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Dépannage
Guide
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Dépannage HPLC
Uwe D. Neue, Société des eaux

1. Durée de vie de la colonne 27. Débits optimaux

2. Temps de rétention variables 28. Charge de carbone

3. Dérive des temps de rétention 29. Contrôle du pH

4. Colonne à colonne et lot à lot 30. Composition de la phase mobile

Reproductibilité 31. Contamination de la colonne

5. Problèmes de préparation des échantillons 32. Vérification de la méthode

6. Sources de traînée de pic 33. Double pics dans les séparations de sucre

7. chromatographie en phase normale 34. Contrôle de la méthode

8. Volume du système, volume mort, volume d'attente 35. pH de la phase mobile

9. Transfert des méthodes de gradient 36. Améliorations du rapport signal sur bruit

10. Système bouché 37. Surcharge

11. Comptage sur plaque de colonne 38. Durabilité de la colonne

12. Contre-pression de la colonne 39. Analyse rapide et contre-pression de colonne

13. Fluctuations de la zone de pointe 40. Rétrolavage de colonne

14. Pics fantômes 41. Changement de sélectivité

15. Dépendance des temps de rétention sur le pH 42. Nouvelle méthode

16. Équilibrage de la colonne 43. Pics négatifs

17. Conditionnement de la colonne 44. Délicat, fastidieux, chronophage

18. Matrices d'échantillons complexes 45. Séparations rapides

19. Effondrement hydrophobe 46. Tampons pour LC/MS

20. Bruit de base 47. Tampons alcalins pour RPLC

21. Colonnes à alésage étroit 48. Dérivatisation post-colonne

22. Échantillon de solvant 49. Volume de maintien dégradé

23. Mise à l'échelle des dégradés 50. Capacité tampon

24. Stockage de colonne 51. Changements de débit et quantification

25. Chromatographie à ions appariés 52. Analyse des composés polaires

26. Stabilité hydrolytique de la phase inversée

Emballages

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1. Durée de vie de la colonne
Q. : Ma colonne n'a duré qu'environ 100 injections. Après ce temps, les pics se sont
déformés et les comptages sur plaque étaient très faibles. Qu'est-ce qui ne va pas?
R. : 100 injections, c'est en effet une courte durée de vie. Dans des circonstances
normales, on peut s'attendre à ce qu'une colonne soit en service beaucoup plus
longtemps. Afin de déterminer ce qui ne va pas, nous devons d'abord déterminer si
la durée de vie courte de la colonne est la règle pour votre application ou non.
Il existe deux cas fondamentaux :
1. Auparavant, les colonnes utilisées pour le même test duraient
beaucoup plus longtemps. 2. toutes les colonnes utilisées pour
cette application meurent après environ la même quantité
d'utilisation.
Dans le premier cas, on chercherait à savoir si le dosage est resté vraiment
constant. La composition de l'échantillon a-t-elle changé ? Les contaminants fortement
adsorbés dans votre échantillon peuvent détruire les performances de la colonne.
Les joints du circuit de fluide de votre instrument sont-ils en bon étatÿ? La perte de
joints peut obstruer les filtres de la colonne et les couches supérieures du garnissage
et affecter ainsi la distribution de l'échantillon.
Si l'on peut être raisonnablement assuré qu'il n'y a pas de changement dans les
conditions chromatographiques, on peut sans risque supposer que la cause du
problème est une faiblesse mécanique du lit garni. Cela peut être provoqué par une
manipulation brutale de la colonne dans votre laboratoire (l'avez-vous fait tomberÿ?)
ou lors de l'expédition, ou il peut s'agir d'un défaut de fabrication. Un tel défaut ne
peut pas être détecté par le CQ de la colonne standard et pourrait n'apparaître
qu'après une certaine utilisation de la colonne. Dans ce cas, les fabricants de
colonnes remplaceront votre colonne gratuitement.
Q. : C'est gentil de la part de ces fabricants, mais ce n'est pas mon problème. Mes
chroniques ne durent toujours que peu de temps.
Parfois, c'est 100 injections, parfois 200. Je pourrais vivre avec 200 injections, mais
seulement 100, ce n'est pas suffisant. Cela devient vraiment cher. Que puis-je faire?
R. : Je suis d'accord avec vous à 100 %. Ce que nous devons faire ensemble, c'est
trouver la cause de votre problème et ensuite voir ce que nous pouvons faire pour y
remédier.
La cause la plus probable de votre problème est l'adsorption des constituants de
l'échantillon sur le haut de la colonne. Ils peuvent soit précipiter en raison d'une faible
solubilité dans la phase mobile, soit être fortement adsorbés. Au fur et à mesure que
vous injectez de plus en plus d'échantillons, ces contaminants s'accumulent au
sommet de la colonne et empêchent l'échantillon de s'adsorber et de se distribuer
correctement. Il en résulte une distorsion du profil de crête.
Souvent, ce problème s'accompagne d'une augmentation du dos
pression.
Q. : OK, ça pourrait être ça. Comment contourner ce problème ?
R.ÿ: Il existe plusieurs façons d'éviter que cela ne se produise.
L'une consiste à nettoyer l'échantillon avec une technique de préparation d'échantillon
appropriée. Extraction en phase solide à l'aide d'un SPE
3
cartouche avec une chimie similaire à celle de la colonne de séparation fonctionne
bien pour ce problème.
Une autre approche plus puissante consiste à utiliser une colonne de garde. La
précolonne sert de tête de colonne sacrificielle qui est remplacée lorsque le problème
survient. Pour de meilleures performances, vous devez utiliser une colonne de garde
qui contient exactement le même garnissage que la colonne analytique et qui est
garnie avec la même technique de garnissage haute performance que la colonne
analytique. Si vous utilisez des précolonnes fabriquées avec une autre marque de
garnissage, vous n'obtiendrez pas les performances optimales tant en capacité de
séparation qu'en protection de votre colonne analytique. De plus, n'utilisez pas une
taille de particules plus grande. Des particules plus grosses ou des précolonnes mal
garnies peuvent entraîner une détérioration de la séparation en raison de
l'élargissement de la bande dans la précolonne.
Q.ÿ: L'utilisation d'une colonne de garde semble acceptable. Avez-vous d'autres
solutions ?
A. : Eh bien, pas vraiment. Il existe quelques autres possibilités, mais elles ont toutes
leurs inconvénients.
Je ne suis pas partisan du "lavage" de la colonne avec des solvants censés
dissoudre les contaminants en haut de la colonne. Dans de nombreux cas, ce
processus ne fonctionne tout simplement pas. Par exemple, si les contaminants sont
des protéines qui se sont précipitées sur le dessus de la colonne, au moment où
vous essayez de les laver, ils ont beaucoup vieilli par dénaturation et peut-être même
par réticulation, de sorte qu'il peut être impossible de les solubiliser à nouveau. De
plus, chaque lavage éliminera également la phase liée hydrolysée, qui reste autrement
dans un équilibre local au site où l'hydrolyse s'est produite.
Par conséquent, un lavage répétitif peut en effet entraîner un vieillissement accéléré
de la colonne. De plus, après ce lavage, vous devez rééquilibrer votre colonne avec
la phase mobile, ce qui, dans certains cas, comme dans la chromatographie à paires
d'ions, peut prendre beaucoup de temps.
Une autre approche souvent essayée est le rétrobalayage des colonnes. Si vous
le faites avec un solvant différent de votre phase mobile, les mêmes objections
s'appliquent que pour le lavage de la colonne. Si vous le faites uniquement avec la
phase mobile, cela prendra beaucoup de temps jusqu'à ce que les contaminants
soient éliminés ou cela peut ne pas fonctionner du tout. De plus, tout rétrobalayage
affaiblit la colonne.
Bien que les colonnes d'aujourd'hui soient suffisamment bien remplies pour résister
au rétrobalayage, je recommanderais tout de même de ne pas en faire une pratique
standard.
Q.ÿ: Votre meilleure recommandation est donc d'utiliser une précolonneÿ?
A. : Absolument. Ils ne coûtent pas si cher - selon la marque et le type entre 10 $ et
50 $ - et ils protègent une colonne qui coûte généralement environ dix fois plus cher.
De plus, ils protègent également votre colonne d'autres sources de contaminants qui
peuvent être plus difficiles à tracer.
La source de votre problème de colonne peut être, par exemple, de la poussière
dans la phase mobile ou des débris provenant de la perte de joints de pompe.
Ou il pourrait s'agir de l'adsorption de contaminants de la phase mobile. Certains
d'entre eux peuvent être très difficiles à
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dépanner, mais la colonne de garde s'occupera simplement d'eux.
Q.ÿ: Existe-t-il d'autres causes de la courte durée de vie de la colonneÿ?
A. : Oui, mais ils sont moins probables si vous suivez les recommandations
du fabricant.
Une possibilité est que la colonne s'effondre en raison d'un pH de la phase
mobile en dehors de la plage recommandée. Cela peut également être
causé par un échantillon dissous dans une solution fortement acide ou
alcaline.
De plus, il y a quelques éléments qui sont spécifiques à certaines
colonnes.
Les colonnes amino réagissent par exemple avec les aldéhydes et les
cétones. Les colonnes amino dans une solution aqueuse non tamponnée
génèrent un pH fortement alcalin qui conduit à une dissolution partielle de
la silice.
Les colonnes peuvent également s'effondrer lorsqu'elles sont exposées
aux mauvais solvants. La raison en est que les colonnes sont
fondamentalement des structures très lâches. Ils sont partiellement
maintenus ensemble par l'adhérence des particules les unes aux autres.
Lorsque vous les mettez dans des phases mobiles qui rompent cette
adhérence, il y a un risque accru d'effondrement du lit. Cela arrive
occasionnellement aux colonnes CN dans des solvants de polarité
intermédiaire ou aux colonnes Phenyl dans le THF.
Une raison de plus de rester à l'écart du "lavage" de la colonne.
2. Temps de rétention variables
Q. : Les temps de rétention de mes pics sont incohérents. Quel est le
problème?
A. : Tout d'abord, nous devons trouver quel est le modèle de cette variation.
Cela nous en dira beaucoup sur la source potentielle du problème. Si les
temps de rétention changent de manière aléatoire d'une analyse à l'autre,
je vérifierai d'abord la ou les pompes et les dispositifs de mélange de
solvant. Pour vérifier que les pompes fonctionnent, mesurer le débit avec
une éprouvette graduée et un chronomètre. Pour vérifier que la composition
de la phase mobile ne change pas, vous pouvez ajouter un traceur à l'un
des solvants et observer la ligne de base. Si la composition de la phase
mobile est constante, la ligne de base sera stable. S'il y a un décalage dans
la composition, vous observerez des décalages correspondants dans la
ligne de base. Par exemple, si vous utilisez une méthode en phase inversée
avec détection UV, vous pouvez ajouter 0,1 % d'acétone au solvant
organique et surveiller la ligne de base à 254 nm. Alternativement, vous
pouvez préparer la phase mobile manuellement et contourner les dispositifs
de mélange de solvant. Si les fluctuations du temps de rétention
disparaissent, la source de votre problème était le dispositif de mélange.
Q.ÿ: Les temps de rétention sont assez constants d'une exécution à l'autre,
mais ils varient d'un jour à l'autre.
R. : Dans ce cas, l'instrument lui-même est moins susceptible d'être le
coupable. La source de variation la plus probable est la
composition de la phase mobile. En chromatographie en phase inverse, il
existe une relation exponentielle entre le facteur de rétention k et la fraction
volumique du solvant organique dans la phase mobile. En règle générale,
si vous faites une erreur de 1 % dans la quantité de solvant organique, le
temps de rétention peut changer entre 5 % et 15 %, typiquement d'environ
10 %. Cela signifie que vous devez mesurer la quantité de solvant très
soigneusement. La meilleure approche consiste à préparer la phase mobile
de manière gravimétrique plutôt que volumétrique.
De plus, la façon dont vous dégazez votre phase mobile peut contribuer
à la variabilité. La meilleure méthode de dégazage est l'application
simultanée de vide et d'ultrasons pendant environ une minute.
Il en résulte un bon dégazage avec une quantité minimale d'évaporation du
solvant. Une bonne méthode alternative est la méthode de barbotage
d'hélium. Après l'équilibrage initial de la phase mobile avec de l'hélium, le
flux d'hélium doit être réduit. Sinon, l'hélium entraînera avec lui des vapeurs
de solvant et la composition du solvant peut changer en raison de
l'évaporation.
Si les constituants de votre échantillon sont ioniques ou ionisables, le
contrôle du pH de la phase mobile est très important. Un changement aussi
faible que 0,1 unité de pH peut entraîner un décalage du temps de rétention
de 10 %. Il est donc très important de mesurer le pH avec précision et de
garder le pH-mètre bien calibré. En phase inverse, la rétention des acides
diminue et la rétention des bases augmente avec l'augmentation du pH.
D'ailleurs, mon professeur de chimie disait toujours : « Un tampon
s'appelle un tampon parce qu'il est censé tamponner le pH. S'il ne le fait
pas, ce n'est pas un tampon. Par exemple, une solution d'acétate
d'ammonium est juste cela, une solution d'acétate d'ammonium. Un tampon
acétate contient l'ion acétate et l'acide acétique. S'ils sont présents en
quantités égales, le pH résultant est le pK du tampon, 4,75 dans le cas de
l'acétate. Un tampon a toujours sa capacité tampon la plus élevée à son pK.
Q. : Je n'avais pas réalisé à quel point il fallait contrôler la composition de
la phase mobile pour obtenir des résultats reproductibles. Y a-t-il d'autres
variables auxquelles il faut prêter attention?
A. : Un autre facteur important est la température. Vous soupçonnerez que
la température est la cause des fluctuations, si la rétention de tous les pics
se déplace dans la même direction.
La règle générale est que les temps de rétention changent d'environ 1ÿ% à
2ÿ% par 1º Celsius. Ce n'est pas tant que ça dans des circonstances
normales, mais dans de nombreux endroits, le chauffage ou la climatisation
sont coupés pendant le week-end. Et puis vous vous demandez pourquoi
les analyses exécutées automatiquement pendant le week-end montrent
des temps de rétention différents de ceux exécutés pendant la semaine.
Ceci peut évidemment être évité lorsqu'un thermostat à colonne est utilisé.
Dans la chromatographie en phase inverse utilisant des composés
d'échantillon ioniques ou ionisables, la rétention est également influencée
par la force ionique du tampon, mais l'influence est si faible qu'elle est
généralement négligeable. Les changements typiques sont inférieurs à 1 %
pour un changement de 20 % de la molarité du tampon. Étant donné que
les constituants du tampon sont toujours pesés, il est impossible qu'une
erreur aussi importante se produise.
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Q.ÿ: Existe-t-il des cas particuliers où des paramètres supplémentaires doivent être
pris en compteÿ?
R. : Oui. En chromatographie à paires d'ions, la concentration de l'agent d'appariement
d'ions influence la rétention des constituants ioniques de l'échantillon. La rétention
des analytes qui sont chargés de manière opposée aux agents d'appariement d'ions
augmente, la rétention des analytes de charge égale diminue. Les composés neutres
ne sont pratiquement pas affectés. A faible concentration, c'est-à-dire en dessous de
5 mM/L, la rétention des constituants de l'échantillon qui interagissent avec l'agent
change proportionnellement à la concentration du réactif à paire d'ions. A forte
concentration du réactif d'appariement d'ions, c'est-à-dire autour de 10 mM/L, la
surface de l'adsorbant est saturée de réactif, et un changement de concentration du
réactif n'entraîne pas de modification notable du temps de rétention des analytes .
C'est quelque chose à penser lors du développement des méthodes. Si vous pouvez
rendre la méthode insensible à l'une des variables, vous devez le faire.
En chromatographie en phase normale, les temps de rétention sont très sensibles
à la concentration des constituants polaires dans la phase mobile. L'un de ces
constituants qui est toujours là, qu'on le veuille ou non, c'est l'eau. Ainsi, des quantités
d'eau variables peuvent entraîner une rétention variable. Une astuce qui a été utilisée
pour contourner ce problème consiste à utiliser des solvants non polaires comme
l'hexane ou le chlorure de méthylène qui sont à moitié saturés d'eau. Pour ce faire,
vous prenez un volume de solvant et le saturez d'eau en y ajoutant de l'eau et remuez
pendant un moment, puis vous mélangez ce solvant saturé d'eau et le mélangez
avec un volume égal de solvant "sec". Cette procédure aboutit à une reproductibilité
raisonnablement bonne de la teneur en eau des solvants non polaires. Cela permet
également d'éviter la dérive des temps de rétention, mais cela fera l'objet d'une
prochaine section.
3. Dérive des temps de rétention
Q. : Les temps de rétention des pics de mon chromatogramme dérivent. Quel est le
problème?
A. : C'est un problème intéressant. Il peut y avoir de nombreuses causes différentes
à cela. Passons-les en revue une par une.
Les gens supposent le plus souvent que la dérive des temps de rétention est un
problème d'équilibrage. Si vous effectuez une chromatographie en phase normale
sur des colonnes de silice non modifiées, c'est également le problème le plus
probable. Les temps de rétention en chromatographie en phase normale sont très
sensibles à la quantité d'eau adsorbée sur la surface de la silice, qui à son tour est
fonction de l'eau dissoute dans la phase mobile. Étant donné que la solubilité de l'eau
dans des solvants comme l'hexane ou le chlorure de méthylène est extrêmement
faible, il faut beaucoup de temps pour que les colonnes s'équilibrent. J'ai vu des cas
où les temps de rétention dans l'hexane très sec se déplaçaient encore après une
semaine d'équilibrage. Je recommande donc d'éviter les solvants très secs. Une
solution courante au problème d'équilibrage de la silice avec de l'eau consiste à
utiliser des solvants "à moitié saturés" en eau. Ils sont préparés en saturant un
volume donné d'hydrophobe
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solvant avec de l'eau, puis en le mélangeant 1:1 avec du solvant "sec".
Cette approche accélère considérablement les temps d'équilibrage.
En chromatographie en phase inverse, l'équilibrage est généralement très rapide.
Quelques volumes de colonne (5 à 10) de phase mobile sont généralement suffisants
pour l'équilibrage. Ce n'est cependant pas toujours le cas. Une exception notable est
l'équilibrage d'une colonne avec un réactif d'appariement d'ions en chromatographie
par paires d'ions.
Les réactifs d'appariement d'ions sont typiquement utilisés à une concentration
d'environ 2 à 5 mmol/L ou moins. Ils s'adsorbent à la surface du garnissage en phase
inverse à une concentration surfacique comprise entre 0,5 et 2 µmol/m2 .
Une colonne de 4,6 mm x 250 mm contient
environ 3 g de garnissage avec une surface de 330 m2 /g. Cela signifie qu'il y a 1000
m2 de surface dans la colonne. À une concentration de surface de 2 µmol/m2, 2
mmol de réactif doivent être pompés dans la colonne pour un équilibrage complet. A
une concentration de 2 mmol/L, cela prend un litre de phase mobile. Il s'agit clairement
d'un cas extrême, mais ne soyez pas surpris s'il faut quelques centaines de millilitres
de phase mobile pour équilibrer la colonne. Il est donc déconseillé de convertir les
colonnes utilisées en chromatographie par paires d'ions en un solvant organique pour
un stockage pendant la nuit, car pendant ce processus, le réactif d'appariement d'ions
est lavé et le lendemain, vous devez passer par une longue procédure de rééquilibrage.
Int. : Ces deux phénomènes ont un point commun : de faibles concentrations en
phase mobile d'un agent fortement adsorbé. Est-ce la cause la plus fréquente de la
dérive des temps de rétentionÿ?
A. : Je dirais oui. D'autres phénomènes ne sont pas aussi fréquents.
Mais l'agent fortement adsorbé pourrait également provenir de l'échantillon. Dans ce
cas, il s'accumulerait lentement lors d'injections répétées et modifierait ainsi les
propriétés chimiques de la colonne. Un exemple de ceci serait l'adsorption d'excipients
à partir d'un échantillon de médicament.
On peut dire si une contamination provient de la phase mobile ou de l'échantillon
en regardant la vitesse à laquelle les temps de rétention changent.
Une expérience pourrait être comme suit : 1.
Injecter l'échantillon plusieurs fois, par exemple, quatre fois pour un temps
d'exécution total de 1 h.
2. Pomper la phase mobile pendant la même durée sans injecter d'échantillon.
3. Répétez la première étape.
4. Tracer les temps de rétention
a, en fonction du
temps b, en fonction du nombre d'injections.
Si le premier tracé vous donne une courbe lisse, alors la phase mobile est
porteuse de la contamination. Si le deuxième tracé donne une courbe lisse,
l'échantillon est la source de la contamination.
Q.ÿ: Existe-t-il d'autres causes de décalage des temps de rétentionÿ?
R. : Oui. Il est possible que la composition de la phase mobile change avec le temps.
Si vous n'utilisez pas le mixage en ligne
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capacités des instruments d'aujourd'hui, vous pouvez observer une évaporation rencontré du tout avec des phases greffées qui ne sont pas coiffées.
lente d'un composant dans la phase mobile. Cela est particulièrement vrai
lorsque vous aspergez la phase mobile d'hélium pour éviter les bulles d'air
dans la pompe. Il faut maintenir le taux de barbotage au minimum.
4. Reproductibilité de colonne à colonne et de
Une cause souvent sous-estimée des décalages de rétention est l'hydrolyse
de la phase greffée. Les fabricants spécifient généralement une plage de pH
lot à lot
en dehors de laquelle la phase greffée est "instable". Cette plage va
Q. : Je suis sur le point de commencer le développement d'une nouvelle
généralement de pH 2 à 8 ou 9.
méthode HPLC. Après validation, la méthode sera transférée au QC-lab, où
Cependant, il faut traiter ces limites avec beaucoup de prudence.
elle sera utilisée pendant de nombreuses années. Je suis préoccupé par la
Il n'y a pas de limite nette, l'hydrolyse dépend également d'autres facteurs tels
reproductibilité à long terme de la méthode, en particulier par la reproductibilité
que la température et le solvant organique, et une hydrolyse lente se produit
à long terme de la colonne.
également à l'intérieur de ces limites.
Que puis-je faire pour assurer une bonne reproductibilité ?
La stabilité hydrolytique d'une phase greffée est meilleure à des valeurs de
pH intermédiaires, autour de pH 3 à 5 et à basse température. Les conditions
A. : Tout d'abord, permettez-moi de vous féliciter d'avoir réfléchi à cet aspect
chromatographiques isocratiques sont meilleures que les gradients. Bien que
de votre méthode avant de commencer à travailler dessus. Si l'on peut prévoir
l'hydrolyse se produise également dans des conditions isocratiques, la phase
qu'une nouvelle méthode sera utilisée pendant plusieurs années, cette
liée s'adsorbe souvent sur elle-même et se trouve dans un équilibre local.
connaissance devrait faire partie du processus de sélection des colonnes.
Cependant, lorsqu'une concentration plus élevée de solvant organique est
Vous voudrez peut-être vous assurer que la colonne sera disponible pendant
utilisée - comme dans un gradient ou pendant les procédures de nettoyage de
toute la durée de vie prévue de la méthode.
la colonne - cet équilibre local est interrompu et la phase liée hydrolysée est
Cela signifie que vous souhaitez sélectionner un fabricant qui a une grande
lavée de la colonne.
entreprise et qui est susceptible de rester en activité dans un avenir prévisible.
De plus, vous souhaitez sélectionner une chimie de surface "standard" -
comme C18 ou C8 - plutôt que des chimies de surface nouvelles et/ou moins
Q. : Je garderai cela à l'esprit. Les changements de température peuvent-ils entraîner
utilisées. En d'autres termes, votre sélection de colonnes doit être prudente.
des dérives des temps de rétention ?

