Stage de perfectionnement

LICENCE APPLIQUEE EN GENIE DES PROCEDES

PARCOURS : AGROALIMENTAIRE

Travail réalisé au sein de :

Laboratoire Régional de la Santé Publique de Nabeul

LRSPN

Durée du stage : de 15Janvier jusqu’à 09 Février

Réalisée par : Boumaiza Hazem

Encadré (e) par : Mme SiwarNsaibia

Année universitaire : 2020/2021

 Remerciement
J’ai l’honneur d’exprimer ma gratitude et mes vifs remerciements à madame SiwarNsaibia
mon encadreur et tous les techniciens de LRSP , Souad Boukhdir , Monsieur Anouar ,
Monsieur Chaaben et Madame Rawdha qui m’ont permis de développer mes connaissances
dans le domaine agroalimentaire et pour les précieuses orientations et recommandations qu’ils
m’ont bien voulu fournir lors du déroulement du stage.

Mes Remerciements vont également à l’adresse de tous les personnels du LRSP pour la
confiance qu’ils m’ont accordé en mettant à ma disposition leurs compétences et leurs
documentations et m’ont montré les points les plus intéressants de cette étude afin d’en
profiter au maximum.
 Sommaire
Introduction Générale....................................................................................................................1

Chapitre 1 : Présentation du laboratoire.....................................................................................2

I. Généralités..................................................................................................................................2
II. Carte d’identité...........................................................................................................................2
III. Plan du laboratoire.................................................................................................................3
IV. Hygiène et sécurité.................................................................................................................3
V. Le principe de la marche en avant..............................................................................................4
Chapitre 2 : Unité de préparation des milieux de culture..........................................................5

I. Introduction.............................................................................................................................5

II. Equipements nécessaires...........................................................................................................5

III. Techniques de préparation des milieux de culture................................................................5
1. Contrôle de la quantité de l’eau distillée................................................................................5
2. Les étapes de la fabrication d’un milieu de culture................................................................6
3. Stérilisation.............................................................................................................................6
4. Identification et stockage du milieu........................................................................................7
IV. Quelques exemples de milieux de culture à préparer............................................................8
1. Milieu de PCA.........................................................................................................................8
2. Milieu TSI................................................................................................................................8
3. Bouillon cœur cervelle............................................................................................................8
Chapitre 3 : Unité d’analyse microbiologique des denrées alimentaires..................................9

I. Introduction................................................................................................................................9
II. Matériels utilisés........................................................................................................................9
III. Nature des échantillons et analyses effectuées....................................................................10
IV. Techniqu1e d’analyses..........................................................................................................10
1. Pesage et préparation de la suspension mère......................................................................10
2. Dilution.................................................................................................................................11
3. L’ensemencement................................................................................................................11
4. Incubation 37 ºC pendant 24 heurs......................................................................................12
5. Comptage des colonies.........................................................................................................12
V. Exemples des germes recherchés dans les denrées alimentaires............................................12
1. Recherche de Salmonelle.....................................................................................................12
Chapitre 4 : Etude de cas d’hygiènes hospitalières..................................................................14

I. Introduction..............................................................................................................................14
II. Préparation les boites de prélèvements...................................................................................14
III. Milieux utilisés pour les analyses..........................................................................................14
1. Milieu Chapman...................................................................................................................14
2. Milieu Drigalski.....................................................................................................................15
3. Milieu ADN...........................................................................................................................15
4. Milieu PCA ou GNG...............................................................................................................15
5. Milieu TSI..............................................................................................................................16
6. Milieu cœur cervelle.............................................................................................................16
IV. Mode opératoire..................................................................................................................17
1) Réception des échantillons...................................................................................................17
2) Comptages des colonies.......................................................................................................18
3) Vérifications sur les deux milieux Chapman et Drigaski........................................................18
4) Les tests effectue pour les cocci gram +...............................................................................19
5) Les tests effectué de bacille gram -.....................................................................................27
b) Test Kligler-Hajna................................................................................................................28
Tableau 8:Résultats du testKligler-Hajna.....................................................................................29
Pseudomonas luteola99.98...........................................................................................................30
Conclusion générale......................................................................................................................32
Liste de figures
Figure 1: Le laboratoire Régional de la Santé Publique..........................................................................2
Figure 2 : Stérilisation par autoclavage..................................................................................................7
Figure 3: Stérilisation par chaleur sèche.................................................................................................7
Figure 4 : Pesage de l'échantillon.........................................................................................................11
Figure 5 : Stomacher............................................................................................................................11
Figure 6 : Des anses pour l'étalement..................................................................................................12
Figure 7 : Milieu chapman....................................................................................................................14
Figure 8 : Milieu Drigalski.....................................................................................................................15
Figure 9 : Milieu ADN...........................................................................................................................15
Figure 10 : milieu PCA...........................................................................................................................16
Figure 11 : Milieu TSI............................................................................................................................16
Figure 12 : Bouillon coeur cervelle.......................................................................................................17
Figure 13 : boites de RODAC.................................................................................................................17
Figure 14 : Isolement sur le milieu Chapman.......................................................................................18
Figure 15 : Isolement sur le milieu Drigaski..........................................................................................19
Figure 16 : Test catalase.......................................................................................................................20
Figure 17 : Résultat test catalase..........................................................................................................21
Figure 18 : Test ADN.............................................................................................................................22
Figure 19 : Coagulation négative.........................................................................................................22
Figure 20 : Coagulation positive..........................................................................................................22
Figure 21 : Les caractéristiques de Staphylocoques Aureus................................................................24
Figure 22 : Boite d'air de moisissures...................................................................................................26
Figure 23 : Test oxydase.......................................................................................................................27
Figure 24 : Milieu TSI............................................................................................................................28
Figure 25 : Résultats des testesKliger-Hajna.........................................................................................29
Figure 26 : Remplissage l'Api par l'eau distillé......................................................................................30
Liste de tableaux
Tableau 2 : Identification les bactéries des l'échantillon.......................................................................10
Tableau 3 :Dénombrément des colonies...............................................................................................18
Tableau 4 : Résultats du test catalase....................................................................................................20
Tableau 5:Résultats de test catalase et coagulase.................................................................................23
Tableau 6: Caractères différentiels entre les espèces du genre staphylococcus....................................23
Tableau 7:Résultats du test oxydase.....................................................................................................28
Tableau 8:Résultats du testKligler-Hajna.............................................................................................29
Liste des abréviations
PCA Nature air
R Nature RODAC
E Nature empreinte ( méthode d’écouvillonnage )
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNase Désoxyribonucléase
PCA Plate Count Agar
GNG Gélose nutritive glucosé
GN Gélose Nutritive
TSI Triple SugarIron
RODAC Replicate Organism Direct Contact
UFC Unité Formant Colonie
API Analytic profile index
VRBL Milieu lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre
TSC tryptone Sulfite Cyclosérine
 Introduction Générale

