Ministère de l’enseignement supérieur

Et de la recherche scientifique
Université de Monastir
Faculté de Pharmacie de Monastir

Rapport de stage d'internat en

Biologie
6 ème année pharmacie
CHU Hédi Chaker
Laboratoire régional d'hygiène
Sfax

Nom et prénom: Megdiche Ali

Responsable du stage: Pr Férièle Messadi Akrout

Période de stage: 01/03/2018  31/05/2018

Année universitaire 2017-2018

 Remerciements
J’adresse mes remerciements les plus vifs à mes responsables de
stage, et à toute personne ayant rendu cette expérience si
intéressante et si formatrice. Aux biologistes qui nous avaient
accueillis comme des confrères et non comme des stagiaires.

Je tiens à remercier toute l’équipe et personnels du laboratoire,

pour l’accueil qu’ils nous avaient réservé, pour la générosité qu’ils ont
manifesté et pour leur disponibilité et serviabilité.

Je souhaite faire part de ma reconnaissance au Professeur Férièle

Messadi Akrout Chef de Service du Laboratoire du centre d'hygiène
de Sfax, pour m’avoir accueilli et veillé au bon déroulement de mon
stage.

J'adresse mes remerciements à Mme Smaoui Salma, Mme kammoun

Sana, Mme Marouane Chema ; Mme Ghorbel Asma, Mlle hachicha
salma qui m'ont aidé par leurs disponibilités et leurs conseils et qui
ont contribué au succès de ce stage.
 Sommaire

I. Organisation générale du laboratoire: ......................................................... 1

1. Processus de la gestion des locaux: ......................................................... 1
2. Processus d'hygiène et de sécurité: ......................................................... 2
2-1-Les mesures préventives des principaux risques :................................. 3
2-1-2- Conduite à tenir devant un accident contaminant ou toxique:....... 4
2-1-3-La prévention des risques chimiques: ............................................ 5
2-2- La gestion des déchets: ....................................................................... 6
3. Processus de la gestion des personnels: .................................................. 7
3-1- Organigramme du laboratoire: ............................................................ 7
3-2- La formation continue: ........................................................................ 7
3-3- Répartition des taches: ........................................................................ 8
4. Gestion de la documentation:.................................................................. 9
4-1-Les documents qualité :........................................................................ 9
4-2-La transmission des résultats : .............................................................. 9
4-3-Archive : ............................................................................................ 10
5. Processus de la gestion des consommables: .......................................... 10
5-1-L’approvisionnement ......................................................................... 10
5-2-La réception des commandes ............................................................. 10
5-3-Le stockage : ...................................................................................... 11
5-4-Gestion du stock : .............................................................................. 11
6. Processus de la gestion des équipements: ............................................. 11
II. Processus analytique :............................................................................... 13
1. Phase pré-analytique : ........................................................................... 13
 La demande d'analyse ........................................................................... 13
2. La phase analytique : ............................................................................ 19
3. La phase post-analytique ...................................................................... 19
3.1 La validation technique ................................................................. 19
 3.2 La validation biologique. .............................................................. 19
3.3 Expression des résultats et comptes rendu d'analyses .................... 19
3.4 Transmission des résultats ............................................................ 20
III. Gestion du contrôle de qualité : ............................................................ 20
1. Contrôle de qualité interne :.................................................................. 20
2. Contrôle de qualité externe : ................................................................. 20
IV. Réactifs et dispositifs d’analyse : .......................................................... 20
1. Réactifs pour identification : .................................................................... 20
2. Milieux de culture : .............................................................................. 21
V. Principales analyses effectuées et équipements utilisés : .......................... 26
1. Au niveau de la salle de bactériologie ................................................... 26
1-1-Prélèvement vaginal (PV) : ................................................................ 26
1-2-Examen cytobactériologique des urines : ........................................... 29
1-3-Coproculture : .................................................................................... 32
1-4-Recherche de mycobactéries : ............................................................ 34
2. Au niveau de la salle de sérologie : ....................................................... 42
2-1-La sérologie : ..................................................................................... 42
2-2-Groupage sanguin .............................................................................. 42
3. Au niveau de la salle de parasitologie –mycologie : ............................. 45
A. Parasitologie : ............................................................................... 45
a. Examen parasitologiques des selles (EPS) ................................ 45
b. Scotch test anal ......................................................................... 47
c. Examen parasitologiques des urines .......................................... 48
d. Les parasites du sang et du système réticulo-histiocytaire : ....... 49
B. Mycologies : ................................................................................. 53
a. Prélèvement .............................................................................. 53
b. Examen direct ........................................................................... 54
c. La mise en culture ..................................................................... 55
d. Identification :........................................................................... 55
Les cas cliniques ........................................................................ 59
 Cas clinique n°1 : ........................................................................................ 60
Analyse toxicologique post-mortem ............................................................. 60
I. Présentation du cas ................................................................................... 60
II. Matériel et méthode d'analyse .................................................................. 60
1. Détermination de l'alcoolémie par la méthode de Cordebard ................ 60
2. Recherche générale de toxiques ............................................................ 63
2.1. Recherche des toxiques acides ...................................................... 63
2.2. Recherche des toxiques basiques .................................................. 64
3. Recherche de benzodiazépines: ............................................................ 65
III. Conclusion:....................................................................................... 66
Cas clinique n°2 : ........................................................................................ 67
Infection vaginale(Vaginite à SGB) ............................................................ 67
I. Présentation du cas ................................................................................... 67
II. Prélèvement .............................................................................................. 67
III. Diagnostic biologique ........................................................................... 68
Cas clinique n°3 : ........................................................................................ 76
Examen cytobactériologique des urines ...................................................... 76
I. Présentation du cas : ................................................................................. 76
II. Prélèvement :............................................................................................ 76
Cas clinique n°4 : ........................................................................................ 82
Tuberculose pulmonaire ............................................................................ 82
I. Présentation du malade : ........................................................................... 82
II. Manipulation et interprétation : ................................................................ 82
1) Prélèvement .......................................................................................... 82
III. Traitement : .......................................................................................... 87
IV. Conclusion: .......................................................................................... 87
Cas clinique n°5 : ........................................................................................ 87
Examen mycologique des ongles du pied: Onychomycose ....................... 87
I. Présentation du cas: .................................................................................. 88
II. Examen macroscopique ............................................................................ 88
1) Prélèvement .......................................................................................... 88
2) Examen direct ....................................................................................... 89
3) La mise en culture ................................................................................ 89
4) Interprétation des résultats .................................................................... 90
III. Conclusion ........................................................................................... 91
 I. Organisation générale du laboratoire:
1. Processus de la gestion des locaux:
Le laboratoire d'analyse médical (LAM) où j'ai effectué notre stage est situé au
2éme étage de l'établissement public.
C'est un centre polyvalent où les locaux sont attribués aux diverses unités pour
leurs fins propres d'assumer la charge du travail tout en procurant la qualité des
analyses et la sécurité des personnels.
Le laboratoire d'hygiène est organisé en un hall, un couloir et des salles réparties
des deux cotés, divisé comme ce suit:

 Des locaux administratifs:

 Le bureau du chef service: il est mené d'un espace pour les
réunions.
 Les bureaux des assistantes: le laboratoire comporte 3 bureaux des
assistantes Hospitalo-universitaires.
 Le bureau de la surveillante.
 Le secrétariat: un bureau pour la secrétaire

 Des locaux destinés à la réalisation des analyses biologiques:

 Une salle pour les analyses bactériologiques: pour les examens
cytobactériologiques des urines (ECBU), les prélèvements vaginales
(PV), examen bactériologique des selles ( la coproculture)
 Un compartiment spécialisé pour la recherche de Bacille de Koch (BK):
composé de 3 salles: une salle pour l'examen direct, une salle pour les
prélèvements pulmonaire (crachats) et une autre salle pour les
prélèvements extra-pulmonaires ( LCR, liquide pleural...)
 Une salle de parasitologie-mycologie:
- C'est salle où sont effectués les examens parasitologiques des
selles (EPS), les examens mycologiques, la recherche de
corps de leishmanies.
 Une salle de sérologie :
- Une salle consacrée pour le diagnostic de toxoplasme et de la
rubéole.
 Deux salles de toxicologie.
 Une unité pour la préparation des milieux.
 Un compartiment destiné à l'analyse des eaux et des aliments.

 Des locaux non destinés à l'exécution des analyses:

1
  Les espaces d'attente: auprès de la salle des prélèvements mycologiques,
auprès du bureau de réception
 Un bureau de réception des prélèvements : urines, selles.
 Des vestiaires: réservées aux personnels de laboratoire.
 Des toilettes: il existe une toilette réservée aux personnels et une autre
consacrée pour les patients.
 La laverie: consiste à décontaminer le matériel utilisé et le stériliser à
l'autoclave.
 Des locaux d'archivage et de stockage:
II est nécessaire de créer des zones de stockage à différentes températures tout
dépend aux critères de conservation de chaque produit:
 Une chambre froide (à +4°C) contenant les réactifs et les milieux de
culture déjà préparés.
 Un local pour le stockage des produits chimiques et les matières
premières et une armoire fermée à clé contenant les produits toxiques.Ces
produits sont rangés par ordre alphabétique
 Une salle séparée conçue pour le stockage des produits d'usage courants:
papiers, stylos, tubes, bouchon...

2. Processus d'hygiène et de sécurité:

La mise en place d'un processus d'hygiène et de sécurité est obligatoire et doit
être rigoureusement respecté par tous les personnels.
Plusieurs stratégies de prévention dont on peut citer:
 Le respect des règles de bonnes pratiques et d'hygiène générale.
 La maitrise des risques en portant une blouse blanche, des gants ...
 La disponibilité d'un spray antiseptique à chaque paillasse des différents
locaux pour le lavage hygiénique des mains après chaque manipulation.
 La décontamination et le bon nettoyage des locaux, des matériels et des
paillasses.
 La gestion du stock et l'élimination des produits à risque.
 La formation et l'information des personnels des dangers à confronter et
des mesures préventives nécessaires.

Au sein de notre service, les postes de travail sont nettoyés

quotidiennement à la fin des manipulations et les postes contaminés sont
désinfectés avec de l’eau de javel.
Les déchets à risques pour l'homme ou l'environnement (les prélèvements
biologiques, les produits sanguins, les gants souillés et le matériel piquant ou
coupant) sont évacués de manière à ne pas compromettre la santé du personnel
du laboratoire et du personnel chargé de collecter ces déchets et à ne pas polluer
l’environnement.

2
2-1-Les mesures préventives des principaux risques :
2-1-1- La prévention des risques biologiques:

Ces risques se présentent en :

 Milieux de cultures : cultures des bactéries pathogènes, culture des
dermatophytes, culture des levures...
 Prélèvements: sang, urines, crachats, cheveux, ongles...
 Matériaux utilisés: anses, lames, micropipettes..
 Appareils ou automates: microscopes...
 Déchets.

Différentes voies de contamination :

 Voie aérienne : production d’aérosols

 Voie orale : pipetage à la bouche
 Voie conjonctivale : projection de liquide contaminé
 Voie cutanéo-muqueuse : contact muqueux ou avec la peau lésée

Les mesures préventives:

 Porter une blouse fermée à manches longues.
 Porter des gants pour éliminer tout risque de contact avec le liquide
biologique et les changer fréquemment.
 Attacher les cheveux longs pour éviter une contamination ou une
brûlure.
 Appliquer les règles universelles de sécurité à tous les stades de
cheminement des échantillons biologiques (recueil, transport, analyse,
élimination)
 Préparer tout le matériel nécessaire à la manipulation avant de
commencer pour limiter le déplacement dans la salle.
 Privilégier le matériel à usage unique ( anses calibrées,
micropipettes...)
 Travailler en position stable assise auprès de la flemme du bec bunsen
ou sous une hotte ( zone stérile)
 Prévenir une contamination aérienne par l'utilisation des hottes de
sécurité.
 Protéger toute plaie par un pansement afin de bloquer toute porte
d'entrée possible.
 Se laver les mains fréquemment après toute manipulation
 Décontaminer le matériel utilisé et les surfaces souillées par l'eau de
javel.
 Ne pas manger ni boire dans le local du travail.
 Vaccination obligatoire (Hépatite B, VAT)

3
  Les Postes de Sécurité Microbiologique (PSM) : ils permettent une
protection de l’opérateur contre la contamination aéroportée ainsi que,
selon la catégorie du PSM, un confinement dynamique des produits
manipulés.
 Le dispositif PSM assure d’une part la protection de l’opérateur en
établissant une aspiration d’air vers l’extérieur (dépression) et d’autre part la
protection de l’environnement en utilisant des filtres HEPA (High Efficiency
Particulate Air Filter). Au niveau du laboratoire d'hygiène, un PSM de type I
est disponible dans la salle de BK ( la salle spécialisée pour la recherche de
bacille de Koch) et un autre dans la salle de denrée alimentaire de type II
2-1-2- Conduite à tenir devant un accident contaminant ou toxique:
 En cas de plaie :
 Nettoyer immédiatement avec de l'eau et du savon puis désinfecter avec
un dérivé chloré (dakin ou eau de javel) en laissant un contact d'au moins
5 minutes.

 En cas de projection sur les muqueuses :

 Dans le cas d'une projection oculaire, rincer immédiatement au sérum
physiologique ou à l'eau pendant au moins 10 minutes. Après le rinçage,
une instillation d'un collyre antiseptique sera préférable.

