Matière de Microbiologie Chargé de la matière : Dr.

RAHLI Fouzia
2ème année des classes préparatoires

Fiche de TD n° 06 : Les méthodes de mesure de la croissance bactérienne

1. Définition :

La croissance se définit comme l’accroissement ordonné de tous les composants d’un

organisme. Chez les organismes pluricellulaires, elle conduit à une augmentation de la taille.
Chez les microorganismes unicellulaires conduits à une augmentation du nombre de cellules.

La croissance peut être étudiée sur milieu solide, la multiplication donne naissance à une
colonie microbienne; ou sur milieu liquide, en favorisant une bonne dispersion des cellules.

2. Les méthodes de numération :

Deux grandeurs permettent de définir ou d’estimer une population microbienne: la masse

cellulaire (quantité de biomasse), et le nombre de cellules (individus).

Il existe de nombreuses techniques de numération. Certaines ne permettent pas de différencier

les germes vivants des germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter
individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associées.

On distingue les techniques directes qui s’appliquent aux cellules microbiennes et les
techniques indirectes, qui s’appliquent aux cultures qui en sont issues.

Dans les deux cas, la numération n’est possible que si la concentration cellulaire de
l’échantillon à analyser est adéquate. Effectuer des dilutions si la concentration est trop forte
ou au contraire une concentration si elle est trop faible.

Techniques de dilution:

Une série de dilutions décimales est réalisée: 0,1 (10-1); 0,01 (10-2) ; 0,001 (10-3), etc.Le
diluant doit être neutre vis-à-vis les microorganismes.

Techniques de concentration:

La concentration proprement dite ne modifie pas le nombre de germe en valeur absolue mais
elle permet leur localisation d’un petit volume.

 La filtration: identique à la filtration stérilisante, permet de concentrer les

microorganismes.
 La centrifugation : utilisée pour séparer les matières en suspension dans un produit.

2.1. Techniques de numération :

a) Numération par microscope :

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On peut déterminer le nombre total de cellules par numération microscopique. Cette technique
est couramment utilisée avec les levures mais autant avec les bactéries compte tenu de leur
faible taille. Lorsque les microorganismes sont mobiles, il faut pratiquer une fixation.

 Comptage à l’hématimètre :

En utilisant les cellules de Thoma ou de Malassez. Cette méthode n’est valable que si le
nombre de germe au ml est suffisant >106. Par cette méthode, toutes les cellules sont
dénombrées quel que soit leur état physiologique.

 Numération sur frottis :

Il est également possible d’estimer au microscope le nombre de microorganismes d’un produit

donné après étalement et coloration.

b) Numération après culture en milieu solide :

Cette technique est basée sur le fait qu’une cellule, placée dans un milieu solide favorable,
donnera naissance à une colonie macroscopiquement visible. Elle ne permet pas de distinguer
une cellule d’un amas cellulaire. Pour cette raison, les résultats s’expriment en unités formant
colonie (UFC).

 Inoculation dans la masse :

1ml de chaque dilution est placé dans une boite de Pétri. Ensuite 10 à 15ml du milieu de
culture sont coulés dans la boite et homogénéisés. Ce type de numération convient
parfaitement aux germes aéro-anaérobies.

 Inoculation en surface:

0,1ml de chaque dilution est déposé à la surface d’un milieu gélosé coulé en boite de Pétri.
Puis étalé sur toute la boite. Ce type de numération est bien adapté pour les germes aérobies.

c) Numération après culture en milieu liquide :

Cette méthode est basée sur le fait qu’après ensemencement d’un milieu liquide, toute
croissance microbienne indique la présence d’au moins un germe, unité formant trouble
(UFT).

Le développement peut être apprécié, visuellement par turbidimétrie, par virage d’un colorant,
etc. Elle présente des avantages par rapport à la technique en milieu solide:

Elle facilite le développement des microorganismes. Elle permet d’étudier plusieurs caractères
à la fois (croissance, modification du pH, production de gaz, etc).

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Tables de Mac Grady de trois tubes par dilution :

Nombre Nombre de Nombre Nombre de Nombre Nombre de
caractéristique cellules caractéristique cellules caractéristique cellules
000 0.0 201 1.4 302 6.5
001 0.3 202 2.0 310 4.5
010 0.3 210 1.5 311 7.5
011 0.6 211 2.0 312 11.5
020 0.6 212 3.0 313 16.0
100 0.4 220 2.0 320 9.5
101 0.7 221 3.0 321 15.0
102 1.1 222 3.5 322 20.0
110 0.7 223 4.0 323 30.0
111 1.1 230 3.0 330 25.0
120 1.1 231 3.5 331 45.0
121 1.5 232 4.0 332 110.0
130 1.6 300 2.5 333 140.0
200 0.9 301 4.0

2.2. Techniques d’estimation de la biomasse :

a) Détermination du poids sec :

Les microorganismes sont récoltés par centrifugation ou par filtration sur membrane. Après
un lavage soigneux à l’aide d’un tampon approprié, le culot ou le filtre est desséché à 100-
110°C jusqu’à poids constant.

Les résultats sont exprimés en gramme de matière sèche par kilo de milieu. La mesure du
poids sec totalise toute la masse cellulaire, vivante et morte.

b) Mesure du trouble :

C’est le procédé le plus simple, le plus rapide. Il consiste à mesurer la transmission de la

lumière au travers d’une culture à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de
650 nm. La technique est inapplicable avec les milieux de culture très colorés ou troubles.
Comme elle est incapable de différencier les cellules mortes des cellules vivantes.

c) Autres techniques indirectes :

Mesure de l’activité: on peut mesurer soit :

La consommation d’un substrat présent dans le milieu, soit :

Un constituant cellulaire, soit :

Une molécule excrétée par les cellules, soit :

Encore une variation physico-chimique du milieu.

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