Au cours de mes études universitaires, il y a trois stages obligatoire (initiation, technicien,

PFE) , dans ce cadre j’ai effectué mon deuxième stage technicien au sein de laboratoire
régional de santé publique de Nabeul durant un mois où j’ai pu m’intéresser à suivre les
procédures de travail.

La LRSPN est un laboratoire qui s’intéresse par les analyses des denrées alimentaire,
hygiène environnementaux, analyses des eaux de boisson et eaux usées et les hygiènes
hospitalière et dans ce stage de technicien j’ai vu la méthode de préparation des milieux de
culture, la microbiologie hospitalière, et j’ai été intéressée à la partie d’hygiène
environnementales ou j’ai effectué mon étude de cas .

Mon rapport se compose de 4 chapitres :

1
 Chapitre 1 : Présentation du laboratoire
I. Généralités 
Le laboratoire Régional de la Santé Publique (L.R.S.P) est un établissement étatique que
, le siège du laboratoire est fixé à Rue Bab Zaouïa Nabeul, la principale activité de ce
laboratoire c’est microbiologie clinique et contrôler d’hygiène enverimental , de denrée
alimentaire et analyse des eaux .

Figure 1: Le laboratoire Régional de la Santé Publique

Le L.R.S.P reçoit des prélèvements :
- SONEDE : Société Nationale d’exploitation et de Distribution des Eaux.
- SRHMPE : Service Régional de l’Hygiène de Milieu, et de Protection
l’Environnement.
- ANCSEP : Agence Nationale de Contrôle Sanitaire de l’Environnements et des
Produits .
- CS SB : Centre Sanitaire de Santé de Base .

II. Carte d’identité 

Nom : LRSP Nabeul
Désignation : Laboratoire Régional de la Santé Public de Nabeul
Tél.fax : 72 28 70 56
Superficie :450 m2
Date de création : Février 1981
Principal activités  :Microbiologie agro-alimentaire et microbiologie clinique

2
III. Plan du laboratoire 
Le laboratoire est constitué de deux étages :
- Ré de chaussée : analyse microbiologie clinique
- Premier étage : analyse microbiologie Agro- alimentaire
Le ré de chaussée comporte :
- Réception
- Coprologie
- Parasitologie
- Mycologie
- Les maladies sexuellement transmissibles
Le premier étage comporte :
- Unité de réception des produits soumis à l’analyse
- Unité de préparation des milieux de culture
- Unité d’analyse microbiologie des eaux
- Unité d’analyse microbiologie des denrées alimentaire
- Unité d’analyse microbiologie d’hygiène hospitalière.

IV. Hygiène et sécurité 

L’hygiène est un point critique , qui doit être bien maitrisé pour éviter tous les risques qui
peuvent agir sur la qualité des produits .
Chaque personnel du laboratoire doit respecter les bonnes pratiques pour assurer sa sécurité et
celle de ses collègues et du laboratoire :
- Porter une blouse destinée pour la microbiologie .
- Avoir les cheveux attachés et les ongles courtes .
- Il est strictement interdit de manger ou de fumer pendant les travaux pratiques.
- Eviter de parler pendant l’ensemencement
- Nettoyer et désinfecter paillasse et matériels après manipulation .
- Oter les bagues , les bracelets et les montres .

3
V. Le principe de la marche en avant 
Le principe de fondamental de la « marche en avant » est la séparation en 2 secteurs , un
secteur propre et un secteur souillé .
Les locaux ne doivent pas continuer, du fait de leur implantation , un risque d’insalubrité pour
les produits à analyser .
Ils doivent être munis d’un dispositif permettant leur protection contre toutes les souillures et
construit sans communication avec toutes sources d’insalubrité (toilette , poubelle…).
Les locaux et postes de travail doivent être disposés de façon à assurer une progression
continue des taches professionnelles.
L’acheminement des produits à analyser doit suivre un circuit distinct de celui des déchets et
des ordures, afin que le secteur propre et le secteur souillé ne se chevauchent pas.

