IDENTIFICATION BACTERIENNE:

DIFFERENTS GROUPES

TESTS et MILIEUX DE CULTURE

Préparation aux Travaux Pratiques

Procédure générale d’identification
Souche pure

Description macroscopique (milieux ordinaires, sélectifs…)

Examens microscopiques: Etat frais / gram…

Tests d’orientation: Enzymes respiratoires (bactéries gram+ catalase /

Bactérie gram- oxydase)

Orientation vers une famille

Type respiratoire (O2)

Ensemencement d’une galerie d’identification ou tests biochimiques (utilisation des sucres,

de protéines , BN hostiles…)

Identification du genre et de l’espèce (pas toujours)

 Les milieux de cultures (voir compléments TD moodle)
On distingue les cultures liquides en bouillons des cultures en milieu semi-solide (ou
gélose molle) et les milieux gélosés en boîte de Pétri ou en tube inclinée

Les ensemencements sur les milieux de cultures sont divers (voir compléments TD moodle)
Ex: Pour obtenir une culture pure on ensemencera la gélose en quadrant

L’inoculum est progressivement

épuisé en réalisant des stries selon un
schéma défini
Dans les dernières stries se dépose
une cellule qui en se multipliant
donnera une colonie distincte
Stériliser l’anse de Pt entre chaque étape
 Description macroscopique:
Analyses sur la colonie la plus isolée sur gélose
- la taille et la forme de la colonie :
i. petite : diamètre est égal ou inférieur à 1mm
ii. moyenne : diamètre compris entre 1.5-3mm
iii.grande : diamètre supérieur à 3mm
Formes colonie
- l’allure des contours :
En étoile

contours colonie

- La forme du relief (élévation) :

Elevation colonie

Et ombiliquée (cratère au centre)

ATTENTION! pour un temps d’incubation à une température donnée et sur un milieu de culture défini
- la transparence :
i. opaque :
ii. translucide :
iii.transparentes :

- l’aspect de la surface :
lisses (homogène dans la structure) - S
rugueuses (hétérogène et sec)- R
muqueuses (structure hétérogène et humide)- M

- l’existence ou non de pigments (coloration) :

très souvent grisâtres, blanches ou jaunes-ocres
rouge, jaune, vert, rose
Serratia marcescens
Micrococcus roseus
- Odeur: impossible si mélange de µorgs- acide, acétone, foin, urine, terre…
 Examens microscopique:
L’état frais

Examen direct des cellules – Une goutte d’inoculum entre lame et lamelle

l’état frais permet d’étudier :

o forme de la cellule:
Voir diapo suivante
o Mode de regroupement

o La mobilité:
mouvements désordonnés ou à contre-courant
Détermination du GRAM
Épaisseur peptidoglycane ~ 30 à 300 nm

Épaisseur peptidoglycane ~ 20 à 30 nm + 15
nm membrane externe
Test sur lame avec de la potasse KOH 3% :
Une à 2 colonies déposées aseptiquement sur la lame
Ajout d’une goutte de KOH 3%– attendre 1 min – avec boucle anse tirer
doucement
GRAM+: pas de filament visqueux observé
GRAM-: filament observé (cf: photo)
… ou Coloration de GRAM
 Avec Tests d’orientation réalisés:
GRAM- : recherche Cytochrome C
oxydase
GRAM+: Catalase
(voir CM1 et 2)
on arrive à

Identification de la famille
Détermination du type respiratoire:

milieu semi-solide (gélose molle) contenu dans un tube long et fin. Il est ensemencé
par piqûre: Plonger à la verticale une pipette Pasteur boutonnée (ou fil droit) chargé
d’inoculum
Le milieu est régénérée au bain marie 20 min pour établir un gradient de concentration
en O2
Pipette Pasteur
boulée chargée
d’inoculum

Piqûre centrale

Variante 

10
Ensemencement du milieu Viande Foie (VF)
Détermination du type respiratoire: gélose Viande Foie (VF)

Etudier le comportement des bactéries vis à vis de l’oxygène

Et la production de gaz (CO2, H2) lors de fermentation du glucose

Quantité
Composant Rôles
(g/L)
Apport AA, fact. de
Base viande foie 30
croissance…
Source de C et
glucose 2,0
d’énergie
agar gélifiant 6,0

Attention à ne pas visser le bouchon à fond!

Exercice:
Détermination du type respiratoire et production de gaz: gélose Viande Foie (VF)

5
1?

2 ?

3 ?

4?
1 3 2 4
5?
Les différents groupes bactériens
Caractéristiques – milieux de culture

VOIR LES DOCUMENTS SUR MOODLE

Cocci à GRAM positif Voir tableau groupe (doc sur moodle)

Micrococcus spp.
Micrococcaceae
(catalase +) Staphylococcus spp.
2 familles:
Streptococcus spp.
Streptococcaceae
(catalase -) Enterococcus spp.