 En cas d'accident exposant du sang(AES):

 S'informer sur les statut sérologique du patient source
 En fonction du risque, une décision de mettre en route d'un traitement
antirétroviral post exposition prophylactique est faite en urgence dans les
4 heures suivant l'AES ( pour le cas du VIH)
 Au delà de 48 heures la mise en route d'un traitement n'a plus d'intérêt
 On peut injecter des immunoglobulines anti-hépatite B comme traitement
prophylactique dans les 72 heures suivant l'exposition

Informer le médecin du travail et

déclarer l'accident dans les 48 h suivant
l'exposition

4
 2-1-3-La prévention des risques chimiques:
Le risque chimique est lié aux:
 Incompatibilités chimiques au stockage
 Séparer les acides des bases concentrées
 Ne pas stocker les produits toxiques avec les produits inflammables
 Les produits chimiques doivent être facilement identifiables pour éviter
tout manque d'informations ( conditions de stockage et de transport,
prévention, gestion des déchets...)

 Risque d'incendie : le « triangle du feu »

Figure N° 1 : Le triangle du feu

Les causes d’incendie les plus fréquentes sont :

 Les problèmes électriques (court-circuit)
 Les installations défectueuses ou bien atmosphère impropre
 Le mauvais stockage des produits inflammables (solvants, gaz, …)
 Existence de points chauds (flammes, étuves)
 Le mauvais état de conduites des gaz combustibles (tuyaux et
branchements)

La prévention du risque d’incendie repose sur :

 La mise en place du matériel de sécurité (extincteurs, douches de
sécurité, couvertures ignifuges)

5
  La conformité des installations électriques
 le stockage des produits inflammables dans un local isolé et aéré
 la vérification de la date de péremption des tuyaux de gaz
 ne pas verser de solvant dans l’évier sans faire couler de l’eau
La conduite à tenir en cas d’incendie :
 téléphoner au 198
 fermer les vannes de gaz
 couper l’électricité générale
 utiliser les extincteurs

Le stockage des produits chimiques

 Vérifier l’étiquetage de chaque flacon.
 Tenir compte des incompatibilités lors du stockage : combustibles et
comburants, acides forts et bases fortes, oxydants et réducteurs.
 Respecter les conditions de stockage de chaque produit.
 Faire l’inventaire des produits et procéder à l’élimination des périmés.

La manipulation des produits chimiques

Il faut sensibiliser le personnel aux précautions d’emploi de ces produits en se
référant aux fiches de données de sécurité:
 Connaître les propriétés de chaque produit (toxique, très toxique, cancérigène,
mutagène, irritant, nocif, corrosif, sensibilisant)
 Maitriser les mesures de sécurité lors de la manipulation (éviter
l’encombrement des Sorbonne par les produits en cours d’utilisation, fermer
systématiquement tous les flacons après usage…)
2-2- La gestion des déchets:
Au niveau de notre laboratoire, on distingue:
 les déchets biologiques: DASRI ( les déchets d'activités de soins à
risques infectieux)
Sont éliminés dans:
 Des récipients cylindriques jaunes à couvercle rouge destinés à recevoir les
lames et lamelles utilisées...
 Des poubelles munies d'un sac plastique rouge destinées à recevoir les
prélèvements déjà analysés ou cultivés (flacons contenant des selles, des
urines, les écouvillons) , les milieux de culture utilisés, les antibiogrammes
déjà interprété, les galeries d’identification…
Ces produits passeront par un cycle de décontamination réalisé par une
société de sous-traitance conventionnée avec l’hôpital.
 Un chariot pour l’élimination du matériel réutilisable à stériliser (tubes et
les flacons en verre…)

6
  Les déchets non biologiques
 Une poubelle avec des sachets noirs pour l’élimination des papiers et des
déchets ordinaires…

3. Processus de la gestion des personnels:

3-1- Organigramme du laboratoire:
L'organigramme comporte:
 Le chef de service : Professeur en pharmacie
 Trois assistantes hospitalo-universitaires en bactériologie.
 Une professeure agrégée en bactériologie
 Une professeure agrégée en toxicologie
 Un résident (en bactériologie)
 Trois internes
 Une surveillante.
 Une secrétaire
 Des techniciens majeurs.
 Des techniciens principaux.
 Des techniciens supérieurs.
 Des infirmiers.
 Des ouvriers.

3-2- La formation continue:

Une formation continue est assurée à tout le personnel du laboratoire pour
suivre les nouvelles techniques de biologie.
 Les objectifs :
 C’est un moyen pour actualiser leurs connaissances et améliorer leurs
compétences.
 S’informer des nouveautés scientifiques et technologiques.
 Favoriser l'insertion ou la réinsertion professionnelle

 Les procédés :
Cette formation est assurée par la discussion des cas cliniques et la
participation à des congrès, des séminaires (nationaux et internationaux), des
stages, des réunions, des exposés…
La formation continue est déterminée selon le besoin du laboratoire et ceci à
l'initiative du chef de service ou émanant de la demande du personnel.

7
3-3- Répartition des taches:
Afin d’assurer la qualité au sein du laboratoire, il est indispensable de définir les
tâches de chaque personnel.
Les principales tâches des différents membres du laboratoire sont présentées
dans le tableau ci-dessous.
Tableau 1 : Principales tâches des membres du laboratoire

Fonction Attributions
Chef de service Elle gère la direction du laboratoire et supervise le bon
déroulement du travail tout en assurant :
 L’encadrement
 La gestion des ressources humaines
 La participation à la recherche scientifique
 Les appels d’offre auprès des fournisseurs
 La validation biologique des résultats d’analyse.
Les assistantes  Encadrement des résidents et des internes
hospitalo-  Mise au point et validation des techniques
universitaires  Avis scientifique et biologique
en biologie  Réalisation des travaux de recherche
 Validation biologique des résultats d’analyse.
Le résident  Il effectue les actes de biologie médicale ( résident en
bactériologie) et valide les résultats des analyses biologiques
sous le contrôle du responsable
 Il participe à la formation de l'interne
Les internes  Initiation à l’exercice de la profession de biologiste
 Formation théorique et pratique sous le contrôle des
biologistes.
La surveillante  Gestion des ressources humaines : congés…
 Gestion du stock : réactifs, consommables, …
 Réaliser l’inventaire de tous les produits
 Approvisionnement régulier des différentes salles du
laboratoire en consommables et en réactifs.
La secrétaire  Mise en forme des documents utilisés et établis par le
laboratoire
Les techniciens  Réception des prélèvements et enregistrement
 Manipulation des différents types d’analyse biologique
 Validation technique.
Les ouvriers  Transport des consommables et du courrier
 Nettoyage et désinfection des locaux afin d’assurer l’hygiène
et l’entretien.
8
 4. Gestion de la documentation:
4-1-Les documents qualité :
 Guide des bonnes pratiques de laboratoire :
Pour garantir la fiabilité et la rentabilité des résultats des analyses tout en
assurant la sécurité du personnel et la protection de l'environnement, il faut se
référer au guide des bonnes pratiques de laboratoire. Ce guide énonce les règles
auxquelles doivent se conformer les laboratoires d'analyses médicales
 Les documents opérationnels :
Ce sont des classeurs que dispose chaque salle de notre laboratoire comportant
les instructions et les modes opératoires des différentes manipulations et
techniques exécutées. Ces fiches de paillasse sont élaborées par les responsables
du laboratoire et révisées périodiquement

 Les documents d’enregistrement :

C’est l’ensemble de documents qui apportent la preuve de la réalisation de
toute activité au sein du laboratoire comme les feuilles de paillasse, les registres
des résultats des différentes analyses ( PV, ECBU, BK...). Ces documents
permettent aussi la gérance du personnel (registre des fiches du personnel,
registre des congés…), la gestion du stock des consommables (bons de livraison,
bons de commandes, registres…) et la gestion des équipements (fiche de suivi
des contrôles de température des réfrigérateurs ou des étuves, fiche de
nettoyage…)

4-2-La transmission des résultats :

La transmission des résultats validés doit se faire sur papier à en-tête du
laboratoire. Le compte rendu peut être envoyé selon divers processus :
 Pour les centres de santé de bases, les résultats sont envoyés par des
chauffeurs au bout de 10 jours.
 Pour les services cliniques, les ouvriers viennent rechercher les résultats ou
on les adresse directement au service.
 Pour les patients apportant auparavant leurs prélèvements: Ils peuvent eux
même revenir au laboratoire pour recevoir leurs résultats.

 Cependant si le résultat met en jeu le pronostic vital, le biologiste doit tout

mettre en œuvre pour joindre et avertir le médecin traitant ou l’équipe
médicale dans le plus bref délai.

9
4-3-Archive :
Depuis l'ouverture du laboratoire d'hygiène, toute documentation est conservée
au secrétariat ou au bureau de la surveillante sauf pour les cahiers des résultats
qui sont archivés au niveau des unités techniques.
La durée de l’archivage varie selon le type du document. En effet les registres
administratifs seront gardés pendant au moins dix ans et les documents relatifs
au système qualité, on les conserve pendant au moins cinq ans.

5. Processus de la gestion des consommables:

Les consommables sont tous les produits, y compris les réactifs, nécessaires à la
réalisation des analyses autres que les appareils (automates et équipements).
Exemples de consommables : réactifs, embouts, tubes, boîtes de pétri…)
La gestion des consommables se fait par des fiches produits portant le nom du
produit, le nom des fournisseurs et indiquent la quantité présentes dans les stock
ainsi que les mouvements d'entrée et de sortie de chaque produit.
5-1-L’approvisionnement
 Chaque fin d’année, le chef de service et la surveillante déterminent les
prévisions des besoins et le service d’approvisionnement du CHU lance alors
des appels d’offre auprès de différents fournisseurs.
 L’approvisionnement est trimestriel et se fait par un bon de commande
précisant le nom du fournisseur, la nature du produit et la quantité désirée.
Ces bons sont par la suite adressés au service qui se charge du remplissage
des bons de commande et de leur envoi au fournisseur.
 Pour certains réactifs, l’approvisionnement se fait obligatoirement auprès
du fournisseur qui a mis à disposition l’appareil utilisant ces réactifs. La
durée de cet engagement est prévue par un contrat
 Quelques produits sont commandés directement de la Pharmacie Centrale
de la Tunisie tels que la soude, l’acide chlorhydrique, quelques produits
dangereux (acides, acétone) avec autorisation du ministère de la santé.
 Commande ferme de la PCT de Tunis, tels que le coffret d’antigène HBs,
quelques milieux de culture (LJ)
 Commande de la pharmacie de l’hôpital : coton, aiguilles, dakin, lames
bistouri, compresses, gants…
 Commande du magasin de l’hôpital (mensuelle): eau de javel, stylo, papier,
encre, cachets…
5-2-La réception des commandes
-Il faut vérifier la conformité du bon de livraison (BL) avec le bon de commande
(BC), les quantités reçues, ainsi que la date de péremption.
-Enregistrer les commandes reçues dans le registre des commandes en
mentionnant le nom du fournisseur, la date de réception, le produit commandé et
les quantités reçues

10
-Remplir la fiche du produit

Date Entrée Sortie Stock

5-3-Le stockage :
-Une petite quantité de consommable est mise directement à la disposition des
techniciens au niveau de chaque salle.
-Les produits sont rangés selon leur date de péremption de telle façon que les
plus anciens seront plus accessibles que les nouveaux.
-Ces produits sont stockés selon les recommandations du fabriquant : à
température ambiante ou au réfrigérateur (+2 à + 8°C)
-Les produits dangereux (acides forts, acétone,…) sont conservés dans une
armoire fermée à clé, et sont enregistrés dans le cahier des produits dangereux,
signé et paraphé par la police.

5-4-Gestion du stock :
-Le stock est contrôlé régulièrement suivant les mouvements (entrées et sorties)
des produits.
-Un stock minimum ou stock d’alerte est fixé pour chaque produit. On doit
signaler à la surveillante ou l’un des responsables du stock que le seuil estimé
pour un produit est atteint.
-La bonne gestion du stock est complétée par les inventaires annuels.
-Les mouvements des produits dangereux doivent être enregistrés dans des
registres séparés et sont déclarés chaque mois auprès de la police.

6. Processus de la gestion des équipements:

Le laboratoire est équipé de tout le matériel nécessaire pour la réalisation des
analyses biologiques: microscopes optiques, autoclaves, hottes, centrifugeuses...
Leurs approvisionnement se fait suite à un besoin formulé au niveau du
laboratoire :
 Défaillance d’un appareil, d’un automate…
 Augmentation du débit de travail
 Introduction de nouvelles techniques plus précises ou plus rapides ou de
nouveaux paramètres habituellement sous-traités
 du budget pour l'achat des équipements.

La gestion des équipements de laboratoire revient à :

 Réaliser les opérations techniques nécessaires permettant d’avoir
l’assurance du bon fonctionnement (étalonnage, vérification,
maintenance, ...)
11
  Connaître l’état de son parc d’équipement (inventaire, planning
d’étalonnage et de maintenance, ...) ;
 Connaître l’historique de l’ensemble des interventions réalisées sur ses
équipements (fiches de vie...) ;
 Maîtriser l’utilisation de ses équipements (notice d’utilisation, modes
opératoires...).

Il ne faut pas oublier que l’équipement doit être utilisé par du personnel formé à
son utilisation et en particulier pour les mesures pour lequel il est destiné.
Tout matériel doit subir une maintenance interne réalisée par le technicien
travaillant sur l’appareil et tout matériel défectueux doit être mis hors service,
étiqueté et entreposé jusqu’à réparation tandis que la maintenance externe est
réalisée par le fournisseur.

12
 II. Processus analytique :

L'analyse biologique

La phase pré-analytique La phase analytique La phase post analytique

Réception Organisation interne Validation

Prélèvement Personnels Edition
Tri et identification Techniques Interprétation
Conservation Equipements Communication

Prélèvement Analyse Résultat

1. Phase pré-analytique :
La phase pré-analytique est l’ensemble des facteurs qui peuvent influencer le
résultat d’un échantillon avant l’analyse.
Elle comprend :
 l’interrogatoire du patient,
 le prélèvement,
 l’étiquetage des échantillons prélevés,
 l’enregistrement des demandes d’analyses,
 la prise en charge des prélèvements (prétraitement,
centrifugation…)
 la conservation de l’échantillon avant l’analyse.