4
 Chapitre 2 : Unité de préparation des milieux de culture

I. Introduction 
Un milieu de culture est un substrat nutritif d’une espèce bactérienne. Les milieux de
culture sont utilisés dans divers techniques bactériologiques telles que l’isolement,
l’identification , le dénombrement et la conservation des bactéries et des champignons
microscopiques . Ces milieux doivent se caractériser par certaines qualités pour assurer de
bonnes conditions pour la croissance des entités microbiennes et pour répondre aux
recherches destinées.

II. Equipements nécessaires 

- Balance étalonnée calibrée
- pH-mètre
- Spatules
- Eprouvettes graduées
- Bidons de 10 litres
- Bain marie
- Coton
- Distillateur
- Plaque chauffante
- autoclave

III. Techniques de préparation des milieux de culture 

1. Contrôle de la quantité de l’eau distillée 

L’eau à u utiliser pour la préparation est obtenue par la distillation , on met l’eau
distillée des bidons , avant de l’utiliser .Il faut que l’eau soit de bonne qualité :
- Le pH doit être compris entre 5 et 7,5 , si dépasse l’intervalle écrit sur la boite on fait
l’ajout du pH .
- La conductivité est < 1.25 us/cm ,

5
 - Contrôle de bactériophage c’est-à-dire la quantité des micro-organismes qui se trouve
dans l’eau < 100 bactéries . Elle est déterminée conformément à l’iso 6222 (avec
incubation à 22°C pendant 68 heurs) une fois par semaine.
Après l’étape du contrôle , le technicien enregistre les résultat du contrôle de l’eau sur le
formulaire d’enregistrement FE 4037 et consommée l’eau distillée dans un bidon de 10L.

2. Les étapes de la fabrication d’un milieu de culture 

La préparation constitue l’une des étapes fondamentales de l’analyse microbiologique .
Elle est nécessaire et se fait selon les étapes suivantes :
 Pesage de la quantité appropriée de la poudre déshydratée en utilisant la balance .
 Réhydratation :
Placer environ 1/3 du volume d’eau nécessaire .
Ajouter la poudre pesée
Homogénéiser.
Ajouter le reste de l’eau plus au moins tiède
 Procéder à un chauffage doux porter à l’ébullition si présence d’agar
Si le milieu contient de l’agar ,on chauffe jusqu’ à sans agitation pour permettre la
dissolution complet du milieu .
 Mesurage et ajustement d’ pH : avant et après stérilisation de sorte qu’après
stérilisation et refroidissement jusqu’à 25 ºC le milieu soit au pH demandé à +ou -0.2 .

3. Stérilisation 
La stérilisation est une étape destinée à détruire touts les micro-organismes , leur
principe est destructive des micro-organismes vivants .
Les types de la stérilisation la plus utilisé :

a) Stérilisation par chaleur humide = autoclavage 

Cette technique nécessite la présence d’un autoclave , c’est un appareil très performant
qui est indispensable de microbiologie. Elle consiste à faire bouillir de l’eau dans une enceinte
close pour augmenter la pression et par conséquent dépasser les 100 ºC d’ébullition .La
chaleur humide provoque la dénaturation des protéines des micro-organismes et donc la mort
de ces derniers .
ceci peut réalisé à 121 ºC pendant 15 min .

6
 Figure 2 : Stérilisation par autoclavage
b) Stérilisation par air sèche : T =180 ºC pendant 30 min
La chaleur sèche détruit les micro-organismes par déshydratation de leur cytoplasme . Le
stérilisateur à chaleur sèche est aussi appelé Four Pasteur .Une résistance chauffe une
enceinte dans laquelle la chaleur se réparti par convection .

Figure 3: Stérilisation par chaleur sèche

7
 c) Stérilisation par filtration équipement stérile

d) Stérilisation par flambage

e) Stérilisation par radiation UV

4. Identification et stockage du milieu

Après stérilisation, on procède à contrôler le pH du milieu, puis on ajoute les suppléments
nécessaire, et on l’identifie , l’identification des milieux se fait en motionnant  : code , le
nom , le date de préparation et d’expiration puis les stocker dans Les flacons et les tubes sont
conservés dans un réfrigérateur pendant trois mois à 5°C .

IV. Quelques exemples de milieux de culture à préparer 

1. Milieu de PCA 
On met en suspension 20,5 g du milieu déshydraté dans 1L d’eau distillée , puis on
porte à ébullition jusqu’à dissolution complète , après l’ébullition on réparti en flacons et on
passe à autoclavage 121ºC pendant 15 min puis refroidir à 47 ºC , enfin couler en boite de
Pétri .

2. Milieu TSI 
On met en suspension 58,0 g de milieu déshydraté dans 1 L d’eau distillée , on porte à
l’ébullition jusqu’à la dissolution totale , puis on réparti en tubes et stériliser à l’autoclave
pendant 15 minutes à 121 ºC , enfin incliner les tubes de manière à obtenir un culot de 3cm et
une pente oblique .

3. Bouillon cœur cervelle 

On met en suspension 23 g de milieu dans 1 L d’eau distillée , puis on fait bouillir
pendant 2 minutes et enfin réparti en tubes .

