Chapitre

27
Taxonomie bactérienne
à l'heure des technologies
nouvelles de la taxonomie
polyphasique
à la taxogénomique
G. Durand, A. Van Belkum

PLAN DU CHAPITRE
Introduction : la taxonomie et le concept La génomique pour la taxonomie bactérienne
d'espèce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 (génotaxonomique) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
Aspects de la variation bactérienne . . . . . . . . 254 Pertinence de la métagénomique pour
Taxonomie polyphasique . . . . . . . . . . . . . . . . . 255 l'évolution de la taxonomie bactérienne . . . . 259
Les technologies « omiques » comme outils Conclusion et perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . 259
taxonomiques (taxon « omiques ») . . . . . . . . . . 255
La protéomique et la spectrométrie de masse
MALDI-TOF pour la taxonomie bactérienne . . . 255

Introduction : la taxonomie taxonomie se subdivise en trois parties : (1) la classification,

c'est-à-dire l'arrangement des organismes dans des groupes
et le concept d'espèce taxonomiques ou « taxons » sur la base de la similarité de
Depuis la première description de bactéries vivantes par leurs caractères, (2) la nomenclature, c'est-à-dire la dénomi-
Anthonie Van Leeuvenhoek en 1665 jusqu'à la fin du nation de ces groupes selon des règles strictes, et (3) l'iden-
XIXe siècle, il n'y eut que peu d'intérêt pour l'identification tification, c'est-à-dire la comparaison des caractères d'un
des espèces bactériennes et leur classification. Leur étude organisme inconnu à ceux des différents groupes décrits
n'a véritablement commencé qu'avec la découverte de leur permettant alors de l'assigner à l'un d'entre eux.
rôle dans les processus de fermentation et de leur mode de Un taxon regroupe différents organismes dans le groupe
transmission en pathologie infectieuse grâce aux travaux de qu'il constitue. L'élément de base est l'espèce. On considère
Louis Pasteur et de Robert Koch. C'est le naturaliste sué- alors des taxons d'espèce (par exemple espèce Escherichia
dois Carl von Linné (1707–1778) qui fonda la science du coli), de genre (genre Escherichia), de famille (famille des
classement des organismes vivants appelée taxonomie (du Enterobacteriaceae), d'ordre (ordre des Enterobacteriales),
grec taxis, arrangement), et le premier ouvrage « moderne » de classe (classe des Gammaproteobacteria), de phylum
de classification bactérienne parut en 1923 avec le Bergey's (phylum des Proteobacteria) et de domaine ou encore appelé
Manual of Determinative Bacteriology. La taxonomie per- taxon de super-règne (Bacteria).
met de différencier les organismes vivants en définissant En bactériologie clinique, l'identification d'une bacté-
les limites aux groupes à l'intérieur desquels les organismes rie responsable d'une pathologie infectieuse permet d'en
seront rassemblés sur la base de leurs caractères communs déduire l'ensemble des caractéristiques écologiques, épidé-
ou distinctifs, caractères principalement liés à la morpho- miologiques et thérapeutiques se rapportant au taxon. La
logie, à la niche écologique ou encore à la physiologie. La taxonomie bactérienne, discipline relativement récente, s'est

Bactériologie médicale
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254   Partie III. Identification et systématique bactérienne
développée principalement au cours du siècle dernier et n'a
réellement atteint sa maturité qu'avec l'avènement de la bio-
logie moléculaire étudiant les motifs de séquences d'acide
nucléiques. Cependant, la taxonomie reste un domaine en
constante évolution avec la découverte régulière de nou-
velles espèces ou encore la révision des frontières entre les
espèces [12]. La classification bactérienne se trouve réguliè-
rement mise à jour sur le site internet www.bacterio.net et les
nouvelles espèces sont publiées dans la revue International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM).
Comme pour la plupart des autres formes de vie, la
taxonomie bactérienne a été initialement fondée sur des
caractères phénotypiques, principalement morphologiques.
Par exemple, le genre Staphylococcus a été nommé ainsi
sur son apparence en forme de grappes de raisin au micro­
scope après coloration de Gram. La distinction de l'espèce
Staphylococcus aureus des autres espèces de staphylocoques
à coagulase négative a été établie sur la coloration jaunâtre
(liée au pigment caroténoïde) de ses colonies sur des milieux
de culture synthétiques. Beaucoup d'observations simi-
laires fondées sur la morphologie, la coloration ou encore
les effets d'hémolyse des colonies sur les milieux de culture
ont conduit dans les années 1950 à une définition complexe
de la notion d'espèce. L'avènement de la « culturomique »,
approche fondée sur l'utilisation de plus de 200 conditions
de culture différentes permettant la croissance synthétique
de micro-organismes jusqu'alors qualifiés de non cultivables
[14], a encore significativement complexifié la notion d'es-
pèce. Au cours du siècle dernier, de nombreuses technolo-
gies ont été utilisées dans l'analyse comparative de souches
bactériennes pour la délimitation d'espèces. La technologie
clé, toujours considérée comme un standard de l'Interna-
tional Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP),
est l'hybridation ADN/ADN (DNA-DNA hybridization
[DDH]). Cette méthode, au cours de laquelle la totalité du
génome bactérien est hybridée, permet de mesurer un pour-
centage de similitude entre deux molécules d'ADN. Pour les
génomes bactériens, on estime qu'une hybridation à 70 % ou
un ΔTm (différence de températures de demi-dénaturation
à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme simple brin) de
4 à 5 °C correspond à une homologie de séquence de 96 %.