Le critère suivant devrait alors être la reproductibilité de la colonne. Si vous

R. : Oui, la température est toujours suspecte. Si vous analysez vos
ou vos collègues avez eu une bonne expérience de la reproductibilité d'une
échantillons sans surveillance pendant la nuit ou le week-end, vous pouvez
colonne particulière dans le passé, c'est un bon point de départ. Vous devez
obtenir des temps de rétention à la dérive en fonction des changements de
également tenir compte des informations disponibles auprès du fabricant.
température du laboratoire. Dans de nombreux endroits, la température
Récemment, certains fabricants de colonnes ont commencé à publier leurs
ambiante est maintenue à un réglage différent pendant la nuit ou le week-end
spécifications et les résultats de leurs études de reproductibilité d'un lot à
pour économiser l'énergie. En règle générale, les temps de rétention varient
l'autre. Vous pouvez obtenir ces informations auprès des fabricants et les
d'environ 1 à 2 % par 1 ºC.
examiner de manière critique.
Liés au dernier phénomène, il y a les décalages des temps de rétention qui
sont provoqués par une augmentation de la contre-pression dans la colonne.
L'augmentation de la contre-pression peut indiquer une contamination de la
Q.ÿ: Qu'est-ce que je recherche dans ces informationsÿ?
colonne, mais même une fritte obstruée peut affecter les temps de rétention.
La pression nécessaire pour pousser la phase mobile à travers la fritte
R. : Permettez-moi de revenir un peu en arrière et d'expliquer les différents
réchauffe la phase mobile par frottement, et cette augmentation de température
aspects de la reproductibilité de colonne à colonne et de lot à lot. Dans ce qui
peut affecter les temps de rétention.
suit, je parlerai des garnitures à phase inversée, car ce sont les plus
couramment utilisées.
Il existe d'autres causes de dérive des temps de rétention, mais elles
Si vous examinez différentes colonnes fabriquées à partir du même lot de
sont extrêmement rares.
garnissage, vous pouvez obtenir des différences dans le nombre de plateaux
Un phénomène d'équilibrage lent rencontré en chromatographie en phase
de la colonne (largeur de pic), la contre-pression et les temps de rétention.
inverse est l'équilibrage avec des phases mobiles contenant moins de
Les temps de rétention changent proportionnellement à la densité de
quelques % de solvant organique. Les garnissages "entièrement end-capped"
garnissage et au volume de la colonne, ce dernier dépendant principalement
à forte couverture en C18 ne sont pas bien mouillés par ces phases mobiles.
de la reproductibilité du diamètre interne de la colonne. Cette variabilité ne
Cela conduit à plusieurs phénomènes allant de la perte de contact de la phase
doit pas être préjudiciable à votre méthode, car les temps de rétention de tous
mobile avec la phase stationnaire à "l'effondrement hydrophobe", qui est la
les pics changent proportionnellement les uns aux autres et la résolution est
réduction de la surface disponible pour l'interaction avec l'échantillon en raison
préservée. Cependant, vous devez en être conscient afin de spécifier
de l'auto-adsorption de la phase liée sur elle-même. Les colonnes peuvent
correctement les fenêtres de temps d'élution pour votre méthode.
être régénérées rapidement en utilisant quelques volumes de colonne de
solvant organique, de préférence le modificateur organique de votre phase
La variation du temps de rétention due à cet effet est généralement de 3ÿ%
mobile.
RSD, mais peut être aussi faible que 1ÿ% RSD, si le fabricant de la colonne a
un bon contrôle sur le matériel de la colonne.
Ce phénomène est moins prononcé ou même pas

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La variation du nombre de plaques de colonne peut affecter votre
méthode, en particulier lorsque vous avez affaire à des paires de pics qui
sont à peine résolues à la ligne de base. Une reproductibilité typique du
nombre de plaques est de +/- 10 %, bien que des écarts-types aussi
faibles que 2 à 3 % aient été atteints. N'oubliez pas que le nombre de
plaques est un nombre au carréÿ; la résolution ne dépend que de la
racine carrée du nombre de plaques. Par conséquent, une variation de 2
% du nombre de plaques signifie que la largeur de pic ne varie que de 1
%. Vous devez vérifier si le fabricant de la colonne a une limite supérieure
et inférieure pour le nombre de plateaux ou seulement une spécification
minimale. Les spécifications recto-verso sont plus souhaitables.
La contre-pression de la colonne est très reproductible pour toute
procédure de remplissage donnée. La variation au sein d'un lot
d'emballage donné doit être inférieure à +/- 5 %.
Q.ÿ: Qu'en est-il de la reproductibilité d'un lot à l'autreÿ?
R. : Si vous examinez la reproductibilité des paramètres chromatographiques
sur différents lots de garnissage, les mêmes paramètres que ci-dessus
peuvent varier. Mais plus important encore, la sélectivité de la séparation
peut changer avec le lot de garnissage. Cela signifie que la rétention
relative des pics peut varier, c'est-à-dire leur position relative dans le
chromatogramme. Cela peut nuire à la spécificité de votre méthode.
Cette variation est le problème le plus important contre lequel vous
voulez vous prémunir. Par conséquent, ce que vous souhaitez obtenir du
fabricant de la colonne, ce sont des informations sur la manière dont la
reproductibilité d'un lot à l'autre est assurée. Cela implique généralement
certaines mesures des propriétés physiques, chimiques et
chromatographiques d'un garnissage. Parmi les mesures physiques, la
plus importante est probablement la surface spécifique du garnissage,
puisqu'une variation de ce paramètre se traduit directement par une
variation des temps de rétention. Par conséquent, vous souhaitez
comprendre quelle variabilité de la surface spécifique le fabricant trouve
acceptable. On peut généralement trouver une plage de +/- 10 %, mais
+/- 5 % est réalisable.
En tant que paramètre chimique le plus important, vous souhaitez
comprendre la variabilité de la couverture de surface pour la phase
greffée. Celle-ci est habituellement exprimée en µmol/m2 de phase
greffée. De nombreux fabricants ne donnent pas directement ce
paramètre, mais ont des spécifications sur la teneur en carbone de la
garniture. Ce que l'on aimerait voir, ce sont à nouveau des spécifications
bilatérales et une fourchette étroite. Mieux que +/- 10% peut être assez
courant, alors que moins de +/- 4% est réalisable.
Enfin, vous aimeriez comprendre le test de reproductibilité
chromatographique utilisé par le fabricant de l'emballage.
Souvent, les colonnes sont accompagnées d'un chromatogramme d'un
mélange de composés neutres simples, comme le toluène, le naphtalène
et l'anthracène. Ce n'est pas un bon test de reproductibilité d'un lot à
l'autre. La rétention relative entre composés hydrophobes neutres est
extrêmement reproductible et très insensible aux variations de couverture
de surface du garnissage. De meilleurs tests de reproductibilité d'un lot à
l'autre incorporent des composés fortement basiques dans le mélange de
test. Des composés de base bien sélectionnés dans un test bien conçu
interagissent
sept
majoritairement avec les silanols "résiduels" sur un garnissage, tandis
que les composés neutres interagissent majoritairement avec la phase
greffée. Ainsi, la rétention relative entre des composés basiques bien
sélectionnés et des composés neutres représente un test rigoureux de la
reproductibilité d'un lot à l'autre d'un garnissage en phase inversée. Si un
fabricant utilise un tel test pour les tests de reproductibilité d'un lot à
l'autre et a des spécifications raisonnablement strictes, votre niveau de
confort devrait augmenter.
Q. : Je ne suis pas sûr de la relation entre les tests du fabricant et mes
composés dans mon dosage. Que puis-je faire pour assurer une bonne
reproductibilité d'un lot à l'autre pour mon testÿ?
A. : Vous avez tout à fait raison : les informations données ci-dessus sont
un point de départ qui vous permet de sélectionner une colonne qui a de
bonnes chances d'être reproductible. Mais le test ultime est un test de la
reproductibilité de votre test lui-même. Certains fabricants proposent à
cet effet des kits comprenant des colonnes de différents lots de
garnissage. D'autres fabricants fournissent sur demande des colonnes
préparées à partir de différents lots. Assurez-vous de bien comprendre
ce que vous obtenez. Différents lots de colonnes contenant le même lot
de garnissage ne sont pas utiles, vous devez obtenir des colonnes
garnies de garnissage provenant de différentes réactions de liaison. Il
peut y avoir une certaine confusion si le fabricant considère que des
colonnes conditionnées à des jours différents avec le même lot de
conditionnement comprennent des lots différents. Il est donc préférable
de demander deux fois si le fabricant vous fournit vraiment ce que vous
voulez.
Vous souhaitez probablement obtenir trois lots différents de garnissage
pour tester la reproductibilité de votre méthode. S'il s'avère que votre test
n'est pas affecté par la variabilité d'un lot à l'autre, vous pouvez être
raisonnablement assuré que votre méthode sera reproductible pour les
années à venir.
5. Problèmes de préparation des échantillons
Q. : Je rencontre des problèmes avec la préparation de mon échantillon.
J'utilise une extraction en phase solide avec un sorbant en phase inverse.
Habituellement, la récupération est bonne, autour de 80 % ou mieux.
Mais parfois, il tombe à 50% ou même moins. Quel pourrait être le
problème?
A. : Le problème que vous avez n'est pas inhabituel. J'ai constaté que la
plupart du temps, une faible récupération peut être attribuée à un mauvais
développement des méthodes. Bien qu'il puisse être suffisant pour
l'objectif analytique de votre méthode, une récupération de 80 % n'est
pas un bon signe du point de vue de la robustesse de la méthode. Il est
fort probable qu'il y ait une seule raison à la récupération incomplète qui
se traduit parfois par une perte de 20 % et parfois par une perte de 50 %.
Ce que nous devons faire ensemble, c'est découvrir où finissent les 20 à
50 % manquants.
Q.ÿ: OK, comment fait-onÿ?
A. : Il y a quatre scénarios possibles :
Machine Translated by Google
1. L'analyte est perdu avant l'extraction en phase solide.
2. L'analyte n'est pas complètement adsorbé pendant l'étape
d'adsorption.
3. L'analyte est partiellement lavé dans une étape de lavage.
4. Une partie de l'analyte reste sur la cartouche d'extraction en
phase solide après l'étape d'élution.
Pour savoir si l'analyte traverse la première cartouche SPE lors de l'étape
d'adsorption, vous pouvez simplement placer une deuxième cartouche SPE
derrière la première et la traiter ensuite de la même manière que la
cartouche principale. Si la fraction obtenue à partir de la deuxième cartouche
contient une bonne quantité d'analyte, alors l'étape d'adsorption est
incomplète. Il y a plusieurs raisons possibles pour lesquelles cela peut se
produire. Premièrement, le solvant dans lequel l'échantillon est dissous
peut être un solvant trop fort. Si tel est le cas, vous pouvez diluer votre
échantillon avec de l'eau ou, si votre analyte est ionisable, avec un tampon.
Deuxièmement, vous pouvez vérifier que vous activez la cartouche SPE
avant de charger l'échantillon. Les cartouches SPE en phase inversée
doivent être activées avec un solvant organique comme le méthanol ou
l'acétonitrile, suivi d'un équilibrage avec de l'eau ou un tampon. Ce n'est
qu'alors que l'échantillon doit être appliqué. Beaucoup de gens essaient
d'éviter ces étapes supplémentaires fastidieuses, mais elles sont nécessaires
pour une exécution correcte de la méthode.
Q.ÿ: J'active la cartouche conformément aux recommandations du fabricant.
Donc je ne pense pas que ce soit le problème. J'aime bien votre proposition
d'utiliser une deuxième cartouche pour vérifier l'intégralité de l'étape
d'adsorption. Que dois-je faire pour vérifier les autres étapes de la méthode ?
A.ÿ: Pour vérifier les étapes de lavage, vous devez collecter toutes les
fractions et les analyser par HPLC. Cela peut ne pas être facile si les étapes
de lavage éliminent les composés qui interfèrent avec la quantification de
l'analyte. Alors la quantification de l'analyte dans ces fractions est par
définition difficile. Vous pouvez essayer la technique suivante pour
contourner ce problème. Évaporer les fractions douteuses jusqu'à siccité et
les reconstituer dans la même composition de solvant que l'échantillon
d'origine. Ensuite, prélevez cet échantillon et traitez-le sur la cartouche
d'extraction en phase solide de la même manière que votre échantillon
d'origine. Si vous trouvez maintenant une autre fraction de votre analyte
dans l'étape d'élution, vous savez qu'une partie de l'analyte est lavée dans
l'une des étapes de lavage.
Une autre façon de procéder consiste à utiliser des étalons et à les exécuter
tout au long du processus de préparation des échantillons. Ceci est moins
rigoureux, car la présence de la matrice peut affecter le comportement des
analytes.
Q. : Ce sont quelques bonnes suggestions. Comment puis-je analyser
l'analyte qui reste sur la cartouche après l'étape d'élutionÿ?
R.ÿ: Vous devez à nouveau éluer la cartouche avec plus d'éluant après
votre étape d'élution d'origine. Cela peut éluer un analyte supplémentaire.
Souvent, vous devez augmenter la force d'élution de
l'éluant utilisé dans l'étape d'élution. Pensez à la façon dont une partie de
l'analyte peut être retenue plus fortement. Serait-ce dû à une interaction
avec les silanols résiduels ? Ensuite, vous voudrez peut-être modifier le pH
du tampon ou la force du tampon dans votre étape d'élution.
Est-ce dû à une interaction hydrophobe ? Augmentez ensuite la
concentration de solvant organique dans l'étape d'élution ou passez à un
solvant organique plus fort (par exemple, remplacez le méthanol par de
l'acétonitrile). Est-il possible que l'échantillon interagisse avec les silanols
résiduels via une liaison hydrogène ? Ensuite, l'ajout de méthanol à
l'acétonitrile ou au tétrahydrofurane pourrait aider.
Q. : OK Si je ne trouve pas la fraction manquante dans toutes ces étapes,
puis-je exclure l'étape d'extraction en phase solide comme source du
problème ?
R. : Oui. Maintenant, nous devons explorer si l'analyte se perd dans une
autre étape de la préparation de l'échantillon. Se pourrait-il qu'il soit
fortement adsorbé sur un récipient d'échantillon. Un analyte fortement
hydrophobe peut s'adsorber sur les parois d'un flacon en polyéthylène. Les
composés fortement basiques peuvent se lier aux silanols à la surface des
flacons en verre. Il est également possible que l'analyte puisse s'adsorber
sur les solides de la matrice ou se lier à d'autres constituants de la matrice
(par exemple des protéines). Ces problèmes peuvent être plus difficiles à
isoler.
Fondamentalement, essayez d'obtenir une récupération de l'analyte
aussi proche que possible de 100 %. C'est une bonne assurance que votre
méthode est robuste dès le départ. Même dans ce cas, des circonstances
peuvent survenir et entraîner une récupération non reproductible, mais elles
sont moins probables que si vous commencez avec une méthode déjà
compromise.
Si vous pouvez obtenir une bonne récupération dès le départ, ni une
variabilité normale de la composition de l'éluant ni du matériau de garnissage
lui-même n'est susceptible d'affecter votre méthode.
La seule cause restante de récupération variable pourrait être la qualité du
lit garni de la cartouche SPE. Si un vide se forme dans le lit, alors le flux
n'est pas uniforme et une percée précoce de l'analyte est possible. Vous
pouvez vous prémunir contre ce problème en inspectant rapidement
l'appareil. Un vide qui affecterait la méthode est assez évident.
6. Sources de traînée de pic
Q. : Que puis-je faire pour me débarrasser de la traînée de pic ?
R. : Tout d'abord, nous devrons découvrir d'où vient le pic de traînée. Il
existe de nombreuses sources de traînée de pic, allant des problèmes de
colonne aux problèmes de chimie en passant par les problèmes d'instrument.
Les raisons les plus courantes de la traînée de pic sont l'élargissement de
la bande extra-colonne, la détérioration du lit garni et l'interaction des
analytes avec les sites actifs sur le garnissage. Évidemment, ce qui doit
être fait dépend de la cause des résidus.
Q. : J'accepte cela. Maintenant, comment puis-je déterminer la cause de la
traînéeÿ?
8
Machine Translated by Google
R.ÿ: Une première étape rapide consiste à examiner attentivement le
chromatogramme. Il y a beaucoup d'informations dans un chromatogramme qui
peuvent vous donner des indices sur la nature du problème sans aucune
connaissance des échantillons ou des conditions chromatographiques. Vous
pouvez ensuite utiliser les informations supplémentaires pour tester les hypothèses
que vous avez formées sur la base de l'examen du chromatogramme.
L'une des premières choses à examiner est la hauteur des pics. Si un détecteur
UV a été utilisé et que les hauteurs de pic sont de l'ordre de 1 AUFS, une bonne
supposition est que la colonne est surchargée et que la traînée de pic est due à
une surcharge. Ce jugement suppose que les coefficients d'extinction des
composés sont de l'ordre de 1000, ce qui est une règle empirique raisonnable.
Pour confirmer la surcharge de masse, vous poseriez alors la question de la
quantité de masse injectée sur la colonne. Pour un garnissage normal et
entièrement poreux avec une taille de pores d'environ 100 Å, la surcharge
commence à déformer les pics à une charge d'environ 100 µg.
Ce sont toutes des règles empiriques, mais elles peuvent être utilisées comme
lignes directrices raisonnables en cas de surcharge d'échantillons. Vous pouvez
tester la surcharge en injectant environ 10 fois moins de masse sur la colonne et
voir si la forme du pic s'améliore.
Q. : D'accord. Mais que se passe-t-il si les résidus se produisent à des quantités injectées beaucoup
plus faiblesÿ?
A.ÿ: Encore une fois, un coup d'œil sur les pics du chromatogramme est utile. S'il
y a de nombreux pics dans le chromatogramme, déterminez si la forme du pic
reste à peu près constante ou s'il y a un changement constant de la forme du pic
dans tout le chromatogramme. Si les pics traînent davantage dans la première
partie du chromatogramme que dans la dernière partie, on soupçonnerait que des
effets extra-colonne en sont responsables. L'influence des effets extra-colonne
diminue à mesure que les pics s'élargissent, c'est pourquoi ils déforment
davantage les pics précoces que les pics ultérieurs. Deux effets extra-colonne
sont à considérer :
1. élargissement de bande extra-colonne 2.
constante de temps du détecteur.
L'étalement de bande dans les tubes de connexion, les injecteurs et les
détecteurs entraîne une traînée dans les premiers pics du chromatogramme.
Vous pouvez rencontrer ce problème si vous placez une colonne de petit diamètre
sur un instrument qui n'a pas été configuré pour l'utilisation de colonnes de petit
volume, ou si vous avez récemment replombé votre système. Si tel est le cas,
examinez le type de tube que vous avez utilisé (il doit avoir un diamètre intérieur
de 9/1000" de l'injecteur au détecteur).
Inspectez également toutes les connexions, si elles ont été faites correctement.
Une cause courante d'étalement de bande extra-colonne est le fait que différents
fabricants de colonnes utilisent des distances différentes entre la pointe de la
ferrule et l'extrémité du tube dans leurs embouts de colonne. Un étalement de
bande extra-colonne avec un écart type de seulement 15 µL influence
significativement la forme du pic jusqu'à un volume d'élution d'environ 3 mL sur
une colonne de 5 µm.
Une grande constante de temps du détecteur a la même influence.
Plus de résidus sont observés sur les pics précoces que sur les élutions tardives
9
pics. Souvent, le réglage par défaut de la constante de temps est de 1 sec.
Si une colonne haute performance de 5 µm est utilisée, une distorsion des pics
peut être observée jusqu'à 2 à 3 minutes dans le chromatogramme. Des constantes
de temps plus grandes donneraient évidemment des effets plus importants.
Si les pics sont tous à peu près au même degré pour tous les composés de
l'échantillon dans le chromatogramme, il y a deux possibilités : 1. le lit garni est
endommagé 2. tous les composants de l'échantillon sont chimiquement similaires,
et nous avons affaire à des effets chimiques.
Dans le premier cas, un test de comptage sur plaque dans des conditions
standard, notamment dans les conditions recommandées par le fabricant, révélera
si la colonne s'est détériorée ou non. La colonne peut avoir été endommagée par
l'adsorption de contaminants ou de particules. Parfois, il est possible d'éliminer
ces contaminants avec un solvant approprié (par exemple du THF sur une colonne
en phase inverse), mais si le lit lui-même s'est déplacé, il n'y a rien que l'on puisse
faire pour réparer la colonne.
Dans le cas où tous les pics sont chimiquement similaires, les effets chimiques
sont des candidats potentiels comme causes de traînée. Si seuls certains pics du
chromatogramme sont traînants et que d'autres pics donnent une bonne forme de
pic, les effets chimiques sont les principaux candidats comme causes de traînée
de pic.
Q. : Quels sont ces « effets chimiques » ? S'il vous plaît, expliquez!
R. : Il pourrait y avoir plusieurs effets ici aussi, mais la cause la plus fréquente est
l'interaction des analytes avec une surface énergétiquement non uniforme. Un
exemple typique est la traînée de bases fortes sur certains garnissages en phase
inverse.
Ces types de composés interagissent fortement avec les groupes silanols
résiduels à la surface du garnissage ainsi qu'avec la phase greffée. Si les groupes
silanol à la surface forment une population non homogène, des résidus peuvent
en résulter.
Q.ÿ: Que puis-je faire pour éliminer les résidus dus aux influences chimiquesÿ?
R. : Tout d'abord, vous devriez envisager d'utiliser une colonne qui ne présente
pas ce phénomène. Certains des nouveaux garnissages à phase inversée ont été
conçus pour minimiser la traînée des bases. Deuxièmement, cette traînée peut
être médiée soit par le pH de la phase mobile, soit en utilisant des bases
organiques dans la phase mobile qui entrent en compétition avec les analytes
pour les sites actifs. Cela est dû au fait que les interactions silanophiles sont
souvent des interactions d'échange d'ions. A pH acide, moins de silanols sont
chargés négativement. Par conséquent, moins de traînées sont observées pour
les analytes chargés positivement. En tant que base concurrente, la triéthylamine
est souvent utilisée. Mais parmi les bases concurrentes, celles qui ont une plus
grande hydrophobicité fonctionnent souvent mieux.
Des exemples sont les sels d'octylamine ou de tétrabutylammonium.
Dans le cas où l'interaction silanophile de l'analyte n'est pas un échange d'ions,
mais une liaison hydrogène, vous pouvez améliorer la forme du pic en modifiant
le caractère de liaison hydrogène de votre solvant. Par exemple, le méthanol
souvent
Machine Translated by Google