8
Chapitre 3 : Unité d’analyse microbiologique des denrées
alimentaires

I. Introduction 
L’objectif de l’analyse microbiologique alimentaire est de rechercher des contaminants
par identification des microorganismes et quantification du nombre de colonies.
L’analyse microbiologique alimentaire s’intéresse également à des germes témoins de
mauvaises pratiques hygiéniques.
Pour chaque produit alimentaire, une liste de micro-organismes est établie par le
législateur avec les taux de présence acceptables pour lesquels des analyses doivent être
effectuées.

II. Matériels utilisés 

Hotte à flux laminaire , pipettes stériles , vortex ( agitateur) , tubes à essais remplis d’eau
peptonnée tamponnée , flacons d’eaux peptonnée tamponnée , boites de pétri stériles , étaleurs
en verre , compteur de colonies , anse de platine , pipette pasteur , galerie API 20 , pH
mètre , broyeurs homogénéisateurs : le stomacher, étuves à température réglables , bain
Marie réglable à 45 ºC + ou – 0.5 , congélateur, .

9
III. Nature des échantillons et analyses effectuées 
Tableau 1 : Identification les bactéries des l'échantillon

Nature Analyses effectuées Milieu de culture

Laits , produits laitiers Coliformes fécaux VRBL
E. coli TBX
Salmonelles Hektoen ou gélose XLD
staphylocoques Baird Parker
Plat cuisinier Germes totaux PCA
Coliformes totaux VRBL
Anaérobie sulfito-réductrices TSC
Staphylocoques aureus Baird Parker
Salade ‘ mechouia ‘ Microorganismes à 30°c PCA
Coliforme VRBL
Coliforme thermotholérent à VRBL
44°c
Bactérie anaérobie sulfito- TSC
réductrices
Staphylocoques coagulasse Baird Parker
positives
Hektoenougélose XLD
Salmonelle spp

Crevette , poisson, Coliformes VRBL

10
 E.coli TBX
Staphylocoques Baird Parker
Autres ( à la demande )
Autres : gâteaux, A la demande …..
charcuteries

IV. Techniqu1e d’analyses 

Tout d’abord, les échantillons sont enregistrés sur une fiche de travail analytique qui sera
rempli au fur à mesure de l’avancement d’analyse .

1. Pesage et préparation de la suspension mère 

Pour tout l’échantillon  et sous une hotte à flux laminaire : peser 26g de l’échantillon à
l’aide d’une balance , puis ajouter 234 ml d’eau distillée tamponnée .
On pesse 26g de l’échantillon , 1g pour rechercher tous les bactéries et 25 g pour rechercher
de Salmonelle

Figure 4 : Pesage de

l'échantillon

homogénéiser pendant 30s au Stomacher( la pesée se fait dans des sachets stériles ).Laisser
revivifier 3 minutes puis passer à la préparation des dilutions .

Figure 5 : Stomacher

11
 2. Dilution 
On Transverse à l’aide d’une pipette stérile 1ml de la suspensions mère dans un tube
contenant 9 ml de diluant stérile. Puis on mélange soigneusement cette suspension en
utilisant un vortex pour obtenir une dilution 10-2 et on Répète ces opérations sur la dilution
précédente pour obtenir la dilution 10-3, 10-4 .

3. L’ensemencement 
La technique d'ensemencement vise à favoriser la multiplication des bactéries sur un milieu
nutritif lorsqu'elles proviennent d'un milieu à faible concentration. Il s’agit de déposer dans un
milieu de culture des germes prélevés à partir d’une culture mère.
Il existe deux types d’ensemencement :
 En profondeur : On ajoute le volume de la dilution dans le boite de Pétri
ensuite on verse le milieu de culture (température 45°C) et on mélange par des
mouvemente rotatifs et le laisser refroidir.

Figure 6 : Des anses pour l'étalement

 En surface : Après avoir écoulé le milieu gélosé dans la boite de pétri et le

laisser solidifier on ajoute le volume de la dilution.

4. Incubation 37 ºC pendant 24 heurs

5. Comptage des colonies

V. Exemples des germes recherchés dans les denrées alimentaires 

1. Recherche de Salmonelle
Définition 

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 Ces sont des microorganismes formant des colonies typiques ou moins typiques sur des
milieux sélectifs solide et possédant les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrits
lorsque l’essai est exécuté selon la présente norme international .
Ces sont des bacilles Gram- , durant leur croissance , ces bactéries sont mobiles à ciliature
péri triche riche comme les autres entérobactéries .
Elles sont des entérobactéries virulentes à l’origine de toxi-infections alimentaires .

Pour dépister la présence des Salmonelles dans un produit alimentaire , il faut passer par les
cinq étapes successives  :
- Pré-enrichissement en milieu non sélectif 
Cette étape consiste à mélanger 25 g de l’échantillon désigné par 234 ml de l’eau
peptonnée tamponnée homogénéisée puis incuber 37 ºC pendant 24 h .
- Enrichissement sur le milieu liquide sélectif 
L’enrichissement a pour but d’assurer la multiplication sélective des Salmonelles , on
utilise deux milieux liquides pour enrichissement :
Bouillon Rapaport
Bouillon Kauffman
A partir de l’homogénéisation pré-enrichi , on ensemence 0,1 ml dans un tube à essai
contenant 10 ml de bouillon Rapaport (coloration bleu ) à l’aide d’un micropipette . Le
bouillon doit être incubée à 41ºC pendant 24 heures .
De même, on ensemence un tube à essai du Kaufman avec 1 ml de suspension pré-enrichi ,
ensuite porter le mélange à 37 ºC pendant 24 heures.
- Isolement sur le milieu solide sélectif 
L’isolement se fait par deux méthodes , un seul est réalisée dans la laboratoire :
A partir du milieu d’enrichissement ( Kaufman ou Rapaport ) , on réalise l’isolement sur les
milieux sélectifs gélosés Hektoen et à l’aide d’une gélose XLD ou vert brillant .
Hektoen ensemencée d’anse stérile à partir du tube Rapaport en faisant des stries parallèles
alors que gélose XLD est ensemencée de la même manière à partir du tube de Kaufman déjà
incuber à une température de 37 ºC .
Les boites des deux milieux ensemencés sont portés à l’incubation 37 ºC pendant 24 heures .
- Lecture 
Sur Hektoen , les colonies apparaissent transparents avec ou sans présence de centre noir .

