Université d’ORAN 1

Faculté de Médecine,
Département de Pharmacie laboratoire de chimie Analytique

Année universitaire 2019/2020

 PLAN

I. Détecteurs en CPG

II. Dérivatisation en CPG.

III. Applications de la CPG .

Chromatographie en phase gazeuse. 2

 Détecteurs
Un détecteur est un instrument placé immédiatement à la sortie de la
colonne.

Il a pour but d’analyser en continu la phase mobile( gaz vecteur) sortant de
la colonne pour y déceler la moindre variation de sa composition.
 Détecteurs
Ils sont caractérisés par :

 Leur caractère sélectif ou universel.

 L’importance de leur domaine de linéarité
 Leur sensibilité de réponse
 Leur quantité ou concentration minimale
détectable
Qualités d’un détecteur :

- Bruit de fond : le plus faible possible

- Sensibilité : maximale
- Seuil de détection : faible
- Domaine de linéarité : étendu
- Sélectivité – Spécificité : distinguer dans la PM
uniquement soluté
- Temps de réponse : faible

Chromatographie en phase gazeuse. 4

 Classifications des détecteurs
1
Selon la proportionnalité de la réponse:

Type 1: Réponse proportionnelle à la concentration (masse/volume) de l’analyte dans le gaz

vecteur.

Type 2: Réponse proportionnelle au débit massique(masse/unité de temps) passant dans le

détecteur (Dépend de la masse réelle de l’analyte).
• Le débit du gaz vecteur n’a pas d’influence sur la réponse des détecteurs type 1.
• La réponse des détecteurs type 2 est proportionnelle au débit du GV :
débit massique de l’échantillon dans le GV = débit GV * *échantillon+
réponse
type 2

type 1

débit GV
Fig. 1: influence du débit du gaz vecteur sur la
réponse du détecteur
5
Chromatographie en phase gazeuse.
 Classifications des détecteurs
2
Classification selon la sélectivité:

Universels Sélectifs
•Détecteur Universel:
Détecte un très grand nombre de
substances. Analyse des
Avantages mélanges Grande sensibilité
•Détecteurs sélectifs: inconnus

Réponse vis-à-vis une propriété

physicochimique particulière des
analytes : Sensibilité vis-à-vis les atomes inconvénients Mauvaise Pas d’analyse des
ou de les groupements fonctionnels sensibilité mélanges inconnus
déterminés.

6
 Classifications des détecteurs
3
Classification selon le principe de mesure:

•Détection directe (propriétés particulière de l’ analyte)

Aucun signal en absence de l’analyte.

•Détection différentielle
Basée sur la différence de comportement entre le gaz vecteur et l’analyte.

7
 Classifications des détecteurs
4
Classification selon le pouvoir destructif:

chromatographie préparative :

Le caractère non destructif est indispensable.

Chromatographie analytique:

il n’a que peu d’importance.

8
 Détecteur a conductibilité thermique
Catharométre –TCD-

C’est l’un des premiers détecteurs employés en CPG (1952).

Principe:

L'élution d'un soluté se traduit par une variation

de la conductibilité thermique du gaz vecteur, donc
de sa température et de sa résistance

 2 filaments métalliques tungstene-rhénium

( thermistors), dans un bloc métallique
thermostaté.

 L'un dans le gaz vecteur, de forte conductibilité

thermique (Hélium ou Hydrogène) et l'autre dans le
gaz vecteur en sortie de colonne.

Fig. 2: principe du fonctionnement du catharométre

Chromatographie en phase gazeuse. 9

 Détecteur a conductibilité thermique
Catharométre –TCD-
•non spécifique : universel (espèces organiques et
inorganiques):
-comparaison de la conductibilité thermique
du gaz vecteur pur à celle des mélanges
solutés - gaz vecteur.
- solutés : - déstabilisent l’équilibre thermique.
- modifient la valeur de la R filament.
•Bonne gamme de linéarité sur 105 ordres de
grandeur
• non destructif
• réponse proportionnelle à la concentration
•sensibilité très moyenne: 10-6 _ 10-8 g= emploi
limité