entraîne une forme de pic améliorée par rapport à l'acétonitrile en tant que heure. L'excès d'eau est éliminé et les deux parties sont recombinées. Il en résulte
modificateur organique de la phase mobile. une phase mobile "à moitié saturée" d'eau à condition que la phase mobile
Des phénomènes similaires sont rencontrés en chromatographie en phase d'origine soit raisonnablement sèche.
normale, et un raisonnement similaire peut y être appliqué pour supprimer les
traînées. Des changements significatifs de traînée peuvent être observés selon
que des alcools ou de l'acétonitrile sont utilisés comme modificateur polaire de la Tableau
phase mobile. 1 Solvant Solubilité de l'eau dans le solvant (température) % p/ p (°C)
Il existe encore d'autres causes de pic-tailing, mais elles sont relativement 0,0111 (20) 0,0091 (25) 0,0055
rares. L'adsorption des constituants de l'échantillon sur les frittés de la colonne ou Hexane (20) 0,0334 (25) 0,1980 (25) 0,0720
les pièces de l'injecteur a été observée. Il est également possible que l'analyte Heptane (23) 0,0100 (24) 0,3090 (25) 2,9400
soit soumis à une modification chimique au cours du processus chromatographique. Isooctane (25) 1,8600 (20) 1,4680 (25) 1,5000
Des exemples de ceci peuvent être une dégradation ou un équilibre lent entre Toluène
différentes formes moléculaires de l'analyte. Dichlorométhane
Chloroforme
Tétrachlorure de carbone
o-Dichlorobenzène
Acétate d'éthyle
7. chromatographie en phase normale
Acétate de butyle
L'éther diéthylique
Q. : J'ai toujours travaillé avec la chromatographie en phase inverse et j'ai évité
Éther méthyl-t-butylique
la chromatographie en phase normale. J'ai fait cela sur le conseil de mes collègues
que la chromatographie en phase normale est beaucoup plus difficile que la
L'équilibrage avec une phase mobile « semi-saturée » est beaucoup plus
chromatographie en phase inversée. Y a-t-il une vérité à cela?
rapide qu'avec des phases mobiles sèches, mais cela peut encore prendre des heures.
Il est donc souhaitable de dédier une colonne à une phase mobile particulière.
Désormais, l'équilibrage ne peut prendre que quelques minutes au lieu d'heures.
R. : Malheureusement, il y a une part de vérité dans cette appréciation.
Cependant, équipé des bonnes connaissances, vous pouvez améliorer certaines
De toute évidence, la concentration d'autres modificateurs polaires dans la
des difficultés.
phase mobile doit également être bien contrôlée. Par exemple, si vous utilisez du
Le problème le plus courant avec la chromatographie en phase normale est la
méthanol comme modificateur, souvent seules de très petites quantités (<0,5 %)
variabilité du temps de rétention. La raison de cette variabilité est la forte
peuvent être nécessaires, et un petit changement peut entraîner de grands
dépendance de la rétention à la concentration de petites quantités de constituants
changements dans la rétention. Dans un tel cas, il est souhaitable d'utiliser un
très polaires dans la phase mobile. Ceci est particulièrement vrai pour la teneur
modificateur moins polaire, tel que l'isopropanol ou un autre alcool supérieur. Ou
en eau de la phase mobile. Mais c'est également vrai pour les petites quantités
vous voudrez peut-être éviter complètement les alcools et utiliser les éthers ou les
de modificateurs polaires comme le méthanol ou l'acétonitrile qui sont ajoutés à la
esters les moins polaires.
phase mobile pour contrôler la rétention et la sélectivité.
Ceci est bien sûr susceptible d'influencer significativement la sélectivité de la
séparation.

L'eau est présente dans tous les solvants organiques à un certain degré.
Q. : Je vois qu'il faut faire beaucoup plus attention à la composition de la phase
Les concentrations sont généralement de l'ordre du ppm. Le tableau 1 donne les
mobile en chromatographie en phase normale qu'en chromatographie en phase
solubilités de l'eau dans certains solvants non polaires (1,2) utilisés en
inverse. Et la phase stationnaire ? Certaines phases stationnaires sont-elles
chromatographie en phase normale. En conséquence, la teneur en eau de la
meilleures que d'autres ?
phase mobile peut varier fortement, si l'on ne prend pas des précautions
particulières pour la contrôler.
Il n'est généralement pas souhaitable de travailler avec des solvants secs, car
A. : Effectivement il y a des différences. La silice et l'alumine sont très
cela peut prendre beaucoup de temps (des jours ont été rapportés) avant qu'une
hygroscopiques et sont donc très sensibles à la teneur en eau de la phase mobile.
colonne soit en équilibre avec une phase mobile sèche. Les phases mobiles
Les phases liées polaires telles que les garnissages cyano, diol ou amino sont
saturées en eau ne sont pas non plus souhaitables, car dans ces conditions l'eau
moins sensibles. Du point de vue de la reproductibilité des temps de rétention, ce
s'accumule dans les pores du garnissage et on obtient une colonne de séparation.
sont donc les garnissages privilégiés lorsqu'une nouvelle méthode en phase
normale doit être développée. Cependant, il y a certaines choses que l'on doit
On souhaite utiliser des phases mobiles à teneur en eau intermédiaire mais
savoir sur le comportement de ces phases.
contrôlée. Une bonne approche pour obtenir une teneur en eau reproductible a
été l'utilisation de phases mobiles à moitié saturées en eau. La préparation est
Par exemple, les groupes amino primaires à la surface d'un garnissage amino
relativement simple. On divise la phase mobile en deux portions égales, puis on
peuvent facilement former des bases de Schiff (imines) avec des aldéhydes et
sature une portion en eau.
des cétones dans des conditions typiques de chromatographie en phase normale.
Par conséquent, les colonnes amino ne doivent pas être utilisées avec des
Ceci est accompli en ajoutant 1 ou 2 ml d'eau à 500 ml de phase mobile et en
échantillons contenant des aldéhydes ou des cétones.
agitant pendant environ une demi-heure.

dix
Machine Translated by Google

Les colonnes cyano sont assez stables dans les solvants non polaires,
8. Volume du système, volume mort, volume
mais présentent souvent le curieux phénomène d'effondrement du lit
d'attente
lorsqu'elles sont exposées à des solvants de polarité intermédiaire comme
l'acétonitrile pur, le THF ou le méthanol. Cette condition peut être rencontrée
Q.ÿ: Je rencontre souvent des termes tels que l'étalement de la bande
lors de tentatives de "lavage" d'une colonne qui s'est détériorée en raison de
système, le volume système, le volume mort, le volume d'attente. Pourriez-
l'accumulation de débris d'échantillon. D'après notre expérience, il est
vous expliquer ces termes ?
préférable de maintenir un haut débit constant à travers la colonne pendant
ces procédures de lavage. L'affaissement du lit est plus susceptible de se
A. : Avec plaisir ! Lorsque nous parlons de ces paramètres, nous devons les
produire à des débits faibles ou lorsque la colonne est stockée dans ces
solvants. définir clairement. Comme nous le verrons, ils sont assez différents et
affectent différents éléments d'une séparation chromatographique.
Les colonnes amino peuvent changer assez radicalement si elles sont
exposées à des éluants aqueux. La forte concentration de groupes amino
Commençons par le volume mort. On l'appelle aussi le volume extra-
dans les pores du garnissage forme un environnement fortement basique, qui
colonne, ce qui est un peu plus clair. Il comprend le volume d'un système
provoque l'hydrolyse de la phase liée. Après retour à la phase mobile en
HPLC entre le point d'injection et le point de détection, mais à l'exclusion de
phase normale, il ne faut pas s'étonner de constater une différence significative
la partie de la colonne qui contient le garnissage. Il comprend donc le volume
dans le comportement du garnissage.
d'injection, le volume de l'injecteur, le volume de la tubulure de raccordement
avant et après la colonne, le volume dans les embouts de la colonne, y
Ces phases greffées polaires sont tout à fait universellement utiles, tout
compris les frittes, et le volume du détecteur. En fait, pour être précis, il
comme la silice elle-même ou l'alumine. Par conséquent, on ne peut pas dire
comprend la moitié du volume d'injection et la moitié du volume du détecteur.
qu'une phase est "meilleure" que les autres.
Ils présenteront des sélectivités uniques qui sont différentes de la silice ou
de l'alumine, et ils sont assez différents les uns des autres. Tout comme les
Nous sommes préoccupés par le volume extra-colonne, car il provoque un
colonnes de silice présentent une forte rétention des analytes basiques, les
étalement de bande extra-colonne. L'étalement de bande signifie que les pics
colonnes amino retiendront plus fortement les acides.
s'élargissent lorsqu'ils traversent le volume extra-colonne. Ceci n'est pas
Les colonnes cyano et diol sont neutres. Les colonnes diol sont plus polaires
souhaitable car cela peut détruire une partie de la séparation réalisée dans la
et donc généralement plus rémanentes que les colonnes cyano.
colonne. Nous aimerions garder la bande extra-colonne aussi petite que
possible.
Comme dans le cas des garnitures à phase inversée, il existe des
différences significatives entre les différentes marques du même type de
phase greffée. Laissant de côté les différences dans la silice de base, il existe
Q.ÿ: Comment peut-on mesurer le volume extra-colonne et l'étalement de
des différences dans le processus de liaison et dans la procédure de coiffage.
bande extra-colonneÿ?
Des silanes monofonctionnels, difonctionnels ou trifonctionnels peuvent être
utilisés. De plus, si des silanes multifonctionnels sont utilisés, des procédures
R. : Le volume total extra-colonne et l'étalement de bande extra-colonne ne
de revêtement significativement différentes peuvent être utilisées qui
peuvent être mesurés qu'à l'aide d'un équipement spécial. Ceci est dû au fait
aboutissent à un revêtement "monocouche" ou un revêtement "polymère".
qu'il comprend les embouts de colonne et les frittés dans la colonne, qui ne
Les colonnes cyano peuvent ou non être coiffées, tandis que les garnissages
sont pas accessibles par l'utilisateur. Nous devons donc simplement croire
amino et diol ne sont généralement pas coiffés. Ainsi, tout comme avec les
que les fabricants de colonnes ont fait du bon travail et ont minimisé cette
garnissages en phase inverse, on ne peut pas supposer qu'une cyano-
partie du volume extra-colonne. Ce que nous pouvons faire facilement, c'est
colonne de la marque A effectuera la même séparation qu'une cyano-colonne
mesurer le volume extra-colonne associé au système HPLC. Pour cela il suffit
de la marque B.
de déconnecter la colonne et de la remplacer par un raccord "zéro volume
mort".
Références:
1. Techniques de Chimie, Vol. II, Solvants organiques, propriétés physiques Ensuite, nous injectons un petit volume d'échantillon et enregistrons la

et méthodes de purification, troisième édition (1970), John A. Riddick et réponse du détecteur. Un exemple de réponse est présenté dans la figure 1.

William B. Bunger, Wiley-Interscience 2. Merck Index, onzième édition (1989),

Merck & Co., Inc. A partir de ce "chromatogramme", nous pouvons déterminer le volume de
colonne supplémentaire et l'étalement de bande extra-colonne. Le volume
extra-colonne est à proprement parler la distance du point d'injection au
centre de gravité du pic.
Pour le déterminer, nous devons calculer le premier moment du pic.
Cependant, nous n'avons pas besoin d'être trop précis et pouvons, pour plus
de simplicité, utiliser la distance entre le point d'injection et le pic maximum
comme mesure du volume mort du système.