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 Sur la gélosé XLD , les colonies apparaissent noires .
- Confirmation Biochimique 
Après l’incubation pour les deux cultures obtenu , on prend les colonies spécifiques et on
les ensemencé sur un milieu gélose incliné «  Kligler » ou TSA .
incuber à 37 ºC pendant 24 heurs .
Galerie Api : c’est l’étape finale pour l’identification du microorganisme .on utilise la
galerie Api 10 pour la recherche de Salmonella .

Chapitre 4 : Etude de cas d’hygiènes hospitalières

I. Introduction 
La but de contrôler l’espace du travail dans les hôpitaux c’est la présence identifiée et
quantifiée ainsi que la persistance de microorganismes potentiellement dangereux pouvant
être transférés au patient au cours des soins, à partir d’un autre individu ou de
l’environnement de soins.
Dans cette partie de rapport nous allons voir mon suivie d’analyse d’hygiène hospitalière , j’ai choisi
de travailler dans ce domaine d’analyse et je suis très satisfaite de mon choix , alors j’ai
travaillée sur ( 2 boite de Pétri , 6 RODAC , 8 écouvillons )

II. Préparation les boites de prélèvements 

Pour les boites de RODAC et de pétri : mise en gélose de PCA ou GNG
Après le prélèvement , On prépare tout d’abord les boites et on les remplie par le milieu PCA
sous la hotte pour la stérilisation , on fait recouvrir les gouttelettes s d’une couche de ce
milieu en surfusion et l’hongéniser grâce à des mouvements circulaires ,
Quand la gélose a refroidi, passer une seconde couche de gélose PCA ce qui aura pour effet
d'immobiliser les bactéries, et donc de former des colonies bien définies.

14
III. Milieux utilisés pour les analyses 

1. Milieu Chapman 
Milieu d’isolement sélectif des bactéries du genre Staphylococcus pathogène c’est un agent
sélectif : forte concentration en NaCl , il utilise le mannitol comme source de carbone.
Coloration jaune : présence de mannitol

Figure 7 : Milieu chapman

2. Milieu Drigalski 
La gélose lactosée de Drigalski est utilisée pour l’isolement sélectif des entérobactéries.
Elle permet la différenciation des bactéries suivant leur aptitude à fermenter le lactose dans
les secteurs alimentaire, pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire .
Les colonies lactose (+) sont jaunes et les colonies lactose (-) restent vertes

Figure 8 : Milieu Drigalski

3. Milieu ADN 
La mise en évidence de l’ADNase consiste à cultiver la souche en présence d'ADN et
à détecter l'hydrolyse éventuelle de l'ADN grâce à HCl , qui a la propriété de précipiter l'ADN
, en formant d’un holot clair en présence des produits d'hydrolyse de l'ADN.

15
 Figure 9 : Milieu ADN

4. Milieu PCA ou GNG

Ils s’agit d’un témoin analytique positif auquel on applique le protocole analytique
complet utilisé avec les échantillons d’essai et qui devra permettre le développent de
l’organisme cible dans tous les essais .
(Plate Count Agar) la gélose glucosée à l’extrait de levure, peptone et glucose pour le
dénombrement des bactéries aérobies et anaérobies .

Figure 10 : milieu PCA

5. Milieu TSI
Ce milieu d’identification permet de mettre en évidence :

- la fermentation du glucose avec ou sans production de gaz

- la dégradation du lactose
- la production de H2S.

Figure 11 : Milieu TSI

16
 6. Milieu cœur cervelle 
Milieu polyvalent riche utilisé pour la recherche de la coagulase libre (enzyme thermostable
des Staphylococcus permettant la formation de caillots de fibrine, coagulation) et la DNA se
thermostable des Staphylococcus. Il peut aussi servir dans la recherche
de streptoccocus résistant enteroccocus dans la galerie de sherman.

Figure 12 : Bouillon coeur cervelle

IV. Mode opératoire

1) Réception des échantillons 

Tout d’abord , les échantillons qui provient du préleveur de type ROAC ou les boites
de Pétri , on met ces derniers directement dans l’étuve d’incubation à 30 ºC pendant 48 heurs
après la confirmation sur le milieu GNG ou PCA .

Mais pour les écouvillons , on les ajoute 1 à 2 ml de bouillon de cœur cervelle pour les
différentes échantillons et on laisse reposer 30 min à 45 min pour l’augmentation de la
prolifération bactériennes , on laisse une boite standard pour clarification notre milieu de
culture , après on fait l’isolement sur le milieu GN puis incubation 30 ºC pendant 48 heurs .