Fig 3:Détecteur a conductibilité thermique

Chromatographie en phase gazeuse. 10
 Les détecteurs à Ionisation de flamme
F.I.D. : Flamme Ionisation Detector (1958)

Principe:
L’ionisation des substances organiques passants
dans la flamme se déroule en deux étapes:
Au centre de la flamme (à l’abris de l’air)
formation des radicaux CH+, CH2+, CH3+ à partir
des composés organiques.
Ionisation chimique avec l’oxygène à
l’interface de la zone centrale et zone externe de
la flamme.
CH+ + O  CHO+ + 1 e-
Les ions formés réagissent avec H2O
atmosphérique:
CHO+ + H2O  H3O+ + CO

Fig. 4 :détecteur par ionisation à flamme

Chromatographie en phase gazeuse. 11
 Les détecteurs à Ionisation de flamme
F.I.D. : Flamme Ionisation Detector (1958)

•le plus utilisé

-gaz ionisé dans une flamme à 2100°C
- ions recueillis par une électrode Électrode
collectrice
- signal amplifié et transmis à (cathode)
l'enregistreur Extrémité du
• non spécifique: quasi universel brûleur/Électrode
d’ionisation
- tous les composé organiques:
Dispositif
hydrocarbures, halogénés, aminés, d’allumage
hydrogénés, carbonylés…
Isolation en verre
• sensibilité: 10-9 _ 10-10 g Diffuseur d’air
• linéarité sur 107 ordres de grandeur
Air
•réponse proportionnelle au débit massique.
•destructif Sortie
de la
Hydrogène colonne
Chromatographie en phase gazeuse. 12
Fig5:Les détecteurs à Ionisation de flamme
 Les détecteurs à Capture d'électrons
ECD: Electron Capture Detector(1960)

-composés à atomes électronégatifs:

halogénés, nitrés, cyanés...
Principe:
- gaz vecteur bombardé émet des électrons
N2 N2+ + e-
-les électrons se fixent sur les molécules et les
transforment en radicaux libres chargés
négativement, qui se combinent avec les ions
positifs du gaz.
M + e-  M-
M- + N2+  M + N2
-courant reçu par l'électrode est diminué.
Fig.6 : détecteur capture d’électrons
13
 Les détecteurs à Capture d'électrons
ECD: Electron Capture Detector(1960)

Fig7 Principe du fonctionnement ECD

•Spécifique.
•sensibilité: 10-13 g
• linéarité sur 104 ordres de grandeur. e-

e- N2+
• réponse proportionnelle à la
concentration N2+
e- N2+
e-
e-
•destructif Gaz d’appoint N2+

ou make-up N2
N2+
N2
N2
N2

Sortie de la colonne

Chromatographie en phase gazeuse. 14

 Détecteur thermoionique
T.S.D. : Thermoionic Specific Detector ou N.P.D. : Nitrogen-
Phosphorus Detector

Fig. 8: principe du fonctionnement du

-Principe: détecteur thermoionique

-Une flamme d’H2 (N2 si colonne capillaire)

très froide maintenue par chauffage
électrique d’une pastille de sel alcalin
(bromure de rubidium ou de césium, chlorure
de sodium selon la détection souhaitée).

-La pastille libère des électrons qui

interagissent avec N ou P (pas de combustion).

-Ions formés génèrent un courant.

Chromatographie en phase gazeuse. 15

 Détecteur thermoionique
T.S.D. : Thermoionic Specific Detector ou N.P.D. : Nitrogen-
Phosphorus Detector

•Sélectivité: pour les composés

phosphorés (organophosphorés) et les
composés azotés.
• Sélectivité: 104 à 105
•Sensibilité élevée 10-13 g pour l’azote et
10-14 g pour le phosphore.
•Domaine de linéarité 104 (P), 105(N).

Fig.9 : détecteur thermoionique

Chromatographie en phase gazeuse. 16
 Les détecteurs à Photomètre de flamme
F.P.D. : Flame Photometry Detector (1966)

Principe:
•spécifique: dérivés soufrés et phosphorés
• Les solutés issus de la colonne sont brûlés
dans une flamme suffisamment chaude
très riche en H2
•l’excitation des éléments, traduite sous
forme d’une émission lumineuse.
•détectée par un photomultiplicateur.