11
Machine Translated by Google
Figure 1
V Nous devrions rendre obsolète le terme volume du système et utiliser plutôt
h
w pression est utilisé), le volume des têtes de pompe et des clapets anti-
Figure 1 : Mesure du volume extra-colonne et de l'étalement de bande.
V est le volume extra-colonne, w est la largeur du pic à 4,4% de la hauteur
du pic, correspondant à 5 écarts-types.
Nous pouvons utiliser l'écart type du pic comme mesure de l'étalement
de bande du système. L'écart type du pic peut être calculé à partir du
deuxième moment du pic. Un moyen plus simple consiste à mesurer la
largeur du pic. Étant donné que ce pic est hautement asymétrique, il est
préférable de mesurer la largeur aussi près que possible de la ligne de
base pour obtenir une bonne mesure de l'étalement des bandes extra-
colonne. Par exemple la largeur du pic à 4,4 % de la hauteur du pic
correspond à une largeur de 5 écarts types.
Q.ÿ: OK, mais quel échantillon et quelle phase mobile dois-je utiliser pour
cette mesureÿ?
R. : Vous pouvez simplement utiliser la phase mobile utilisée dans votre
analyse. Comme échantillon, vous pouvez simplement utiliser les normes
que vous utilisez dans l'analyse chromatographique. Cependant, la plupart
du temps, la norme est susceptible d'être trop concentrée et vous devez la
diluer pour la rendre compatible avec le petit étalement de bande de
colonne supplémentaire. Si vous faites cela, vous obtenez une idée directe
de l'étalement des bandes extra-colonne dans vos conditions
chromatographiques réelles. D'autre part, vous pouvez standardiser la
mesure sous la forme d'une vérification générale du système indépendante
du test chromatographique que vous exécutez. L'inconvénient est que
vous risquez de manquer quelque chose qui est spécifiquement lié à votre
analyse particulière. J'ai rencontré un cas il y a quelques années, où
l'échantillon interagissait fortement avec une pièce de l'injecteur.
Bien que tout ce que nous avons fait ait indiqué un étalement excessif de
la bande de colonne supplémentaire, nous ne pouvions pas le voir dans
notre test standardisé, qui utilisait un échantillon différent et une phase
mobile différente. Ce n'est que lorsque nous avons utilisé l'échantillon réel
dans des conditions réelles de phase mobile que nous avons trouvé le
problème.
Q. : Cela couvre le volume extra-colonne et l'étalement de bande extra-
colonne. Qu'en est-il du volume du système et du volume d'attenteÿ?
12
R.ÿ: Je n'aime pas le terme "volume système", car il est ambigu. Vous
pouvez avoir un volume mort système ou un volume d'attente système.
les mots volume de colonne supplémentaire et volume de séjour en
gradient. Ce dernier peut également être appelé volume de retard de
gradient. Il fait référence au volume d'un système HPLC à gradient entre le
point de mélange du gradient et le sommet de la colonne. (Elle existe aussi
en chromatographie isocratique, mais là elle est sans importance).
Le volume de séjour du gradient comprend le volume du mélangeur à
gradient, la tubulure de raccordement à la pompe (si un mélange à basse
retour, la tubulure entre la pompe et l'injecteur, le volume de l'injecteur et
le tube de connexion entre l'injecteur et la colonne. Comme on peut le voir,
il pourrait y avoir beaucoup de volume dans toutes ces parties.
Lorsque vous démarrez un gradient, il faudra un certain temps pour que
ce volume soit purgé et que le gradient entre dans la colonne. Pendant ce
temps, les pics sont soumis à une migration isocratique dans la phase
mobile de départ. S'il existe de grandes différences dans le volume de
séjour du gradient entre différents systèmes, cette migration isocratique
peut être suffisamment différente pour affecter le chromatogramme, en
particulier la première partie du chromatogramme.
Un autre effet gênant est que votre séparation réelle peut être
considérablement retardée. Si vous avez un système avec un volume de
retard total de 2 mL et que vous exécutez un gradient à 200 µL/min, il
faudra 10 minutes jusqu'à ce que le gradient atteigne le haut de votre
colonne. Par conséquent, le début de votre séparation est retardé de 10
minutes.
Q.ÿ: Comment puis-je mesurer le volume d'arrêtÿ?
A.ÿ: Encore une fois, vous déconnectez la colonne de votre système.
Ensuite, vous exécutez un gradient progressif du méthanol au méthanol
avec 10 mg/L de propyl paraben, à l'aide d'un détecteur UV.
Cela créera une trace de détecteur en forme de S. Vous mesurez ensuite
le délai entre le point auquel vous avez commencé le dégradé et le point
où la moitié de la hauteur de la marche est atteinte. En multipliant ce temps
avec le débit, vous obtenez le retard de gradient ou le volume d'arrêt.
Q.ÿ: Existe-t-il une référence bibliographique contenant ces définitionsÿ?
R.ÿ: De nombreux manuels contiennent des sections qui définissent les
termes utilisés en chromatographie. Il existe cependant un organisme
faisant autorité, la Commission de la nomenclature analytique de la Division
de chimie analytique de l'Union internationale de chimie pure et appliquée,
qui définit de nombreux termes utilisés en HPLC et dans d'autres techniques
chromatographiques. Je crois que leur dernière publication contenant la
nomenclature actuellement en vigueur a été publiée dans Pure et Appl.
Chem, Vol. 65, No. 4, pp. 819-872, 1993. Malheureusement, tous les
termes utilisés ne sont pas expliqués, par exemple le volume de séjour
manque, et la définition de certains termes reste encore ambiguë.
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9. Transfert des méthodes de gradient

R.ÿ: Il existe une solution qui fonctionne la plupart du temps. Si le volume
de maintien du gradient est plus petit sur le système vers lequel vous
Q.ÿ: J'ai développé une méthode de gradient qui est très reproductible
transférez votre méthode, vous pourrez peut-être compenser le manque
lorsque je l'exécute sur mon système, mais je ne peux pas obtenir les
de volume de maintien en programmant une partie isocratique au début
mêmes résultats sur un autre système. Qu'est-ce qui ne va pas?
de votre gradient qui compense la différence de volume. Le reste du
gradient reste simplement constant. Si d'autre part le volume d'arrêt du
A.ÿ: Parfois, certaines difficultés surviennent lorsque les méthodes de
gradient sur le deuxième système est plus grand que celui sur le premier
gradient sont transférées d'un système HPLC à un autre.
système, la situation est plus difficile. En principe, vous pouvez démarrer
À moins que les systèmes ne soient identiques, on peut généralement
s'attendre à des changements dans les temps de rétention. La plupart du le gradient, puis injecter l'échantillon après un délai qui tient compte de la
temps, ces changements de rétention n'affectent pas la résolution dans la différence de volume de maintien du gradient entre les deux systèmes.
Mais cela peut ne pas être possible sur un système automatique, où
mesure où une méthode devient inutile, et on peut généralement procéder
l'injection déclenche le début de la pente. Dans ce cas, vous devrez peut-
en ignorant les différences. D'autre part, avec une bonne compréhension
être revenir à zéro et redévelopper la méthode.
des causes sous-jacentes, on peut être en mesure d'ajuster le gradient
pour obtenir des performances égales à partir de systèmes HPLC différents.

Dans la dernière colonne, nous avons abordé un aspect du problèmeÿ:

Q. : Ce ne serait pas une situation très agréable après tout le temps que
le volume de séjour du gradient. C'est le volume entre le point de mélange
j'ai passé à développer la méthode. Que puis-je faire pour éviter que cela
du gradient et le haut de la colonne.
ne se reproduise à l'avenirÿ?
Après avoir commencé votre analyse en injectant l'échantillon, le gradient
n'atteindra pas le haut de la colonne tant que le volume de maintien du
R. : Vous pouvez éviter cette situation en développant la méthode pour
gradient n'aura pas été purgé. Cela signifie que votre échantillon est
les systèmes HPLC qui utiliseront finalement la méthode.
soumis initialement à une période de migration isocratique jusqu'à ce que
Cela nécessite une certaine prévoyance et une certaine planification, mais
le gradient se rattrape. Étant donné que le volume de séjour du gradient
n'est généralement pas impossible. Ce que vous devez faire en amont,
peut être différent d'un système à l'autre, ce temps de migration isocratique
c'est caractériser les systèmes susceptibles d'être utilisés pour votre
sera différent et peut entraîner des différences de temps de rétention ou
même affecter la résolution. méthode. Il y a deux choses de base que vous devez savoir pour chaque
systèmeÿ: le volume de maintien du gradient et la précision de la
Une autre possibilité est le dégradé lui-même. Il pourrait y avoir des
composition. Vous pouvez obtenir les deux informations en une seule
différences de composition d'un système à l'autre. Avec la plupart des
expérienceÿ: comme décrit ci-dessus, vous ajoutez un absorbeur d'UV à
systèmes HPLC fabriqués aujourd'hui, cela ne devrait être qu'une
votre solvant B. Ensuite, vous programmez un gradient à étapes multiples
préoccupation secondaire. Mais généralement, tout système de gradient
par incréments de 5 % de 0 % B à 100 % B. Le débit doit être le débit
fournit une composition avec la plus grande précision dans la plage
généralement utilisé, vous utiliserez donc très probablement un débit de 1
médiane de la composition, c'est-à-dire à un mélange de 50ÿ% A et 50ÿ%
ml/min.
B. La précision souffre, lorsque des quantités très disproportionnées de A
Les intervalles entre les étapes doivent être de quelques minutes, peut-
et B sont mélangées, par exemple 5% A ou 95% A.
être 5 minutes. Exécutez maintenant ce gradient sans colonne en place
sur les différents systèmes et enregistrez la réponse du détecteur. Le délai
Q.ÿ: Que puis-je faire pour déterminer laquelle de ces possibilités cause
entre le temps programmé pour chaque étape et l'occurrence réelle de
mon problème de transfert de méthodeÿ?
l'étape vous donne le temps de retard du gradient. La hauteur de la marche
vous donne une mesure de la composition. Les étapes seront un peu
R. : Le plus simple est de comparer votre gradient sur les deux systèmes.
étalées, ce qui est fonction du volume de mélange dans votre système.
Pour ce faire, vous déconnectez la colonne et ajoutez un absorbeur d'UV
au solvant B de votre gradient. Si vous utilisez un système en phase
inversée, vous pouvez par exemple ajouter 10 mg/L de propyl paraben à
Maintenant que vous avez caractérisé les systèmes, vous pouvez
votre solvant B. Ensuite, vous exécutez le dégradé sur les deux systèmes
concevoir votre méthode autour des caractéristiques des systèmes.
et enregistrez la ligne de base. Vous comparez ensuite les deux tracés
Comme je l'ai mentionné précédemment, le plus gros problème est
l'un à l'autre. Vous souhaitez trouver le point de départ du dégradé et vous
généralement le volume de maintien du gradient. Si vous savez que les
souhaitez également mesurer le profil du dégradé. Si votre dégradé est
systèmes dont vous avez besoin pour transférer votre méthode ont un
linéaire, il vous suffit de vérifier la pente du dégradé.
volume de séjour plus important que le système sur lequel vous développez
votre méthode, vous devez automatiquement ajouter une étape isocratique
Vous constaterez très probablement que le début du gradient est
dans le développement de vos méthodes qui compensera cette différence.
différent entre les deux instruments, tandis que le profil est très similaire,
Si les volumes d'attente des systèmes cibles sont inférieurs à celui de
juste décalé d'un certain laps de temps. Dans ce cas, vous avez une
votre système de développement, vous devriez pouvoir simplement
différence dans le volume de maintien du gradient.
compenser cela en ajoutant un temps de retard de gradient au début de
votre méthode lors du transfert de la méthode.
Q.ÿ: Si tel est le cas, existe-t-il un moyen simple de compenser la
différence de volume de temporisationÿ?

13
Machine Translated by Google
S'il y a des différences de composition au milieu de la course de dégradé, vous
pourriez éventuellement les compenser également en ajustant le profil de dégradé,
mais je n'ai jamais rencontré de situation où cela était nécessaire.
Cette discussion suppose que la colonne est en équilibre complet avec la phase
mobile de départ. Parfois, j'ai rencontré une situation où, dans une analyse de
routine, les gradients se succèdent si rapidement que la colonne ne revient jamais
à l'équilibre dans la phase mobile de départ. Vous verrez que vous avez cette
situation si votre premier dégradé donne toujours des résultats différents des
dégradés suivants.
Cela peut être avantageux pour accélérer une méthode, mais cela peut être une
cause de difficultés lorsque cette méthode est transférée à un autre système avec
un volume de séjour différent.
10. Système bouché
Q. : La pression de mon système est beaucoup plus élevée qu'elle ne devrait l'être.
Quel est le problème?
A. : Tout d'abord, laissez-nous vérifier votre prémisse. Comment savez-vous, quelle
devrait être la pression?
Q. : Auparavant, la même colonne avec les mêmes conditions de phase mobile à
la même température me donnait une contre-pression d'environ 2000 PSI.
Maintenant, il a doublé. J'ai réglé la limite de haute pression de la pompe à 4000
PSI, et la pompe s'arrête à cette pression.
R. : C'est bien que vous ayez un point de référence précédent, nous pouvons
commencer notre dépannage à partir de là. Il y a beaucoup de choses différentes
qui peuvent conduire à une augmentation de la contre-pression.
Tout d'abord, la viscosité de votre phase mobile pourrait ne pas être correcte.
Deuxièmement, une partie de votre système peut être obstruée. Ce dernier cas est
le plus courant, mais avant de démonter votre système, laissez-nous vérifier vos
locaux.
Comment savez-vous que vous pompez la bonne phase mobileÿ? Si vous
utilisez un mélange automatique, avez-vous mis le bon solvant sur la bonne ligne
d'entrée de la pompeÿ? Par exemple, un mélange de la ligne de méthanol et
d'acétonitrile (si votre instrument est configuré de cette façon pourrait facilement
donner une différence de contre-pression d'un facteur deux en raison de la
différence de viscosité entre les mélanges de chaque solvant avec de l'eau.
Si vous travaillez à température élevée avec un chauffe-colonne, vous devez
vérifier que votre chauffe-colonne est allumé et qu'il fonctionne. La viscosité d'un
solvant change généralement de 25 % pour 10 °C. Donc si votre solvant est censé
être à 60
°C, mais que votre radiateur ne fonctionne pas, vous pourriez obtenir le double de
la contre-pression.
Q. : OK C'est facile à vérifier. Que puis-je vérifier d'autreÿ?
R. : Je pose souvent la question de savoir si l'arrêt haute pression s'est produit au
milieu d'une longue série d'analyses ou au démarrage.
14
Si la haute pression s'est développée au démarrage, il est probable qu'une sorte
d'erreur se soit produite. Vérifions quelques éléments, en commençant par les
éléments simplesÿ: est-ce la bonne colonne avec la bonne taille de particulesÿ? La
contre-pression de la colonne change avec le carré de la taille des particules. Donc,
si par accident vous avez saisi la version 5 µm de la colonne 10 µm que vous aviez
l'habitude d'exécuter, cela expliquerait l'augmentation de la pression.
Si ce n'est pas le cas, alors quelque chose est bouché. Tout d'abord,
déconnectons la colonne et remplaçons-la par une union, en laissant les colonnes
de garde et les filtres de précolonne en place. Une possibilité que nous vérifierons
est une incompatibilité de la phase mobile. Si nous laissions la colonne analytique
en place, nous pourrions l'endommager lors des opérations ultérieures.
Après avoir déconnecté la colonne, nous vérifions à nouveau la contre-pression du
système. S'il est substantiel, c'est-à-dire supérieur à 1500 PSI, alors l'une des
parties restantes est colmatée et la colonne est probablement encore OK. Nous
pouvons alors déconnecter les éléments restants du chemin de fluide un par un et
déterminer lequel des éléments contribue le plus à la contre-pression.
Habituellement, il est plus efficace de remplacer la pièce obstruée, plutôt que
d'essayer de la nettoyer. Mais dans de nombreux cas, une pièce de rechange n'est
pas facilement disponible et nous pouvons envisager des procédures de nettoyage.
Il est plus facile de développer une procédure de nettoyage, si nous savons ce
que nous essayons de supprimer. Dans ce cas hypothétique, nous savons que le
colmatage s'est produit au démarrage. Nous devrions alors nous demander
pourquoi le sabot s'est produit. Il est possible, par exemple, que la dernière phase
mobile utilisée dans le système n'ait pas été complètement purgée et soit
incompatible avec la nouvelle phase mobile. Un tampon peut avoir précipité. Si tel
est le cas, vous pouvez simplement laver ou rincer la partie obstruée avec un
solvant qui redissoudra le précipité, et vous serez opérationnel en peu de temps.
Le sabot peut même disparaître pendant que vous vérifiez toujours quelle partie
était bouchée.
S'il s'avère que la colonne analytique ou la colonne de garde s'est colmatée lors
du démarrage, vous pouvez vérifier dans quel solvant la colonne ou la colonne de
garde a été stockée. Le solvant de stockage peut être incompatible avec la phase
mobile et provoquer la précipitation d'un tampon. Ou bien, la colonne ou la colonne
de garde a été stockée avec une phase mobile contenant un sel et séchée
(partiellement) en raison de bouchons desserrés. Dans ce cas, vous pourrez peut-
être ressusciter la colonne ou la colonne de garde en la rinçant à faible débit avec
une phase mobile qui redissoudra le sel.
Q.ÿ: Dans mon cas, l'arrêt à haute pression s'est produit au milieu d'une série
d'exécutions. Quel pourrait être le problème dans ce cas ?
R. : Dans ce cas, il est fort probable qu'une partie de votre système se soit obstruée
à cause de débris qui se sont accumulés. Les débris peuvent provenir des joints
de votre instrument ou de l'échantillon. Il peut s'agir de constituants de votre
échantillon qui sont insolubles dans la phase mobile. Il peut s'agir d'un composant
de l'échantillon fortement adsorbé sur la colonne de garde ou, si vous n'utilisez pas
de colonne de garde, sur la colonne elle-même. Souvent, ceux-ci sont élevés-
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les constituants de poids moléculaire de votre échantillon qui n'ont pas été
éliminés ou qui n'ont été que partiellement éliminés. Il peut s'agir de protéines
dans un échantillon de sérum, d'excipients dans une formulation pharmaceutique
ou de constituants de poids moléculaire élevé dans un échantillon alimentaire.
Si vous utilisez des filtres de précolonne et des colonnes de garde,
déconnectons-les un par un et mesurons la contre-pression du système sans
cette pièce. De cette façon, nous devrions être en mesure d'identifier rapidement
la partie encrassée. S'il s'agit d'une colonne de garde ou d'un filtre précolonne,
il est préférable de remplacer simplement la pièce. Il a fait le travail qu'il était
censé faire et a protégé votre colonne analytique. Tenter de ressusciter cette
pièce en la nettoyant est une fausse économie : cela ne fonctionnera pas aussi
bien la prochaine fois, et il y a par conséquent une probabilité accrue que la
colonne analytique soit endommagée.
S'il s'agit de la colonne analytique elle-même, il vaut la peine de faire
quelques travaux pour tenter de la nettoyer. Cependant, le meilleur remède est
la prévention, et vous pouvez envisager d'utiliser un filtre précolonne ou mieux,
une colonne de garde à l'avenir pour protéger la colonne analytique. Si l'origine
du problème est l'échantillon lui-même, vous pouvez envisager de filtrer
l'échantillon ou d'utiliser une extraction en phase solide pour éliminer le
contaminant.
Si vous avez un filtre de rechange pour votre colonne, je tenterais d'abord de
remplacer le filtre d'entrée de la colonne. Si vous n'avez pas de filtre, vous
pouvez retirer le filtre et tenter de le nettoyer dans un bain à ultrasons. Ceci n'est
possible qu'avec des colonnes à base de silice. Avec les colonnes polymères,
le garnissage est soumis à des contraintes et suinte hors de la colonne dès que
vous retirez le filtre. Si vous avez un filtre de rechange à portée de main, vous
pouvez le remplacer rapidement et refermer la colonne. Si vous n'avez pas de
filtre de rechange, vous ne devez pas ouvrir une colonne polymère.
Si un remplacement ou un nettoyage du filtre d'entrée n'entraîne pas de
réduction de la contre-pression, il est fort probable que quelque chose soit
adsorbé sur la surface du garnissage ou s'est précipité dans la colonne. Dans
ce cas, la colonne doit être rincée à des débits lents avec quelque chose qui
redissout ou désorbe le contaminant suspecté. Les fabricants de colonnes
recommandent généralement une séquence de solvants de force de solvant
croissante pour accomplir cette tâche. Pour les colonnes en phase inverse, on
peut envisager la séquence suivanteÿ: eau, méthanol, THF, chlorure de
méthylène, méthanol et retour à l'eau. Pour les colonnes en phase normale,
l'ordre des polarités est inversé : chlorure de méthylène, THF, eau, méthanol,
chlorure de méthylène.
Si cela ne résout pas le problème, vous pouvez toujours tenter de rétro-rincer
la colonne. Mais à ce stade, il serait peut-être préférable de prendre le téléphone
et de commander une nouvelle colonne.
11. Comptage sur plaque de colonne
Q. : Lorsque j'exécute ma méthode et que je mesure le nombre de plaques,
j'obtiens environ 8 000 plaques pour ma colonne. Mais la documentation du
fabricant spécifie 13000 plaques. Pouvez-vous expliquer cet écart ?
R.ÿ: Les colonnes n'ont pas de nombre de plaques fixe. Pour une colonne
donnée, le nombre de plateaux dépend du débit, de la viscosité de
15
le solvant et le poids moléculaire de l'analyte. L'instrument peut également
affecter la mesure, mais nous l'ignorons pour le moment.
Le fabricant de la colonne a mis en place des conditions standardisées par
lesquelles la qualité de la colonne est mesurée.
En chromatographie en phase inverse, la mesure est généralement effectuée
avec un simple analyte hydrophobe, comme le toluène, le naphtalène ou
l'acénaphtène. Les phases mobiles utilisées avec ces composés contiennent
une grande quantité de solvant organique.
Ils ont donc une faible viscosité. D'autre part, la plupart des utilisateurs de HPLC
ont affaire à des molécules plus polaires, qui nécessitent des phases mobiles
avec une teneur en eau plus élevée. Ces phases mobiles ont une viscosité plus
élevée. Étant donné que dans des conditions HPLC normales et des débits
HPLC normaux, le nombre de plaques diminue lorsque la viscosité augmente,
le nombre de plaques est inférieur dans des conditions d'utilisation pratiques
que dans des conditions de test de colonne.
Q.ÿ: Si le nombre de plaques dans des conditions normales d'utilisation est
inférieur au nombre de plaques indiqué par le fabricant, les fabricants ne
trompent-ils pas les utilisateurs quant aux capacités de la colonneÿ?
A. : Pas vraiment. Ce n'est pas le but. Les procédures de test de colonne
utilisées par les fabricants sont conçues pour vérifier la qualité de la colonne, et
il est préférable de le faire au maximum ou à proximité du maximum de la
capacité de comptage sur plateau de la colonne. C'est le point où la technique
de garnissage de la colonne a la plus grande influence. Par conséquent, si je
veux vérifier la qualité de la technique d'emballage, c'est à ce moment-là que je
veux la mesurer.
Q.ÿ: Veuillez expliquer un peu plus pourquoi et comment le nombre de plateaux
de la colonne varie en fonction du débit, du remplissage de la colonne, etc.ÿ!
A.ÿ: La hauteur réduite de la plaque et sa dépendance à la vitesse réduite sous-
tendent toute cette dépendance du nombre de plaques à divers paramètres. Je
vais esquisser cela un peu, mais pour une compréhension plus approfondie,
nous devons consulter un manuel de chromatographie.
Le nombre de plaques de la colonne est la longueur de la colonne L
divisé par la hauteur de plaque réduite h et la taille des particules dpÿ:
L
N = (1)
HD p
ÿ
La longueur de la colonne et la taille des particules sont fixes (et connues).
La hauteur réduite du plateau dépend de la vitesse réduite, qui est définie
comme suitÿ:
tu ÿ d
= p
ÿ (2)
ré
m
Cette équation contient la vitesse linéaire u, le coefficient de diffusion DM de
l'échantillon dans la phase mobile et encore une fois la taille des particules. La
plupart des travaux HPLC sont effectués à des vitesses réduites entre 3 et 20.
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Il existe plusieurs équations dans la littérature qui décrivent la dépendance est inversement proportionnel à la viscosité de la phase mobile : ÿ de la
de la hauteur de plaque réduite sur la vitesse réduite. Dans la plage de
vitesse discutée ici, ils donnent des résultats identiques. Par conséquent, 1
laissez-moi utiliser la plus simple, qui est basée sur l'équation de van- MD ÿ (5)
ÿ
Deemterÿ:
Cela signifie que la vitesse (ou le débit) à laquelle le nombre maximal de
ÿ
1h30
1=++ (3) plaques se produit diminue avec l'augmentation de la viscosité. Une phase
ÿ 6 mobile d'acétonitrile/eau 70/30 v/v a une viscosité de 0,7 cP, tandis que la
Les coefficients sont empiriques et ont été dérivés d'une large base de
viscosité d'une phase mobile de méthanol/eau 50/50 v/v est de 1,8 cP.
données pour les conditions de fonctionnement en phase inversée. Lorsque nous utilisons la phase moblie méthanol/eau, le débit optimal
La courbe décrite par cette relation présente un minimum, qui est atteint à
diminue donc entre 0,2 et 0,3 mL/min pour la colonne de 3,9 mm et entre
une vitesse réduite d'environ 2,5. Le premier coefficient est une mesure de 0,3 et 0,45 mL/min pour la colonne de 4,6 mm remplie de particules de 5
l'uniformité du garnissage. µm. C'est quelque chose qu'il vaut la peine de garder à l'esprit lors du
Cela dépend donc du processus d'emballage.
développement des méthodes.
Le nombre de plateaux de la colonne dépend de la vitesse réduite
comme suitÿ:
Il y a un aspect secondaire intéressant de la dépendance du coefficient
L de diffusion sur la viscosité du solvant. On peut utiliser la règle empirique
N = (4)
ÿ suivante pour estimer les performances de la colonne, lorsque la composition
ÿ1ÿ ÿ
1,5 + + ÿÿ
ré p de la phase mobile est modifiéeÿ: la même colonne donnera environ le
ÿ
6ÿ
ÿ
même nombre de plateaux à la même contre-pression dans différentes
Etant donné que la dépendance de l'HETP à la vitesse a un minimum, la
phases mobiles. Une règle utile à retenir !
dépendance du nombre de plaques à la vitesse a un maximum. Un petit
calcul montre que le nombre maximal de plaques est d'environ L/2,3 dp.
Nous pouvons donc conclure qu'une colonne de 15 cm remplie de particules
de 5 µm qui a un nombre de plaques maximum de 13 000 est une bonne
colonne. 12. Contre-pression de la colonne
Un mauvais garnissage de colonne affecte largement le premier coefficient
de l'équation 3, tandis que les autres restent à peu près les mêmes. L'effet Q. : J'utilise une colonne C18 de 4,6 mm x 150 mm 5 µm. Ma phase mobile
de ce coefficient est le plus grand, quand l'influence des autres est minime. est un tampon méthanol/phosphate 50/50 pH 7. J'obtiens 3000 psi à 1,5 mL/
C'est la raison pour laquelle il faut tester les colonnes à ou près du nombre min. Est-ce normal?
maximal de plaques.
A. : C'est un peu élevé, mais pas scandaleux. Je me serais attendu à une
Abordons maintenant la deuxième partie de votre question, la dépendance contre-pression pour la colonne seule d'environ 2400 psi, plus vous devez
du nombre de plaques au débit. J'ai un peu glissé là-dessus en passant à la ajouter peut-être 200 psi supplémentaires pour la contre-pression du tube
vitesse réduite. Premièrement, la vitesse réduite est proportionnelle à la de connexion. Cela nous amènerait à 2600 psi. Je pense que votre colonne
vitesse linéaire, qui est proportionnelle au débit. Par conséquent, le nombre peut être partiellement obstruée.
de plaques dépend du débit. Elle est faible à très faible débit et faible à fort
débit. Le nombre maximal de plaques se situe quelque part entre les deux. Q. : C'est tout à fait possible. Je m'en doutais aussi, et c'était la raison de
Mais où? Comme nous l'avons vu à partir de la définition de la vitesse ma question. Comment êtes-vous arrivé à l'estimation de 2400 psi comme
réduite dans l'équation 2, la vitesse réduite inclut le coefficient de diffusion contre-pression "attendue"ÿ?
de l'analyte dans la phase mobile. Nous savons, d'après les résultats ci-
dessus, que le nombre maximal de plaques se produit à une vitesse réduite A. : Je l'ai calculé à partir de l'équation de Kozeny-Carman. Cela fonctionne
quelque part autour de 2 à 3. Pour les analytes hydrophobes généralement très bien pour toutes les colonnes HPLC remplies de garnitures
utilisés comme échantillons de test de colonne avec une phase mobile de incompressibles comme les garnitures à base de silice.
70/30 v/v acétonitrile/eau, cela se traduit par une vitesse linéaire de 1 à 1,5 L'équation de Kozeny-Carman relie la pression au débit F, la longueur de la
mm/sec pour une colonne de 5 µm. Le débit qui correspond à cette vitesse ÿ , de la colonne r
colonne de viscosité L, le rayon
linéaire est d'environ 0,5 à 0,7 mL/min pour un diamètre interne de colonne
et diamètre des particules dpÿ:
de 3,9 mm et de 0,7 à 1 mL/min pour une colonne de 4,6 mm.
Floride
ÿ ÿ