17
Figure 13 : boites de RODAC
 2) Comptages des colonies
Tableau 2 :Dénombrément des colonies

Echantillons Nombre des colonies ( en UFC )

PCA 3 15 colonies blanc et jaune et une moisissure

PCA 4 12 Colonies et une moisissures

R1 12 colonies et une moisissure

R10 >150 : colonies jaune et es moisissures

R4 3 colonies et moisissure

R6 62 colonies jaunes et moisissure

R8 64 colonies blanc

R3 40 colonies et une moisissures

E1 Colonie blanc et moisissures

E 11 Colonie jaune et blanc et moisissure

E 13 , E 2, E9 , E6 , E8 , E 12 Présence des colonies grandes et petites et

des moisissures

3) Vérifications sur les deux milieux Chapman et Drigaski 

Isolement sur ces deux milieux pour les types de prélèvements  prés du bec bunsen .
Après l’incubation, on identifie :
- Le milieu Chapman de coloration rouge : le Cocci gram+ si ce dernier vire de coloration
jaune on constate que la présence de cet couleur présence mannitol + et reste rouge
mannitol - .
- Le milieu Drigaski de coloration vert le bacille gram - ,

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 Figure 14 : Isolement sur le milieu Chapman

Figure 15 : Isolement sur le milieu Drigaski

Résultats 
Les bacilles gram - : E1 B , E2 , R3
Les cocci gram + : PAC 3J , PCA 3B , PCA 4 , E 13 , E 11J , E9 , E6 , E8 , E 12 ,
R1 ,R 10 J ,R4 , R6 , R8

4) Les tests effectue pour les cocci gram + 

Après l’identification les cocci gram + sur le milieu Chapman, on prélève avec une
anse stérile des colonies prés de bec bunsen on fait les tests suivants :

a) Test catalase 
 Intérêt 
La recherche de la catalase présente un intérêt taxonomique en ce qui concerne les bactéries à
Gram +.
 Principe 
La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) :

H2O2 → ½ O2 + H2O
Produits toxique formation des bulles

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Le test consiste à mettre des bactéries en quantité suffisante en contact de peroxyde
d’hydrogène (H2O2). Si elles possèdent la catalase, elles dégradent le peroxyde d’hydrogène
en eau et dioxygène visible par la formation de bulles.
 Le Technique 
- Déposer sur une lame une goutte d’eau oxygénée (= peroxyde d’hydrogène) à l’aide d’une
pipette Pasteur ( pour élimination la phénomène d’oxydation ) .
- Prélever une colonie à l’aide de l’anse
- Dissocier la colonie dans la goutte

Figure 16 : Test catalase

 Lecture 
La bactérie possède la catalase, elle est dite : Catalase + : effervescent
La bactérie ne possède pas la catalase, elle est dite : Catalase – : non effervescent
 Résultats 
Tableau 3 : Résultats du test catalase

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 Echantillons Testes catalase

PCA 3 J +

PCA 3 B +

PCA 4 +

E13 +

E 11 J +

E9 +

E6 +

E12 +

E8 +

R1 +

R10 J +

R4 +

R6 +

R8 +

Figure 17 : Résultat test catalase

b) Test ADNase et le test coagulase libre

 Intérêt 
Touts les échantillons qui ont démontrés des résultats du test catalase + par des cocci gram
+ , on passe à réalisation du test ADN  : leurs rôle d’identifier les bactéries d’espèce Aureus et
test coagulase
 Technique 

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- Ensemencer à l’aide d’anse stérile les colonies sur un milieu liquide bouilon du cœur
cervelle.
- Isoler les colonies suspects en strie simple à la surface de milieu ADN avec une même
anse 
- Incuber 24 heurs à 37 ºC
Pendant l’incubation si la bactérie étudié possède une DNase grâce à celle il aura une
réaction hydrolyse aura lieu selon la réaction , et la suivante :
                                    ADNase
ADN                          H2O        +             Nucléotides
ou Poly nucléotides
- Après l’incubation : verser à la surface de la gélose une solution d’acide de chlorhydrique
 Interprétation 
Après l’incubation , on ajoute pour le bouillant cœur cervelle 0,5 ml de Plasma de Lapin ,
puis l’incube 37ºC pendant 24heurs et on ajoute un réactif HCL pour le milieu solide
l’ADN après 5 min de l’ajout on constate :
- S’il y a un halo clair autour du trait bactérien : l’ADN a été hydrolysé par la
bactérie donc ADN : ( +)
- Pas de cercle de transparence : ADN ( –)

Après 5 minutes :

Figure 18 : Test ADN

- Après l’incubation :

22
 Figure 19 : Coagulation négative

Figure 20 : Coagulation positive

 Résultats 
Tableau 4:Résultats de test catalase et coagulase

Echantillons Test catalase Test ADN Test coagulase

PCA 3J + - -

PCA 3B + - -

PCA 4 + - -

E 13 + - -

E11 J + + -

E9 + + -

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 E6 + - -

E12 + - -

E8 + - -

R1 + + +

R10 J + + -

R4 + - -

R6 + - -

R8 + - -

c) Exploitation des résultats 

Tableau 5: Caractères différentiels entre les espèces du genre staphylococcus

Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus

Aureus epidermidis Saprophyticus
Cocci à Gram + + + +
Catalase + + +
ADN + - -
Coagulase + - -
Mannitol + - +

