnaissance de formes bactériennes connues telles que MYD88 et était liée à la
production de SCFA suggérant un mécanisme indépendant de la voie rapportée par le groupe de Yoshimura. À partir de ces résultats, on
peut émettre l'hypothèse que l'expression du gène TGFB1 peut être régulée par des facteurs de transcription et des voies de signalisation
spécifiques au type cellulaire.
Nous décrivons ici pour la première fois le mécanisme par lequel le producteur de butyrate du microbiote intestinal impacte la régulation
du gène TGFB1 dans les cellules épithéliales intestinales qui implique HDACi et le facteur de transcription SP1. Bien qu'ils soient limités à la
lignée cellulaire HT29, nous pensons que nos résultats ne se limitent peutêtre pas à cette lignée cellulaire.
En effet, des études antérieures ont montré que le butyrate active l'expression de TGFB1 dans divers types de cellules, y compris les lignées
cellulaires épithéliales intestinales, telles que HCT116 et Caco2, suggérant que le mécanisme décrit a généralement un impact sur IEC4,53–
55. Par conséquent, une validation plus poussée dans les IEC primaires humains ou les organoïdes intestinaux est un défi futur pour
améliorer notre compréhension de l'impact complexe du butyrate sur les IEC. La longue coévolution du microbiote et des cellules hôtes
semble avoir entraîné de multiples mécanismes pour augmenter l'expression de TGFB1 par les IEC et les DC avec une finalité qui se
chevauche, la génération de Tregs protecteurs. Notre étude soutient cette hypothèse et contribue à la compréhension des mécanismes
développés par le microbiote intestinal et notamment les bactéries productrices de butyrate pour favoriser la tolérance immunitaire locale et
systémique.
Matériels et méthodes Culture
cellulaire. Les lignées cellulaires épithéliales humaines HT29 ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, MD). Les cellules HT29 ont été cultivées dans du RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur,
2 mML de glutamine, 50 U/mL de pénicilline, 50 U/mL de streptomycine dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C. Tous les
milieux de culture et suppléments ont été fournis par SigmaAldrich. La contamination par les mycoplasmes a été régulièrement testée à
l'aide de MycoAlert (Lonza) et de PlasmoTest (Invivogen).
Plasmides et lignées cellulaires rapporteurs. Une section de 3,2 kb (section 1864 / + 1370, TGFprom et une section de 1,3 kb (section
1362 / + 11, TGF1362 / + 11) du promoteur TGFβ1 humain ont été clonées dans le pGL4.14 (Promega) luciférase plas mid. La construction
TGF453/+11 et ses mutants dérivés (TGF453/+11SP1 et TGF 453/+11AP1) étaient un kind gif de C. Weigert et transférés dans le
squelette pGL4.14 46. Ces constructions ont été utilisées pour établir le stables HT29TGFprom, HT29TGF−1362/+11, HT29
TGF−453/+11, HT29TGF−453/+11SP1 et HT29TGF−453/+11AP1 lignées cellulaires rapporteuses après sélection antibiotique
(hygromycine, 600 µg.mL, InvivoGen) La lignée cellulaire HT29NFκB a été transfectée de manière stable avec pNiFty2SEAP (Invivogen)
et a été décrite précédemment25.
Ffar2 humain (GPR43) et Hcar2 (GPR109a) ont été clonés après digestion par EcoRI et XhoI dans le vecteur pCMVeGFPN1
(Addgene). Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification de FFAR2 étaient aaaactcgagatgctgccggactggaa et aaaa
gaattcctactctgtagtgaagtccga. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification de HCAR2 étaient aaaactcgagatgaatcggcac catctgcaggat et
aaaagaattcttaaggagaggttgggcccaga.