ÿ
ÿ = pf
ÿ

(1)
2
ÿ
ÿ

2r ÿ

d
p

La pression augmente avec l'augmentation du débit, de la viscosité et de

Puisque l'emplacement du minimum de la courbe dépend du coefficient
la longueur de la colonne. Il diminue avec le carré du rayon de la colonne et
de diffusion, nous avons besoin de connaître la dépendance du coefficient
le carré du diamètre des particules.
de diffusion en fonction de la phase mobile.
Le facteur de proportionnalité f dépend de la fraction interstitielle (l'"espace"
Il existe des équations dans la littérature qui permettent d'estimer le
entre les particules) et donc de la densité de tassement. Les garnitures
coefficient de diffusion d'un analyte dans un solvant particulier (par exemple
incompressibles emballent équitablement
l'équation de Wilke-Chang). Cependant, pour la discussion actuelle, nous
avons seulement besoin de savoir que la diffusion

16
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sensiblement la même densité de tassement, c'est-à-dire à une fraction Q. : Cela aide beaucoup. Maintenant, revenons à la colonne. Il semble être
interstitielle d'environ 40 %. Pour une telle colonne, le facteur f est d'environ 1000. partiellement bouché. Que dois-je faire ?

Q. : OK Permettez-moi de calculer la pression pour mon exemple de colonne.
J'ai le débit, la longueur et le diamètre de la colonne et la taille des particules.
Et la viscosité ?
R. : Pour les solvants purs, vous pouvez facilement trouver la viscosité dans
les manuels. Pour les mélanges de solvants de solvants non associatifs, vous
pouvez estimer la viscosité en supposant une relation linéaire avec la fraction
volumique. Pour les mélanges aqueux, cela ne fonctionne pas. La plupart des
mélanges de solvants organiques avec de l'eau ont un maximum de viscosité.
La viscosité des mélanges aqueux les plus couramment utilisés est indiquée
sur la figure 1.
La viscosité d'un mélange 50/50 de méthanol et d'eau est d'environ 1,8 cP
(=0,018 P) à température ambiante. Il n'y a pas beaucoup de différence entre
l'eau et un tampon dilué, et je peux utiliser la viscosité du mélange eau/
méthanol du tableau.
R. : La chose la plus simple à faire est de remplacer la fritte d'entrée.
Espérons que cela réduira la pression. En fait, vous pouvez également
nettoyer l'ancienne fritte dans un bain à ultrasons. Si le remplacement de la
fritte n'entraîne pas une réduction de la contre-pression, la garniture elle-
même peut être partiellement colmatée.
Vous pouvez passer par quelques cycles de lavage pour enlever tout ce qui
obstrue l'emballage, mais c'est une bonne quantité de travail. Étant donné que
l'augmentation de pression n'est que faible, je continuerais à utiliser la colonne
jusqu'à ce qu'elle atteigne la limite de pression de votre système. J'essaierais
également de comprendre quelle est la source de l'augmentation de pression
et d'essayer de l'empêcher autant que possible. Souvent, l'utilisation d'une
colonne de garde entre l'injecteur et la colonne analytique résout le problème
ou au moins ralentit toute augmentation de pression.
Q. : OK, je vais essayer de remplacer le filtre. Dans le cas où cela n'aide pas
et que je décide de nettoyer la colonne, comment dois-je procéderÿ?

Viscosités des mélanges aqueux

3 R. : Vous devez d'abord retirer le tampon de la colonne, vous voulez donc le
laver avec 5 à 10 volumes de colonne d'eau.
Soit entre 10 et 20 mL pour cette colonne. Ensuite, vous passez à 100ÿ% de
méthanol et laissez la colonne se purger pendant un certain temps, peut-être
2 MeOH
environ 15ÿminutes. Vous pouvez faire tout cela à haut débit, puisque votre
MeCN colonne n'est pas encore complètement colmatée.
EtOH Je ferais donc cela à 1,5 mL/min. Vérifions la pression en méthanol. Le
Acétone méthanol a une viscosité de 0,6 cP. Par conséquent, nous nous attendrions à
1
THF une pression d'environ 800 psi à 1,5 mL/min dans du méthanol. Si la pression
est toujours élevée, rincez la colonne avec du tétrahydrofurane (viscosité 0,5
cP) ou du chlorure de méthylène (viscosité 0,4 cP) ou les deux. Le volume de
0 chaque solvant doit être d'environ 20 ml. Tout ce qui n'est pas éliminé dans
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ce volume ne sera probablement pas du tout facilement éliminé dans ce

Volume % d'eau solvant. Après ce processus, vous pouvez revenir à la phase mobile d'origine.
Vous devez vous assurer que les phases mobiles dans les étapes suivantes
Figure 1: sont miscibles. Il faut donc passer du chlorure de méthylène au méthanol puis
Viscosité des mélanges de solvants organiques avec l'eau en fonction de la à l'eau (ou 50/50 méthanol/eau) à 50/50 méthanol/tampon. Vous devez
teneur en eau (% v/ v). Appréciations : MeOH = méthanol, MeCN = acétonitrile, maintenant rééquilibrer la colonne. Dans votre cas, avec cette phase mobile
EtOH = éthanol, THF = tétrahydrofurane
simple, le rééquilibrage est rapide. Si vous deviez effectuer une séparation
nécessitant un réactif à paire d'ions, vous auriez maintenant besoin de purger
votre colonne avec la phase mobile pendant un certain temps, avant de
retrouver l'équilibre.
Le calcul de la pression s'effectue donc
comme suitÿ:
1.5 0,018 15
ÿ

6
atm[=] ÿp
1000
ÿ ÿ ÿ

dix
2
60 2 3,1415 0,23 0,0005
ÿ ÿ

13. Fluctuations de la zone de pointe

Le dernier facteur (10-6) est le facteur de conversion en atmosphères. Ne
pas oublier de diviser le débit par 60 pour obtenir le débit en mL/sec. Ensuite, Q.ÿ: Quelles sont les raisons des fluctuations de la surface du pic, lorsque le
nous avons les mêmes dimensions partout. même échantillon est injecté plusieurs foisÿ?

Pour convertir des atmosphères en psi, multipliez par 14,7. Tu A. : Malheureusement, il y a beaucoup de raisons différentes, trop nombreuses
devrait obtenir 2388 psi, soit environ 2400 psi. pour être comptées. Presque toutes les pièces de l'instrument HPLC

17
Machine Translated by Google
peut éventuellement contribuer à des changements dans la zone de pic.
Passons-les en revue un par un.
L'injecteur vient à l'esprit en premier. Les problèmes que vous pourriez
rencontrer dépendent dans une certaine mesure du type d'injecteur. Mais
dans tous les cas, la formation de bulles d'air lors de la mesure du volume
d'injection est une source de problème majeur. Si vous injectez manuellement,
assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans votre seringue. Avec les
injecteurs à boucle fixe, assurez-vous qu'aucun air n'est aspiré dans la boucle
de l'injecteur. Dans les auto-injecteurs, des bulles d'air peuvent se former si
le capuchon du flacon se referme bien autour de l'aiguille, ce qui peut créer
un vide lorsqu'une grande partie de l'échantillon est injectée. Toute formation
de bulles d'air entraîne une variation aléatoire du volume d'injection d'une
injection à l'autre.
Si la concentration de l'analyte varie considérablement d'un échantillon à
l'autre et que la surface du pic obtenue à partir d'un seul échantillon ne
devient constante qu'après deux ou trois injections, le transfert d'échantillon
est une source probable du problème. Nettoyez soigneusement la seringue
après chaque injection, si vous injectez manuellement, ou vérifiez le lavage
de l'aiguille dans un auto-injecteur. Assurez-vous que le solvant utilisé pour
le lavage de l'aiguille est un bon solvant pour le ou les analytes.
Les diminutions de la surface de pic d'une analyse à l'autre peuvent
également être causées par des changements de température, mais l'effet
est faible, inférieur à 2 %. Si vous sortez un échantillon du réfrigérateur et
que vous le mettez dans un auto-injecteur, il se réchauffera lentement jusqu'à
la température de l'injecteur et le solvant se dilatera. Par conséquent, vous
injecterez d'abord une plus grande masse d'échantillon que plus tard lorsque
l'échantillon aura atteint la température du compartiment échantillon.
Des variations aléatoires du débit peuvent également entraîner des
fluctuations de la surface de pointe. Ils sont généralement causés par des
clapets anti-retour défectueux ou par de l'air ou de la cavitation dans la tête
de pompe. Ils s'accompagnent généralement de fluctuations des temps de
rétention. Vous pouvez vérifier si c'est le problème en surveillant la contre-
pression. Les fluctuations tolérables dépendent de la largeur du pic.
Supposons qu'il y ait une différence de débit de 10 % entre les deux têtes de
votre pompe. Si votre largeur de pic est d'environ 20 coups de pompe, la
fluctuation de la zone de pic causée par la pulsation de la pompe est inférieure
à 1 %. Mais ce sera 10 % si la largeur du pic est d'environ un coup de pompe.
Une autre cause potentielle de changements de débit sont les fuites du
côté haute pression du système. Ils doivent être faciles à trouver.
Les erreurs d'intégration sont plus difficiles à résoudre. Des changements
brutaux dans la façon dont le logiciel intègre les pics peuvent être trouvés
par un simple examen visuel, mais des changements plus subtils sont
difficiles à repérer. Des erreurs d'intégration importantes se produisent
souvent avec des pics de traînée à un rapport signal/bruit de 100 ou moins.
Généralement, le bruit de ligne de base limite la précision de l'intégration,
mais le problème s'aggrave avec les pics avant ou arrière. Vous pouvez
essayer de retraiter les données avec différents réglages des paramètres
d'intégration et voir si cela réduit le problème.
Dans les échantillons complexes qui contiennent des pics qui ne sont que
marginalement résolus des pics d'intérêt, le logiciel
18
peut avoir des difficultés à déterminer où se trouve la ligne de base. Dans un
tel cas, une intégration manuelle ou une intégration automatique avec une
ligne de base forcée peut améliorer la reproductibilité de l'intégration.
L'échantillon lui-même peut être la source du problème. En chromatographie
en phase inverse, il a été observé que certaines protéines ne s'éluaient pas
complètement pendant le gradient initial. Une quantité supplémentaire est
éluée dans les gradients de blanc suivants. Ce "ghosting" est spécifique à la
protéine et au protocole d'élution. Si cela se produit, des gradients vierges
doivent être exécutés entre les analyses.
De plus, les protéines peuvent être adsorbées « de manière irréversible »
sur certaines colonnes. La surface du pic obtenue avec une nouvelle colonne
peut augmenter lentement avec des injections répétitives. Vraisemblablement,
certaines protéines se lient à des sites actifs sur l'emballage. Une fois ces
sites saturés, une surface de pic reproductible est obtenue. Il n'est pas
nécessaire d'utiliser la protéine que vous devez analyser. Il a été rapporté
que d'autres protéines peuvent également être utilisées pour saturer les sites
actifs.
Le détecteur contribue aux fluctuations de la surface des pics de manière
indirecte. La qualité de l'intégration du pic dépend de son rapport signal sur
bruit. Vous ne pouvez pas vous attendre à une reproductibilité de la zone de
crête meilleure que le rapport du bruit de base au signal au maximum de
crête.
La phase mobile contribue rarement aux fluctuations de la zone de pointe.
S'il y a des changements dans la composition de la phase mobile, ils
affecteront les temps de rétention bien avant d'affecter les zones de pic. Les
pics fantômes ou les pics négatifs qui peuvent être générés par la phase
mobile affectent l'intégration de la même manière que toute autre interférence.
Ils peuvent souvent être évités en dissolvant l'échantillon dans la phase
mobile.
Q.ÿ: À quelle reproductibilité de la surface du pic puis-je raisonnablement
m'attendreÿ?
A.ÿ: À moins que vous ne soyez limité par le rapport signal sur bruit, l'écart
type relatif de la zone de pic pour les injections répétitives doit être nettement
inférieur à 1ÿ%. Des valeurs de 0,2 à 0,5 % sont réalisables. La reproductibilité
peut être encore augmentée en utilisant un étalon interne et en calculant le
rapport de la surface du pic de l'analyte (s) à la surface du pic de l'étalon
interne, mais même avec cette méthode, vous ne pourrez probablement pas
piloter le rsd bien en dessous de 0,1 %.
14. Pics fantômes
Q.ÿ: Un pic apparaît lorsque je fais une injection à blanc.
D'où est ce que ça vient?
R. : Les pics fantômes peuvent se produire dans plusieurs situations
différentes. Dans ce qui suit, nous aborderons les différentes causes de ces
pics fantômes. Premièrement, différents phénomènes peuvent se produire
en chromatographie isocratique et en chromatographie à gradient. C'est
pourquoi nous diviserons la discussion suivante en ces sujets.
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1. Chromatographie isocratique
Définissons ce que vous entendez par une injection "à blanc". Si vous
injectez de la phase mobile, alors en effet nous ne nous attendons pas à voir
un pic. Mais si vous injectez autre chose, par exemple le solvant dans lequel
vous dissolvez couramment l'échantillon, vous ne devriez pas être surpris de
voir des pics. L'injection d'autre chose que la phase mobile perturbe l'équilibre
entre la phase mobile et la phase stationnaire, et des pics peuvent être
observés.
Phase mobile recirculée
Si un constituant de la phase mobile a une rétention modérée, il apparaîtra
comme un pic retenu. Ces pics peuvent être positifs ou négatifs. Si vous
recirculez la phase mobile, et si cette phase mobile a été utilisée pendant un
certain temps, vous pouvez voir un profil de pic négatif qui correspond à
l'échantillon que vous injectez habituellement. Les échantillons préalablement
injectés se sont accumulés dans la phase mobile recirculée, et la phase
stationnaire est partiellement recouverte des analytes. Lorsque vous injectez
une phase mobile fraîchement préparée ou juste un solvant à blanc, il y a un
déficit de concentration des constituants de l'échantillon. Ce déficit de
concentration descend dans la colonne à la même vitesse que les pics
correspondants, et une image négative du chromatogramme normal en résulte.
Le phénomène est appelé chromatographie de vacance et les pics sont
appelés pics de vacance. C'est l'une des raisons pour lesquelles une
recirculation de la phase mobile n'est généralement pas une bonne idée.
Report et précipitations
Si vous injectez un échantillon identique à la phase mobile et que vous
observez toujours un pic, nous devons rechercher des sources extérieures à
la colonne et à la phase mobile. Par exemple, il pourrait y avoir un certain
report des injections précédentes. Vous devriez vérifier si le lavage de l'aiguille
de votre auto-injecteur fonctionne bien. Si vous utilisez un injecteur manuel,
assurez-vous que votre seringue est correctement nettoyée. Cela inclut
l'extérieur de l'aiguille.
Est-il possible que des constituants de l'échantillon précédemment injectés se
soient précipités dans l'injecteur ou soient adsorbés sur une partie de
l'injecteurÿ? La surface des pics que vous observez devrait alors diminuer à
chaque injection. Assurez-vous que tous les constituants de l'échantillon sont
solubles dans la phase mobile. La meilleure solution est de dissoudre
l'échantillon en phase mobile.
Problèmes de chemin de fluide
Une injection est toujours accompagnée d'une impulsion de pression. S'il y
a des coins morts dans le trajet du fluide, comme une connexion en T à un
manomètre, etc., l'impulsion de pression peut amener une partie du solvant
dans ces coins morts à pénétrer dans le trajet du fluide et à créer un pic.
Habituellement, ces pics sont plus larges que les pics normalement observés
dans le chromatogramme. Inspectez le trajet du fluide et éliminez ces angles
morts dans la mesure du possible.
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2. Chromatographie en gradient
Tous les commentaires précédents s'appliquaient à la chromatographie
isocratique. Si vous utilisez des gradients, il existe plusieurs autres sources
possibles de pics dans les passages à blanc.
Solvant Impuretés
Tous les constituants mineurs et les impuretés de la phase mobile
s'enrichiront sur la colonne lors de l'équilibrage de la colonne avec la
composition de départ. Au fur et à mesure que vous augmentez la force de la
phase mobile pendant le gradient, ces constituants mineurs et impuretés seront
désorbés de la colonne comme un échantillon. Cela peut entraîner des
chromatogrammes complexes avec de nombreux pics, si votre phase mobile
contient de nombreuses impuretés. Une source typique de problèmes est la
qualité de l'eau utilisée dans la chromatographie en phase inverse.
L'eau peut contenir des impuretés provenant de nombreuses sources. Ces
sources comprennent le système de purification de l'eau lui-même, les
récipients dans lesquels l'eau est stockée et la croissance bactérienne.
Les performances d'un système de purification d'eau doivent être surveillées
régulièrement à l'aide d'un gradient de phase inversée à blanc. Sinon, l'achat
d'eau de qualité HPLC est recommandé.
Même avec des solvants et des réactifs de haute qualité, il est possible
d'observer des pics dus aux réactifs eux-mêmes. Cela dépend du détecteur
que vous utilisez. Si vous utilisez un détecteur UV, cela dépend de la longueur
d'onde et de la sensibilité du détecteur aux changements de l'indice de
réfraction de la phase mobile. Avec des réactifs de haute qualité, le fond
dégradé peut apparaître comme une bosse plutôt qu'une collection de pics.
Échantillons contenant des protéines
Lorsque des échantillons contenant des protéines sont analysés par
chromatographie en phase inverse, il est également possible d'observer des
pics avec des gradients de blanc qui proviennent d'une injection précédente
de l'échantillon. La surface du pic diminue rapidement avec les gradients de
blanc suivants. Le phénomène rappelle le report d'échantillon dans l'injecteur,
sauf qu'aucun échantillon n'est injecté. L'injecteur peut même être mis hors
ligne. Ce qui se passe, c'est que l'élution de certaines protéines est incomplète
dans le premier gradient. Par exemple, dans un ensemble spécifique de
conditions, seuls 2/3 de la quantité injectée d'ovalbumine sont récupérés dans
le premier gradient. Dans chaque gradient ultérieur, approximativement la
même quantité d'ovalbumine restante est récupérée. Après quelques passages,
la quantité d'ovalbumine devient négligeable. Ce phénomène semble être
spécifique aux protéines. A ma connaissance, cela n'a jamais été observé avec
de petites molécules.
Sommaire
Être conscient de toutes ces causes de pics fantômes permettra
à prendre les précautions nécessaires pour éviter ces situations.
Machine Translated by Google