Une espèce peut donc se définir comme le rassemblement
de souches ayant des relations ADN/ADN qui se traduisent
à la fois par des valeurs d'hybridation supérieures à 70 % et
une instabilité thermique des hybrides inférieure ou égale à
5 °C. Néanmoins, cette méthode ne permet que la compa-
raison d'ADN deux à deux et les taxonomistes s'accordent
sur le besoin d'une approche modernisée intégrant un plus
grand nombre de données issues d'approches expérimen-
tales multiples.
L'approche taxonomique utilisée de nos jours est la taxo-
nomie dite « polyphasique » ou encore « mixte et consen-
suelle » prenant en compte le maximum de techniques
possibles, phénotypiques, chimiotaxonomiques et molé-
culaires dans le but d'obtenir une résolution fine des diffé-
rents groupes bactériens. Sa description intervient pour la
première fois en 1970 par Colwell et al. [5], mais elle a été
réellement mise en avant par Vandamme et al. en 1996 [25].
Tout en intégrant les données phénotypiques et chimiomé-
triques, la taxonomie polyphasique se fonde sur l'analyse
des séquences d'ARN ribosomal (ARNr), principalement de
l'unité 16S. En 1987, Carl Woese émet l'hypothèse que l'évo-
lution s'effectue à un rythme quasi indépendant des change-
ments de phénotypes. Les gènes d'ARN ribosomaux codent
pour des molécules constantes et universelles et qui ne sont
pas sous contrainte de la pression de sélection. On considère
alors que les mutations des ARNr au cours du temps ont
été constantes puisqu'elles ne conféraient pas d'avantages
sélectifs. Selon le paradigme de Woese [26], les séquences
d'ARNr 16S doivent avoir plus de 97 % de similitude au
sein d'une même espèce. Des souches dont les séquences
d'ARNr 16S possèdent moins de 97 % de similitude ne font
donc pas partie de la même espèce ; en revanche, l'inverse
n'est pas vrai et, dans la pratique courante, l'intérêt du
séquençage 16S devient alors vite limité lorsque les orga-
nismes sont très proches.
Les taxonomistes s'accordent sur la nécessité de revisiter
la taxonomie et de moderniser les outils, grâce notamment à
l'utilisation de nouvelles technologies comme le séquençage
du génome complet (whole genome sequencing [WGS]) qui
a déjà permis la découverte et la caractérisation de milliers
d'espèces d'origine clinique ou environnementale [21, 22, 24].
L'objectif de ce chapitre consiste à décrire les tendances
actuelles pour la taxonomie bactérienne, et la transition
dans les années à venir de la taxonomie polyphasique
comme nous la connaissons actuellement vers ce que nous
pourrons appeler la « taxogénomique », taxon « omique » ou
encore la « génotaxonomique ».
Aspects de la variation bactérienne
La description d'une espèce est assortie du dépôt d'une
souche type de l'espèce dans au moins deux collections inter-
nationales. Cependant, au sein d'une espèce, des variants
peuvent coexister qui se différencient de l'espèce type par
des caractères mineurs et stables. La variation bactérienne
est en réalité un processus fondamental dans le cycle de
vie bactérien. Elle est causée par la sélection des variants
les plus appropriés à partir d'un ensemble de mutants qui
émergent spontanément du fait d'échecs partiels de réplica-
tion de l'ADN, l'ADN polymérase n'étant pas une enzyme
infaillible. Des mutations peuvent apparaître de manière
relativement fréquente avec des polymorphismes sur un
seul nucléotide (single nucleotide polymorphism [SNP]), ou
encore des insertions ou des délétions dans l'ADN géno-
mique, générant des populations cellulaires hétérogènes au
sein de la même souche. Des plasmides peuvent être perdus
ou amplifiés durant la réplication, et des éléments génétiques
mobiles peuvent changer de localisation ou bien voir modi-
fier leur nombre de copies. De même, des bactériophages
peuvent être intégrés ou activés en fonction des conditions
physiologiques. L'échange et l'acquisition d'ADN sont des
processus relativement fréquents (dépendant de l'espèce
bactérienne ou du type), facilitant l'adaptation environne-
mentale et l'échappement aux agents stressants. Ces phé-
nomènes surviennent fréquemment dans les communautés
bactériennes, y compris au sein des biofilms. Les change-
ments dans l'arsenal génétique peuvent alors conduire à
un phénotype plus ou moins désirable qui sera sélectionné
par la pression environnementale. Par l'intermédiaire d'un
 Chapitre 27. Taxonomie bactérienne à l'heure des technologies nouvelles    255
processus communément appelé « goulot d'étranglement »,
on peut voir apparaître de nouveaux variants bactériens.