La phase pré-analytique comprend le prélèvement, le transport, la

réception, le tri, l’identification et l’enregistrement
 La demande d'analyse
La demande d'analyse doit contenir:
 Les informations concernant l’identité du patient, le sexe et la date de
naissance.

13
  L’analyse demandée écrite clairement.
 Le type d’échantillon biologique recueilli.
 La date de recueil de l’échantillon.
 Le nom du clinicien prescripteur ou de toute autre personne autorisée à
prescrire des analyses, ainsi que son cachet.
 Les renseignements cliniques nécessaires à l’interprétation du test.

 L’interrogatoire est indispensable. Il permet de recueillir des informations

cliniques précieuses indispensables pour l’interprétation des résultats
(exemple : diabète, immunodépression, corticothérapie, contact avec des
animaux, pratique de sport…).

 Le prélèvement

Le prélèvement se fait dans la salle de prélèvement (si consultation externe) ou

au lit du malade par un personnel habilité (infirmier, biologiste, résident,
interne).
Les prélèvements mycologiques ainsi que les frottis dermiques (Leishmaniose)
se font au laboratoire, dans la salle de mycologie.
Le respect des conditions de prélèvement est primordial pour la fiabilité des
résultats (à jeun ou à une certaine heure , selon le type de prélèvement...)
a. Le préleveur :
Il doit respecter les règles de soins et d’hygiène, notamment en ce qui
concerne le port de gants et de blouse.

b. L’échantillon :
Le spécimen doit être recueilli au site le plus susceptible de détecter l’agent
infectieux, avec une quantité suffisante et de préférence avant traitement.

c. Le matériel :
Dans tous les cas, les prélèvements seront réalisés avec du matériel stérile,
étanche à usage unique et étiqueté à l’avance au nom du malade.

d. Les méthodes de prélèvement :

Le procédé d'analyse de l'échantillon dépend du type de prélèvement et la
valeur des résultats est tributaire de la qualité de l'échantillon :

14
Type du Diagnostic Commentaire
prélèvement
Bactériologie
Urine Infection urinaire Moment du prélèvement : le matin au réveil, ou
urines ayant séjournées au moins 4 heures dans la
vessie.
Chez l’adulte :
1) Lavage hygiénique des mains et toilette
soigneuse au savon de la région vulvaire chez la
femme et du méat chez l’homme suivi d’un
rinçage.
2) Eliminer le 1er jet d’urines (20ml)
3) Recueillir au minimum 20 à 30 ml d’urine dans
un flacon stérile.
4) Refermer hermétiquement le flacon.
5) Acheminer rapidement (dans les 2 heures) au
laboratoire.
Chez le nourrisson :
1) Désinfecter soigneusement avec du dakin toute
la région périnéale suivi d’un rinçage
2) Placer un collecteur stérile spécifique (poche
adhésive à usage unique).
3) Dès la miction terminée, retirer le collecteur et
transvaser les urines dans un flacon stérile.
4) Si le temps d’attente dépasse 30 mn, placer une
autre poche après une nouvelle désinfection.
Chez un patient sondé :
1) Clamper la sonde en aval pendant 5mn
2) Désinfecter en amont du clamp avec un
antiseptique iodé
3) Prélever à l’aide d’une seringue environ 5ml
d’urine

Crachat Tuberculose Le prélèvement se fait le matin, au réveil, après

pulmonaire rinçage bucco-dentaire, suite à un effort de toux ou
aidé par kinésithérapie.
pour la recherche de BK, on a besoin de 2
prélèvements de 2 jours successifs.

Selles Infection il se fait à domicile ou dans le laboratoire par le

digestive patient qui va recueillir les selles dans un récipient
stérile : des selles fraichement émise

15
Prélèvement vulvovaginites ou -Le prélèvement doit être effectué à distance d’une
vaginal leucorrhée antibiothérapie locale ou générale, d’un rapport
-depistage sexuel (24 h) et en l’absence de toilette vaginale.
systématique à la -Après mise en place d’un spéculum, sans lubrifiant,
recherche de on prélève par écouvillonnage des sécrétions des
streptocoque B parois du vagin jusqu’à la vulve.
chez la femme -Pour la détection du portage de streptocoque de
enceinte groupe B, il n’est pas utile d’utiliser un spéculum,
l’écouvillonnage simple suffit.

endométrite et -Mise en place d’un spéculum

endocervicite : -Nettoyage soigneux de l’exocol avec un écouvillon
ou un tampon stérile imbibé d’eau physiologique
stérile
-Prélever par écouvillonnage de l’endocol à l’aide
d’écouvillon en dacron ou en alginate qui sera tourné
plusieurs fois dans le col avant d’être retiré
-si port de stérilet : Prélèvement de pus
éventuellement puis retirer le matériel sans toucher
les parois du vagin

Coprologie –parasitologie

Selles Parasitose Il se fait à domicile ou dans le laboratoire par le

digestive patient qui va recueillir les selles dans un récipient
stérile
L’examen parasitologiques des selles, doit toujours
être réalisé sur au moins 3 selles émises à quelques
jours d'intervalle.

Suc Leishmaniose  humidifier la lésion suspectée. Après ablation de la

dermique cutanée croute superficielle, prélever les sérosités à la
périphérie de la lésion.
Etaler le suc dermique obtenu sur une lame.

Scotch test Oxyurose Le prélèvement est fait le matin, avant défécation et

anal avant toute toilette intime. On applique un morceau
de scotch au niveau de la marge anale.
Sang Paludisme -Sang capillaire : au bout du doigt, au talon ou au lobe
de l’oreille chez le nourrisson de moins de 6 mois.
L’étalement doit être fait immédiatement.
16
 -Sang veineux : sur anticoagulant (EDTA).
L’étalement peut être différé.
- Déposer une goutte de sang à l'extrémité d'une lame
pour le frottis mince.
- Déposer une grosse goutte de sang sur une lame
dégraissée pour la goutte épaisse.

Urine Bilharziose Il se fait à la recherche d'œufs de schistosomes sur les

urines de 24 heures ayant subies une décantation de
24H au réfrigérateur, suivie d’une centrifugation.
Mycologie
Cheveux et Teigne Prélèvement se fait dans la salle de prélèvement Avec
poils une pince à épiler, arracher en
périphérie des lésions les cheveux cassés.
Peau Pityriasis Dans la salle de prélèvement racler les squames à la
versicolor périphérie des lésions à l’aide d'une curette et les
Herpes circiné recueillir dans une boite de Pétri.
Ongles Onyxis -Si plusieurs ongles sont atteints, chaque lésion doit
être prélevée et ensemencée séparément.
-dans la salle de prélèvements racler la face interne de
l’ongle dans une boite de pétri
Scotch-test Pityriasis On colle un ruban adhésif transparent sur la lésion
cutané versicolor après léger grattage de celle ci.

Muqueuse Candidose buccal Il est réalisé par écouvillonnage, le matin. Le sujet

buccale doit être à jeun. L’utilisation de dentifrice et de bain
de bouche est proscrite.
Sérologie
Sang veineux Sérologie de la Il est réalisé sur un tube sec. Le sérum est séparé par
toxoplasmose, de centrifugation.
la rubéole, Ag
HBS, HIV,
syphilis
Autres prélèvements pour la recherche de tuberculose:
• Le contenu gastrique par tubage gastrique.
• Ponction lombaire, ponction pleurale, ponction ganglionnaire..
• Fragment de biopsie, pus d'abcès.
Autres types de prélèvements:
• Les produits alimentaires.
• Les eaux (de boisson, usées..).

17
 Acheminement :

Les prélèvements effectués en dehors du laboratoire doivent être acheminés le

plus rapidement possible (au bout d'un délai optimal de deux heures) afin de
réaliser une bonne exécution des analyses tout en évitant une multiplication des
micro-organismes.

 La réception :
Au moment de la réception des prélèvements, il faut tout d’abord vérifier la
concordance entre l’étiquette du tube et le bon de demande d’analyse, ainsi que
la concordance entre la nature du prélèvement et l’examen demandé.
 Enregistrement :
Enregistrement de chaque échantillon en lui attribuant un numéro d’ordre qui
permet son identification lors de la phase analytique.
 Prétraitement des échantillons :
La plupart des échantillons ne nécessitent pas un prétraitement et seront analysés
directement (urines, selles, PV…).
Concernant la sérologie, tous les tubes sanguins doivent subir une
centrifugation préalable afin d’obtenir le sérum.
 La préparation des milieux de culture :
Elle se fait dans une salle propre à distance des autres salles techniques.
 On effectue les pesées des différents milieux à préparer selon les modes
opératoires détaillés, et on additionne la quantité adéquate d’eau distillée.
 Les milieux sont stérilisés à l'autoclave à 121°C
 Les bouillons sont versés dans des tubes à vis ou à coton.
 Les géloses sont versées dans des tubes à vis (Kligler-Hajna,
Sabouraud…) ou coulés dans des boîtes de pétri (Mueller-Hinton, GO ,
BCP…).

Pour chaque lot de milieu préparé, on effectue un test de stérilité et un test de

fertilité :
 Test de stérilité : l’échantillon est incubé pendant 48 heures dans l’étuve à
37°C.
 Test de fertilité : l’échantillon est ensemencé à partir d’une suspension
bactérienne connue.

18
 2. La phase analytique :
C'est une phase consacrée à la manipulation proprement dite qui sera faite selon
des procédures analytiques convenables à chaque type d’analyse. Ces
procédures sont documentées et sont disponibles au poste de travail du
personnel concerné.
Pour assurer une phase analytique de qualité, il faut respecter des conditions
majeures :
 Organisation des postes de travail
-Il doit y avoir une bonne répartition des tâches entre le personnel pour obtenir
un meilleur rendement.
-Pour chaque analyse, des matériaux et leurs fiches techniques appropriées sont
fournis par le laboratoire au niveau des postes de travail
 Entretien et contrôle de la fiabilité des appareils
-Le responsable du laboratoire assure l’entretien régulier des appareils, organise
et planifie les opérations de maintenance préventive.
 Choix de la technique
-Le responsable du laboratoire assure le choix de la technique la plus fiable
c'est-à-dire la plus précise, la plus exacte et la plus spécifique.

3. La phase post-analytique
C’est la phase de validation et d’enregistrement des résultats. Elle comprend la
validation technique et la validation biologique .
3.1 La validation technique
C'est une phase de validation où les résultats d’analyses sont notés tout d’abord
par les techniciens sur les feuilles de paillasse et ensuite seront contrôlées par les
assistantes ou la chef de service.
3.2 La validation biologique.
Une fois le résultat est validé de point de vue technique, il sera inscrit sur le
registre, et par la suite transmis à l’assistante ou la chef de service pour
signature.
3.3 Expression des résultats et comptes rendu d'analyses
Les feuilles de résultats finales sont établies tout en indiquant les valeurs de
références et en utilisant les unités du système internationale. Il faut se référer
aux tables de conversion pour éviter d’éventuelles erreurs de conversion
d’unités.
19
 3.4 Transmission des résultats
Après signature, les résultats sont amenés au bureau de la surveillante qui va les
répartir dans les différents dossiers correspondant à chaque service.

III. Gestion du contrôle de qualité :

Selon le Guide de Bonne Pratique de Laboratoire (GBPL) : « Tout laboratoire
d’analyse médicale doit disposer d’un système qualité basé sur des procédures et
des modes opératoires écrits couvrant les différentes étapes des analyses. Ce
système doit être permanent et soumis à des évaluations internes et externes. »

1. Contrôle de qualité interne :

Le contrôle de qualité interne permet de reconnaître les anomalies et les non
conformités afin d’y remédier immédiatement. Il consiste à passer une série
d’échantillons de contrôle connus qui doivent être traités de façon identique aux
spécimens de patients.
Le contrôle de qualité interne se fait quotidiennement : par exemple dans la
sérologie, chaque type de réaction possède ses contrôles internes qui permettent
de calibrer les résultats, ainsi devant toute valeur anormale du contrôle interne,
on doit refaire toute la série d’analyse.
Les résultats du contrôle de qualité interne doivent être conservés pour une
période minimale d’1 an.

2. Contrôle de qualité externe :

Le contrôle de qualité externe est un outil d’évaluation des techniques d’analyse
et des procédures d’assurance qualité mises en œuvre dans les laboratoires.
Chaque année, le laboratoire reçoit des échantillons provenant du ministère de la
santé qui doivent être analysés dans les mêmes conditions que les échantillons
des patients.
Après l’envoi des résultats, on reçoit des comptes-rendus individuels et le
compte rendu de l’évaluation globale. Les résultats de cette évaluation sont
conservés pendant une durée de 5 ans.

IV. Réactifs et dispositifs d’analyse :

1. Réactifs pour identification :

Oxydase, Catalase, Kovacs, VP1, VP2, TDA, colorants (violet de gentiane,
Fuschine, bleu de méthylène, lugol )…

20
 2. Milieux de culture :
 Milieux d’isolement (non sélectifs) :
 Gélose ordinaire:
Gélose nutritive à 2,8% de NaCl C’est un milieu qui convient à la culture des
bactéries sans exigences particulières.
 Milieux enrichis
-Gélose au sang : milieu composé d’une gélose Columbia additionnée à 5% de
sang frais de cheval ou de mouton cuit à 45 °C. Ce milieu permet la lecture du
caractère hémolytique des bactéries (streptocoques ++).

- Gélose au sang cuit: milieu composé d’une gélose Columbia additionnée de

sang cuit à 80°C. C’est un milieu préconisé pour l’étude du genre Neisseria et
d’Haemophilus.