R1 , R10J : staphylococcus Aureus

PCA 3J , PCA 3B , PCA 4, R6 ,E8 ,E13,E11J, E12 ,R8 :staphylococcus epidermidis

E6 ,E1,R4 : staphylococcus sarprophyticus

 Les groupes staphylocoques 

24
Figure 21 : Les caractéristiques de Staphylocoques Aureus

- Définition 
Les staphylocoques sont classés en fonction de leur capacité à provoquer la
coagulation du sang. Staphylococcus aureus est un staphylocoque coagulase-positif. Si S.
aureus est le staphylocoque impliqué dans les pathologies les plus graves chez l'homme,
d'autres staphylocoques ,coagulase-négatifs, peuvent également provoquer des infections.
Ce sont des pathogènes dits opportunistes qui devront profiter d'un point d'entrée dans
l'organisme et d'une diminution des défenses immunitaires pour provoquer une infection.
Ils sont en général considérés comme moins dangereux que S. aureus. C'est le cas
notamment de Staphylococcus epidermidis, ou staphylocoque blanc, qui est une bactérie
commensale de l'homme faisant partie de la flore cutané-muqueuse de la quasi-totalité de
la population. Ce staphylocoque peut néanmoins devenir pathogène dans certaines
circonstances, lorsque le sujet présente une immunodéficience (sida, radiothérapie,
chimiothérapie, ) ou à l’occasion de l’implantation dans l’organisme de corps étrangers
(prothèses osseuses ou cardiaques, sondes, cathéters,…). Le matériel implanté peut alors
être contaminé par des souches de la flore cutané-muqueuse du patient ou du personnel
soignant. Ce type d'infection est essentiellement de type nosocomial (contracté à l'hôpital)
ou iatrogène (résultant d'un acte médical).

Parmi les staphylocoques responsables d'infections humaines, on peut aussi

citer Staphylococcus saprophyticus, associé à des cystites aigues survenant principalement
chez les jeunes femmes. Après Escherichia coli, c'est la seconde bactérie responsable
d’infections urinaires.

25
- Augmentation des infections
S. aureus est retrouvé, en dehors de toute pathologie, chez environ 30 à 50% des sujets
sains : bien que porteuses de la bactérie, ces personnes ne présentent pas de symptômes. A
l’hôpital, l’infection peut survenir quand les défenses immunitaires des patients diminuent, ou
quand la barrière cutané-muqueuse est rompue, ce qui favorise la pénétration dans
l’organisme de souches véhiculées par les patients ou par les membres de l’équipe soignante.
L’élévation de l’incidence des infections staphylococciques s’explique par le nombre
croissant de personnes immunodéprimées (au système immunitaire affaibli) mais aussi par la
multiplication des procédures invasives altérant la barrière cutané-muqueuse : interventions
chirurgicales, pose de cathéters ou de sondes, implantation de prothèses…
- L'hygiène comme rempart
Seuls l’isolement des patients et le respect permanent des mesures d’hygiène peuvent
limiter la dissémination et la persistance des souches hospitalières.
- Traitement et prévention
En milieu hospitalier, des mesures draconiennes d'hygiène et d'isolement des patients sont
requises pour limiter la dissémination de ces bactéries. Aujourd’hui, l’antibiothérapie reste le
traitement de choix, surtout dans les phases précoces de l’infection. Cependant, l'émergence
récente de souches résistantes à la vancomycine laisse entrevoir une impasse thérapeutique,
mais des approches vaccinales sont actuellement à l’étude .
 Moisissures 

Figure 22 : Boite d'air de moisissures

- Désinfection
Il est important d’identifier et de corriger toute cause d’accumulation ou d’infiltration d’eau
comme un bris de tuyau, une inondation ou un refoulement d’égout.
Nettoyez les surfaces touchées sans délai et jetez les matériaux poreux endommagés
Pour les petites surfaces (le rebord d’une fenêtre, par exemple) :

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Faites disparaître les taches à l’aide d’un chiffon propre et d’un nettoyant tout usage. Il n’est
pas recommandé d’utiliser de l’eau de Javel;
 Asséchez bien la surface.
 Si les surfaces atteintes sont grandes (plus de 1 m2), nombreuses, difficiles à
nettoyer ou si les moisissures reviennent après le nettoyage :
 Faites appel à une entreprise spécialisée. Celle-ci pourra mieux évaluer l’ampleur des
travaux à entreprendre et vous aider à détecter et à corriger la source du problème;
 Jetez les articles poreux et très endommagés par l’eau.
- Précautions à prendre pour vous protéger lors du nettoyage
 Afin d’éviter de vous exposer inutilement aux moisissures, il est recommandé de
porter :
 des lunettes de protection ;
 des gants de caoutchouc ;
 un masque anti-poussière.