L'émergence constante de variants bactériens résistants aux
antibiotiques ou aux antiseptiques courants illustre bien ce
processus continu de sélection. Cette pression de sélection
conduit à une diversification des génotypes et phénotypes
bactériens à l'origine de la diversité des espèces bactériennes
connues actuellement ou encore non identifiées.
Taxonomie polyphasique
La taxonomie polyphasique comprend deux types d'infor-
mations : le phénotype et les informations génomiques.
La taxonomie fondée sur le phénotype étudie la morpho-
logie bactérienne (forme, présence de flagelles, aspects
tinctoriaux comme la coloration de Gram, sporulation,
etc.), l'aspect des colonies (couleur, taille, forme, etc.), la
physiologie (croissance à différentes températures et dans
différentes conditions atmosphériques, pH, concentration
en sel, sensibilité à un bactériophage, etc.). La chimiotaxo-
nomie fondée sur des techniques d'analyse biochimique
comme l'électrophorèse ou la chromatographie fait partie
de l'analyse phénotypique. Elle a permis une grande avan-
cée dans la taxonomie en étudiant les différents constituants
biochimiques (acides aminés, sucres, lipides) de la cellule
bactérienne ou de sa paroi. Elle comprend entre autres l'ana-
lyse des acides gras cellulaires (analyse FAME, ou fatty acid
methyl ester), des acides mycoliques pour les mycobactéries,
des lipides polaires, des quinones, des polyamines ou encore
des exopolysacharides. Comme nous l'avons évoqué, l'hy-
bridation ADN-ADN a été la première technologie molé-
culaire utilisée à des fins taxonomiques. Au cours des trois
dernières décennies, d'autres méthodes moléculaires ont été
introduites. Ces méthodes sont dites de première génération
lorsqu'elles reposent sur l'analyse de l'ADN entier comme
l'approche RFLP (restriction fragment length polymorphism),
dont le typage ribosomal, l'électrophorèse en champ pulsé
(pulsed field gel electrophoresis [PFGE]) ou encore les sondes
à ADN. Elles sont dites de deuxième génération quand elles
consistent à amplifier des fragments d'ADN spécifiques au
moyen de la PCR telles les approches par AFLP (amplified
fragment length polymorphism), AP-PCR (arbitrarily-primed
PCR), rep-PCR (repetitive extragenic palindromic-PCR),
RAPD (random amplification polymorphic DNA), analyse de
l'ADNt, VNTR (variable number of tandem repeat) et LMVA
(multiple loci VNTR analysis).
Au final, les analyses phénotypiques et moléculaires
peuvent conduire individuellement ou de façon combinée
(polyphasique !) à l'identification d'espèces bactériennes
nouvelles ou préexistantes. Cependant, la taxonomie poly-
phasique dans son format actuel peut parfois échouer
dans la dénomination de nouvelles espèces bactériennes.
Vandamme et al. [25] suggèrent alors que la taxomonie
moderne devrait s'appuyer sur le séquençage du génome
complet en association avec des données phénotypiques et
biochimiques. La principale difficulté réside dans l'accep-
tation de cette nouvelle approche taxonomique de façon
consensuelle comme l'outil principal et supportant le code
international de nomenclature bactérienne.
Les technologies « omiques »
comme outils taxonomiques
(taxon « omiques »)
Face à la masse de données générées au cours des analyses
taxonomiques, Vandamme et al. [25] avaient conclu dès
1996 que « la taxonomie dite synthétique serait rendue pos-
sible par le développement de nouvelles stratégies mathé-
matiques et informatiques ». Cette affirmation visionnaire
est devenue maintenant une réalité avec l'émergence des
technologies « omiques » telles que la protéomique, la géno-
mique, la transcriptomique, la lipidomique, la glycomique
qui ont considérablement modifié l'étendue des données
analysables.
À l'ère du big data, l'explosion de la quantité de don-
nées nécessite des technologies d'interprétation à haut
débit. Pour toutes les méthodes analytiques à visée
taxonomique vues précédemment, un point de mesure
unique a été converti en un large ensemble de données.