15. Dépendance des temps de rétention sur le pH tableau, les pKa d'un phosphate sont d'environ 2 et 7. 4,5 est juste au
milieu, et le phosphate n'a aucune capacité tampon à ce pH. Pour
Q. : J'ai une séparation qui semble être très sensible aux variations de tamponner le pH à 4,5, vous devez utiliser un autre tampon, par exemple
pH. C'est une méthode simple en phase inversée, et je n'utilise aucun de l'acide acétique.
réactif d'appariement d'ions. J'ai connu de nombreux changements dans De même, une solution d'acétate d'ammonium à pH 7 n'est pas un
le temps de rétention d'un jour à l'autre, que j'ai pu attribuer à de petites tampon, mais une solution saline. L'utilisation de "tampons" d'acétate
variations de pH. Quel est le problème? d'ammonium est devenue populaire, car l'acétate d'ammonium est volatil
et peut être utilisé avec des détecteurs de spectrométrie de masse.
R. : D'après votre description du problème, il semble que vous ayez Mais à pH 7 ce n'est pas un tampon, et autant le laisser en dehors de la
affaire à des analytes ionogènes avec un pKa proche du pH de la phase phase mobile, à moins d'avoir besoin d'un sel pour un autre
raison.
mobile. Par conséquent, vous avez affaire à deux formes de vos analytes
qui ont des temps de rétention très différents. Il peut s'agir par exemple
d'un acide sous sa forme protonée et non protonée. La forme chargée de Tableauÿ: valeurs de pKa des ions tampons couramment
l'analyte a un facteur de rétention beaucoup plus faible que la forme non utilisés (à 25ÿ° C)
chargée. Les deux sont en équilibre l'un avec l'autre qui dépend du pH. Amortir pKa
De petites variations du pH de la phase mobile modifient le rapport des Acétate 4,75
deux formes de l'analyte et donc le temps de rétention. Ammonium 9,24
Borate 1 9,24
Borate 2 12,74
En conséquence, il est nécessaire de contrôler étroitement le pH. Borate 3 13,80
Puisque vous avez déjà fait quelques expériences, vous avez peut-être Citrate 1 3,13
obtenu suffisamment d'informations pour connaître quantitativement la Citrate 2 4,76
dépendance du temps de rétention au pH. Sinon, faites quelques Citrate 3 6,40
expériences contrôlées pour obtenir ces connaissances. Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)
Vous pouvez également vérifier l'historique de la méthode. Ces 6,15
informations auraient dû être générées lors des tests de robustesse de la Oxalate 1 1,27 Oxalate 2 4,27
méthode. Une fois que vous êtes dépendant, vous devez décider quelles Phosphate 1 2,15 Phosphate 2 7,20
sont les fluctuations du temps de rétention avec lesquelles vous pouvez Phosphate 3 12,38 Acide
vivre. Ensuite, vous calculez quelle devrait être la précision de l'ajustement trichloroacétique 0,52 Triéthanolamine
7,76
du pH. Même dans les cas difficiles, une précision de +/- 0,02 unités de Triéthylamine 10,72 Acide
pH devrait suffire. trifluoroacétique 0,50
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)
Q.ÿ: Il est difficile d'ajuster le pH avec autant de précision. Si je n'ajoute 8,08
qu'un peu d'acide, le pH change radicalement.

R.ÿ: Malheureusement, cela indique que vous n'utilisez pas de tampon.

La définition d'un tampon est qu'il tamponne le pH à partir de petites
additions d'acide ou de base, c'est-à-dire que le pH devrait changer très
peu lors de l'addition d'acide ou de base. Cette capacité à maintenir le
pH s'appelle la capacité tampon. Cela dépend de la concentration du
tampon et du pKa des ions tampons. La capacité tampon maximale est
obtenue au pKa de l'ion tampon. Le tableau 1 vous donne les pKa de
certains tampons couramment utilisés en HPLC. A noter qu'ils sont
mesurés dans l'eau, sans ajout de solvant organique. Les pKa se
déplaceront lors de l'ajout d'un solvant organique. Mais généralement,
tous les pKa de tous les composés, y compris votre analyte, subiront le
même changement.
Pour les concentrations de tampon couramment utilisées en HPLC, le
pH de votre tampon doit rester dans les 1,5 unités de pH autour du pKa
de l'ion tampon. Pour les tampons très dilués, inférieurs à 5 mM, vous
souhaiterez peut-être réduire encore plus la plage à +/- 1 unité de pH
autour du pKa.
Malheureusement, je rencontre fréquemment des méthodes qui
ignorent complètement la capacité de la mémoire tampon. Un exemple
est une solution de dihydrogénophosphate de potassium à pH 4,5. Ceci
n'est pas un tampon, c'est une solution saline. Comme vous pouvez le voir sur
Q.ÿ: Que puis-je faire pour améliorer la méthodeÿ?
R. : Si vous utilisez le mauvais tampon pour le pH prévu, vous devez
simplement en sélectionner un plus approprié dans le tableau.
Souvent, la substitution n'affecte pas la séparation, sinon vous devrez
peut-être effectuer des ajustements supplémentaires.
Parfois, une substitution du tampon n'est pas possible en raison des
contraintes imposées par le détecteur. Nous avons déjà mentionné la
nécessité d'utiliser des tampons volatils avec des spectromètres de
masse. Les tampons à base d'acides carboxyliques sont moins adaptés
à la détection à faible UV en raison d'une forte absorption de fond, ce qui
entraîne un bruit excessif. Si vous ne trouvez pas de tampon compatible
avec la détection autre que celui que vous utilisez, vous êtes en difficulté.
Vous pouvez soit vivre avec la variabilité de la rétention telle quelle, soit
redévelopper la méthode au pKa ou à proximité du tampon que vous
utilisez.
Cela va clairement changer radicalement le chromatogramme et vous
devez réoptimiser la méthode à partir de zéro. Ce n'est peut-être pas une
bonne nouvelle, mais vous vous en sortirez mieux à long terme.

20
Machine Translated by Google

Je recommande généralement pour le développement de méthodes de
sélectionner d'abord le tampon et donc la plage de pH générale, puis
d'utiliser la sélectivité du solvant pour affiner la séparation. Cette stratégie
de développement de méthodes est rapide et très efficace. Cela vous évite
également de vous retrouver au mauvais endroit en ce qui concerne le pH
du tampon. Vous voudrez peut-être envisager cette approche dans votre
prochain développement de méthodes.
maintenant avec une phase mobile contenant 1% de méthanol. Le méthanol
doit se substituer à l'acétonitrile adsorbé sur la surface. Cet équilibrage n'est
pas favorable au méthanol, on peut donc prévoir un temps d'équilibrage
plus long. Mais nous pouvons accélérer le processus en lavant d'abord la
colonne avec une phase mobile contenant une forte concentration de
méthanol, puis en réduisant la concentration au niveau de 1 %.

Des volumes d'équilibrage encore plus grands peuvent être nécessaires,

si la concentration d'un ingrédient de la phase mobile est encore plus faible.
16. Équilibrage de la colonne Un tel exemple sont les réactifs d'appariement d'ions. Ils sont généralement
utilisés à des concentrations de 5 mmol/L (5 µmol/mL).
Q. : Combien de temps me faut-il pour équilibrer ma colonne ?
Heureusement, leur concentration en surface est aussi généralement assez
faible, entre 1 et 3 µmol/m2 . On peut passer par la même
R. : L' équilibrage des colonnes est assez simple, une fois les principes de calcul comme avant et constatez que nous avons besoin de 150 à 450 µmol
base compris. La durée d'équilibrage nécessaire dépend principalement de
de réactif d'appariement d'ions par ml de volume de colonne.
l'état de la colonne avant équilibrage, de la concentration des ingrédients
À la concentration donnée de réactif d'appariement d'ions dans la phase
de la phase mobile et du facteur de rétention de ces ingrédients.
mobile, nous avons besoin de 30 à 150 volumes de colonne pour fournir la
quantité nécessaire de réactif d'appariement d'ions à la colonne. Un
Il faut se rendre compte que la cinétique d'équilibrage est assez rapide, et
équilibrage complet nécessitera des volumes encore plus importants de
l'équilibre local dans la colonne est atteint pratiquement instantanément.
phase mobile.
Par conséquent, l'équilibrage est principalement limité par la vitesse à
Par conséquent, dans le premier cas discuté, le facteur limitant le temps
laquelle les constituants de la phase mobile sont transportés dans la colonne
d'équilibrage est la concentration de l'ingrédient concerné dans la phase
ou peuvent être retirés de la colonne. Examinons d'abord les cas
mobile et sa concentration superficielle finale. Si nous voulons accélérer
l'équilibrage, il pourrait être avantageux d'augmenter la concentration du
où la colonne doit être équilibrée avec de nouveaux constituants de la phase
constituant critique de la phase mobile.
mobile.
A l'équilibre, la concentration des constituants de la phase mobile qui
sont adsorbés sur la surface peut être comprise entre 1 et 20 µmol/m2 .
Q. : Permettez-moi de résumer ce que vous avez dit. Si nous devons
Un garnissage typique a une surface de 300 m2 /
équilibrer la colonne avec un nouveau constituant de la phase mobile, nous
g et une colonne HPLC typique contient environ 0,5 g de garnissage par ml
devons prendre en considération la quantité nécessaire pour équilibrer la
de volume de colonne. Par conséquent, la surface par volume de colonne
colonne et la quantité dissoute dans la phase mobile. Ensuite, nous pouvons
est d'environ 150 m2 /mL et la concentration des ingrédients adsorbés est
estimer combien de temps il faut pour fournir la quantité nécessaire de ce
de 150 à 3000 µmol/mL. constituant à la colonne. Mais qu'en est-il du cas inverse, lorsqu'il faut retirer
un ingrédient de la colonne ?
Les solvants ont généralement une concentration élevée en surface.
Prenons le méthanol avec un poids moléculaire de 32 comme exemple.
En utilisant une concentration en phase stationnaire de 3 mmol/mL, nous
R. : Exact. Dans le second cas, le facteur déterminant l'équilibration est le
avons besoin d'environ 100 mg de méthanol par mL de volume de colonne
facteur de rétention du composé adsorbé en surface dans la nouvelle phase
pour saturer complètement la surface. Si nous commençons avec une
mobile. Les solvants organiques généralement utilisés en chromatographie
surface qui ne contient aucun méthanol et si la concentration de méthanol
en phase inverse ont un faible facteur de rétention dans toutes les phases
dans la phase mobile est de 10 % ou plus, un mL de phase mobile est
mobiles typiques. Ce n'est pas le cas pour les solvants polaires en
suffisant pour fournir la quantité nécessaire de méthanol à la colonne. Pour
chromatographie en phase normale. Par exemple, le facteur de rétention du
un équilibrage complet, ajoutez un facteur de 2 à 3 environ, et votre colonne
méthanol sur de la silice avec de l'hexane comme phase mobile est très
est équilibrée. Cela signifie que pour les ingrédients de la phase mobile qui
important. Pour éliminer le méthanol de la surface d'un sorbant en phase
sont présents à une concentration élevée, l'équilibrage est rapide.
normale, il est préférable de laver d'abord la colonne avec un solvant de
force d'élution intermédiaire. Il peut être préférable de choisir le solvant
C'est l'une des raisons pour lesquelles la chromatographie en gradient
utilisé pour modifier la force d'élution de l'hexane. Si l'acétate d'éthyle est le
fonctionne aussi bien. D'autre part, si la concentration d'additifs de phase
constituant polaire de notre phase mobile à base d'hexane, nous devons
mobile est faible, il en résulte de longs temps d'équilibrage. Par exemple, si
d'abord laver la colonne avec de l'acétate d'éthyle pour éliminer le méthanol.
la colonne n'a jamais vu de méthanol et que la concentration de la phase
Ce n'est qu'alors qu'il faut l'équilibrer avec la phase mobile finale hexane-
mobile n'est que de 1 % de méthanol, nous avons besoin d'au moins 10
acétate d'éthyle.
volumes de colonne pour fournir la quantité correcte de méthanol à la
colonne. Dans un tel cas, d'autres équilibres de phase mobile peuvent en
fait compliquer les choses. Supposons que la colonne ait été équilibrée à
Si nous comprenons ce que nous devons faire pour équilibrer rapidement
l'origine avec de l'acétonitrile et que nous voulions l'équilibrer
la colonne, nous pouvons concevoir des protocoles d'équilibrage efficaces.

