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microbiologie
L3 – Microbiologie
2021-2022 Dr. Quadri
Dr.QUADRI
Programme
Dr.QUADRI
Matière
Biomolécule
première Extraction Extrait brut Purification
pure
(microbienne)
Physique (choc
osmotique) Filtration
Mécanique
(congélation-
Centrifugation
décongélation,
broyage,
sonication)
Chromatographie
Chimique (solvant
organique)
L’électrophorèse
Enzymatique
3
Extraction des molécules bioactives (biomolécules):
mécanique (Sonication)
Bain ultrasonique
4
Extraction des molécules bioactives (biomolécules): chimique
Croissance (OD 600nm)
1.6 40
1.4 35
1.2 30
1 25
0.8 20
0.6 15
0.4 10
0.2 5
0 0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Temps (h)
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Extraction des molécules bioactives
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Extraction des molécules bioactives
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Méthodes d’identification et de dosage des
biomolécules
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Techniques chromatographiques
Les méthodes chromatographiques sont les méthodes les plus importantes de l’analyse
immédiate. Elles permettent de séparer les constituants d’un mélange plus ou moins
complexe. Et peut également assurer dans certaines conditions l’identification et la
détermination quantitative des substances.
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Méthodes chromatographiques Principe
Chaque molécule sera plus ou moins rapidement entraînée selon son affinité pour,
respectivement, la phase stationnaire et la phase mobile, permettant la séparation
des différents constituants présents.
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Méthodes chromatographiques Principe
• Celles-ci sont plus ou moins retenues selon l’importance de leur interaction avec la
phase stationnaire
• Les molécules sont alors entrainées plus ou moins vite en fonction de leurs
propriétés physico-chimiques, ce qui permet leur séparation.
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À partir de ce principe très général, il existe de très nombreux types de
chromatographie en fonction de la nature de la phase stationnaire, de la nature de la
phase mobile, et de la nature des interactions entre ces phases et les molécules à
purifier.
En effet, selon les cas, les facteurs physico-chimiques qui interviennent comme
critère de séparation sont totalement différents : ce peut être la masse moléculaire, la
charge, l’hydrophilie/hydrophobicité, la structure tridimensionnelle, etc.
Évidemment, le choix est effectué au cas par cas en fonction des besoins. Il n’est
d’ailleurs pas rare d’utiliser successivement plusieurs types de chromatographies
différentes au cours d’une même purification.
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Le principe de l'extraction est simple :
Soit un soluté S réparti entre 2 phases non miscibles (1) et (2).
A l'équilibre, on a :
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Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation
au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration ou
à la quantité du soluté en sortie de la colonne.
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Un constituant est caractérisé par son temps de
rétention tR, qui représente le temps écoulé entre
l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le
chromatogramme au maximum du pic qui lui est lié.
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Classification des chromatographies
4. Classification fondée sur les modalités adoptés pour immobiliser la phase stationnaire
(sur papier ou couche mince, sur colonne)
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Classification basée sur les phénomènes physicochimiques
à la base de séparation
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Le phénomène repose sur le fait qu’en principe deux corps différents ne se partagent pas
Partage de façon identique entre deux phase.
Les rapports de leurs solubilités dans les deux phases , c-à-d leurs coefficients de partage
ne sont pas égaux
L’adsorption est l’accumulation des substances à la surface d’une des deux phases.
Adsorption Elle est du à des forces de cohésion et aux interactions polaires.
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La phase stationnaire est un gel ou un réseau
Exclusion-
macromoléculaire exerçant un véritable de tamis vis-à-vis de
diffusion
grosses molécules, celles- ci migrant plus vite que les
molécules de faible poids moléculaire.
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• Méthodes chromatographiques
Types de chromatographie
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• Méthodes chromatographiques CCM
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• Méthodes chromatographiques CCM
Elle comprend :
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• Méthodes chromatographiques CCM
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• Méthodes chromatographiques CCM
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• Méthodes chromatographiques CCM
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• Méthodes chromatographiques CCM/Bioautographie
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• Méthodes chromatographiques CCM/Bioautographie
254 nm 366 nm
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Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
C’est une technique très répandue. Son développement est du à sa grande sensibilité, à sa polyvalence,
à la rapidité et aux possibilité d’automatisation.
Principe
La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et une phase
mobile gazeuse.
La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de ces composés pour la phase mobile
et pour la phase stationnaire.
Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une substance
liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte,
appelé « gaz vecteur », qui constitue la phase mobile.
Limites: seuls les composés suffisamment volatiles et thermiquement stables peuvent être analysés
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• Méthodes chromatographiques CPG
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• Méthodes chromatographiques CPG
• Un injecteur
• Un système de détection
• Un dispositif
d’enregistrement
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Gaz vecteur Injecteur Détecteur
Porte d’entrée de l’échantillon Colonne
(phase mobile) Placés immédiatement à la
Fonctions: vaporiser et entrainer (phase stationnaire)
Hélium, diazote sortie de la colonne.
en tète de colonne l’échantillon Colonne remplie ou
ou dihydrogène Destiné à fournir un signal
mélangé au gaz vecteur colonnes capillaire.
dont l’exploitation conduira
au chromatogramme.
Enceinte thermostatée
Ou four, permet de chauffer la
colonne jusqu’à 400°C.
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• Méthodes chromatographiques CPG
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• Méthodes chromatographiques CPG-MS
une technique en chimie analytique utilisée pour séparer, d'identifier et de quantifier chacune des
composantes en mélange
- Applicables aussi sur des solutés thermolabiles et des masses moléculaires plus grandes ( comparé à
la CPG)
- Efficacité des colonnes est plus faible que celles utilisé en CPG
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Méthodes chromatographiques HPLC
Principe
• Une pompe est utilisée pour fournir un écoulement continu d'un solvant dans lequel un
échantillon dissous est introduit.
• Une fois que l'échantillon dissous est introduit, il voyage à travers une colonne analytique
contenant la phase stationnaire et les analytes dans le mélange d'échantillon dissous sont ensuite
séparés en fonction de leur affinité pour les particules enrobées dans la colonne.
• Une fois que les composants de l'échantillon sont séparés, ils peuvent passer à travers un
assortiment de détecteurs. La réponse du détecteur et le «temps de rétention» (temps nécessaire
pour qu'un composé passe de l'injecteur au détecteur) du ou des composés d'intérêt peuvent alors
être comparés à un matériau de référence.
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• Méthodes chromatographiques HPLC
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• Méthodes chromatographiques HPLC
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• Méthodes chromatographiques HPLC
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• Méthodes chromatographiques Chromatographie d’exclusion
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• Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions
Principe
- Ce procédé de séparation est basé sur des processus d'échange d'ions se produisant entre les
analytes dans la phase mobile et la résine fixée sur la colonne.
- La chromatographie d'échange d'ions est utilisée pour séparer les anions et les cations inorganiques
et organiques.
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• Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions
Principe
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• Méthodes chromatographiques Chromatographie échangeuse d’ions
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Techniques spectroscopiques
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• Méthodes spectroscopiques
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• Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible
Soumis à un rayonnement dans cette gamme de longueurs d'onde, les molécules, les ions ou les
complexes sont susceptibles de subir une ou plusieurs transition électronique(s). Cette
spectroscopie fait partie des méthodes de spectroscopie électronique.
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• Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible
Principe
• L’échantillon à analyser est traversé par un rayonnement lumineux de longueur d'onde allant
de 100-800 nm.
• Les photons issus du rayonnement transfèrent aux composés analysés une énergie qui excite
les molécules, atomes ou ions traversés. Ainsi une partie du rayonnement incident est absorbé.
• L'étude du rayonnement après passage à travers la substance analysée permet d'obtenir des
informations sur sa nature.
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• Méthodes spectroscopiques Spectroscopie UV-visible
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• Méthodes spectroscopiques La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse est une technique analytique qui permet d’identifier et de doser une
substance ou un élément chimique.
Principe
Elle est fondée sur la séparation et la détection d’ions formés dans une source d’ionisation ou dans
une chambre de collision.
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• Méthodes spectroscopiques MALDI-ToF MS
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MALDI TOF MS
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• Méthodes spectroscopiques MALDI-ToF MS
Identification des
microorganismes
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• Méthodes spectroscopiques RMN
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique analytique
puissante qui peut révéler des informations structurelles sur de nombreuses molécules
organiques et inorganiques.
Constitue actuellement la technique la plus puissante et la plus générale d’analyse structurale
des composés organiques
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• Méthodes spectroscopiques RMN
Utilisation
•Analyse quantitative
•Cinétique de réaction
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• Méthodes spectroscopiques RMN
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• Méthodes spectroscopiques RMN
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• Méthodes spectroscopiques RMN
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