Par exemple, alors que la chromatographie en phase
gazeuse était auparavant utilisée pour des analyses très
limitées, de nouvelles approches, en particulier celles
couplées à la spectrométrie de masse (mass spectro-
metry [MS]), facilitent la détection, l'identification et
la quantification de molécules parfois au niveau d'une
cellule unique. La combinaison de diverses technolo-
gies « omiques » autorise un inventaire quasi exhaus-
tif de toutes les catégories de molécules cellulaires et
de leurs représentants individuels. Cependant, reste
à définir quelles molécules ou quelle combinaison de
molécules fournissent la meilleure plateforme analy-
tique pour l'identification des espèces. Finalement, les
technologies omiques montreront que beaucoup d'enti-
tés appelées espèces aujourd'hui seraient en réalité des
hybrides d'autres espèces. Bien que de nombreux cher-
cheurs voient les données omiques comme détermi-
nantes dans la définition des espèces, les valeurs de seuil
de « variabilité autorisée » devront être mieux définies.
Quel devrait être le nombre commun de pics dans un
chromatogramme ou bien de changements de nucléo-
tides au sein de séquences d'ADN pour statuer que deux
isolats appartiennent bien à la même espèce ? C'est ce
paramètre quantitatif qui reste à définir et qui devra
être accepté en dernier ressort par les taxonomistes du
monde entier comme le critère de définition d'espèce.
La protéomique et la
spectrométrie de masse
MALDI-TOF pour la taxonomie
bactérienne
L'introduction récente de la spectrométrie de masse
MALDI-TOF dans les laboratoires de microbiologie médi-
cale a révolutionné l'identification des micro-organismes
isolés d'échantillons biologiques et environnementaux. Les
systèmes commerciaux mettant en œuvre cette technologie
sont MALDI BioTyper® de Bruker Daltonics et VITEK® MS,
de bioMérieux.
256   Partie III. Identification et systématique bactérienne
La spectrométrie de masse, technologie fondée sur l'io-
nisation des échantillons, étudie le déplacement d'entités
ioniques dans des champs électromagnétiques et permet
l'identification des micro-organismes grâce à l'analyse de
leur contenu protéique. Une colonie bactérienne ou fon-
gique est étalée sur une cible, recouverte d'une matrice
ionisante et bombardée par un laser. Les ions ainsi générés
sont séparés en fonction de leur temps de vol (time of flight
[TOF]), c'est-à-dire la mesure du temps qu'ils mettent pour
parcourir la longueur du tube de vol. Lorsqu'ils sont soumis
à une tension accélératrice. La zone de vol se situant hors
du champ électrique, la séparation des ions ne dépend que
de la vitesse acquise lors de la phase d'accélération. Ainsi,
les ions avec un rapport masse sur charge (m/z) le plus petit
parviendront au détecteur en premier. Pour chaque groupe
d'ions de même rapport m/z, un signal est enregistré au
niveau du détecteur sous la forme d'une fonction temps/
intensité ; l'ensemble des pics ainsi enregistrés constitue un
spectre de masse. La source d'ions de type MALDI, source
dite « douce », permet la formation d'espèces ioniques prin-
cipalement monochargées ; la séparation des ions ne dépend
ainsi que de leur masse. Parmi les nombreux pics produits,
les principaux correspondent à des protéines ribosomales,
spécifiques d'espèce et peu influencées par les variations
intraspécifiques. Les spectres générés à partir de bactéries
entières sont ensuite comparés aux spectres de référence
de la base de données d'un système expert. Ces spectres
de référence ont été obtenus à partir des souches types et
d'isolats cliniques issus de collections internationales. En
résumé, les profils de pics sont spécifiques d'espèces et par-
fois même spécifiques d'une sous-espèce ou d'un type [7].
Bien que la majorité des protéines détectées par MALDI-
TOF MS soient d'origine ribosomale, d'autres protéines
hautement exprimées peuvent être détectées comme les
ADN et ARN polymérases ainsi que des enzymes impli-
quées dans la synthèse des protéines. Ainsi, toute forme de
taxonomie liée à cette technologie possède les mêmes avan-
tages et inconvénients que la taxonomie fondée sur les gènes
d'ARNr, en tenant compte que la contribution de protéines
non ribosomales reste très limitée. Bien que les microbio-
logistes cliniques aient largement plébiscité la spectromé-
trie de masse en raison de la simplicité des procédures et
de la fiabilité de l'identification des espèces bactériennes, la
technologie en elle-même ne permettra pas une étude taxo-
nomique bactérienne de façon autosuffisante. Cependant,
grâce aux bases de données contenant les spectres de réfé-
rence de centaines d'espèces bactériennes, une taxonomie
dite « pratique » peut être mise en œuvre en routine dans le
laboratoire de microbiologie. La technologie possède une
résolution qui n'a pas été exploitée à son maximum et la
base de données des espèces embarquée dans le système
n'est pas encore exhaustive. Des améliorations dans l'inter-
prétation des données au même titre que des évolutions
technologiques sont envisagées, comme l'amélioration
de la résolution. Les technologies analytiques comme la
chromatographie en phase gazeuse ou liquide trouveront
des applications sur le terrain en combinaison avec la MS.