21
Machine Translated by Google
Il est donc important que nous connaissions l'histoire de la colonne.
Un autre exemple de constituants de phase mobile fortement adsorbés sont
les réactifs d'appariement d'ions. Il est généralement recommandé de dédier les
colonnes utilisées avec des réactifs d'appariement d'ions aux applications
d'appariement d'ions car ces réactifs sont difficiles à retirer de la surface. Ces
réactifs sont fortement retenus sur les garnissages en phase inverse pour deux
raisons : l'une est l'interaction hydrophobe, l'autre est l'interaction polaire. Si nous
devions gérer uniquement l'interaction hydrophobe, nous pourrions laver notre
emballage avec un solvant organique puissant tel que le THF. Mais les réactifs
d'appariement d'ions interagissent également fortement avec les silanols de
surface. Les réactifs cationiques d'appariement d'ions, tels que les sels de
tétrabutylammonium, sont particulièrement difficiles à éliminer. Par conséquent,
toute procédure de lavage doit tenir compte de cette interaction complexe. Sans
procédures de lavage spéciales, une élimination complète des réactifs
d'appariement d'ions est pratiquement impossible.
L'un des problèmes d'équilibrage les plus difficiles est l'équilibrage avec de
l'eau en chromatographie en phase normale.
L'eau n'est généralement présente qu'en très petites quantités et elle est fortement
retenue sur les garnissages en phase normale, en particulier la silice et l'alumine.
Du fait de la forte rétention d'eau, l'équilibrage avec une phase mobile sèche
d'hydrocarbure peut prendre plusieurs jours. Pour éliminer l'eau de la silice, il est
préférable d'utiliser un protocole avec des solvants séquentiellement plus faibles.
Une séquence possible est le méthanol, l'acétate d'éthyle, le chlorure de
méthylène, l'hexane. C'est un moyen plus rapide d'obtenir une colonne "sèche"
que d'essayer de laver une colonne "humide" avec de l'hexane.
Q.ÿ: Par conséquent, si la phase mobile ne contient pas de composants fortement
retenus à de faibles concentrations, je devrais observer un équilibrage rapide.
Quel est le problème, si les temps de rétention dérivent néanmoins lentement ?
R. : Dans un tel cas, je soupçonnerais que la cause de votre dérive du temps de
rétention n'est pas liée à l'équilibrage en soi. Il est possible que la cause de la
dérive du temps de rétention soit autre chose qu'un phénomène de colonne. La
composition de la phase mobile change-t-elle lentement en raison de
l'évaporationÿ? La température dans le laboratoire change-t-elle lentementÿ?
Peut-être qu'un composant de votre échantillon s'accumule sur la colonne.
Peut-être s'agit-il simplement du vieillissement de la colonne, par exemple par
hydrolyse de la phase stationnaire. Ces deux derniers phénomènes sont
généralement classés dans la catégorie du conditionnement de la colonne plutôt
que de l'équilibrage. Nous discuterons du conditionnement de la colonne dans
une colonne de dépannage HPLC distincte.
17. Conditionnement de la colonne
Q.ÿ: Qu'est-ce que le conditionnement des colonnesÿ?
R. : Dans la dernière colonne de dépannage, nous avons parlé de l'équilibrage
des colonnes. L'équilibrage de la colonne comprend tous
22
phénomènes réversibles, tandis que le conditionnement de la colonne modifie la
colonne de manière irréversible. En conditionnant la colonne, vous modifiez le
produit que le fabricant vous a livré, et la reproductibilité de cette étape est de
votre responsabilité. Je déconseille généralement le conditionnement, mais il
existe certaines circonstances où le conditionnement de la colonne est inévitable.
Q.ÿ: Veuillez donner quelques exemples de conditionnement de colonneÿ!
A. : Mon premier exemple est une procédure couramment utilisée.
Cependant, je tiens à souligner que je ne recommande pas d'utiliser cette
procédure. Si vous utilisez une phase mobile fortement acide, pH 2 ou moins,
avec une colonne C18 entièrement endcapping, vous hydrolyserez assez
rapidement les groupes endcapping.
Par conséquent, la colonne aura une activité silanol beaucoup plus importante
que celle qui a été livrée par le fabricant.
Ceci peut influencer la sélectivité d'une séparation. Il est possible que quelqu'un
ait développé une méthode utilisant une phase mobile fortement acide, et au
moment où le développement des méthodes était terminé, la colonne avait déjà
changé.
Lorsqu'une nouvelle colonne est utilisée ultérieurement pour le même test, la
sélectivité de la séparation peut être différente. Mais la séparation revient, lorsque
la colonne est "conditionnée" pendant un jour ou deux avec la phase mobile
acide. Comme vous pouvez le voir, il s'agit d'un changement permanent de la
colonne en dehors des spécifications du fabricant. Je déconseille une telle
procédure, mais elle est pratiquée dans certains laboratoires, et des protocoles
détaillés de conditionnement des colonnes ont été mis en place pour les nouvelles
colonnes. Au lieu de modifier les propriétés d'une colonne avec un tel processus
de conditionnement, je recommande d'explorer la possibilité de redévelopper la
méthode sur un garnissage non endcapped. Cela évite une telle étape de
conditionnement dans le futur.
Un autre exemple de conditionnement de colonne se produit lorsque des
phases à liaison aminopropyle sont utilisées dans des solvants aqueux.
L'application la plus courante est l'utilisation de cette colonne pour la séparation
des glucides par chromatographie d'interaction hydrophile.
Phases typiques portable
mélanges eau/acétonitrile sommes
avec 60 à 90% d'acétonitrile.
Lorsqu'une colonne aminopropyle est exposée pour la première fois à un éluant
aqueux, la forte concentration des groupes amino dans les pores du garnissage
crée un pH basique, ce qui entraîne une hydrolyse lente de la silice et de la phase
greffée. La quantité de phase greffée qui est lavée diminue de façon exponentielle
avec le temps, et bientôt des temps de rétention presque stables sont atteints.
Cependant, la colonne a considérablement changé par rapport à ses propriétés
d'origine et ne doit plus être utilisée pour des séparations de phases normales
sans spécifier l'exposition aux éluants aqueux dans le cadre de l'historique de la
colonne.
Si vous souhaitez utiliser des phases liées à l'aminopropyle pour la séparation
des glucides, il n'y a tout simplement pas moyen de contourner ce problème de
conditionnement. Certains fabricants proposent des colonnes dédiées à cette
application. Dans ce cas, le fabricant a effectué l'étape de conditionnement pour
vous.
Étant donné que cela est effectué avec un protocole fixe selon des spécifications
fixes, il est préférable d'acheter un
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colonne préconditionnée au lieu de faire le conditionnement vous-même.
Un autre phénomène de conditionnement désagréable, mais apparemment
inévitable, se produit avec les colonnes utilisées dans la séparation des
protéines, très spécifiquement avec les phases greffées diol utilisées pour la
chromatographie aqueuse d'exclusion stérique des protéines. Il a été observé
que pour certaines protéines, les injections initiales donnent des pics plus
petits que les injections ultérieures. Cela a été attribué à la liaison non
spécifique de la protéine aux sites d'adsorption sur le garnissage. Pour éviter
cela, il a été proposé d'injecter au préalable une grande quantité d'une
protéine, par exemple de la sérumalbumine bovine, pour conditionner la
colonne et saturer les sites actifs. En général, je ne recommande pas cette
procédure de conditionnement et vous suggère d'observer par vous-même
si votre échantillon présente ou non un tel phénomène. Lorsque vous
observez une augmentation de la hauteur du pic lors d'injections ultérieures,
vous devez vous assurer qu'elle n'est pas causée par un transfert dans
l'injecteur.
Le dernier exemple dont je veux discuter ne correspond pas à ma
définition du conditionnement, mais est considéré comme une étape de
conditionnement par de nombreuses personnes. L'exemple implique des
colonnes sèches en phase inverse. Il est possible qu'une colonne se soit
asséchée pendant le stockage, car les raccords n'ont pas été bien serrés.
De plus, les cartouches à compression radiale sont expédiées sèches. Dans
ces cas, la colonne doit d'abord être humidifiée avec un solvant organique,
tel que le méthanol ou l'acétonitrile. Cela chasse l'air des pores et mouille la
surface. Vous pouvez désormais remplacer le méthanol ou l'acétonitrile par
votre phase mobile et obtenir des temps de rétention reproductibles. Dans
le cas d'une colonne qui s'est asséchée accidentellement, un problème peut
survenir si la colonne a été stockée dans une phase mobile contenant du
tampon ou du sel. Le tampon précipité peut donner lieu à une contre-pression
élevée pendant l'étape de reconditionnement, et vous devrez peut-être
rééquilibrer la colonne à de faibles débits.
Un phénomène connexe est "l'effondrement hydrophobe". Les garnitures
en phase inverse très hydrophobes et bien coiffées peuvent perdre leur
rétention dans les phases mobiles très aqueuses. Il a été observé que cela
peut se produire soudainement, par exemple lorsque l'écoulement à travers
une colonne est arrêté. Dans d'autres cas, une diminution progressive de la
rétention a été observée au cours de quelques jours. Dans les deux cas, la
rétention peut être restaurée en lavant la colonne avec un solvant organique
pendant quelques volumes de colonne et en la rééquilibrant avec la phase
mobile.
18. Matrices d'échantillons complexes
Q. : J'étudie le métabolisme d'un médicament nouvellement développé.
Le milieu d'échantillonnage est le plasma sanguin. Malgré le fait que j'utilise
une technique de préparation d'échantillons, j'obtiens toujours une quantité
importante d'interférences éluées dans le chromatogramme. En plus de ce
problème, la récupération des médicaments à partir de mes échantillons
dopés varie plus que je ne le souhaiterais. Que puis-je faire?
23
A. : Vous faites face à l'un des problèmes de séparation les plus difficiles.
Le sang contient un nombre incalculable de composés qui peuvent interférer
avec la détection de vos analytes. De plus, le nombre d'interférences
augmente à mesure que la concentration de l'analyte diminue. Par
conséquent, la technique de préparation des échantillons est une partie
essentielle de la méthode chromatographique et doit être optimisée avec la
méthode chromatographique elle-même. La méthode de détection du ou des
composés d'intérêt est, bien sûr, une partie importante de la méthode. Des
méthodes de détection plus sélectives telles que la dérivatisation et la
spectrométrie de masse simplifient considérablement le problème de
séparation, mais ces techniques ne sont pas disponibles pour tout le monde.
Discutons donc de certaines des options dont vous disposez pour la
préparation des échantillons. Les échantillons de plasma contiennent une
quantité importante de sel et de protéines qui peuvent précipiter ou
s'adsorber sur les garnitures en phase inversée. La protéine adsorbée peut
facilement encrasser la colonne, entraînant des changements dans la
séparation et obstruant finalement la colonne. Bien que les garnissages
aient été conçus pour l'injection directe d'échantillons de plasma, la plupart
des analyses sont réalisées à l'aide de garnissages classiques en phase
inverse. Si l'on souhaite une durée de vie raisonnable de la colonne, la
préparation de l'échantillon est inévitable.
Il existe plusieurs techniques de préparation d'échantillons disponibles
pour le prétraitement des échantillons de plasma. La plus simple est une
précipitation de protéines. Cette technique implique l'ajout d'un solvant
organique, par exemple l'acétonitrile, à l'échantillon de plasma. Au moins
deux millilitres d'acétonitrile doivent être ajoutés pour chaque millilitre de
plasma. Une quantité importante des protéines présentes dans le sérum
sont précipitées en présence du solvant organique. Cependant, une grande
partie des protéines reste soluble et peut provoquer des interférences avec
les analytes. De plus, tous les composés de faible poids moléculaire, par
exemple les lipides, restent dans l'échantillon.
Une autre option de préparation d'échantillon est l'extraction liquide-
liquide. Une séparation utilisant cette technique nécessite deux solvants non
miscibles. Les solvants polaires miscibles à l'eau ne peuvent pas être utilisés
pour l'extraction. De ce fait, l'extraction liquide-liquide fonctionne mieux pour
les analytes plus non polairesÿ; il ne convient pas aux analytes très polaires.
Étant donné que de nombreux échantillons ont également des métabolites
très polaires, cette méthode a des limites.
Une troisième option - et celle qui est la plus fréquemment utilisée - est
l'extraction en phase solide. C'est une technique très pratique et, en raison
de sa similitude avec la chromatographie, l'extraction en phase solide est
une technique très populaire auprès des chromatographistes. On peut utiliser
plusieurs techniques d'extraction pour nettoyer l'échantillon ; la
chromatographie en phase inverse et l'échange d'ions sont les techniques
les plus couramment employées. En raison de sa polyvalence et de sa
simplicité, l'extraction en phase solide est la méthode de préparation
d'échantillon qui a la plus large gamme d'applicabilité. C'est donc la méthode
de préparation des échantillons que je recommande couramment.
Q. : J'utilise l'extraction en phase solide pour la préparation des échantillons.
La cartouche SPE est une cartouche à phase inversée. J'observe des
récupérations d'analyte faibles et variables.
Machine Translated by Google

A. : Examinons plus en détail la procédure SPE. La procédure générale d'une suggère fortement qu'une interaction analyte-silanol est une cause possible
méthode d'extraction en phase solide en phase inverse est la suivanteÿ: de vos problèmes de récupération. Dans un tel cas, une alternative aux
absorbants à base de silice pourrait être la meilleure solution.
Étape 1 : chargez l'échantillon
Étape 2 : supprimez les interférences
polaires Étape 3 : éluez les analytes en laissant les interférences les plus
non polaires Avant de charger l'échantillon sur la cartouche SPE, nous
devons d'abord activer la cartouche. Cela se fait généralement en lavant 19. Effondrement hydrophobe
initialement la cartouche à phase inversée avec un solvant organique,
Q. : J'ai deux colonnes C18 en phase inverse du même type du même
généralement du méthanol. Le méthanol est alors remplacé par un solvant
fabricant qui montrent une différence significative (40 %) de rétention. Quel
polaire, généralement de l'eau ou un tampon. Le tampon doit être au même
est le problème?
pH que l'échantillon de plasma. Cette procédure de lavage préconditionne la
cartouche à l'échantillon. L'échantillon est ensuite chargé sur la cartouche
A. : C'est évidemment un problème sérieux. La reproductibilité du temps de
préconditionnée. Il est important que la cartouche ne sèche pas entre l'étape
rétention d'une colonne à l'autre devrait être nettement meilleure, de l'ordre de
de conditionnement et l'étape de chargement de l'échantillon. Le séchage en
+/- 5 %. Pour des garnitures de qualité supérieure, la reproductibilité du temps
cartouche peut être l'une des causes des récupérations faibles et variables
de rétention est de l'ordre de +/- 2 %, mais atteindre ce niveau de reproductibilité
sur les sorbants de type C18.
nécessite également un bon contrôle de la température. Sachant cela, la
reproductibilité colonne à colonne observée dans votre cas est évidemment
inacceptable. Laissez-nous enquêter, ce que le problème pourrait être.
Une fois l'échantillon chargé sur la cartouche, l'élimination des interférences
les plus polaires est nécessaire. Le tableau 1 donne les constituants d'un
Tout d'abord, permettez-moi de vous demander si l'une des colonnes a été
échantillon de sérum ou de plasma. Les interférences polaires typiques sont
largement utilisée. Il n'est pas rare de trouver des différences de temps de
les sels, les glucides et une quantité importante de protéines. Les sels et la
rétention entre les anciennes colonnes et les nouvelles colonnes. Cela peut
plupart des hydrates de carbone n'adhèrent pas à un sorbant en phase
être particulièrement remarqué si l'ancienne colonne a été utilisée à proximité
inversée et sont éliminés sans difficulté. Le solvant d'élution pour la plupart de
des limites de la stabilité du pH de la phase greffée. De plus, il n'est pas rare
ces interférences très polaires est l'eau ou une solution tampon au pH de votre
d'observer un changement de temps de rétention si les constituants de
choix. Certaines protéines sont également éluées en utilisant ces conditions.
l'échantillon se sont accumulés sur la colonne. L'accumulation des constituants
de l'échantillon peut provoquer un changement drastique de la rétention. Dans
de tels cas, il est nécessaire d'examiner un protocole de lavage approprié pour
Pour éliminer toutes les interférences plus polaires que vos analytes, il est
éliminer les constituants de l'échantillon de la colonne. Alors, laquelle des
préférable de laver la cartouche avec un solvant plus polaire que votre phase
deux colonnes a été largement utiliséeÿ?
mobile. En général, la plupart des interférences protéiques sont éliminées à
l'aide d'un lavage d'environ 5 % de solvant organique. Vous pouvez également
modifier la rétention de vos analytes par rapport aux interférences en modifiant
Q. : Ni l'un ni l'autre ! Les deux colonnes sont neuves, fraîchement sorties de
le pH de la solution de lavage. Vous devez examiner attentivement cette étape
la boîte. Je me serais attendu à obtenir une bien meilleure reproductibilité à
pour vous assurer que vous ne perdez pas une partie de vos analytes au cours
partir de colonnes flambant neuves.
de cette étape.

R. : En effet, la reproductibilité colonne à colonne devrait être bien meilleure.

L'élution des analytes nécessite un éluant plus puissant que votre phase
Même la reproductibilité d'un lot à l'autre de l'emballage devrait être meilleure
mobile. De nombreuses personnes utilisent un solvant organique pur, le plus
que ce que vous observez. La reproductibilité d'un lot à l'autre doit être
souvent du méthanol, pour l'élution. Le méthanol est facile à évaporer, ce qui
meilleure que +/- 10 %, voire meilleure que +/- 5 % si vous achetez la colonne
donne un échantillon qui peut être facilement reconstitué en phase mobile.
auprès d'un fabricant réputé. Avez-vous cherché à savoir si les deux colonnes
Cependant, une étape d'élution mettant en oeuvre du méthanol n'est ni
ont été préparées à partir du même lot de garnissageÿ?
spécifique ni sélective. Dans votre cas, un problème potentiel peut résulter de
fortes interactions de vos analytes avec les silanols de surface, qui ne sont
pas cassés par le méthanol. Si tel est bien le cas et la cause de votre
Q. : Oui, j'en ai. Le fabricant a déclaré que les deux colonnes avaient été
récupération variable, vous devez envisager un sorbant ne contenant pas de
préparées à partir du même lot de garnissage.
silanols. Les sorbants en phase inversée qui ne sont pas à base de silice sont
disponibles dans le commerce.
R. : Cela rend les différences de temps de rétention encore moins

Alternativement, des procédures d'extraction plus spécifiques peuvent être compréhensibles. Il semble que la seule différence entre les deux colonnes

conçues. Une manipulation du pH en conjonction avec une augmentation de est le processus de remplissage. Les procédés de garnissage de colonne sont

la teneur en modificateur organique est quelque chose à considérer. Vous suffisamment reproductibles pour que les densités de garnissage ne varient

devez comparer la récupération de vos analytes à pH neutre et à pH acide. pas de plus de +/- 2 %. Par conséquent, les temps de rétention ne doivent pas

Bien sûr, une telle approche ne fonctionnera que pour les composés avec des varier de plus de +/- 2 %. Même si des incertitudes sur la constitution de la

groupes fonctionnels ionisables. Cependant, la description de votre problème phase mobile s'ajoutaient au

analytique

24
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l'incertitude du processus d'emballage, cela n'expliquerait toujours pas les
écarts importants de temps de rétention que vous observez.
En règle générale, des erreurs dans la composition de la phase mobile
pourraient être une explication de votre observation. Si le contenu organique
de la phase mobile varie de 1 %, vous pouvez observer des différences de
temps de rétention de 10 %. D'autre part, des différences de concentration
d'un tampon de phase mobile allant jusqu'à 20 % entraînent des différences de
temps de rétention de seulement 1 % dans de nombreux cas.
Une autre possibilité serait une erreur dans le pH de la phase mobile. Si le pKa
de vos analytes est proche du pH du tampon de phase mobile, un changement
de pH de 0,1 unité peut entraîner des différences de temps de rétention de 10
%. Par conséquent, un contrôle minutieux du pH de la phase mobile est
nécessaire.
Les autres influences externes sont moins prononcées. Les changements
de température peuvent affecter la rétention d'environ 10 % par tranche de 5 °C.
Par conséquent, les changements de température ne sont probablement pas
la cause de votre problème. S'il s'agit d'une séparation de paires d'ions, il n'est
pas rare d'utiliser sans le savoir des colonnes qui n'ont pas été complètement
équilibrées avec la phase mobile.
Il faut souvent plusieurs 100 ml de phase mobile pour équilibrer la colonne
avec un réactif d'appariement d'ions, en particulier si la concentration en phase
mobile du réactif d'appariement d'ions est faible.
Q. : Je n'utilise pas de réactif d'appariement d'ions. Aussi, permettez-moi
d'ajouter que les deux colonnes ont été testées avec la phase mobile identique,
colonne. Ceci est dû au fait que l'eau et les phases mobiles à très haute teneur
en eau ne mouillent pas très bien la surface C18 hydrophobe. Lorsque l'on
utilise une phase mobile à forte teneur en eau, seule une partie de la surface
C18 est donc disponible pour la rétention. Par conséquent, les facteurs de
rétention sont nettement inférieurs à ceux observés sur une colonne bien
mouillée. Vous pouvez éliminer le problème en reconditionnant la colonne
avec du méthanol à 100 %, puis en la rééquilibrant avec une phase mobile.
Cette étape de « remouillage » garantit que toute la surface du garnissage est
disponible pour l'interaction avec les analytes. Après avoir fait cela pour les
deux colonnes, les temps de rétention devraient être très reproductibles, peut-
être aussi proches que 1ÿ%. Sur la base de la description du problème et du
fait que nous avons éliminé toutes les autres possibilités, je suis très certain
que c'est la cause de votre problème de temps de rétention.
20. Bruit de base
Q.ÿ: J'ai mis en place une méthode il y a quelque temps, et elle a bien
fonctionné pendant longtemps. Récemment, le bruit de base a considérablement
augmenté, environ 5 fois par rapport à ce qu'il était auparavant.
La méthode est une méthode en phase inversée et j'utilise un détecteur UV.
Quel pourrait être le problème?

et les résultats sont reproductibles. Cela exclut les influences que vous venez
R.ÿ: Les toutes premières choses qui vous viennent à l'esprit dans votre cas
de décrire, n'est-ce pas ?
sont soit une fenêtre de cellule sale, soit une phase mobile sale. Parlons
d'abord de la phase mobile sale. Bien que cela puisse être plus difficile à
R. : Cela rend encore plus difficile l'explication de vos résultats.
résoudre, cela ne nécessite aucun démontage de la cellule du détecteur pour
Comment les colonnes étaient-elles traitées avant de les testerÿ?
nettoyer la fenêtre.