Fig 10:Les détecteurs à Photomètre de flamme

Chromatographie en phase gazeuse. 17

 Les détecteurs à Photomètre de flamme
F.P.D. : Flame Photometry Detector (1966)

Composé
Performances Composé soufré
phosphaté
Sensibilité 10-12 g/s 10-10 g/s

Linéarité 105 103

•réponse proportionnelle au débit massique.

Applications:

-Composés Phosphatés et Soufrés.

fig11 -polluants dans air et eau.
- Pesticides.

Chromatographie en phase gazeuse. 18

 Détecteur à photo ionisation
P.I.D. : Photo-Ionisation Detector

 Ce type de détecteur est capable

d’opérer à des températures pouvant
atteindre 400°C.

 Cette caractéristique unique élargit

considérablement le champ d’application de ce
détecteur à la C.P.G. haute température.

 La source énergétique d’ionisation est une lampe

ultra violette.

Application:
Ce détecteur est recommandé pour l’analyse des
composés aromatiques, des phénols, fig12
des hydrocarbures insaturés et des gaz
soufrés.
Chromatographie en phase gazeuse. 19
 Les types de détections précédentes ne donnent pas d’informations sur la nature des
composés élués.

 L’identification des composés exige donc de faire un étalonnage préalable des temps
de rétention.

 Lorsque le chromatogramme devient complexe, des confusions de pics peuvent se

produire.

Pour y remédier, il existe des détecteurs permettant d’avoir des informations soit de
nature spectroscopique soit sur la composition élémentaire des produits élués.

 Il est alors possible de disposer à la fois du temps de rétention et de caractéristiques

propres à chaque composé.

 Ces détecteurs sont à eux seuls des techniques indépendantes d’analyse, dont les
résultats sont d’autant plus fiables que les composés ont bien été séparés par la colonne.

 Les détecteurs conduisant à des données structurales abordent le domaine des

méthodes couplées, largement utilisées pour doser les traces.
Chromatographie en phase gazeuse. 20
 Spectrométrie de masse (MS)

•Les produits à analyser sont ionisés soit par impact

électronique (bombardement électronique de
faible énergie), soit par traitement chimique
(gaz réactant : méthane, ammoniac, isobutane).

•Formation d’ion moléculaire et de fragments

caractérisé par le rapport masse / charge (m/z)

•Les fragment sont collectés

•On trace le spectre : nombre de fragment en

fonction du rapport m/z, c’est une caractéristique de la
molécule.

•Le système informatique compare le spectre de

l’analyse effectuée avec ceux d’une bibliothèque de données.
Chromatographie en phase gazeuse. 21
 Détecteur à infra-rouge :

A l’intérieur des molécules, les atomes peuvent vibrer avec des fréquences
caractéristiques des liaisons de cette molécule.

Quand un échantillon est placé dans un faisceau de radiations IR, il absorbe

les longueurs d’onde correspondant à l’énergie nécessaire de ces vibrations.

Le spectre IR résultant (l’absorption du

faisceau en fonction de la longueur d’onde
de ce faisceau) est caractéristique de la
molécule.

Chromatographie en phase gazeuse. 22

Chromatographie en phase gazeuse. 23
 Classifications des détecteurs

Détecteurs conduisant à
Détecteurs classiques
des données structurales.
Détecteurs universels
- Détecteur à conductibilité
thermique. - Détecteur de masse.
- Détecteur à ionisation de - Détecteur infrarouge.
flamme.
Détecteurs spécifiques
- Détecteurs thermo-ioniques.
- Détecteur à capture d’électron.
Type 1
- Détecteur à photométrie de
Type 2
flamme.
fig13: classification des détecteurs en types 1et2
Chromatographie en phase gazeuse. 24
 PLAN

I. Détecteurs en CPG

II. Dérivatisation en CPG.

III. Applications de la CPG .

Chromatographie en phase gazeuse. 25

 DÉRIVATISATION EN CPG

• La chromatographie en phase gazeuse permet la séparation de composés gazeux

ou susceptible d’être vaporisés par chauffage sans décomposition.

• Dans certains cas l’injection directe des composés dans le chromatographe ne

permet pas une séparation influençant l’optimisation de la séparation.