Néanmoins, à ce jour, le manque de multiplexage et le coût
des équipements sont prohibitifs par rapport à la générali-
sation de leur application.
La génomique pour la taxonomie
bactérienne (génotaxonomique)
La technologie du séquençage de dernière génération (next
generation sequencing [NGS]) a fortement évolué au cours de
ces quelques dernières années tout en révolutionnant l'ana-
lyse génomique et en offrant de nouvelles opportunités dia-
gnostiques dans les laboratoires de microbiologie clinique
[8]. De nouveaux génomes microbiens sont séquencés tous
les jours, permettant la constitution de vastes bases de don-
nées accessibles dans le domaine public de génomes entiers
ou de séquences de gènes individuels (Tableau 27.1). La
possibilité de caractériser des communautés microbiennes
complètes en s'affranchissant de l'étape de culture a ouvert
les domaines devenus très populaires de la métagénomique
et de l'analyse du microbiome que nous détaillerons plus
loin. Le microbiote humain est désormais considéré comme
un organe à part entière, plutôt que comme une collection
de micro-organismes. Le NGS a permis de dévoiler des
informations sur les interactions entre le micro-organisme
et son hôte, la littérature médicale regorgeant d'exemples
illustrant la manière dont cette technologie peut être uti-
lisée à des fins de diagnostic clinique ou pour l'étude des
pathogènes. Cependant, l'introduction du NGS dans la pra-
tique médicale ne pourra se faire rapidement en raison de
nombreux challenges, tels que la nécessité de réaliser des
essais cliniques, l'absence actuelle de cadre réglementaire ou
bien l'adaptation nécessaire de la technologie à l'environne-
ment clinique. Le NGS demeure une technologie coûteuse
et complexe dont le temps de rendu des résultats se compte
encore en jours plutôt qu'en heures, et dont l'interprétation
des résultats demeure délicate, nécessitant une expertise
très pointue. Toutefois, les communautés scientifiques, du
diagnostic et de la taxonomie s'accordent sur le fait que
le NGS sera au centre de futurs développements de tests
diagnostiques.
Les séquences génomiques, et plus particulièrement
celles issues de génomes entiers, sont considérées comme
des informations optimales pour la taxonomie. Le séquen-
çage génomique existe depuis des décennies ; la technologie
désormais obsolète de séquençage chimique « Maxam et
Gilbert » était déjà utilisée à des fins taxonomiques. Faisant
suite à la méthode de séquençage enzymatique de Sanger,
dite de terminaison de chaînes, l'avènement de nouvelles
générations de séquençage a permis d'accroître à la fois
la vitesse et le rendement tout en réduisant les coûts de
manière significative. Des technologies encore plus sophis-
tiquées dites de 3e ou 4e génération, telles que le séquençage
par nanopore, sont en cours de développement et permet-
tront l'utilisation de séquences de génomes entiers à des fins
taxonomiques (Tableau 27.2).
Dans le cadre de la révision de la taxonomie, de nouvelles
définitions sont nécessaires. Dans les débats sur la taxo-
nomie génétique, une unité taxonomique opérationnelle
(operational taxonomic unit [OTU]) est définie comme une
espèce ou un groupe d'espèces s'appuyant seulement sur les
données de séquences d'ADN disponibles. C'est l'unité de
diversité microbienne la plus couramment utilisée [3]. La
définition de l'OTU telle que donnée par le National Center
for Biotechnology Information (NCBI) est la suivante :
 Chapitre 27. Taxonomie bactérienne à l'heure des technologies nouvelles    257

Tableau 27.1 Génomes d'espèces bactériennes, connues ou nouvelles, impliquées en pathologie

infectieuse humaine publiés dans la revue ASM Journal Genome Announcements (novembre-décembre
2015).