 Milieux d’orientation
- Gélose BCP (gélose lactosée au bromocrésol pourpre) : c’est un milieu
utilisé pour identifier des entérobactéries, cependant de nombreuses espèces
bactériennes n’appartenant pas à cette famille peuvent être cultivées sur ce
milieu non sélectif. Ce milieu permet de différencier les bactéries lactose (+),
qui fermentent le lactose (virage au jaune) des bactéries lactose (-).
21
  Milieux sélectifs :
 Milieux additionnés d’antibiotiques ou antiseptiques
- Gélose VCN : milieu sélectif pour le gonocoque
Vancomycine 3 µg/mL : Glycopeptide agissant sur les cocci Gram +
Colimycine 7.4 µg/mL : Polymixine E agissant sur les BGN
Nystatine 2µg/mL : antifongique agissant sur les champignons

- Gélose Cétrimide :
Ce milieu est relativement pauvre contient un antiseptique (le Cétrimide)
favorisant la production des pigments
-milieu bleu: pyocyanine.
-milieu jaune-vert: pyoverdine.

 Autres milieux sélectifs

- Gélose SS : C’est un milieu solide qui ralentit le développement de la flore
secondaire grâce aux différents inhibiteurs (citrate de sodium, vert brillant,
sels biliaires). Il est utilisé pour l’isolement des Salmonelles et des Shigelles
dans les selles

22
 .
-Milieu de Chapman: il renferme de fortes concentrations de chlorure de
sodium et du mannitol capable de sélectionner les Staphylococcus.

-Gélose Sabouraud + Chloramphénicol : c’est un milieu pour l’isolement des

levures et moisissures

 Galeries d’API :
Ce sont des mini galeries standardisées contenant des substrats
lyophilisés, permettant de révéler un ensemble d’activités métaboliques et
permettant donc de différencier les espèces bactériennes. (Exemples Api 20E,
Api 20NE, Api 10s….)

Api 10S

Api 20E

23
  Disques d’antibiogrammes :
Pour chaque classe de bactéries mises en culture, on a un ensemble
d’antibiotiques à tester selon les recommandations de la Société Française de
Microbiologie (SFM).
L'antibiotique est présent en quantité connue dans un disque de papier filtre.
Lorsque le disque est déposé à la surface du milieu de culture, l'antibiotique
diffuse en créant un gradient de concentration.

Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires

correspondant à une absence de culture.

24
 Les disques d'antibiotiques utilisés
Entérobactéries Stapylocoques Streptocoques Entérocoques Pseudomonas
- Ampicilline/Amoxicilline - PénicillineG -PéniG -Ampicilline -Ticarcilline
- Amoxicilline + - Céfoxitine -Nitrofurane -Imipénème -Ticarcilline +
acide clavulanique -Moxalactam -Rifampicine -Fosfomycine acide clavulanique
-Ticarcilline - Fosfomycine -Chloramphénicol -Nitrofurane -Pipéracilline
-Ticarcilline + - Nitrofuranes -Norfloxacine -Chloramphénicol -Pipéracilline +
acide clavulanique - Chloramphénicol -Erythromycine -Rifampicine tazobactam
- Pipéracilline - Norfloxacine -Lincomycine -Erythromycine -Céfotaxime
-Pipéracilline+tazobactam - Rifampicine -Pristamycine -Lincomycine -Céfépime
-aztréonam - Erythromycine -Triméthoprime- -Pristamycine -Céftazidime
- Céfalotine - Lincomycine Sulfaméthoxazol -Vancomycine -Imipénème
-céfixime -Pristamycine -Teicoplanine -Teicoplanine -Méropénème
- Céfoxitine -Triméthoprime- -Vancomycine -Triméthoprime - -Aztreonam
- Céfotaxime Sulfaméthoxazole -Gentamicine Sulfaméthoxazol -Tobramycine
- Céftazidime - Teicoplanine -Streptomycine -Gentamicine -Gentamicine
- Cefpirome/Céfépime - Vancomycine -Linezolid -Streptomycine -Ciprofloxacine
- Imipénème - Tetracycline -Tetracycline -Linezolide -Amikacine
-ertapénéme - Tigecycline -Tigecycline -Tigecycline -ceftazidime
- Gentamicine - Acide fusidique -Norfloxacine
- Tobramycine - Gentamicine -Tetracycline
- Amikacine - Tobramycine
- Netilmicine - Kanamycine
- Acide nalidixique - Linezolide
- Norfloxacine
- Ciprofloxacine
- Nitrofurane
- Cotrimoxazole
- fosfomycine

25
V. Principales analyses effectuées et équipements utilisés :
1. Au niveau de la salle de bactériologie
Plusieurs types de prélèvements peuvent faire l’objet d’une analyse
bactériologique parmi lesquels on cite les analyses effectuées couramment :
Prélèvement vaginal, examen cytobactériologique des urines et la coproculture.
1-1-Prélèvement vaginal (PV) :
Le prélèvement vaginal est fait à l’hôpital par un gynécologue ou une sage
femme puis acheminé rapidement au laboratoire (écouvillon).
A partir de cet écouvillon, on prépare une suspension bactérienne dans 2 mL de
sérum physiologique.
 Examen direct : permet la recherche de parasites vaginaux (Trichomonas
vaginalis) et éventuellement de levures, ainsi que l’appréciation de la
présence des leucocytes, les filaments mycéliens, des hématies et des
cellules épithéliales.

 Examen cytologique : coloration de Gram : permettant la détermination

de l’état de la flore vaginale (normale, déséquilibrée…) en déterminant le
score de Nugent.

Coloration de Gram
 Violet de Gentiane : 1 minute
 Lugol : 30 secondes
 Alcool : quelques secondes jusqu’à décoloration
 Fuchsine : 1 minute
 Avec lavage à l’eau après chaque étape

26
 Tableau 2: Détermination du score de Nugent

Score Lactobacillus Gardenerella et Mobiluncus

Bactéroides

0 ++++ 0 0

>30 bactéries / Absence

champ

1 +++ + +

<1 bact/ champ

2 ++ ++ ++

1à 4 bact/ champ

3 + +++

5 à 30 bact/
champ

4 0 ++++

Le score du frottis est calculé en faisant la somme des scores obtenus pour les
différents morphotypes bactériens observés.

Tableau 3 : Interprétation du score de Nugent

Groupe Score Type de la flore

1 0à 3 Normale

2 4à6 Intermédiaire

3 ≥7 Vaginose bactérienne

 Culture bactérienne
La culture se fait à partir de la suspension bactérienne dans 4 milieux :
 Examen bactériologique :

27
 Gélose au sang : permet la culture des germes exigeants et de voir le type
d’hémolyse des streptocoques.
 Gélose au sang cuit ou gélose chocolat : permettant de faire pousser les
germes exigeants tels que les streptocoques, des gonocoques …
 Gélose chocolat + VCN : milieu sélectif pour le gonocoque
 Vancomycine 3 µg/mL : Glycopeptide agissant sur les cocci Gram +
 Colimycine 7.4 µg/mL : Polymixine E agissant sur les BGN
 Nystatine 2µg/mL : antifongique agissant sur les champignons

Incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures dans un milieu enrichi en CO2 (gare

contenant une bougie)
 Examen parasitologique :
 Milieu Sabouraud + Chloramphénicol : permettant de favoriser la pousse
des levures tout en inhibant les autres bactéries par le Chloramphénicol.

Tous ces milieux doivent être incubés pendant 24h à 48h à 37°C

 Lecture des résultats après incubation

S’il y a des colonies suspectes dans l’un des 3 premiers milieux :
-On fait une coloration de Gram à partir de colonies isolées
 Orientation selon la coloration.
-On note l’aspect des colonies, le type d’hémolyse s’il apparait au niveau de la
gélose du sang.
- Vérifier s'il ya une poussée de méningocoque au niveau de la gélose au sang
cuit additionnée au VCN.
- Si le milieu Sabouraud montre la présence de levures, les identifier par un test
de filamentation réalisé au sein du laboratoire de parasitologie.
- L'antibiogramme utilisé pour identifier les germes sur un milieu Muller Hinton
additionné au sang (pour le Streptocoque)
-Les germes les plus incriminés dans les vaginites bactériennes sont :
 Streptocoque de groupe B
 Neisseria gonorrheae
 BGN (entérobactéries)
 Candida
 Chlamydia
Non cultivable en PV classique
 Mycoplasme

28
1-2-Examen cytobactériologique des urines :
 Aspect macroscopique :

Claire, légèrement trouble, trouble, hématique.

 Culture :

Gélose ordinaire Milieu BCP

Etude quantitative Etude qualitative.

• Le dénombrement des germes
s'opère par la technique de l'anse
calibrée de 10μl.
• Le nombre des colonies trouvé est
exprimé en DGU (densité de germe
urinaire) qui sera
multiplié par 100 pour avoir
bactériurie/ml.
• Une gélose lactosée au pourpre de
Bromocrésol ensemencée par la
méthode des cadrans afin
d'avoir des colonies isolées.
• Ce milieu permet la poussée des
bactéries non exigeantes et leurs
différenciations par la capacité
de fermentation du lactose.

 La cytologie :
-Elle sert à déterminer le nombre des leucocytes et des hématies à l'aide des
cellules de Malassez par ml d’urine.
-Cet examen permet de noter la présence des cristaux (oxalate de calcium, urate
de sodium et de potassium...) et de certains microorganismes (levures,
Trichomonas vaginalis)

 Identification et interprétation des résultats :

 La morphologie des colonies:
- Taille: petites, grandes..
- Forme
- Aspect de la surface: muqueuse...
- Opacité: opaque, transparente...
- Consistance: crémeuse, sèche...
- Couleur: beige, crème...
-
 La coloration Gram:
- Elle permet d'orienter l'identification en différenciant les bactéries (cocci et
bacilles) Gram positif des bactéries Gram négatif.

29
 Cocci
Orientation
vers
Cocci gram - méningocoque
Cocci gram + et gonocoque

Catalase + Catalase -

Micrococcaceae Streptococcaceae
Staphylocoque, Microcoque Streptocoque, Entérocoque

Dnase -bouillon hypersalé

Coagulase -milieu bile-esculine

Novobiacine

-esculine -
-esculine +
-bouillion clair
-bouillion trouble

Streptocoques

Dnase/ coagulase + Dnase/ coagulase -

-Novobiacine Novobiacine Test
sensible résistant d’agglutination

Staphylococcus Staphylococcus Streptocoque Entérocoque

aureus saprophiticus B ou autre
Streptocoque
D
30
 Bacille gram -

Oxydase

Négative Positive

Pseudomonas +++
Entérobactéries

-Api 20 E -king A king B

-antibiogramme -tube VF (type de respiration)

-bouillon 6.8
-Api NE

 Antibiogramme :
 Principe : déterminer le diamètre d’inhibition de chaque antibiotique dans le
but de déterminer la sensibilité ou la résistance de la souche aux
antibiotiques.
 Technique : préparer une suspension bactérienne dans 10 mL d’eau distillée
stérile calibrée a 0,5 Mac Farland. On ensemence sur gélose Mueller Hinton
(additionné au sang s’il s’agit d’un streptocoque) à l’aide d’un écouvillon et
on place les disques d’ATB sur la gélose
Incubation à 37°C pendant 24 h

31
1-3-Coproculture :
 Prélèvement :
Le prélèvement est réalisé à domicile ou au laboratoire dans un pot stérile, avant
toute antibiothérapie. Il doit être acheminé au laboratoire rapidement, sinon il
peut être conservé à +4°C pendant maximum 8h.
Le prélèvement est fait sur 2 jours de suite afin d’augmenter la chance de
retrouver les bactéries.

 Aspect macroscopique :
Aspect des selles : molles, aqueuses, glaireuses, sanglantes, Diarrhétique…
 Examen direct :
Recherche des bactéries mobiles :
 Vibrio : mobilité importante en groupe de poisson
 Campylobacter : mobilité importante en vol de mouche
 Présence de levures, leucocytes
.
 Culture :

 Jour 1 :
 enrichissement sur milieu sélénite (pour sélectionner les bactéries
d’intérêt)
 ensemencement sur gélose SS : ce milieu contient des inhibiteurs : sels
biliaires, vert brillant et de fortes concentrations en citrate de
sodium permettant d’empêcher la pousse des bactéries Gram+ et de
rendre difficile la croissance des bactéries Gram – autres que Salmonella
et Shigella.
 Le milieu SS contient aussi du lactose, le rouge de phénol (indicateur
coloré) et le thiosulfate de fer.
 Colonies rouges : lactose +
Colonies incolores : lactose–
Colonies à centre noir : H2S +

32
 Jour 2 :
 Lecture du milieu SS et repiquage sur un 2ème milieu HK à partir du
bouillon sélénite

Colonies
transparentes
à fond noir

 Jour 3 :
 Lecture : si on a des colonies transparentes à centre noir (lactose -,
H2S+) ou des colonies transparentes (lactose -, H2S -)
  ensemencement sur Urée, Kligler-Hajna :
 Le milieu urée-indole : ensemencer en goutes, permet la détection
d’une uréase chez la bactérie.

La salmonelle
ne possède pas
une uréase

 Le milieu Kligler –Hajna contient du glucose, lactose, thiosulfate de

Na + citrate de fer II : ensemencer par une piqure dans le culot et en
stries parallèlement à la pente, permettant de voir la fermentation des
2 sucres, la production de gaz et la production de H2S en effet :
• Fermentation de lactose exprimée par un virage de la pente au
jaune.
• Fermentation du glucose marquée par un virage du culot au jaune.
• Production de gaz (dégagement des bulles d'air et décollement de
la gélose)
33
 • Production de H2S (apparition d'un précipité noir).