ATTENTION! Classification phénotypique

 Famille des Micrococcaceae (voir tableau)
Genre Micrococcus catalase + Genre Staphylococcus

Colonies jaune ou rose pigment non diffusible jaunes, blanches

Regroupement amas irréguliers ou tétrades amas 2D (« grappes »)
Type respiratoire aérobie strict AéroAnaérobieFacultatif (AAF)
milieu hypersalé (7,5%) quelques unes (24h) Souvent
Antibiotiques Bacitracine S Bacitracine R
Nitrofuranes R Nitrofuranes S

Particularité Cultive mieux à 30°C qu’à 37°C

 Gélose Chapman

Aspect du milieu avant Mode

Composition Caractères recherchés Résultats
utilisation d’ensemencement

L'ensemencement Ce milieu contient un On étudie la Les colonies mannitol +

doit être massif inhibiteur : chlorure fermentation du sont entourées d’une
(~abondant), en de sodium (75 g.L-1) mannitol par virage au auréole jaune.
Aspect du milieu après stries serrées ou par ce qui permet un jaune de l’indicateur Ne pas confondre la
utilisation inondation isolement sélectif de coloré, le rouge de pigmentation des colonies et
Staphylococcus halotolér phénol, autour des le virage de l’indicateur
coloré.
Incubation: 24h à ant colonies.
Ainsi des colonies
37°C
pigmentées en jaunes et
mannitol + : forte suspicion
de S. aureus
Type de milieu : Sélectif et différentiel
Cocci à GRAM négatif (voir tableau groupe)
 Bacilles à GRAM positif Voir tableau groupe (doc sur moodle)

Bacilles formant des endospores: Famille des Bacillaceae

2 grands groupes:

Bacilles NE formant PAS des endospores: Corynebacterium,

Listeria, Mycobacterium, Lactobacillus…

Endospore: forme de résistance aux conditions externes défavorables. Etat de repos

végétatif de la cellule (illimité dans le temps)

ATTENTION! Classification phénotypique

examen microscopique spécifique à ce groupe:
La Coloration des spores
Dans la procédure de Schaeffer-Fulton, les endospores (bacilles GRAM+) sont d’abord
colorées par chauffage des bactéries avec du vert de malachite (5%)
Ensuite les cellules sont lavées à l’eau et contre colorées à la safranine
 Famille des Bacillaceae (Voir tableau groupe (doc sur moodle)
Genre Clostridium endospores + Genre Bacillus

Colonies grandes blanchâtres +/- translucides

Regroupement Isolé bacille droit chaînette
mobilité mobiles (ciliature péritriche)
Type respiratoire anaérobies strictes (= catalase -) Aérobie et AAF (=catalase +)
Endospore déformantes, subterminales à centrales, déformantes ou pas
terminales forme ovale/ronde
Particularité A gram variable (vieilles culture)
Exercice: A l’aide de la fiche correspondante (fourni sur moodle) à la gélose à
l’amidon remplissez le tableau

Aspect du milieu Mode Caractères

Composition Résultats
avant utilisation d’ensemencement recherchés

L’ensemencement Ce milieu
se fait … contient

Aspect du milieu Incubation:

après utilisation

Type de milieu :
 Amylase
Amidon -----------------------> Glucose

Aspect du milieu Mode

Composition Caractères recherchés Résultats
avant utilisation d’ensemencement

Milieu Peptones, transformation de Résultat positif :

ensemencer par amidon 1% l’amidon par la bactérie Halo clair autour de la culture:
une ou (source de C grâce à l’action d’amylases hydrolyse de l’amidon – présence
plusieurs strieset d’energie) et Après culture est ajouté du d’amylases
Aspect du milieu à partir d’une agar lugol composé de KI et I2.
après utilisation suspension Les ions iodures qui se Résultat négatif :
bactérienne forment entre I2 et I- vont
s’intercaler dans l’hélice Coloration bleue autour de la
Incubation: 30- formée par l’amidon et culture: pas d’hydrolyse de
37°C _ 24h à 7j provoquer une coloration l’amidon- pas d’amylase
bleue-violet.
Type de milieu : différentiel
Bacilles à GRAM négatif Voir tableau groupe (doc sur moodle)

Enterobacteriaceae

3 familles: Vibrionaceae

Pseudomonadaceae

ATTENTION! Classification phénotypique

On différenciera les familles sur les caractères phénotypiques suivants:

Caractère1,25 Enterobactériaceae Vibrionaceae Pseudomonadaceae

Type respiratoire AAF AAF Aérobie stricte

Cytochrome C
Non Oui Oui
oxydase
Voie d’attaque du Oxydative ou
fermentative fermentative
glucose neutre
Réduction des Oui MAIS nitrites
Oui Oui
nitrates en nitrites en N2
Mobilité Oui! péritriche Oui! polaire Oui! polaire
Détermination de plusieurs caractères avec une gélose:
Milieu Mannitol-Mobilité (-Nitrates) (cf moodle)
Gélose molle en tube - Ensemencement par piqûre centrale
Composant Rôles Quantité (g/L)
Peptone trypsique de viande Cf CM 10
Mannitol Lecture d’un caractère biochimique (source de C et d’énergie) 7,5
Lecture d’un caractère biochimique (accepteur final d’e- =
Nitrate de Potassium (KNO3) 1
respiration nitrate)
Rouge de phénol Indicateur coloré de pH (utilisation ou pas de mannitol) 0,04
agar gélifiant 6,0