Luciférase Reporter et tests de viabilité cellulaire. Pour chaque expérience, les cellules ont été ensemencées à raison de 3.104 cellules par
puits dans des plaques à 96 puits 24h avant incubation avec des surnageants ou des réactifs bactériens. Les cellules Te ont été stimulées
pendant 24h avec des surnageants bactériens, SCFA ou contrôles (TNFα, IL1β, PMA et RPMI) dans un volume total de culture de 100 μL
par puits avant le dosage de la luciférase. L'activité de la luciférase a été quantifiée sous forme d'unités de luminescence relative par un
lecteur de microplaques (Infnite200, Tecan) et le Neolite Luminescence Reporter Assay System (PerkinElmer) conformément aux
instructions du fabricant. La phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) a été révélée avec le réactif QuantiBlue (Invivogen) en
utilisant un lecteur de microplaques (655nm Infinite 200, Tecan). Les activités Te TGFB1 et NFκB ont été normalisées aux témoins, c'està
dire les cellules non stimulées ou les cellules en présence de milieu de culture de bactéries non inoculées. Les expériences ont été réalisées
en triple pour au moins trois essais indépendants. La viabilité cellulaire a été contrôlée par mesure MTS en utilisant la solution CellTiter 96
Aqueous One (Promega) selon les recommandations du fabricant.
Culture de souches commensales, préparation de surnageants bactériens et évaluation de la concentration en AGCC. 135 souches
bactériennes commensales intestinales humaines comprenant 111 espèces différentes issues de la collection interne INRAMicalis ou du
DSMZ ont été cultivées. Les conditions de culture anaérobie ont été réalisées en utilisant la méthode de Hungate62. Les espèces et souches
criblées, les milieux de croissance correspondants, les densités optiques (DO), les concentrations d'acides gras à chaîne courte (SCFA)
sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. La composition des milieux de croissance faits maison est répertoriée dans le tableau
supplémentaire 1. Les cultures bactériennes ont été cultivées pour atteindre la DO maximale et centrifugé à 3 000 g pendant 10 à 20 min.
Les cultures ont été contrôlées en utilisant la méthode de coloration de Gram, un test de croissance aérobie et une nouvelle observation au
microscope. Les surnageants bactériens ont ensuite été collectés et filtrés sur des filtres PES de 0,22 μm et conservés à 80 ° C. Un milieu
de culture de bactéries non inoculé a servi de témoin.
Les concentrations d'AGCC produits par les bactéries cultivées ont été mesurées par HPLC et chromatographie en phase gazeuse comme
décrit63,64.
ÉLISA. Les cellules HT29 ont été ensemencées à raison de 1 × 106 cellules par puits dans des plaques à 6 puits 24 h avant l'incubation
avec du milieu sans sérum et des médicaments. Les surnageants ont été collectés 24h plus tard et immédiatement évalués par ELISA en
suivant les instructions du fabricant en utilisant le kit TGFβ1 DuoSet (systèmes R&D).
Réactifs et cytokines. Tous les agonistes, médicaments et inhibiteurs ont été dissous dans du glycérol, du DMSO ou de
l'eau selon les recommandations du fabricant. Les SCFA provenaient de SigmaAldrich et étaient utilisés dans une gamme
de concentrations de 0,5 à 8 mM. Les agonistes GPR utilisés étaient : GPR41 : 4CMTB (1μM, Tocris 4642) et acide tiglique
(1–10mM, Sigma) ; GPR43 : AR420626 (1 μM, Cayman) et MCPC (1 mM, Sigma) ; GPR109a : Niacine (1 mM–10 mM,
Sigma) et MK1903 (1μM, Tocris). Les inhibiteurs sousunitaires des GPR utilisés étaient : la toxine de la coqueluche (Ptx,
0,2 μg/ml, Sigma) et l'U73122 (Sigma 10 μM). Les inhibiteurs de MCT utilisés étaient : ARC155858 (0,4 μM, Tocris), acide
pChloromercuribenzoate (pCMB, 100 μM, Sigma). Les inhibiteurs d'HDAC utilisés étaient : Trichostatine A (TSA, 1 μM,
Sigma), SAHA (5 μM, Sigma). L'inhibiteur compétitif SP1 utilisé était la Mithramycine A (0,1 μM) de Sigma. IL1β (10 ng/ml)
et TNFα (10 ng/ml) provenaient de Peprotech. Le 12myristate 13acétate de phorbol (PMA, 100 nM) provenait de Sigma.