Pas de virage de pente

au jaune  lactose -

Précipité noir h2S +

Précipité jaune glucose +

Décollement de la gélose
 gaz +

 Jour 4 :
 Lecture du milieu Kligler-Hjana et du test à l’urée
 Si urée -, glucose+, lactose-, gaz + et H2S + suspicion de
Salmonella
Si urée -, glucose +, lactose -, gaz – et H2S -  suspicion de Shigella

 test à l’ONPG (Ortho-nitrophénol galactoside) : c’est un sucre qui utilise la

β-galactosidase bactérienne pour donner du Glucose et du Galactose
Si ONPG – (incolore)  antibiogramme + Api 20 E
 Identification de l’espèce bactérienne (Salmonella/ Shigella)
 S’il s’agit d’une Salmonella, il faut procéder au sérotypage. (dans l’institue
pasteur avec déclaration obligatoire ++)
1-4-Recherche de mycobactéries :
 Prélèvements pulmonaire :
 Crachats émis spontanément après un effort de toux, de préférence le
matin au réveil, dans des flacons stériles à fermeture étanche et à large
ouverture afin d’éviter les contaminations par les bords extérieurs.
 Prélèvement de 2 jours de suite pour augmenter la chance de trouver des
bacilles de Koch, étant donné que l’émission des bacilles est intermittente.
34
  Le prélèvement peut être conservé à +4°C pendant maximum 5 jours.
 Autres prélèvements possibles :
*expectorations provoquées : - Recueillir les expectorations tardives
suivies d'une administration d'aérosols de sérum physiologique pendant 20
minutes.
* tubage gastrique. : - Réaliser un tubage chez les enfants (ne peuvent
pas cracher).

 Prélèvements extra-pulmonaires :
 Les prélèvements stériles précieux
• Les ponctions lombaires, pleurales, péricardiques, péritonéales.
• Les ponctions ganglionnaires ou pus d'abcès.
• Les biopsies.
 Les prélèvements contaminés
• Les urines.
Emmener les prélèvements immédiatement au laboratoire
sinon les conserver au froid (+4°C) sans dépasser 5 jours.

 Réception :
 Identifier chaque crachoir
 Vérifier la conformité du bon d’analyse avec le prélèvement
 Vérifier si la fiche de renseignement est correctement remplie.

 Examen direct :
 Etalement du prélèvement sur 2 lames
 Fixation par flambage
 Coloration de Ziehl Neelsen
 1ère étape : Coloration
 Recouvrir le frottis par la fuchsine phéniquée
 Chauffer doucement jusqu’à émission de vapeur, 3 fois pendant 10
minutes
 Utiliser la flamme d’un coton moulé et trempé dans l’alcool
 Eviter de faire bouillir le frottis
 Rejeter le colorant, rincer à l’eau du robinet.
 2ème étape : Décoloration
 Immerger les lames colorées dans un bain d’acide (H2SO4à 25 %)
et d’alcool (éthanol 95%).
 laver à l’eau de robinet
 laisser sécher

35
  3ème étape : contre coloration
 Immerger les lames dans un bain de bleu de méthylène pendant
30secondes
 Rincer à l’eau et laisser sécher à l’air libre.
Lecture des lames à l’immersion (*100)
Recherche des bacilles de Koch : bacilles acido-alcoolo-résistants, fins, colorés
en rose sur fond bleu.
La lecture se fait selon l’échelle de Ridley.
Tableau 4 : Echelle de Ridley
Nombre de BAAR Réponse

Pas de BAAR / 100 champs Négatif

1 à 9 BAAR /100 champs Nombre exact de BAAR

10 à 99 BAAR / 100 champs +

1 à 10 BAAR / champ ++

>10 BAAR / champ +++

Figure N°2 : Aspect microscopique des Bacilles acido-alcoolo-résistants

(G*100)

 Coloration de l’auramine :
- La fuschine est remplacée par l’auramine, les bacilles fixent le colorant
fluorescent et le conservent après effet de l’acide et de l’alcool.

36
 L’appareil
automatique RAL
Diagnostics
(coloration à
l’auramine)

- Le frottis coloré est examiné au microscope à fluorescence avec un objectif

de faible grossissement (*40) et le résultat est exprimé en nombre de croix selon
un tableau bien défini pour chacun des grossissements.

 Culture

 Prélèvements contaminés par la flore

microbienne (Crachats, urines, selles)
 Décontaminer par deux volumes de soude à 4
%.
 Mélanger au vortex.
 Incuber à l'étuve à 37°C pendant 15 minutes.
 Centrifuger à 3000 tours par minute pendant
15 minutes.
 Laver le culot et neutraliser la soude par l'eau distillée (15 à 20 ml)
 Centrifuger à 3000 tours par minute pendant 15 minutes puis décanter le
surnageant.
 Reprendre le culot et ensemencer 100µl dans chaque tube de Lowenstein
Jensen (*2).
 Culture en milieu solide (la lecture se fait chaque semaine durant 90
jours)
 Prélèvements précieux stériles
 Avant de commencer la décontamination on fait une 1ére sur 3 tubes :
-Deux tubes Lowenstein Jensen
- Un tube Coletsos.
 Décontaminer par deux volumes de soude de 4% ou soude cystéine.
 Mélanger au vortex.

37
  Incuber à l'étuve à 37°C pendant 15 minutes.
 Centrifuger à 3000 tours par minutes pendant 15 minutes.
 Neutraliser la soude par un tampon phosphaté.
 Centrifuger 3000 tours par minutes pendant 15 minutes.
 La culture de culot se fait en deuxième temps sur 4 tubes :
- Deux tubes Lowenstein Jensen
- Un tube Coletsos.
- Un milieu liquide MGIT
Culture en milieu solide et liquide

Incubation à 37 °c pendant 90jours et lecture chaque

Incubation à 37°c Dans le
semaine
BACTEC lecture automatique
- Culture négative : à rejeter après 90 jours chaque heures pendant 42 jours

-Culture positive : à partir de 18 jours jusqu’à 90 jours Résultat + à partir 5éme jours

 Une poussée de culture montre de grandes colonies en "choux de fleur",

arrondies de couleur crème beige.

 Principe de la
technique MGIT
(Mycobacteria
Growth Indicator
Tube) :

Cette technique
utilise un milieu

38
contenant un sel de Ruthénium qui
émet une fluorescence d’autant plus vive que la pression partielle en
oxygène est plus faible. Le métabolisme microbien provoque une
déplétion en O2 et entraîne l’apparition d’une fluorescence dont
l’intensité est proportionnelle au niveau de réduction du milieu.
La croissance peut être détectée aussi par la présence d’une turbidité homogène
ou non, de petits grains ou de flocon dans le milieu de culture.
 Toute culture positive est contrôlée par une coloration de Ziehl Neelsen

Tableau 5: Lecture quantitative des cultures

Nombre de colonies Résultat

Absence Négatif

Contamination Culture contaminée

1 à 9 colonies Nombre exact

10 à 100 colonies +

100 à 200 colonies ++

>200 colonies +++

 Caractères morphologiques des colonies : Décrire l’aspect des colonies, la

taille, le délai de poussée, la pigmentation …

 Identification :
 Caractères morphologiques
 Le délai d'apparition des colonies:
- Précoce Mycobactérium tuberculosis:
- Tardive: Mycobactérium bovis.
 La production du pigment (atypique) recherché par un test
d’Obscurité (O) : tube enveloppé par du papier kraft, pour rechercher une
éventuelle pigmentation à la lumière

39
• L’aspect des colonies :
-grande, beige, fleurs de choux, rigoureuse : Mycobacterium
tuberculosis
-blanchâtre, petite, lisse : Mycobacterium bovis.

 Caractères biochimiques
• Test de niacine: C'est une réaction de
recherche de l'acide nicotinique
synthétisé et libéré par la bactérie

• Nitrate réductase: Il permet de

différencier les bactéries selon leur
capacité de réduction de nitrate en
nitrite.

 Epreuve à la sensibilité aux inhibiteurs:

 Hydroxylamine : les mycobactéries de la tuberculose sont sensibles
 Acide 2 thiophène carboxylique (TCH): Le Mycobacterium
tuberculosis pousse dans un milieu de Lowenstein Jensen contenant cet
inhibiteur (Résistant)

 Antibiogramme :
 Milieu solide
- A partir d'une solution mère, préparer les dilutions 10-2 et 10-4.
- Les 4 antibiotiques utilisés dans le test de sensibilité aux antibiotiques sont:
o Streptomycine.
o Isoniazide Avec solution
o Rifampicine 10-2
o Ethambutol - Avec solution
10-4

40
  Milieu liquide
- Solution mère 100 microlitres dans les tubes : SIRE +
Pyrazinamide
- Dilution au 1/5 pour le contrôle de SIRE.
- Dilution au 1/10 pour le contrôle de Pyrazinamide.

 Interprétation de l'antibiogramme
Apprécier le % de mutants R

• Si N% < 1% : souche S
• Si N% > 1% : souche R

Tableau 5: Caractères différentiels entre M. tuberculosis et M. bovis

Test M. tuberculosis M. bovis

TCH + -
Hydroxylamine - -
Niacine + -
Nitrate + -
Pyrazinamide Sensible Résistant

Identification
moléculaire à
Tunis

41
 2. Au niveau de la salle de sérologie :
2-1-La sérologie :

 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) : C’est une réaction

immunoenzymatique.
Domaines d’application: HIV, AgHBs, Toxoplasmose (IgG, IgM, avidité),
Rubéole (IgG, IgM).

 IFI (Immuno Fluorescence Indirecte)

Domaine d’application : Toxoplasmose.

 Réaction d’inhibition d’hémagglutination

Domaine d’application: ASLO (Dosage des Anti-StreptoLysines O).
 Réaction d’hémagglutination
Domaine d’application : TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutinations
Assay).

 Réaction d’agglutination
Domaine d’application: VDRL (Venereal Disease Research Laboratory).

2-2-Groupage sanguin
Le groupage standard ABO se fait par 2 épreuves (sur une plaque d’opaline) :
 L’épreuve globulaire : Epreuve de BETH VINCENT : consiste à
rechercher, par technique d'agglutination, les antigènes à la surface des
hématies du patient, en utilisant des sérums tests anti A, anti B et anti
AB.
 L’épreuve sérique : Epreuve de SIMOdNIN : consiste à rechercher, par
technique d’agglutination, les anticorps Anti A et Anti B dans le sérum du
patient, en utilisant des hématies tests A, B et O.

42
 Epreuve globulaire Epreuve sérique
GR du patient + Sérum test Sérum du patient + hématie
test
GR test GR test GR test
Anti-A Anti-B Anti-AB
A B O
A + - + - + -
B - + + + - -
AB + + + - - -
O - - - + + -

Réaction + : agglutination Réaction - : Pas d’agglutination

Le groupage standard RH consiste à rechercher, par technique l'agglutination,

l'antigène D à la surface des globules rouges en utilisant le sérum test anti D.
Test Témoin + Témoin -
Sérum anti-D Sérum anti-D Sérum anti-D
+ + +
GR à tester GR témoin O Rh + GR témoin O Rh -

 Si la réaction à l’Ac anti-D est négative (pas d’agglutination), il faut vérifier

s’il s’agit d’un phénotype D faible, en utilisant une carte-ID anti-
D contenant des anticorps anti-D polyclonaux d’origine humaine inclus dans
le gel
 Préparer une suspension d’hématies (réactif : solution de broméline
modifiée)
 Décoller la languette d’aluminium des microtubes nécessaires en
tenant la carte-ID en position verticale.
 Distribuer 10 ou 12,5 µl de la suspension d’hématies au microtube
 Centrifuger la carte-ID 10 minutes dans l’ID-Centrifuge
 Lire et noter les réactions

 Interprétation des résultats :

43
 Positif : hématies agglutinées formant une ligne rouge à la surface
du gel ou des agglutinats dispersés dans le gel.
 Négatif : hématies en culot compact au fond du microtube.

44
 3. Au niveau de la salle de parasitologie –mycologie :
A. Parasitologie :

a. Examen parasitologiques des selles (EPS)

 Examen macroscopique :
Aspect: dure, molle, diarrhéique...
 Examen microscopique :
Préparer une suspension en introduisant une noisette de selles
dans un tube à hémolyse contenant un volume d’eau physiologique.

• Un examen direct à l’état frais

Déposer une goutte de la suspension entre lame et lamelle et observer au
grossissement *10 puis *40 à la recherche des œufs et des kystes.
• Examen après éclaircissement
 Technique de KATO
• Découper des rectangles de papier cellophane non plastifié et les tremper
dans une solution de travail (au moins 24 heures avant utilisation)
La solution de travail contient
- Solution de vert de malachite à 3% dans l’eau distillée.
- Glycérine pure.
- Eau distillée.
• Déposer une noisette de selles sur une lame.
• Couvrir avec le rectangle de cellophane trempé dans la solution.
• Retourner la lame sur un papier filtre et appuyer pour écraser la selle entre la
lame et le rectangle de cellophane.
• Placer la préparation pendant 3 minutes
- Sous lampe de forte puissance ou
- Sur une plaque chauffante à 45°C ou
- A l’étuve à 37°C.
• Examiner à l’objectif *10, bien balayer la totalité de la surface du rectangle
de cellophane.
C’est une technique qui met en évidence les œufs.
(On la pratique surtout pour les étudiants étrangers)
 Examen après concentration
 Méthode de Ritchie :
• Un volume de la suspension des selles.
• 2 volumes d’eau formolée.

45
• 1 volume d’éther
Les mélanger manuellement tout en bouchant l’ouverture de tube
conique puis centrifuger à 1500tr/min pendant 5 minutes, rejeter le
surnageant et récupérer une goutte de culot entre lame et lamelle.
Elle met en évidence les kystes.

 Méthode de Bailenger :
• Délayer une noix de selles avec 10 volumes de solution tampon dans un verre
à pied.
La solution tampon contient
- Acétate de sodium
- Acide acétique
- Eau distillée
• Tamiser la suspension.
• Laisser sédimenter pendant moins d’une minute.
• Décanter dans un tube à centrifuger conique.
• Ajouter dans le tube un volume égal d’éther.
• Agiter énergiquement de manière à émulsionner les deux phases.
• Centrifuger pendant 2 minutes.
• Détacher de la paroi du tube à l’aide d’une pipette pasteur effilée la phase
solide formée à l’interface des deux phases.
• Eliminer en retournant le tube d’un geste rapide de contenu des 3 phases, un
culot mince restant au fond du tube.
• Examiner le culot entre lame et lamelle à l’objectif *10 puis *40.
 Examen après coloration
 Le lugol : il sert à colorer la vacuole.
 MIF (merthiolate iode formol)
C'est un colorant qui fixe, colore et conserve les formes végétatives et
kystiques des protozoaires sur des selles fraiches.