Espèce bactérienne Connue ou nouvelle Nombre de souches Source
Acinetobacter baumannii Connue 3 Bacteriémie
Bacillus anthracis Connue 3 Anthrax cutané
Bacteroides periocalifornicus Nouvelle 1 Periodontite
Bartonella ancashensis Nouvelle 1 Bartonellose, verruga peruana
Bordetella pertussis Connue 11 Coqueluche, souches échappant
au vaccin
Burkholderia pseudomallei Connue 1 Isolat clinique, multirésistant
Campylobacter jejuni Connue 3 Syndrome de Guillain-Barré
et gastro-entérite
Campylobacter ureolyticus Connue 1 Infection génitale
Enterococcus faecalis Connue 1 Souche de référence ERV
(entérobactérie résistant
à la vancomycine)
Escherichia coli Connue 4 Septicémie
Famille des Chitinophagaceae Nouvelle 1 Tumeur péritonéale
Francisella tularensis Connue 1 Isolat humain
Gardnerella vaginalis Connue 1 Infection génitale
Haemophilus influenzae Connue 8 Isolats cliniques
Klebsiella pneumoniae Connue 1 Infection sur cathéter par voie
veineuse centrale
Mycobacterium chimaera Nouvelle (ou variant) 3 Sécrétions respiratoires
Mycobacterium mucogenicum Nouvelle 1 Prélèvement respiratoire
Mycobacterium peregrinum Nouvelle 1 Prélèvement respiratoire
Mycobacterium tuberculosis Connue 2 Crachat, souche multirésistante
Porphyromonas gingivalis Connue 2 Periodontite
Propionibacterium acnes Connue 2 Hypomélanose maculaire progressive
Pseudomonas aeruginosa Connue 4 Infection respiratoire
Salmonella enterica Connue 3 Gastro-entérite, souche
multirésistante
Serratia marcescens Connue 1 Infection urinaire
Serratia rubidaea Connue 1 Infection opportuniste
Staphylococcus aureus Connue 1 Souche de référence SASM
(S. aureus sensible à la méticilline)
Yersinia pestis Connue 19 Peste
27 espèces bactériennes 6 nouvelles 81 souches

« le niveau taxonomique d'échantillonnage sélectionné par
l'utilisateur pour être utilisé dans une étude, comme les indi-
vidus, les populations, les espèces, les genres ou les souches
bactériennes ». Wooley et al. [27] proposent la définition sui-
vante : « l'unité taxonomique opérationnelle, distinction des
espèces en microbiologie utilisant l'ARNr et un seuil de pour-
centage de similarité pour classer les microbes dans le même
ou dans des OTU différents ». Les OTU sont donc des unités
taxonomiques importantes dans la taxonomie génomique.
Bien que la notion d'OTU ne soit pas utilisée de façon très
homogène, cette notion définit les caractéristiques de base de
la taxogénomique que nous allons évoquer ci-dessous.
Les séquences de génomes complets peuvent être
générées pour n'importe quelle espèce bactérienne culti-
vable ou pour laquelle une biomasse suffisante peut être
obtenue. Même si la spectrométrie de masse MALDI-
TOF semble aujourd'hui être la méthode la plus pratique
pour une étude à visée taxonomique, les données de
séquences contiennent une telle masse d'informations
biologiques, fonctionnelles et taxonomiques que la majo-
rité des taxonomistes sont convaincus que le séquençage
de génomes complets sera la source ultime d'informa-
tions avec lesquelles un cadre taxonomique final pourra
être construit.
258   Partie III. Identification et systématique bactérienne

Tableau 27.2 Comparaison des plateformes de séquençage nouvelle génération (next generation
sequencing [NGS]) du génome complet (whole genome sequencing [WGS])*.
Plateforme de Illumina MiSeq® et Ion Torrent PGM® Pacific Bioscience PacBio Oxford Nanopore
séquençage HiSeq® RS® minION®

Mécanisme de Étape de Étape de Pas d'étape de Pas d'étape de

séquençage pré-amplification pré-amplification pré-amplification pré-amplification
Séquençage par synthèse Séquençage par synthèse Séquençage utilisant un Séquençage par
sur semi-conducteur marquage fluorescent nanopore, détection par
courant électrique
Longueur des « read » ≥ 150 pb ~ 200 pb ~ 1 500 pb ~ 10 000 pb max.
(≥ 1500 pb avec le
nouveau robot)
Rendement ~ 1,5–2 Gb pour MiSeq
® 20–50 Mb (314 chip) 100 Mb >  500 Mb en 48 h
® 100–200 Mb (316 chip)
600 Gb max. pour HiSeq
1Gb (318 chip)
Temps/cycle (run) ® 2h 2h Jusqu'à 3 jours mais
27 h pour MiSeq à
® premières données
11 jours pour HiSeq
disponibles en quelques
heures (≤ 6 h)
Préparation automatisée Oui Oui Protocole rapide Protocole de 2 h
de la librairie disponible sans
préparation de la librairie
Quantité d'ADN 50–1000 ng 100–1 000 ng ~ 1 μg 20 ng min.
nécessaire
Taux d'erreurs ® 1,7 % 12,8 % 5–40 %
0,8 % pour MiSeq
®
0,3 % pour HiSeq

* Il est important d'insister sur le fait que cette table ne représente qu'un instantané au jour de sa création et ne sert qu'à un but comparatif puisque chacune
des technologies mentionnées ci-dessus évolue à une vitesse incompatible avec la mise en place d'un tableau à la fois exhaustif et en permanence à jour.
D'après Quail MA, Smith M, Coupland P, et al. A tale of three next generation sequencing platforms : comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina
MiSeq sequencers. BMC Genomics 2012 ; 13 : 341 ; et Liu L, Li Y, Li S, et al. Comparison of next-generation sequencing systems. J Biomed Biotechnol 2012 ;
2012 : 251364), ainsi que d'autres données publiques sur internet disponibles à ce jour (www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide-2014/).