• Devant de telles situation on procède à une transformation préalable des

composés avant leur injection dans le chromatographe.

Chromatographie en phase gazeuse. 26

 DÉRIVATISATION EN CPG

Ce procédé est utilisé dans plusieurs cas :

•Lorsque le point d’ébullition des substances est trop élevé:
La formation d’esters ou d’amides facilite ainsi la chromatographie de dérivés
carboxyliques peu volatils tels les acides aminés.

•Pour modifier la polarité des composés trop polaires qui trainent sur les colonnes (
dérivés hydroxylés, sucres..)

•Pour augmenter la stabilité de composés fragiles aux températures nécessaires à leurs

séparation: hormones Stéroïdiennes .

•Pour faciliter la détection (spécificité et sensibilité) en formant un dérivé halogéné .

•Lorsque les composés ont des masses moléculaires trop faible.

Chromatographie en phase gazeuse. 27

 DÉRIVATISATION EN CPG

Les méthodes de dérivatisation sont de 3 types :

La silylation (triméthyl silylation)

L’alcoylation
L’acylation

Chromatographie en phase gazeuse. 28

 LA SILYLATION : C’est une substitution d’un hydrogène mobile par un
groupement triméthyl silyle –Si(CH3)3 .

RO-H + Cl-Si-(CH3)3 → RO-Si-(CH3)3 + HCl

Réactifs Structure chimique

TMCS: triméthyl chloro silane (CH3)3 Si Cl
HMDS: héxaméthyl di-silazane (CH3)3 Si -NH -Si (CH3)3
Dérivé silylaminé (CH3)3 Si -N R1
R2
BSA: N-O bis triméthyl silylacétamide O-Si (CH3)3
CH3C = N –Si (CH3)3

BSTFA: bis(triméthyl silyl) O-Si (CH3)3

trifluoroacétamide. CF3C = N –Si (CH3)3

TSIM: triméthyl silylimidazole

(CH3)3 Si –N N

BMDS: Bromométhyl dichloro silane CH2Br- Si -Cl2

CH3
Chromatographie en phase gazeuse. 29
•(CH3)3 Si-R + R’ – H  R’–Si (CH3)3 + R-

•(CH3)3 Si-NH -Si(CH3)3 + 2 R’ – H  2 R’-Si (CH3)3 + NH3

Conditions Opératoires:
Pour que la transformation soit quantitative il est nécessaire que cette réaction
soit totale:
Le milieu réactionnel doit être strictement anhydre:
les réactifs silylants sont très fragiles et se décomposent rapidement en
présence de traces d’humidité

(CH3)3 Si-NH -Si(CH3)3 + H2O  (CH3)3 Si-O -Si(CH3)3 + NH3

méthylsiloxane inactif

Cette réaction s’effectue en présence de la pyridine ou DMF qui sont

basiques donc permettent de neutraliser
Chromatographie enLes acides
phase gazeuse. formés 30
 Employer des solvants aprotiques et polaire : DMSO et THF

Le temps de la réaction doit être suffisant (qq min à qq heures)

La présence de catalyseurs si nécessaire.

Quantité de réactifs en excés (× 10- 50 à quantité réellement utile)

Chromatographie en phase gazeuse. 31

 L’ALCOYLATION : C’est un remplacement d’un hydrogène mobile par un radical
alcoyle pour donner un éther à la place d’un alcool et un ester à la place d’un acide.
R-OH  R-O-R’
R-COOH  R-COO-R’
 C’est une réaction lente: utilisation catalyseur (barbotage HCl(g) anhydre ou
addition de tri fluorure de bore).
La méthylation est cas particulier de l’alcoylation:

Réactifs de méthylation Structure chimique

Sulfate de méthyle (CH3)2SO4

Iodure de méthyle CH3 I

Diazométhane CH2 N2

Hydroxyde de triméthyl anilinium C6H5N+(CH3)3, OH-

Chromatographie en phase gazeuse. 32

 L’ACYLATION: C’est un remplacement d’un hydrogène mobile par un cation
acylium (R-C+=O) pour donner un ester à la place d’un alcool et un amide à la place
d’une amine.
RO-H + Cl-CO-R’ → RO-CO-R’+ HCl
R’-NH2 + Cl-CO-R → R-CO-NH2-R’+ HCl