46
  Les kystes à rechercher sont
 Les amibes
- Entamoebae histolytica Famille Espèce Kystes
- Entamoebae coli
- Endolimax nanus Amibes Entamoeba histolytica
- Pseudolimax butchlii
 Les flagellés
- Giardia intestinalis Entamoeba coli
- Chilomastix mesnili

Endolimax nanus

Flagellés Giardia intestinalis

Chilomastix mesnili
b. Scotch test anal
 Il est fait au réveil,
avant de se lever du lit
et avant toute toilette matinale en appliquant un morceau de scotch au
niveau de l’anus.
 Après avoir étalé le morceau sur une lame, acheminer le test le plus
rapidement possible pour la recherche des œufs d’oxyure.
 La lame doit être examinée au grossissement *10.

47
 Figure 3: Œufs d’oxyure sur scotch test anal

c. Examen parasitologiques des urines

 Laisser les urines de 24 heures décantées au réfrigérateur pendant 24
ou 12 heures.
 Introduire un volume d’urine pris du fond de la bouteille dans un tube
conique.
 Laisser centrifuger à 3000 tours par minute pendant 15 minutes.
 Récupérer une goutte du culot entre lame et lamelle et observer à
l'objectif *10.
C’est un examen qui permet de chercher les œufs de Schistosomes
éventuellement chez les étudiants étrangers.

Figure 4:Schistosoma mansoni Figure 5: Schistosoma haematobium

48
 d. Les parasites du sang et du système réticulo-histiocytaire :
 La Leishmaniose cutanée :

La demande de frottis dermique est formulée devant toute lésion d’aspect

volcanique apparue suite à une piqûre d’insecte chez des sujets vivant ou ayant
séjourné dans des zones d’endémie.

 Prélèvement :

Le prélèvement est fait au laboratoire. Après avoir imbibé la lésion dermique par
de l’eau physiologique ou par du dakin, on enlève la croûte à l’aide d’un
vaccinostyle et on prélève la sérosité en raclant la face interne de l’ulcération.
Le suc dermique obtenu est alors étalé sur 2 lames, et le vaccinostyle est trempé
dans un tube aliquote pour la PCR.

 Coloration au MGG : (May Grunwald Giemsa):

1) Fixation par le May Grunwald
 Recouvrir la lame par la solution de May Grunwald
 Laisser agir pendant 2 à 3 minutes
 Rincer à l’eau de robinet
2) Coloration par le Giemsa
 Ajouter immédiatement la solution de Giemsa diluée préparée
extemporanément (10 ml de Tampon + 1 ml de la solution mère de
Giemsa)
 Laisser agir pendant 25 minutes
 Rincer à l’eau de robinet
 Laisser sécher à l’air libre

49
 3) Lecture des lames à l’immersion (* 100)

 Examen microscopique :

Recherche de formes amastigotes de corps de Leishmanies : formes ovoïdes, à

cytoplasme bleu, noyau et kinétoplaste rose violacé.

Si la recherche microscopique est négative, les tubes de PCR seront envoyés au

laboratoire spécialisé au niveau de l'hôpital de Monastir pour la recherche de
Leishmanies par technique moléculaire (PCR).

 Le Paludisme

Le paludisme est recherché systématiquement chez les étudiants étrangers en

début d’année scolaire ainsi que toute personne ayant séjourné en pays
d’endémie et présentant des signes cliniques évocateurs (fièvre…) au retour de
zone endémique.

 Prélèvement :
 Confection d’un frottis mince
 Nettoyer le doigt du malade à l’alcool
 Piquer d’un coup sec et rapide le bout de doigt à l’aide d’une lancette
stérile
 Déposer une goutte de sang à l’extrémité d’une lame.
 Poser la lame juste en avant de la goutte de sang
 Faire glisser la lame jusqu’à ce qu’elle touche la goutte de sang

50
  Le sang diffuse par capillarité tout le long du bord de la lamelle inclinée
à 45°
 Pousser la lame sans appuyer trop fortement de façon à étaler le sang en
couche mince et uniforme
 Les lames doivent être immédiatement séchées en les agitant
 Le frottis mince permet de visualiser les parasites à l’intérieur des
hématies, ce qui permet d’identifier l’espèce.
 Coloration du frottis mince au May-Grunwald-Giemsa
Après confection du frottis mince, sécher les lames en agitant.
 Fixation par le May-Grunwald
- Recouvrir la lame au May-Grunwald et laisser agir pendant 3 minutes.
- Recouvrir d'un même volume d'eau distillée tamponnée pH=7,2, mélanger en

inclinant légèrement les lames dans différents sens et laisser agir pendant 1
minute.
- Jeter la solution.
 Coloration par le Giemsa
- Ajouter immédiatement la solution Giemsa diluée préparée extemporanément
et laisser pendant 25 minutes.
- Rincer la lame à l'eau de robinet.
- Sécher à l'air libre et lire la lame à l'immersion.

 Lecture
Elle se fait au grossissement *100 à l'huile d’immersion.
La lecture est pratiquée sur une grande surface: environ 100 champs au bout de
15 à 20 minutes.

51
 C’est une technique rapide peu sensible : problème pour les parasitémies
faibles

 Confection de la goutte épaisse

 Déposer sur une lame de verre dégraissée, une grosse goutte de sang
 Etaler le sang circulairement à l’aide du coin d’une lamelle, sur une
surface de 1 cm de diamètre jusqu’à défibrination. ( à peu prés après au
bout de 2 minute
 Laisser sécher sur un support de 24 heures à la température ambiante ou 1
heure à l’étuve à 37°C
 La goutte épaisse permet d’éclater les globules rouges qui vont libérer les
parasites  c’est une technique de concentration des parasites donc
permettant de déceler les faibles parasitémies, mais sans identification de
l’espèce.

 Coloration de la goutte épaisse

Après confection de la goutte épaisse
- Laisser les lames sécher à plat sur un support à température ambiante ou 1
heure à l'étuve à 37°C.
- Recouvrir les lames par le mélange Giemsa diluée préparé extemporanément.
- Laisser agir pendant 25 minutes.
- Rejeter le liquide avec précaution.
- Laver à l'eau de robinet.
-Sécher à l'air et lire la lame à l'immersion.
 Lecture
La lecture se fait au grossissement *100 à l'huile d'immersion
Elle est difficile si les parasites sont altérés
52
=>C’est une technique sensible mais lente.

Figure 6 : Hématies parasitées par des trophozoïtes de P. falciparum

B. Mycologies :
Diverses analyses mycologiques sont effectuées au sein du laboratoire :
 Recherche de teignes du cuir chevelu,
 Mycologie des ongles,
 Mycologie de la peau
 Identification des levures.

a. Prélèvement
 Prélèvement de cheveux ou poils :
Le prélèvement est fait au laboratoire, et doit être réalisé avant toute
thérapeutique et hygiène quotidienne, en prélevant à la pince des cheveux
parasités et des squames du cuir chevelu au niveau de la plaque alopécique.

53
  Prélèvement d’ongles :
Le prélèvement est fait en raclant la surface interne de
l’ongle atteint (aspect poudreux) dans une boîte de pétri
stérile. Si plusieurs ongles sont atteints, chaque lésion doit
être prélevée et ensemencée séparément.

Onyxis : ongles des pieds

 Prélèvement de peau (squames):

Avec une lame, racler les squames à la
périphérie de la lésion, et les recueillir dans une
boite de pétri stérile. Si plusieurs zones sont
atteintes, chaque lésion doit être prélevée et
ensemencée séparément.

b. Examen direct
Il se fait après dilacération de quelques fragments du matériel prélevé dans une
goutte de potasse suivie d’une fixation (un léger chauffage au bec bunsen).
Examiner au microscope à l’objectif * 40

54
L’utilisation de la potasse et le chauffage au bec bunsen sont nécessaires pour
éclaircir les cheveux et ramollir les squames
 Cheveux: L’envahissement du champignon permettra de préciser le
parasitisme pilaire. On distingue ainsi :

 Ongles ou peau : L’examen direct montre :

Des filaments mycéliens de 3 à 4 µm, cloisonnés et ramifiés (ongles dures
secs) « Dermatophytes ».

Présence de levures (en général ongle muqueux humide) « Levures »

c. La mise en culture
Culture sur :
- 2 tubes SAC (Sabouraud – Chloramphénicol - Acitidione)  pour les
cheveux
- 2 tubes SAC + 1 tube SG (Sabouraud-Gentamicine)  pour les Ongles
Incubation à l’étuve à 27 °C (SAC) et à 37°C (SG)
Lire les cultures tous les 3 jours (car la vitesse de pousse est un critère de
classification).
21 jours sont nécessaires pour rendre un résultat négatif.

d. Identification :
 Pour les dermatophytes
L’identification est basée sur :
- La vitesse de pousse
- Les caractères macroscopiques (recto et verso des colonies)
- Les caractères microscopiques (ornementation, macroconidies,
microconidies)

55
 Caractères
Vitesse de
Dermatophytes macroscopiques Caractères microscopiques
pousse
(aspect des colonies)
Duveteuses, Microconidies piriformes
Microsporum Très rapide blanches, aspect Macroconidies en
canis (4 à 6 j) étoilé, pigment jaune ‘’quenouille’’
orangé au verso Mycélium en raquettes
Trichophyton Lent Petites, bombées,
Filaments toruloides
violaceum (10 à 15 j) glabres, violettes

Microconidies piriformes,
Duveteuses, blanc-
Rapide disposés en alcadium
Trichophyton crème ou violacées,
(6 à 7 Macroconidies rares, lisses
rubrum verso incolore, rouge
jours) et allongées
ou jaune
Organes triangulaires

56
  Pour les levures : L’identification est basée sur :
 L’examen macroscopique des cultures : colonies blanches muqueuses lisse
et humide
 L’examen microscopique des cultures : levures bourgeonnantes
 Etude des caractères physiologiques et biochimiques :
o Test de blastèse ou test de filamentation :
Il s’agit d’incuber une colonie de levure dans 0.5 ml de sérum humain pendant 2
à 4 heures à 37°C.
 Seule l’espèce Candida albicans forme un tube germinatif : filament plus ou
moins longs flexueux et septés dont la base ne présente aucun étranglement

57
Figure N° 7: Aspect en doigt de gant du tube germinatif de Candida
albicans

58
Les cas
cliniques

59
 Cas Clinique n°1
Analyse toxicologique post-
mortem

I. Présentation du cas
Mr B.M, âgé de 35 ans et originaire de Sidi-Bouzid a été retrouvé mort le 03
septembre 2017 , par des passagers, à coté de la rue en position de décubitus
ventral.

L'autopsie a été réalisée le 04 septembre 2017 et une enquête a été menée par
l'équipe des recherches judiciaires de la garde nationale de Sidi-Bouzid.

Des échantillons gastrique et sanguin ont été prélevés et remis le 08 Novembre

2017 au laboratoire et une recherche de toxiques et une détermination de
l'alcoolémie ont été demandées.

Les analyses à effectuer au niveau du contenu gastrique étaient la recherche

générale de toxiques: recherche des benzodiazépines, des pesticides
organophosphorés, des carbamates pesticides et médicaments, des
organochlorés, des salicylés, des antidépresseurs tricycliques, des
phénothiazines et du trihexyphénydile. Au niveau de l'échantillon sanguin,
l'alcoolémie était à déterminer

II. Matériel et méthode d'analyse

1. Détermination de l'alcoolémie par la méthode de
Cordebard

C'est l'une des méthodes officielles selon la législation tunisienne pour le dosage
de l'alcool.

60
Dans un ballon jaugé, introduire 10 ml de l'échantillon sanguin du défunt
prélevé en post-mortem et ajouter 65 ml d'acide picrique. Porter à ébullition sur
le chauffe-ballon. Le distillat a été recueilli dans un bécher mis dans un récipient
contenant du glaçon pour éviter l'évaporation de l'alcool.

réfigérant à sortie entrée

serpentin d'eau d'eau

ballon
jaugé

chauffe glaçon
ballon
Figure 1 DISPOSITIF DE DISTILLATION PAR LA METHODE DE CORDEBARD

Une fois la distillation terminée, récupérer le distillat dans une fiole jaugée de 50
ml et compléter avec de l'eau distillée jusqu'au trait de jauge si le distillat est
inférieure à 50 ml.

Mesurer dans un erlenmeyer 5 ml de distillat auquel sont ajoutés 20 ml de

solution nitrochromique (préparée au laboratoire avec de l'acide nitrique pur et
du dichromate de potassium sous hotte)

Dans un autre erlenmeyer, opérer parallèlement et de façon identique sur un

témoin blanc ( remplacement du distillat par de l'eau distillé) constitué par un
volume de solution nitrochromique égal à celui utilisé pour le distillat et laisser
les 2 mélanges incuber pendant 20 minutes. Pendant ce temps là, l'alcool va
s'oxyder en acide acétique.