Dans le cadre de l'utilisation des séquences génomiques
en taxonomie, il existe toutefois différents points critiques :
(1) les souches types utilisées doivent être soigneusement
choisies ; (2) la base de données de référence doit être fiable ;
(3) les OTU doivent être clairement définies ; (4) les outils
d'analyse comparative pour vérifier si une nouvelle séquence
est proche (ou pas) d'une séquence de référence doivent être
clairement spécifiés. Afin d'établir des comparaisons géno-
miques fiables, la plupart des taxonomistes préfèrent sépa-
rer les séquences génomiques dans différentes catégories :
les core-gènes (partagés par tous les isolats d'une espèce
donnée), les core-gènes variables (ceux qui varient significa-
tivement mais uniformément présents dans une espèce), les
gènes variables (faisant partie du pangénome, représentant
l'accumulation de tous les gènes présents dans une espèce
plutôt qu'une souche de cette espèce, mais présents de façon
sélective dans une fraction de ces génomes) et les éléments
génétiques mobiles qui doivent être considérés à part pour
une taxonomie optimale. On constate actuellement une
tendance nette vers l'utilisation de core-gènes pour l'ordon-
nancement taxonomique [9, 15, 23]. Le nombre de gènes
utilisés pour ces analyses peut varier selon l'espèce, mais
habituellement il n'excède pas 1 000 gènes [18]. La question
principale reste la définition d'une identification au niveau
de l'espèce qui soit utilisable. Dans le passé, une valeur de
seuil de 97 % d'homologie de l'ARN ribosomal était utilisée,
ou bien une valeur de 70 % d'hybridation ADN-ADN, mais
les nouvelles technologies à haut débit exigent des méthodes
de calcul plus sophistiquées et innovantes [4]. Toutefois, une
approche simple consiste à calculer la moyenne d'identité
de nucléotides (average nucleotide identity [ANI]) [13] pour
laquelle une valeur de 70 % d'hybridation ADN-ADN se tra-
duit par une ANI comprise entre 95 et 96 % [17]. De façon
alternative, la distance phylogénique entre génomes fondée
sur des technologies classiques d'alignement de génome
BLAST (basic local alignement search tool) constitue un
outil pouvant être utilisé même sans avoir recours à l'anno-
tation de génome [10]. Beaucoup d'autres systèmes ont été
développés. La plupart utilisent des séquences annotées et
fondent l'analyse phylogénique sur la comparaison directe
des séquences pour lesquelles la stabilité phylogénétique et
taxonomique peut être déduite d'après les restrictions struc-
turales et/ou fonctionnelles des protéines impliquées. La
plupart de ces méthodes s'apparentent au séquençage multi-
locus (multi locus sequence typing [MLST]) dont les données
générées peuvent être calibrées au niveau de l'espèce mais
aussi au niveau de la sous-espèce ou de la souche [15, 20].
La MLST classique nécessitant habituellement entre 2 et
10 gènes se trouve largement dépassée depuis par la MLST
génomique qui peut utiliser des milliers de gènes en fonc-
tion de la taille du core-génome de l'espèce.
Beaucoup d'optimisations sont attendues dans les années
à venir. Les données génomiques doivent être classées, réfé-
rencées et cumulées avec d'autres informations comme les
 Chapitre 27. Taxonomie bactérienne à l'heure des technologies nouvelles    259
données cliniques, démographiques, environnementales et
aussi épidémiologiques. Les grandes initiatives publiques
sont déjà engagées dans le développement de ces res-
sources et leur accessibilité dans le domaine public via des
programmes nationaux ou internationaux tels que le pro-
gramme européen COMPARE (www.compare-europe.eu).
À terme, la spectrométrie de masse permettra de détec-
ter une nouvelle espèce potentielle et l'analyse ultérieure
du génome viendra définitivement confirmer l'existence de
cette nouvelle espèce [6].
Pertinence de la métagénomique
pour l'évolution de la taxonomie
bactérienne
La notion de génotaxomique que nous avons intro-
duite précédemment est fondée sur la disponibilité
de séquences de génomes « purs » obtenus à partir de
souches microbiennes préalablement cultivées, isolées
et caractérisées. Or, des séquences de génomes entiers
ou partiels peuvent être générées pour des espèces pour
lesquelles des quantités limitées de biomasse sont obte-
nues et qui ne sont disponibles que dans des échantil-
lons polymicrobiens ou au sein de cultures mixtes. Une
large fraction des bactéries terrestres n'a pas encore été
cultivée, et donc isolée, puisque les conditions optimales
de culture de ces bactéries n'ont pas encore été détermi-
nées. La caractérisation de nouveaux procaryotes direc-
tement issus d'un mélange sans culture préalable, soit
par le séquençage de leur ARN ribosomaux, soit par le
séquençage de leur ADN total extrait et purifié, est appelé
métagénomique. La métagénomique permet de connaître
le métagénome, c'est-à-dire l'ensemble des génomes des
micro-organismes qui proviennent d'une même niche
écologique. Quand l'approche ribosomale est utilisée,
les espèces peuvent être cataloguées (et quantifiées)
sur la base (du nombre) des séquences lues couvrant la
séquence du gène ribosomal. Cette approche est quasi
équivalente à la procédure classique de taxonomie fondée
sur l'ARNr 16S utilisée au siècle dernier. L'approche par
séquençage des ADN totaux grâce au NGS est plus avan-
cée mais crée de nouveaux challenges bio-informatiques.