- Milieu utilisable pour les bactéries fermentatives transformant le mannitol en fructose

puis acides courts
- Bactéries très mobiles peuvent se déplacer
Rouge de phénol virage pH
- Les nitrates peuvent être réduits en nitrites puis N2: test voir CM1
Exercice:
Interpréter les résultats d’ensemencements sur milieu mannitol-mobilité
1 2 3 4

1 ?
2 ?
3 ?
4 Témoin (=non inoculé)
Famille des Enterobacteriaceae (ou Entérobactéries)

Regroupent une dizaines de genre pathogènes

Au sein de cette famille divers tests vont être réalisés pour les
différencier:
- tests métaboliques en galerie API 20E, Rapid ID 32E (4h), Rapid D 20E
(4h), Enterotube II …

Quelques Caractères différentiels d’identification des Entérobactéries- voir diapo suivante

 gaz H2S uréase indole TDA VP Citrate gélatinase
Caractère mobilité mannitol lactose onpg <-- glc
Salmonella enterica 1 + + - - + + - - - - +/- -
Shigella sp. 1 - +/- - +/- - - - +/- - - - -
Escherichia coli + + + + + - - + - - - -
Citrobacter koseri + + +/- + + - - + - - + -
Citrobacter freundii + + +/- + + +/- - - - - +/- -
Klebsiella pneumoniae - + + + + - + - - + +/- -
Klebsiella oxytoca - + + + + - + + - + +/- -
Enterobacter sp. + + + + + - - - - + + -
Serratia sp. + + -
?+ +/- - - - - + + +
Proteus mirabilis + - - - + + + - + - + +/-
Proteus vulgaris + - - - + + + + + - -/+ +/-
Morganella morganii + - - - + - + + + - - -
Providencia stuartii + - - - -/+ - - + + - + -
1 identification précise (sérotype pour Salmonella et espèce pour Shigella) nécessite l’utilisation d’anti-serums
 Schéma d’aide à l’identification d’une souche d’Entérobactérie (voir tableau groupe)

+ Proteus, Morganella
+ uréase

TDA - Providencia

+ Klebsiella, Enterobacter, Serratia

- VP + E. coli, Citrobacter
- ONPG
Tests effectués dans une galerie API – (la 20 E par exemple)
- Salmonella, Shigella

VP: VogesProskauer = recherche produits secondaires à la fermentation alcoolique

Exercice: A l’aide de la fiche d’un revendeur (fourni sur moodle) remplissez
le tableau correspondant au milieu de culture Mc Conkey

Aspect du milieu Mode Caractères

Composition Résultats
avant utilisation d’ensemencement recherchés

L’ensemencement Ce milieu
se fait … contient

Aspect du milieu Incubation:

après utilisation

Type de milieu :
 Mode
Aspect du milieu Caractères
d’ensemenceme Composition : Résultats
avant utilisation recherchés
nt
Isolement par la Ce milieu le lactose dont colonies rouges +/- entourées d’un hâlo
méthode des contient deux l’utilisation est opaque de la même couleur du à la
cadrans. inhibiteurs de la révélée par précipitation des sels biliaires: utilise le
Aspect du milieu Incuber 18 à 24 flore Gram+ : l’indicateur coloré lactose
après utilisation h à 37 °C. - les sels du milieu, le rouge colonies jaunes ou incolores : n’assimile
biliaires neutre. pas le lactose
- le cristal violet

Type de milieu : Sélectif et différentiel

Famille des Pseudomonadaceae

Différenciation des espèces par la production de pigments:

Pseudomonas aeruginosa: pyocyanine et pyoverdine

Pseudomonas fluorescens: Pyoverdine
Pseudomonas putida: Pyoverdine
Fluorescence de la Pyoverdine sous UV

Pyocianine soluble dans un mélange eau + trichlorométhane (chloroforme) – milieu King A

Pyoverdine soluble dans H2O et fluorescente sous UV – milieu King B
 Gélose cétrimide (cf moodle)
milieu sélectif destiné aux isolement et dénombrement de Pseudomonas (aeruginosa) –
incubation à 42°C
Composants Principaux Quantité
Rôles
* (g/L)
Antiseptique: Composé ammonium
Cétrimide quaternaire = Inhibiteur grand nombre de 0,3
germes (+ certains Pseudomonas)
Chlorure de magnésium Stimulant production pyocyanine 1,4
Sulfate de potassium Stimulant production pyocyanine 10
* peptones, glycérol et agar viennent compléter la composition de la gélose

Présence de colonies sur le milieu: suspicion de Pseudomonas et

apparentés
Milieu jaune- vert à bleu-vert : pyoverdine et pyocyanine + UV