Ajouter 100 ml d'eau distillée après la fin des 20 minutes et une quantité
suffisante d'iodure de potassium (50 ml KI 10% ) et doser l'iode libéré par une
solution de thiosulfate de sodium ( Na2S2O3 0.05N ) jusqu’à disparition de la
coloration jaune et virage au bleu.
61
Noter les volumes ajoutés pour le témoin blanc (VB) et pour l'essai (VE)

Essai Blanc
(100 ml d'eau
distillé)
Distillat 5 ml

Solution 20 ml 20 ml
nitrochromique
Incubation 20
minutes
Eau distillé 100 ml 100 ml

Iodure de potassium 50 ml 50 ml

Thiosulfate de VE VB
sodium

L'alcoolémie a été calculée en appliquant la formule suivante :

A= 115 x (VB – VE) / (VB x Prise d’essai du sang) = 2.11 g/L

Le taux d’alcool dans le sang chez le décédé est élevé

62
 2. Recherche générale de toxiques

 Les toxiques  Les toxiques

acides : basiques :
- Organo-chlorés - Phénothiazines
- Chloralose - Benzodiazépines
- Salicylés - Amitryptilline
- Carbamates - Trihéxiphénydile
pesticides (Lannate) - Carbamates
- Organophosphorés médicaments
(méprobamate)

2.1. Recherche des toxiques acides

 Extraction acide
Dans un tube à essai, prendre 2 ml d’essai de l’échantillon ( urine ou liquide
gastrique) puis ajouter 0.5ml HCl concentré et compléter avec l'éther sulfurique.
Agiter par retournement (100x) puis récupérer la phase éthérée dans un autre
tube et évaporer à sec dans le bain marie. Reprendre le résidu sec avec quelques
gouttes d'éther et vortexer.

63
 2.2. Recherche des toxiques basiques
 Extraction basique
Procéder de la même manière que l'extraction acide en ajoutant l'hydroxyde de
sodium concentré (NaOH) à la place de l'acide chlorhydrique concentré.

Identification par chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince est une technique de chromatographie
couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d’analyse ou de
purification.

Elle comprend une phase stationnaire (gel de silice) déposée sur une plaque
rectangulaire en verre et une phase mobile (éluant) qui est un mélange de
solvants qui va entraîner les composés à séparer le long de la phase stationnaire
Le résidu sec a été repris par 0.1ml d’éther et porté sur plaque en gel de silice et
laissé migrer dans les solvants appropriés. Pour terminer, la révélation a été
effectuée par la pulvérisation du réactif correspondant à chaque toxique .

Bain de solvants et révélation

Comme solvants, un bain standard a été employé pour les phénothiazines,
l'amytriptiline et le trihéxyphénidyle constitué par l'éthyl acétate, le méthanol
et l'ammoniaque. Et la révélation a été réalisée par l’iodoplatinate de Potassium
pour l'amytriptiline et le trihéxyphénidyle et par l'acide perchlorique pour les
phénothiazines.
 pas de formation de spot correspondant au même Rf que celui du témoin
des phénothiazines et de l'amytriptiline
 Pas de formation d'une tâche violette correspondante au même Rf que
celle du témoin du trihéxyphenidyle
Le bain pour les carbamates médicaments (méprobamate) qui a été utilisé est
constitué du chloroforme et l'acétone et la révélation a été réalisée par le furfural
puis H2SO4 au 1/10ème dans l'acétone (sous la hotte).
 Pas de formation d'une tâche brune correspondante au même Rf que celle
du témoin des carbamates
64
Le bain barbiturique a été utilisé pour les carbamates pesticides et la révélation
a été réalisée par le diphénylcarbazone dans le chlorure mercurique/éthanol.
 pas de formation de spot correspondant au même Rf que celui du témoin
des carbamates pesticides ( le lannate)
Le bain pour les pesticides organo-phosphorés qui a été utilisé était constitué
par l'hexane et l'éthyle acétate et la révélation a été réalisée avec le PdCl 2.
 pas de formation de spot correspondant au même Rf que celui du témoin
des organo-phosphorés ( le parathion)

 Recherche négative: pas de formation de tâches ou de spots

correspondants au même Rf que celui des témoins des
toxiques analysés

3. Recherche de benzodiazépines:

Effectuer une hydrolyse acide préalable du liquide gastrique en mesurant dans

un tube à essai 5 ml de liquide gastrique et ajoutant 1 ml d'acide chlorhydrique
concentrée, puis porter le mélange au bain marie pendant 30 minutes.

Laisser refroidir puis réaliser une extraction basique en ajoutant l'hydroxyde de

sodium NaOH ( les benzodiazépines sont des toxiques basiques) ainsi qu'une
solution d'extraction pour les benzodiazépines ( constituée par l'hexane, le
dichlorométhane et le propanol). Agiter le mélange par retournement ( jusqu'à
100 fois) et récupèrer la phase supérieure puis évaporer au bain marie.

Reprendre l'extrait sec par quelques gouttes d'éther diéthylique et réaliser le

dépôt sur la plaque de couche mince.

Sur la plaque de couche mince, le dépôt de l’extrait alcalin et le dépôt du témoin

de benzodiazépine ont été réalisés ( le tranxène a été utilisé comme témoin)

Laisser la plaque éluer dans un bain de solvants conçu pour les benzodiazépines
( constitué par le toluène et l'acétone) puis retirer la plaque après migration à 0,5
cm du front du solvant et laisser sécher à l'air libre.

65
Comme dernière étape , effectuer la révélation des tâches migrées sur la plaque
comme suit:

 Sous une lampe ultra violette, placer la plaque et observer les

tâches.
 Révélation positive aux benzodiazépines: formation d'un
spot correspondant à une tâche au même Rf que celui du
témoin
 Par vaporisation de réactifs en 3 étapes :
=> Vaporiser légèrement NaNO2 dans l'acide acétique ( CH3COOH à 20% )
=> Vaporiser légèrement le réactif F.N.P

=> Vaporiser abondamment le chlorhydrate de N1-naphtyl-éthylène-diamine

dans l'eau distillée

Il faut s'assurer du séchage de la plaque entre chaque vaporisation.

 Révélation positive: apparition d'une tâche violette

correspondante au même Rf que celle du témoin indiquant la
présence de benzodiazépines.
III. Conclusion:
Les analyses toxicologiques effectuées sur les prélèvements au nom du décédé
B.M ont révélé un taux d'alcool sanguin élevé et la présence de benzodiazépines
au niveau du contenu gastrique. Par conséquent, nous pouvons déduire qu'une
co-intoxication suite à l'absorption d'alcool et de benzodiazépines est à évoquer
tenant compte que l'association <<alcool-benzodiazépines>> constitue
un cocktail toxique pouvant entrainer la mort.

Superviseur Signature Date

66
 Cas clinique n°2 :
Infection vaginale
(Vaginite à SGB)
I. Présentation du cas
 Nom et prénom : K.M
 Sexe : Féminin
 Age : 33 ans
 Service: Office national de la famille et de la population (ONFP)
 Date du prélèvement: 08/05/2018
 Examen demandé : Prélèvement Vaginal (P.V)
 Renseignements cliniques
La patiente, âgée de 33 ans se plaint de pertes blanchâtres avec notion de prurit
et d'odeur désagréable. Après la réception de son prélèvement vaginal le
08/05/2018, un interrogatoire a permis de confirmer qu'elle n'est pas enceinte et
qu'elle n'est sous traitement.

II. Prélèvement

Le prélèvement a été pratiqué par la sage-femme après pose d’un spéculum à

l’aide d’un écouvillon stérile fait en dehors de toute hygiène intime et de toute
antibiothérapie avec acheminement rapide au laboratoire.

67
 III. Diagnostic biologique
1er jour
Une suspension a été préparée à partir de l’écouvillon : l’écouvillon a été
déchargé dans un tube à hémolyse contenant une quantité de 2mL d’eau
physiologique stérile.
 Examen direct
L’examen direct au grossissement x40 entre lame et lamelle a montré :
- Nombreux leucocytes
- Rares hématies
- Quelques cellules épithéliales
 Culture
La culture consiste à ensemencer des milieux de culture avec la suspension déjà
préparée.
Les milieux utilisés sont :
- Gélose au sang
Incubation à 37 °C pendant 48 h
- Gélose au sang cuit dans un milieu riche en CO2
- Gélose au sang cuit + VCN

- Milieu Sabouraud Incubation à 37 °C pendant 48 h

 La coloration de Gram :

L’observation de la lame à l’immersion (x100) montre la présence de cocci

Gram + en chaînettes

- Présence de lactobacilles ( 30) : 0

- Absence de Mobiluncus : 0 Score de Nugent = 0
- Absence de Gardnerella et Bacteroides : 0

Flore vaginale normale

dominée par les lactobacilles 68
Le deuxième jour

 Lecture

Figure 2 Gélose au Sang

Gélose au Sang : présence de petites colonies grisâtres de 0,5mm,

transparentes β-hémolytiques en culture de moyenne abondance

Figure 3 Gélose au sang cuit

Gélose au sang cuit : présence de petites colonies transparentes.

69
 Figure 4 Gélose au sang cuit +VCN

Gélose au sang cuit +VCN : Pas de colonies donc absence de Gonocoque.

Figure 5 Milieu Sabouraud

Milieu Sabouraud : Pas de colonies donc absence de levures.

Conduite à tenir

 Réalisation d'un ré-isolement par ensemencement des petites colonies β-

hémolytiques sur une gélose au sang.
 Test à la catalase
Sur une lame, on mélange une goutte de H2O2 avec une colonie et on observe
s’il y a un dégagement gazeux

Pas de dégagement gazeux, donc Catalase(-)

70
  La coloration de Gram a montré des cocci Gram + avec un test de

catalase negatif, ces données nous orientent vers la famille des

Streptococcacae.
 Différenciation de streptocoques des entérocoques par ensemencement sur
un milieu bile-esculine et sur un milieu hypersalé ou bouillon hostile.
 Milieu bile-esculine

Principe : L’hydrolyse de l’esculine (hétéroside), catalysée par une β-glucosidase

l’esculinase, libère du glucose et l’aglycone : l’esculétine. Cette dernière réagit
avec les ions de Fer III ou les ions du Thallium pour former un précipité noir dans
le milieu
 Bouillon hostile

Principe : la croissance des entérocoques est favorisée par les substances

nutritives apportées par l’extrait de viande, la peptone et la tryptose. Le milieu
est rendu inhibiteur vis-à-vis des bactéries par une très forte concentration en sel
(bouillon hostile)
Le troisième jour
 Identification de la bactérie

Figure 6 Ré-isolement sur gélose au sang

71
Milieu Bile - Esculine: Pas de précipité noir dans le culot Esculinase (-)
Bouillon hostile: Clair Négatif

Il s’agit donc du genre

Streptococcus

 Séro-groupage : test d’agglutination sur latex

- Prélever quelques colonies et les émulsionner dans l’enzyme d’extraction avec
une anse stérile
- Incuber 10 minutes à 37°C puis retirer les tubes et les laisser refroidir à
température ambiante.
- Déposer une goutte de chaque réactif au latex sur les cercles de la carte
- Ajouter une goutte de l’extrait sur chacun des six cercles avec une pipette
Pasteur.
-Imprimer un mouvement de rotation douce à la carte.

 Réaction positive : Agglutination qui apparait au bout de 30 secondes

 Réaction négative : Suspension homogène

72
 Agglutination au niveau du latex B :
Il s’agit d’un Streptocoque de groupe B

 Antibiogramme
Préparer une suspension bactérienne dans 10mL d’eau distillée stérile calibrée à
0,5 Mac Farland. Ensemencer sur 3 géloses Mueller Hinton au sang à l’aide
d’un écouvillon et placer les disques d’ATB sur la gélose à l’aide d’un
distributeur
Incubation à 37°C pendant 24
Le quatrième jour
 Interprétation des résultats de l’antibiogramme

73
 Diamètre Diamètre
Famille Antibiotique testé Interprétation
(mm) critique (mm)
Pénicillines Pénicilline G (PNG) 24 18 S

Carbapénèmes Imipénème (IPM) 34 18-21 S

Streptomycine
15 19 HNR
(HLS) (300µg)
Aminosides
Gentamicine(GEN)
20 7-11 BNR
(500µg)
Tigécycline (TGC) 25 16-19 S
Cyclines
Tétracycline (TET) 13 20-23 R
Erythromycine
28 18-21 S
(ERY)
Macrolides Lincomycine (LCN) 30 18-21 S
Pristinamycine
29 19-22 S
(PTN)
Norfloxacine
22 12 S
(NXN)
Quinolones
Ciprofloxacine
24 19-22 S
(CIP)
Vancomycine
16 13 S
Glycopeptides (VAN)
Teicoplanine (TEC) 19 15 S
Chloramphénicol
Phénicolés 27 19 S
(CHL)
Cotrimoxazole
24 13-16 S
Autres (SXT)
antibiotiques Rifampicine (RIF) 26 15-21 S
Linézolide (LNZ) 23 16-19 S

S: Sensible ; R: Résistant ; BNR: Bas niveau de résistance ; HNR: Haut niveau de

résistance

74
 La bactérie est sensible à la majorité des antibiotiques testés. Elle présente
un bas niveau de résistance à la gentamicine (Il s’agit d’une résistance
naturelle de bas niveau), un haut niveau de résistance au streptomycine et
une résistance aux macrolides et aux cyclines(Tétracycline)

 Interprétation du cas

Il s’agit d’une vaginite à Streptocoque du groupe B, sensible à la majorité des

ATB et présentant une résistance acquise aux tétracyclines.

Superviseur Signature Date

75
 Cas clinique n°3 :
Examen cytobactériologique des
urines
I. Présentation du cas :
 Nom: H.H
 Sexe : féminin
 Service : service des maladies infectieuses à l’hôpital Hedi Chaker
 Date du prélèvement : 19/05/2018
 Examen demandé : ECBU (examen cytobactériologique des urines)

II. Prélèvement :
Le prélèvement a été fait le matin au laboratoire, après avoir nettoyé le méat
urinaire avec du dakin. Après avoir éliminé le 1er jet , les urines sont recueillies
dans un flacon stérile.