La métagénomique permet la découverte de nouvelles
espèces bactériennes, potentiellement des pathogènes
humains, mais aussi la découverte de capacités physio­
logiques inconnues jusqu'alors pour certaines espèces
[16]. La procédure de séquençage ne constitue que la
première étape d'une longue série pour finaliser la carac-
térisation. De nombreux projets de métagénomique uti-
lisent des protocoles standard d'analyses génomiques :
séquencer le plus possible (on parle de profondeur de
séquençage, chaque morceau d'ADN étant séquencé
plusieurs dizaines de fois), assembler les lectures (petits
morceaux d'ADN qu'on obtient en sortie d'un séquen-
ceur) en morceaux plus grands, puis finalement annoter
les séquences génomiques. Or, dans tout le processus,
les espèces très faiblement représentées dans l'échantil-
lon ont toutes les chances d'être considérées comme des
artéfacts et ainsi ignorées ; cela peut mener à des biais
lors de l'analyse des données. Comme la génomique et
la métagénomique ne répondent pas à la même question,
le logiciel d'interprétation pour l'analyse des données de
métagénomique devient alors un élément crucial. Si la
génération des données n'est plus un point limitant d'une
étude métagénomique, c'est dorénavant l'analyse de ces
gros jeux de données qui pose problème aux logiciels
existants, et nécessite le développement de nouveaux
logiciels [2]. Par exemple, pour toutes les lectures, on doit
investiguer si elles appartiennent à un seul chromosome
ou non. Le processus taxonomique requiert alors des
temps de calculs très longs, exige du matériel sophistiqué
et donc des budgets conséquents. Le filtrage et la curation
des données constituent également des étapes critiques
car le regroupement des OTU et l'annotation ne pourront
être réalisés qu'en utilisant des données justes et avec des
bases de données de référence fiables [1]. La revue de
tous les logiciels disponibles va au-delà du cadre de ce
chapitre, le lecteur intéressé pourra se référer à une revue
récente sur ce sujet [19].
En conclusion, beaucoup d'outils mathématiques ont
déjà été développés ces dernières années, mais des modules
logiciels additionnels viendront à l'avenir optimiser et accé-
lérer encore davantage l'interprétation des données dans le
champ de la métagénomique.
Conclusion et perspectives
Les nouvelles biotechnologies nous font appréhender la
taxonomie bactérienne sous une forme totalement dif-
férente. Avec une approche protéomique, il est possible
d'interpréter des profils d'expression protéiques complexes
avec une résolution inégalée jusqu'à ce jour. La protéo-
mique nous aidera alors à analyser les protéines hautement
exprimées au sein d'une espèce bactérienne à des fins de
classification. L'approche génomique avec le séquençage du
génome complet, quant à elle, autorise une comparaison de
souches bactériennes à l'échelle du nucléotide. La transition
d'une taxonomie polyphasique classique vers une forme
de taxon« omique » gouvernée par le génome nécessitera
un peu de temps et, afin de supporter et renforcer cette
approche, l'association avec des données phénotypiques sera
encore nécessaire. Nous sommes convaincus qu'un nou-
veau modèle de taxonomie est à établir de façon urgente,
de même que, par exemple, la description du contenu du
microbiome procaryotique humain nécessitera encore
d'affiner les technologies [11]. Le NGS va pouvoir répondre
à certaines exigences requises pour la mise en place d'un
processus taxonomique « nouvelle génération ». Toutefois,
la définition des critères concernant la délimitation des
espèces requiert avant tout le soutien de l'ensemble des taxo-
nomistes microbiens. En tout état de cause, l'établissement
de ces nouvelles approches taxonomiques va augmenter de
façon considérable les relations entre les disciplines scien-
tifiques autrefois relativement distantes, qu'il s'agisse de la
biologie, des mathématiques appliquées ou de la bio-infor-
matique. Avec un peu de recul, si l'on regarde les récentes
évolutions technologiques spectaculaires dans ce domaine,
on peut sans doute considérer qu'il s'agit d'un véritable pas
de géant pour une seule génération de taxonomistes…
260   Partie III. Identification et systématique bactérienne
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