Dosages d'ARNsi. 4.105 cellules HT29 TGFprom ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et des transfections transitoires ont
été effectuées les jours 2 et 3 avec 2,5 µL de DharmaFECT 1 (Dharmacon) et 25 nM de ONTARGETplus smart Pool siRNA SP1
(L02695900 0005, NM_001251825.1) ou contrôle négatif (D0018101005). Au jour 4, les cellules ont été étalées à 2.103 sur 96 puits,
au jour 5, une incubation avec des réactifs a été effectuée et incubée pour une mesure supplémentaire de l'activité de la luciférase pendant
24 heures.
Pcr en temps réel. Les cellules HT29 ont été ensemencées dans des plaques de culture à 6 puits à des densités de 1,106 par puits 24 h
avant la stimulation et l'ARN total a été extrait à l'aide du minikit RNeasy (Qiagen) selon les recommandations du fabricant avec un
traitement à la Dnase I (R&D). L'ADNc a été synthétisé à partir de 2 µg d'ARN à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité
(Applied Biosystems) et 100 ng ont été utilisés pour effectuer des qPCR sur ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ou StepOnePlus Real
Time PCR System (TermoFischer Scientifc). Les sondes de test d'expression du gène Taqman suivantes ont été utilisées : GAPDH
Hs02758991_g1, GPR43 Hs00271142_s1, GPR41 Hs02519193_g1, GPR109a Hs02341584_s1, SMCT1 Hs00377618_m1 et MCT1
Hs01585687_m1. GAPDH a été utilisé pour la normalisation. Les échantillons ont été testés en doubles expérimentaux et au moins en
triples biologiques.
Analyse du promoteur. Pour rechercher des sites potentiels de liaison des facteurs de transcription sur HT29TGFprom, nous avons utilisé
l'outil logiciel MatInspector (Genomatix, Munich, Allemagne) et la base de données Jaspar.
Rapports Scientifiques | (2018) 8:9742 | DOI :10.1038/s4159801828048y dix
Analyse statistique et graphiques. Les données ont été analysées à l'aide des logiciels R et RStudio. L'analyse PCA a été effectuée
avec le package prcomp et la matrice de corrélation a été réalisée avec le package Hmisc. Les graphiques ont été produits avec le
package ggplot2. Les tests statistiques utilisés étaient le test bilatéral, le test T ou le test du rang de Wilcoxon sur les médianes avec un
niveau de confiance de 95 %. Valeur P : *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, NS : non significatif. Les données proviennent d'au moins 3
expérimentations biologiques indépendantes.
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Remerciements Les
auteurs remercient les Drs Véronique Douard (INRA UMR1319), Marion Espeli (INSERM UMRS996) et Pierre
Larraufe (Université de Cambridge, UK) pour leurs discussions utiles et leurs commentaires critiques sur le manuscrit.
Les auteurs remercient les membres de l'équipe pour leurs discussions utiles. Les auteurs remercient le Dr Cora Weigert (Université
de Tübingen) pour le partage des constructions du promoteur TGF et Agnès David (UMR1280 PHAN) pour l'analyse SCFA. Ce travail
a été soutenu par l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), par des subventions financées par EUFP7 METACARDIS
(HEALTHF42012305312), par l'ANR FunMetagen (ANR 11BSV60013). CMG a été récipiendaire d'une bourse du Ministère de la
Recherche et de l'Education Nationale (Sorbonne Université).
Contributions de l'auteur
Conception et conception des expériences : CMG, NL ; réalisé la plupart des expériences : CMG ; effectué
quelques expériences : FBC, LM, AG, FL, AJ, NL ; analysé les données : CMG, NL ; a rédigé l'article : CMG,
NL ; édité et révisé le manuscrit : HMB
Informations supplémentaires Des
informations supplémentaires accompagnent cet article sur https://doi.org/10.1038/s4159801828048y.
Intérêts concurrents : les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Note de l'éditeur : Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et
les afliations institutionnelles.
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