1er jour

1) L'aspect macroscopique de l'urine: Légèrement trouble (LT)

2) La culture:
-Gélose ordinaire: C'est un milieu qui permet la culture des bactéries peu
exigeantes et permettant une numération des colonies.
A l'aide d'une anse calibrée, réaliser une strie centrale verticale puis des stries
serrées horizontales tout au long de la boite de pétri.
-Milieu BCP (gélose lactosée au pourpre de bromocrésol): C'est un milieu riche
en lactose. Une consommation de lactose par les colonies se traduit par un virage
de la couleur violette au jaune.
Ensemencer par la méthode des cadrans.

76
  Les 2 milieux de culture sont incubés dans une étuve à 37°C pendant 18 à
24h.
3) Examen microscopique :

A l'aide de la cellule de Malassez au grossissement *40 permettant de voir la

cytologie urinaire : numération des leucocytes et des hématies, appréciation semi
quantitative des cellules épithéliales et recherche de levures et de cristaux.

-Leucocytes: Innombrables

- Hématies: 5. 104 /ml

-Absence de cellules épithéliales, de levures et de cristaux.

 Leucocyturie > 104/ml témoigne d’un processus inflammatoire qui peut être
en faveur d’une infection urinaire

2ème jour

1) Lecture des résultats :

Culture bactérienne positive sur les 2 milieux

-Gélose ordinaire : DGU  105 UFC/ mL , culture pure.

77
-Gélose BCP :Développement de grandes colonies muqueuses.

Virage de la couleur du milieu BCP du violet vers le jaune : donc il y avait une
consommation du lactose par les bactéries: Lactose +

2) Coloration Gram : Bacilles à Gram négatif

3) Recherche de l’oxydase : oxydase négative
 Ces données sont en faveur d’une bactérie appartenant à la famille des
Entérobacteriaceae
4) Identification d’espèce : Galerie Api 10S et réalisation d'un antibiogramme
sur le milieu Mueller Hinton

5)Antibiogramme:

Etude de la sensibilité de la souche aux antibiotiques

A l'aide d'un densimat, préparer une suspension bactérienne 0,5 Mac Farland dans
du sérum physiologique

Ensemencer sur 2 boites de gélose Mueller Hinton à l’aide d’un écouvillon stérile.

Poser les disques d’antibiotiques à l’aide d’un distributeur.

Incuber à 37°C pendant 24h.

78
3ème Jour:
1) Lecture des résultats :
a) Lecture de l’Api10

ONPG (+), GLU (+), ARA(+) = 7

LDC (+), ODC(-), CIT (-) = 1 Le score de l'Api 10S est 7105. Il s'agit de Escherichia Coli
H2S (-), URE (-), TDA (-) = 0
IND (+), OX (-), NO2 (+) = 5

b) Résultat et interprétation de l’antibiogramme :

Mesure des diamètres d’inhibition et comparaison avec les diamètres critiques.

79
 Diamètre
Familles Antibiotique testé Diamètre critique Interprétation
(mm) (mm)
Pénicillines -Ampicilline (AMP) 0 14 R
Bêta- lctamines

-Amoxicilline + Acide 19 19 S
Clavulanique (AMC)
-Ticarcilline (TIC) 0 23 R
- Ticarcilline+ 25 23 S
Ac.Clavulanique(TCC)

-Pipéracilline (PIL) 15 17-20 R

-Pipéracilline+Tazobactam(PTZ) 25 17-20 S

Céphalosporines -Céfixime( FIX) 29 17 S

-Céfoxitine (FOX) 28 19 S
-Ceftazidime (CZD) 30 19-22 S
-Cefepime ( FEP) 33 21-24 S
-Cefalexine (CXN) 18 14 S
-cefotaxime (COX) 30 17-20 S
Carbapénèmes Imipénème ( IPM) 30 16-22 S
Ertapénème (ETP) 34 22-25 S

Aminosides -Gentamicine10 (GMN10) 18 14-17 S

-Tobramycine (TMN) 17 14-17 S
-Amikacine (AKN) 21 13-16 S

80
 -Netilmicine ( NTM) 18 12-15 S
Quinolones -Ac. Nalidixique ( NAL) 23 14-19 S
-Norfloxacine (NXN) 30 19-22 S
-Ciprofloxacine (CIP) 30 19-22 S

Divers -fosfomycine ( FOS) 34 13-16 S

-Nitrofurane ( NFE) 25 11 S
-Cotrimoxazole ( SXT) 0 13-16 R

 L’interprétation de l’antibiogramme a été faite selon les recommandations

du CASFM\EUCAST 2017

→ Il s’agit d’une infection urinaire à Escherichia Coli, sécrétrice de

pénicillinase de bas niveau; présentant une résistance acquise aux antibiotiques
suivants : Ampicilline, Amoxicilline, Ticarcilline et une résistance acquise au
cotrimoxazole.

Superviseur Signature Date

81
 Cas Clinique n°4 :
Tuberculose pulmonaire
I. Présentation du malade :
Nom et Prénom : B.S.A

Sexe: Masculin

Age : 23

Origine: Ketatna- Sfax

Service : pneumologie

Date de prélèvement : 06/03/2018

Renseignements cliniques :

 Altération de l'état générale

 Radio thorax douteuse avec présence d'excavations et de micronodules
bilatéraux

II. Manipulation et interprétation :

1) Prélèvement
- Les prélèvements privilégiés pour la tuberculose pulmonaire sont les crachats
qui sont émis spontanément après un effort de toux et de préférence le matin au
réveil.

- Le prélèvement est réalisé pendant 2 jours consécutifs ( pour augmenter la

chance de présence de bacilles de Koch étant donné que leurs émission est
intermittente) dans des flacons stériles à fermeture étanche et à large ouverture
afin d'éviter les contaminations par les bords extérieurs.

- Aspect macroscopique du crachat : mucopurulent

Examen direct : coloration de Ziehl Neelson

 Réalisation du frottis
82
- Etalement d’une parcelle de crachat sur une lame

- Fixation par séchage à l’air libre

- Fixation du frottis en passant la lame sur la flamme du bec bunsen

 Coloration de Ziehl-Neelson

- Recouvrir les frottis par la fushsine phéniquée

- Chauffer doucement jusqu'à émission de vapeur (on évite l'ébullition) puis
laver à l'eau
- Mettre les lames dans un mélange alcool-acide pendant trois minutes et laver à
l'eau pour décolorer
- Colorer avec le bleu de méthylène pendant une minute, laver à l'eau et laisser
sécher ( contre coloration)

 Lecture
- Bacilloscopie : lecture des lames au grossissement (x100) en utilisant l'huile à
immersion

- La lecture des frottis au Ziehl Neelson permet la recherche de bacilles acido

alcoolo résistants (BAAR) qui apparaissent colorés en rose sur un fond bleu. Il
s'agit de bacilles fins légèrement incurvés.

→ Présence de Bacilles acido-alcoolo-résistant (BAAR) fins et colorés en rose

sur un fond bleu.

83
→ Nombre de BAAR de 1 à 10 BAAR/champ. Selon l’échelle de Ridley :

Prélèvement Nombre de croix

1er prélèvement ++
2ème prélèvement ++

Examen direct positif à deux croix

Culture
o Décontamination à la soude : méthode de Pétroff :

• Ajouter au crachat 2 fois son volume de soude 4 %

• agiter vigoureusement

• Incuber pendant 15 min

• Centrifugation : 3000 tours/ min pendant 15 minutes

o Neutralisation de l’effet de la soude par addition de 15 ml d’eau distillée

stérile
o Centrifugation : 3000 tours/ min pendant 15 minutes
o Décanter le surnageant et ramener le culot en suspension
o Culture sur milieu Lowenstein Jensen (LJ) : 2 tubes
o Incubation à 37°C et lecture hebdomadaire jusqu’à 2 mois

o Culture négative: Attendre 60 jours d’incubation avant de déclarer la

culture négative
o Culture positive: A partir de 18 jours et jusqu’à 60 jours, on observe à l’œil
nu des colonies à la surface du milieu de Lowenstein Jensen.

 La culture s’est positivée le 26/03/2018 à J21 avec apparition d’une

dizaine de colonies : entre 10 et 100 colonies sur les 2 tubes de LJ.

Milieu LJ
(Lowenstein Jensen)
préparé

84
 Apparition de colonies beiges épaisses
et rugueuses, en choux fleur sur les
tubes de culture

Identification

L’identification est assurée par 4 tubes :

 Lumière (L) : aspect des colonies à la lumière
 Obscurité (O) : tube enveloppé par du papier kraft, pour rechercher une
éventuelle pigmentation à l’obscurité
 Acide thiophène 2 carboxylique (TCH) : -M. tuberculosis est résistant
- M. bovis est sensible
 Hydroxylamine (H) : seules les mycobactéries atypiques poussent sur ce
milieu.

 L’identification de l’espèce est assurée par 2 tests biochimiques

 Recherche de la niacine
La réaction est positive s’il y a virage vers le jaune
 Recherche de nitrate réductase
La réaction est positive s’il y a virage vers le rouge brique

85
 Date 11-04-2018 26-04-2018 11-05-2018
Lumière ∞ ∞ ∞
Obscurité ∞ ∞ ∞
TCH ∞ ∞ ∞
H 0 0 0
Niacine +
Nitrate +

Il s’agit de Mycobacterium tuberculosis.

Antibiogramme : Méthode des proportions

*Les antibiotiques testés sont les antibiotiques de 1ère intention : Streptomycine
(S), Isoniazide (I), Rifampicine (R), Ethambutol (E)
*L’antibiotique est ajouté dans le milieu de culture lors de la préparation des
milieux.
*L’antibiogramme est réalisé à partir de 2 dilutions : 10-2et 10-4
*La lecture des cultures de l’antibiogramme a été faite tous les 15 jours pendant
45 jours.

86
 Date 11-04-2018 26-04-2018 11-05-2018
10-2 10-4 10-2 10-4 10-2
10-4
Sans ATB ∞ 2 ∞ 15 ∞ 30
(tube témoin (Nombre colonies colonies colonies
contenant les
infini de
bactéries
colonies)
uniquement)
Streptomycine 0(absence) 0 0 0 0 0
Isoniazide 0 0 0 0 0 0
Rifampicine 0 0 0 0 0 0
Ethambutol 0 0 0 0 0 0

Il s’agit d’un Mycobacterium tuberculosis

sensible à tous les antituberculeux testés.

III. Traitement :
H : Isoniaside 4-5 mg/kg

R : Rifampicine 10 mg/kg 2 mois HRZE / 4 mois HR

Z : Pyrazinamide 20-30 mg/kg

E: Ethambutol 15-20 mg/kg

IV. Conclusion:
Il s’agit d’une tuberculose pulmonaire à Mycobacterium tuberculosis qui est
sensible à tous les antituberculeux testés

Date Superviseur Date

87
 Cas clinique n°5:
Examen mycologique des ongles
du pied: Onychomycose
I. Présentation du cas:
Une patiente H.B a consulté le 03/05/2018 chez un médecin généraliste pour des
douleurs au niveau du gros orteil. Elle a été adressée le même jour au laboratoire
régional de Sfax par son médecin pour un prélèvement mycologique des orteils

II. Examen macroscopique

L'ongle suspecté avait un aspect décollé avec une surface effritée et avec un
changement de couleur qui est devenu jaunâtre. Cet aspect présente les premiers
signes de l'onychomycose.

1) Prélèvement

Le prélèvement a été fait en coupant la partie supérieure du gros orteil avec un

coupe-ongle puis en raclant la surface interne de l’ongle atteint avec une lame
bistouri (aspect poudreux) dans une boîte de pétri stérile.

88
 2) Examen direct
L'examen direct a été réalisé après dilacération de quelques fragments du
matériel prélevé dans une goutte de potasse (KOH 30 %) suivie d’une fixation
par un léger chauffage au bec bunsen.
Examiner au microscope à l’objectif * 40 à la recherche de filaments mycéliens
caractéristiques des dermatophytes ou des levures.
L’utilisation de la potasse et le chauffage au bec bunsen sont nécessaires pour
leurs rôle éclaircissant afin de faciliter l'examen microscopique.

 Examen directe positif: Présence de filaments mycéliens

Filaments
mycéliens

3) La mise en culture
Ensemencer les milieux suivants en une zone stérile (à proximité du bec
bunsen):

89
  2 tubes contenant le milieu SAC (Sabouraud Actidione
Chloramphénicol) : C'est un milieu qui permet de cultiver les
dermatophytes.
 Un tube contenant le milieu SG (Sabouraud Gentamicine): C'est un
milieu qui permet de cultiver les levures ou les dermatophytes.
Incuber les 2 milieux SAC à l'étuve à 27°C et le milieu SG à 37°C.
Lecture tous les 3 jours jusqu'à 21 jours sont nécessaires pour rendre un résultat
négatif.

4) Interprétation des résultats

La culture sur le milieu SAC s'est positivée au 6ème jour pour les 2 tubes
ensemencés.
L'aspect des colonies était duveteux de couleur blanc-crème au recto et rouge
brun au verso des tubes.

On a examiné ensuite les colonies au microscope en utilisant la technique de

drapeau:
 Utiliser du Scotch transparent. Découper de façon à avoir une largeur
inférieure au diamètre de l’orifice du tube, et la
faire adhérer à l’extrémité d’une anse.
Appuyer fermement la face adhésive sur la
face de la colonie à étudier

90
  Placer le morceau de scotch dans une goutte de bleu de coton
préalablement déposé sur une lame porte objet, face collante contre la
lame
 Déposer une nouvelle goutte sur le scotch et recouvrir d’une lamelle
 Observer au microscope au grossissement x10 puis x40

Résultat

Présence de micro-conidies inconstantes, piriformes disposées en acladium.

 Il s'agit d'une dermatophytose à Trichophyton Rubrum

Le milieu SG était négatif après 21 jours de culture Absence de levures

III. Conclusion
La patiente H.B souffre d'une onychomycose du gros orteil à dermatophytes:
Trichophyton Rubrum qui nécessite un traitement adéquat.

Date Superviseur Date

91