C’est une réaction qui s’effectue en milieu pyridiné, avec utilisation de

catalyseur (acide perchlorique ou para toluène), T°>100°C (bain de sable ) ,à l’abris
de l’air(tubes scellés) et en milieu anhydre.
Les solvants doivent être inertes (acétone, acétonitrile, acétate d’éthyle)

Chromatographie en phase gazeuse. 33

Principaux réactifs Structure chimique
Chlorures Chlorure d’acétyle
d’acides CH3- CO -Cl
monochloracétyle
Cl –CH2- CO -Cl
anhydride Anhydride acétique (CH3-CO)2
d’acides Anhydride (CF3-CO)2
trifluoroacétique
Anhydride propionique (C2H5-CO)2

R’-OH + R-C-Cl R-C-O-R’ + HCl

R’-NH2 + R-C-Cl R-C-O-NH-R’ + HCl

2 R’-OH + (CF3-CO)2 R-O-C-CF3 + H2O

Chromatographie en phase gazeuse. 34
 PLAN

I. Détecteurs en CPG

II. Dérivatisation en CPG.

III. Applications de la CPG .

Chromatographie en phase gazeuse. 35

 Analyse qualitative

 Pureté et identification d’une substance:

 On peut s’assurer de la pureté d’une substance en la chromatographiant

plusieurs fois dans des conditions différentes (nature des phases ou
conditions opératoires).

Lorsque cette substance est pure et non dégradée thermiquement au

contact des phases, elle ne doit donner qu’un seul pic sur les tracés
chromatographiques.

L’examen de ces tracés permet en outre de comparer l’élution d’une substance

inconnue à celle de substances de référence et , lorsque les grandeurs de
rétention sont identiques ,de présumer de similitude ou d’affirmer leur
différence de nature, en cas contraire.
Chromatographie en phase gazeuse. 36
 Indices de rétention de kovats:

• L’identification d’une substance peut être facilitée par la connaissance de

cet indice.
• une série homologue de alcanes sont injectés sur la colonne en régime
isotherme.

• les logarithmes des temps de rétention réduits croissent linéairement avec

le nombre n d’atomes de carbone des n-alcanes correspondants

Chromatographie en phase gazeuse. 37

Figure 14 : Chromatogramme d’une série de n-alcanes et
Droite de Kovats correspondant.
38
 Sans changer les réglages de l’appareil qui ont servi à déterminer la droite de Kovats, un
composé x est injecté.

Signal Pic i
n
n+1

6 12 18 24 30 tR

Chromatographie en phase gazeuse. 39

 Analyse quantitative

Domaine pharmaceutique
 Contrôle des matières premières : recherche des impuretés en particulier les
solvants résiduels.

 Contrôle des préparations pharmaceutiques : identification et dosage des

principes actifs (Eucalyptol, Barbituriques, Huiles essentielles….)

 Contrôle des gaz médicaux.

 Recherche d’oxyde d’éthylène résiduel (sondes stérilisés par l’oxyde d’éthylène).

 Etudes pharmacocinétiques (études de biodisponibilité).

40
 Analyse quantitative

Recherche des impuretés : Solvants résiduels.

41
 Analyse quantitative
Toxicologie ;Recherche des molécules impliquées dans les diverses intoxications
(méthanol, carbamate…)

Figure 15 : Dosage de l’éthanol dans le sang. 42

 Analyse quantitative

Suivi thérapeutique des médicaments:

Figure 16 : Chromatogramme d’une mixture diazépam 5mg/ml et d’amitriptyline

5mg/ml dans le méthanol par CPG/SM
43
 Analyse quantitative

Agroalimentaire et environnement

Recherche des pesticides dans les eaux, dans les produits agricoles d’origines animales ou
végétales.

44

Figure 17 : Dosage de résidus de pesticides dans les pommes.

 Analyse quantitative

 Biochimie

• Hormonologie (dosage des œstrogènes).

• Analyse des acides aminés dans les liquides biologiques.

Figure 18 : Dosage de AA par CPG-FID. 45

Analyse quantitative

Chromatographie en phase gazeuse. 46