5) Les tests effectué de bacille gram - 

a) Test oxydase 
 Intérêt
La recherche de l’oxydase présente un intérêt taxonomique en ce qui concerne les
bactéries à Gram -.
 Principe 
Le test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder un
réactif incolore (la NN-diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé rose violacé.
N-N-diméthyl-prophénylènedianinie produit coloré
incolore oxydation rose violacé
 Technique 
- placer un disque non imprégné sur une lame à l’aide d’une pince flambée,
- déposer une goutte de réactif sur le disque non imprégné,
- avec une pipette Pasteur prélever une colonie sur milieu solide (GN) et la déposer
doucement sur le disque

27
 Figure 23 : Test oxydase

 lecture 
Pas de lecture avant 30 secondes environ
Tâche rose violette
La bactérie possède l’activité oxydase, elle est dite : Oxydase +
Pas de tâche rose violette
La bactérie ne possède pas l’activité oxydase, elle est dite : Oxydase -
 Résultats 

Tableau 6:Résultats du test oxydase

Echantillons Test oxydase

E1 B +
E2 +
R3 +

b) Test Kligler-Hajna 
 Principe 
A partir de GN , on va prélever une colonie par une anse stérile et dans une zone stérile , on
effectue sa culture sur TSI : on effectue une piqure au centre du culot puis des stries sur la
pente , puis incubation 37ºC pendant 24 heurs.

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Figure 24 : Milieu TSI

 Lecture 
Si la pente devient jaune c’est Lactose (+)
Si la pente reste rouge c’est Lactose (-)
Si le culot devient jaune c’est Glucose (+)
Si le culot reste rouge c’est Glucose (-)
S’il ya noircissement c’est H2S (+)
S’il y a des bulles d’air c’est Gaz (+)
 Résultats 

Tableau 7:Résultats du testKligler-Hajna

Références Culot Pente Ensemble du tube

E1B Jaune glucose + Jaune Noircissement : H2S -.

lactose+ Pas fragmentation de la gélose : Gaz
-.
E2 Rouge glucose- Jaune Pas de noircissement : H2S –
lactose+ Pas de fragmentation de la gélose :
Gaz -.

R3 Jaune glucose+ Rouge Pas de noircissement : H2S -

lactose- Pas de fragmentation de la gélose :
Gaz

a.

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 Figure 25 : Résultats des testesKliger-Hajna

C - Test Api 20E 

C’est l’étape final pour l’identification du microorganisme. On utilise la galerie Api 20E
pour la recherche de l’espèce des entérobactérie . La galerie API 20E comporte 20 micro
tubes contenant des substrats déshydratés. Les testes sont inoculés avec une suspension
bactérienne qui reconstitue les milieux .
Les réactions produits pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés
spontanées ou révélés par l’addition des réactifs .
 Matériel et réactif 
Suspension 9 ml

Huile de paraffine

Pipettes

Vortex

Anse stérile

 Technique 
- Prélever avec une anse stérile une suspension de surface de milieu de GN

Figure 26 : Remplissage l'Api par l'eau distillé

- Réaliser une suspension dans 9 ml d’eau distillée .

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- La faire passer sur le vortex pour homogénéiser : suspension mère
- Incuber Api 20 : faire remplir les trous de l’Api par l’eau distillée stérile et les tubes par la
suspension : tubes et cupule , tubes seuls
- Recouvrir d’huile de paraffine (LDC , ODC , H2S , URE )

Après incubation , lire la galerie : la lecture se fait suivant une sommation triplet

 Résultats

Pseudomonas luteola99.98
Le genre Pseudomonas a été créé en 1894 par Migula sur des critère morphologiques et
métaboliques.
Au cours des années, ce groupe a subi de nombreux remaniements du fait de ces critères
d’inclusion très peu spécifiques.
Les Pseudomonas sont des agents pathogènes opportunistes qui infectent préférentiellement
des sujets hospitalisés immunodéprimés ou affaiblis.
- Facteurs responsables à l’infection
Plusieurs facteurs sont responsables en partie de ces infections et sont liés à l’hôpitaux
techniques hospitalières(sondages, intubations, respirateurs ,dialyseurs, stérilisation de
matériel) .Du fait de leur nature opportuniste, la première étape de l’infection par un
Pseudomonas est liée à une diminution des défenses de l’organisme.
- Infection à Pseudomonas luteola
Plusieurs cas d’infection à Pseudomonas luteola ont été décrits dans le monde en médecine
humaine en tant que maladie nosocomiale chez des individus immunodéprimés , et voici
quelque cas des personnes infectées par cette bactérie :
- Cas n °1 (en 2011) : une infection respiratoire et une septicémie chez un homme de 60 ans,
diabétique, hypertendu et asthmatique, présentant un choc cardio-génique et une détresse
respiratoire (patient décédé).
- Cas n°2, 3, 4 et 5 (en 1995) : un répertoire de cas rencontrés dans une université entre Mai
1990 et Mai 1995,Un abcès du fémur gauche chez une femme de 26 ans, une péritonite chez
une femme de 55 ans ayant subi une appendicectomie l’année précédente, une bactériémie
chez une femme de 26 ans, épileptique, ayant subi plusieurs chirurgies suite à une chute dans
les escaliers quelques jours auparavant, une péritonite chez un homme de 83 ans présentant un
carcinome côlon (patient décédé).

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 Conclusion générale

Durant la réalisation de ce stage j’ai appliqué directement les connaissances acquises en

cours. Pour réaliser un travail aussi important . Elle m’a permis d’enrichir mes connaissances
scientifiques et techniques. De plus, je me suis rendu compte de l’ampleur des danger1s de la
contamination des produits agroalimentaires. Je dois aussi faire plus de précaution lors de la
consommation de ces produits.
Je garde du stage un bon souvenir vu que c’est une expérience qui m’a aidé à envisager
mon avenir et je remercie tout le personnel du laboratoire.
Enfin ce stage s’est avéré bénéfique à plusieurs titres.

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