Q. : Les deux ont été traités exactement de la même manière. Je les ai sortis
Si vous utilisez une méthode en phase inverse, vous utiliserez probablement
de la boîte et je les ai équilibrés avec la phase mobile.
une phase mobile aqueuse avec du méthanol, de l'acétonitrile ou du
tétrahydrofurane (THF) comme modificateur organique. Pour chacun des
A.ÿ: Hmm... Cela devient difficile maintenant. Pour résumer, nous avons deux
solvants organiques, vous devez vous assurer qu'ils sont de qualité HPLC. Si
nouvelles colonnes, préparées à partir du même lot de matériau de garnissage,
d'autres grades sont utilisés, ils contiennent souvent de petites quantités de
donnant des résultats
seule conclusion
chromatographiques
dans
rationnelle
l'équilibrage
significativement
estces
qu'ilchangements
deexiste
la colonne
certaines
différents.
de
provoquant
rétention.
temps
différences
La de
produits chimiques divers qui peuvent influencer le fond UV du solvant. Surtout
Quelle est la concentration de solvant organique dans la phase mobile ?
lors de l'utilisation de THF, vous devez vous assurer que vous utilisez une
qualité HPLC. D'autres qualités de THF contiennent des antioxydants qui
peuvent être détectés par des détecteurs UV et affectent donc le fond UV.
Puisque nous parlons de THF : l'utilisation d'anciens THF peut également
entraîner un fond UV élevé en raison de la formation de peroxydes.
Q. : La phase mobile est presque 100 % aqueuse. Il se compose de 98 % de
tampon et de 2 % de méthanol. J'ai retiré les colonnes de la boîte et les ai
équilibrées avec la phase mobile pendant une heure avant de commencer à
injecter mes échantillons.
Les autres solvants ne se détériorent généralement pas avec le temps, mais
le méthanol est moins adapté que l'acétonitrile pour la détection aux faibles
A. : Maintenant, nous nous rapprochons. La faible concentration de solvant
longueurs d'onde UV. Cependant, il s'agit d'une propriété intrinsèque du solvant
organique dans la phase mobile soulève la possibilité que les différences de
et non de quelque chose qui changerait avec le temps et se manifesterait
temps de rétention que vous avez observées soient dues à des différences de
après une longue utilisation. Mais il existe d'autres ingrédients des phases
mouillage des colonnes. Les colonnes C18 très hydrophobes et bien coiffées
mobiles en phase inversée qui peuvent créer des problèmes de fond. Dans de
peuvent présenter des différences significatives de rétention en fonction de
nombreuses méthodes en phase inverse, des tampons sont utilisés pour
leur historique antérieur. Si l'une des deux colonnes a séché ou partiellement
contrôler le pH de la phase mobile. La plupart des sels tampons inorganiques
séché par inadvertance pendant l'expédition, elle peut présenter des temps de
comme le phosphate sont d'une pureté suffisante pour qu'une augmentation
rétention nettement inférieurs à ceux d'un C18 entièrement mouillé.
du fond UV ne soit pas très probable. Mais c'est généralement

25
Machine Translated by Google
recommandé d'utiliser des réactifs de haute qualité, par exemple pa.
Si vous utilisez de la triéthylamine ou des amines apparentées comme
ingrédient tampon, il est possible que le fond UV de votre tampon varie
avec la pureté de l'amine. La qualité des amines se détériore également
avec l'âge, en grande partie à cause de l'oxydation.
Dans certaines circonstances, l'eau peut également être à l'origine du
problème que vous avez décrit. Habituellement, l'eau est soumise à un
système de purification tel que l'échange d'ions ou l'osmose inverse. Des
problèmes d'impuretés peuvent survenir lorsque les cartouches du système
de purification sont saturées et doivent être remplacées. Cela peut
augmenter le bruit de fond de la méthode chromatographique. Un bon
schéma de contrôle de la qualité de l'eau générée par le dispositif de
purification doit avertir l'utilisateur lorsque la durée de vie utile des
cartouches de purification est atteinte. Ceci est mieux accompli en
exécutant un gradient en phase inverse de l'eau vers un solvant organique
à 100 % à l'aide d'une colonne en phase inverse dédiée.
La trace UV obtenue à partir de ce gradient est ensuite comparée à une
bonne trace UV standard.
Si vous utilisez un système à gradient à double pompe, vous pouvez
utiliser une ancienne colonne entre la pompe pour le composant le plus
aqueux de votre phase mobile et le point où le gradient est mélangé. Les
impuretés de votre phase mobile plus aqueuse sont adsorbées sur la
précolonne et vous obtenez une ligne de base plus propre. Bien entendu,
il est nécessaire de nettoyer régulièrement la précolonne. Malheureusement,
cette solution élégante au problème de l'élimination des impuretés de la
phase mobile n'est disponible que pour les utilisateurs de systèmes HPLC
à gradients à double pompe.
Généralement, vous verrez beaucoup plus d'impuretés de solvant
lorsque votre méthode de détection utilise la plage UV faible entre 200 et
215 nm que lorsque vous utilisez la longueur d'onde standard de 254 nm.
Cela peut faire une différence significative dans le fond UV.
Q. : Dans ce test, j'utilise également 254 nm comme longueur d'onde
standard. J'ai déjà examiné certains des problèmes évoqués ci-dessus,
mais je n'ai pas encore été en mesure de résoudre le problème. Qu'en est-
il des problèmes d'instrument comme une fenêtre de cellule saleÿ?
A. : C'est exactement le point que je veux aborder ensuite. Si nous ne
trouvons pas de problème avec la phase mobile, la cause de l'augmentation
du bruit est très probablement liée au détecteur. La cause la plus fréquente
d'augmentation du bruit de base est la saleté dans la cellule du détecteur
ou une fenêtre de détecteur sale. Bien sûr, une bulle d'air dans la cellule
du détecteur ressemblera exactement à de la saleté, mais elle peut être
facilement éliminée en pressurisant brièvement la cellule du détecteur ou
en rinçant la cellule à un débit plus élevé. Souvent, un court morceau (4"
de long) de tube 9/1000 peut être utilisé dans la conduite d'évacuation
pour empêcher la formation de bulles d'air dans la cellule du détecteur.
Cependant, si de la saleté s'est accumulée dans le détecteur ou sur la
fenêtre de la cellule, cette simple astuce ne changera en rien le phénomène.
26
La seule façon de nettoyer la cellule du détecteur et la fenêtre du
détecteur est de démonter la cellule du détecteur et de nettoyer la fenêtre
manuellement. Le démontage de la cellule du détecteur vous donnera
également accès au corps de la cellule du détecteur, et tout matériau qui
s'est accumulé dans cette zone pourra être retiré sans difficulté. Pour
nettoyer la fenêtre de la cellule, il faut faire attention à utiliser des
techniques douces. Souvent, la fenêtre peut être traitée dans un bain à
ultrasons avec un solvant qui enlèvera tout film à sa surface. Vous pouvez
essayer une solution savonneuse ou du tétrahydrofurane (grade HPLC). Il
s'agit d'un traitement plutôt doux et doit toujours être essayé en premier.
Si un lavage aussi simple n'enlève pas le film, on peut essayer de nettoyer
la fenêtre en la frottant avec un morceau de papier ou de chiffon humide
approprié. Vous pouvez obtenir des outils appropriés en vous rendant
dans un magasin d'appareils photo et en demandant du tissu et du liquide
de nettoyage pour objectif. Cela devrait résoudre le problème.
Étant donné que cette procédure est impliquée, il est préférable d'éviter
une contamination de la fenêtre du détecteur. Malheureusement, il peut y
avoir de nombreuses causes différentes pour les fenêtres sales des
cellules de détection et, dans de nombreux cas, la cause de la
contamination de la fenêtre n'est pas du tout claire. Mais généralement, il
faut éviter les précipitations en utilisant les mêmes précautions que pour
une colonne.
Si la cellule du détecteur est propre et que le problème persiste, il est
fort probable que la lampe du détecteur ait vieilli.
Vous devriez consulter le manuel du détecteur pour déterminer si vous
pouvez remplacer la lampe par vous-même ou si vous avez besoin d'un
service technique. Dans la plupart des cas, le remplacement d'une lampe
de détection UV est quelque chose qui peut être effectué sans difficulté
par l'opérateur HPLC.
Si le problème persiste après le nettoyage de la cellule et le
remplacement de la lampe du détecteur, l'augmentation du bruit peut être
due à des problèmes avec d'autres parties de l'équipement HPLC telles
que l'intégrateur ou le système de données. Dans un tel cas, il est
préférable de faire vérifier le système par un personnel de service qualifié.
21. Colonnes à alésage étroit
Q.ÿ: Je comprends que la consommation de solvant dépend du diamètre
de la colonne. Je souhaite réduire la consommation de solvant au
laboratoire et souhaite donc utiliser des colonnes de 2 mm.
Malheureusement, les premières colonnes de 2 mm que j'ai achetées ne
sont pas aussi performantes que les colonnes standard. Quel est le
problème?
A. : Malheureusement, votre expérience n'est pas unique. Je reçois des
commentaires similaires de la part de nombreuses personnes qui essaient
pour la première fois des colonnes à petit volume. Cependant, nous ne
devons pas supposer que le problème est nécessairement le résultat d'une
mauvaise performance de la colonne. Plus fréquemment, les performances
de colonne inférieures aux attentes sont dues à des problèmes d'instrument,
Machine Translated by Google

2 2
plus spécifiquement l'étalement de bande d'instrument d'un instrument HPLC N wR 16 V R
ÿ

un
= = (3)
standard. 22 22
N C + wow
c o 16 V Rw N
ÿ

+ oC ÿ

Avant d'expliquer cela en détail, je voudrais souligner un moyen rapide par

Si ce rapport se rapproche de 1, les performances apparentes de la colonne
lequel vous pouvez déterminer si l'étalement de bande du système joue un rôle
sont similaires aux performances réelles de la colonne. Ceci est réalisé lorsque
dans vos tests standard. Je vous garantis que vous serez surpris de l'ampleur
l'étalement de bande extra-colonne wo devient négligeable.
des effets de l'instrument.

Supposons que vous utilisez une méthode isocratique et que votre test
Q.ÿ: Pouvez-vous me montrer avec quelques exemples concrets de calculs
contient plusieurs analytes qui éluent à différents facteurs de rétention. Vérifiez
comment l'étalement de bande extra-colonne détériore les performances de la
le nombre de plaques que votre instrument mesure pour les différents analytes.
colonneÿ?
Dans de nombreux cas, vous observerez que le nombre de plaques augmente
avec une rétention accrue. Notez maintenant qu'il n'y a pas de règle dans la
R. : Oui. Regardons la figure 1. Dans cette figure, j'ai tracé la relation entre le
théorie HPLC qui prédit un nombre de plaques plus élevé à une rétention
taux de comptage sur plaque (équation 3) et le volume de rétention. J'ai
accrue. supposé pour ce calcul que le nombre de plaques de colonne est de 10 000 et
Par conséquent, l'augmentation observée des performances de la colonne pour
que l'étalement de bande de colonne supplémentaire (mesuré en tant que
les pics avec des valeurs de rétention plus élevées est le plus souvent due à
largeur de pic par la méthode tangente) est de 80 µL. On peut voir que le
une diminution de l'influence de l'étalement des bandes extra-colonne.
nombre réel de plaques de la colonne n'est jamais atteint, même à un volume
Étant donné que cet effet est généralement présent dans une certaine mesure
d'élution de 10 ml. Un volume d'élution de 10 mL se traduit par environ un k' de
avec des colonnes de diamètres standard (4,6 mm, 4,0 mm et 3,9 mm), il 4 pour une colonne de 4,6 mm x 150 mm. Le graphique montre également qu'à
jouera un rôle plus important avec des colonnes de plus petit diamètre.
un volume d'élution d'environ 2 ml, qui est à peu près le point d'élution d'un pic
Dans ce qui suit, je vais discuter de cet effet plus en détail et vous donner les
non retenu sur cette colonne, le nombre réel de plaques n'est que la moitié du
équations qui vous permettent de calculer la détérioration des performances
nombre maximal de plaques réalisable.
de la colonne due à l'influence de l'instrument.

En chromatographie isocratique, le carré de la largeur du pic est la somme

observé par le détecteur w2 t du carré du et du carré du pic
largeur de pic à l'intérieur de la colonne w2c
largeur de tous les effets en dehors de la colonne w2 oÿ: Influence de l'étalement de bande extra-colonne

2 2 2
poids = wc + wo
(1) 1
0,9
La contribution de la largeur de pic de la colonne seule augmente avec la Performance
0,8
rétention. La contribution de la largeur de pic à l'extérieur de la colonne reste
0,7
constante. Cette contribution du système est également appelée étalement de
0,6
bande extra-colonne ou effet extra-colonne.
0,5
colonne
Fraction
réalisée
de
la
n

La mesure de l'étalement de bande extra-colonne est très simpleÿ:

déconnectez la colonne et injectez l'échantillon directement dans le détecteur, 0,4
en utilisant la même phase mobile et le même débit que vous utilisez pour 0,3
l'analyse HPLC. Vous devrez peut-être diluer l'échantillon si la hauteur du pic
0,2
dépasse la plage dynamique du détecteur.
0,1
Pour aller plus loin, il faut préciser la contribution de l'effet extra-colonne. 0
Nous supposerons que les contributions à la largeur des pics sont toutes 0123 4 5 6 7 8 9 10
mesurées de la même manière, spécifiquement par la méthode tangente ou 4-
sigma. Pour cette méthode, la contribution de la colonne à la largeur totale du Volume d'élution [mL]
pic estÿ:

2
2
VR (2) Figure 1 : Influence de l'étalement de bande extra-colonne sur les performances
c =16 ÿ
semaines

NC
Dans cette équation, NC est le nombre de plaques de colonne et VR est le
volume de rétention du pic d'intérêt. Ce qui nous intéresse, c'est le nombre
apparent de plaques Na fourni par la combinaison de l'instrument et de la
colonne. Cela peut être dérivé des deux équations précédentes:
de la colonne
Considérons maintenant une réduction du diamètre de la colonne à 2 mm.
Le volume mort de la colonne d'une telle colonne n'est que d'environ 0,33 mL.
Il s'agit du volume d'élution auquel notre premier pic élue. À un volume d'élution
aussi faible, les effets de colonne supplémentaires dominent la largeur du pic,
et moins de 1/30e du nombre réel de plaques de colonne peut être réalisé. La

27
Machine Translated by Google
le volume d'élution d'environ 2 mL discuté ci-dessus correspond maintenant
à un k' d'environ 5. Comme nous l'avons vu plus haut, on n'obtient environ
que la moitié des plateaux dont la colonne est capable à ce k'. Ce n'est
qu'avec un facteur de rétention d'environ 10 ou plus, équivalent à des
volumes d'élution supérieurs à 5 ml, que nous obtenons à nouveau de
bonnes performances de colonne.
Pour la plupart des applications chromatographiques, un facteur de
rétention de 5 ou moins est normal et, dans ces circonstances, les
performances de la colonne sont considérablement réduites par les effets
extra-colonne. En résumé, c'est la raison fondamentale des faibles
performances des colonnes de 2 mm de diamètre interne sur les
instruments HPLC normaux. Par conséquent, ce n'est généralement pas
la colonne qui pose problème, mais l'étalement de bande de l'instrument
HPLC standard.
Q.ÿ: Cela correspond assez bien à mon expérience. Que puis-je faire
pour améliorer la situation ?
A.ÿ: Nous devons réduire la propagation de la bande extra-colonne à un
niveau significatif. Pour atteindre à peu près le même niveau de
performance que vous avez connu avec la colonne de grand diamètre,
vous devez réduire l'étalement de bande extra-colonne du même facteur
que le changement de volume de la colonne. Dans le cas où vous passez
d'une colonne de 4,6 mm à une colonne de 2 mm, vous devez réduire les
effets d'étalement de bande extra-colonne d'un facteur 5 environ. Cela
signifie que si vous aviez de bonnes performances sur un instrument
standard avec un étalement de bande d'environ 80 µL, vous devez vous
efforcer d'obtenir un système d'étalement de bande d'environ 16 µL pour
une utilisation avec une colonne de 2 mm.
Pour ce faire, vous devez généralement réduire la longueur du tube de
l'injecteur à la colonne et de la colonne au détecteur. De plus, il faut
généralement réduire le diamètre du tube de connexion du tube standard
de 9/1000" à un tube de 5/1000". Naturellement, vous devez réduire le
volume d'injection proportionnellement au volume de la colonne. Si votre
volume d'injection pour la colonne standard était d'environ 25 µL, il ne
devrait être que d'environ 5 µL pour la colonne de 2 mm. Le problème
suivant est la réduction de l'étalement de bande dans la cellule du
détecteur. Vous devez utiliser une cellule de détection conçue pour la
colonne de plus petit diamètre. Cette cellule doit avoir un volume nettement
inférieur à celui de votre cellule de détection standard.
Généralement, des cellules de 3 µL sont facilement disponibles. Bien sûr,
cela ne vous amène pas tout à fait au facteur 5 de réduction de volume,
mais c'est un début. L'autre chose que vous devez réaliser est qu'une
réduction du volume de la cellule du détecteur augmente généralement le
bruit du détecteur. Par conséquent, si vous avez besoin d'une sensibilité
élevée et que vous avez suffisamment d'échantillon à injecter, l'étape vers
une colonne de plus petit diamètre est en fait déconseillée. Bien sûr, vos
intentions étaient de réduire la consommation de solvant, et cet objectif
peut en effet être atteint avec des colonnes de plus petit diamètre.
22. Échantillon de solvant
Q.ÿ: Malgré la préparation de l'échantillon, la concentration de l'analyte
de mon échantillon est très faible et je dois atteindre
28
sensibilité. Lorsque j'injecte 100 µL de l'échantillon, je vois déjà une
détérioration inacceptable de la séparation. Que puis-je faire pour
améliorer la sensibilité du test ?
R. : Il existe plusieurs techniques différentes que vous pouvez utiliser pour
augmenter la sensibilité d'un test. Une des premières choses à considérer
est le choix du détecteur ou de la longueur d'onde de détection, si un
détecteur UV est utilisé. Si plusieurs principes de détection sont possibles,
et si les différents détecteurs sont disponibles dans votre laboratoire, cela
peut être une première approche.
Par exemple, les détecteurs à fluorescence sont plusieurs ordres de
grandeur plus sensibles que les détecteurs UV, si la fluorescence est une
option. De plus, la détection dans la plage UV faible peut être nettement
plus sensible que la détection à une longueur d'onde plus élevée. Bien
sûr, on obtient également plus de signal des interférences dans la plage
des UV faibles, ce qui peut être contre-productif. La détection
électrochimique peut être très spécifique et très sensible, mais les
détecteurs électrochimiques ne sont pas facilement disponibles dans de
nombreux laboratoires. Les techniques de dérivatisation post-colonne et
pré-colonne peuvent améliorer de manière significative les limites de
détection d'un analyte, mais la complexité des procédures et/ou de
l'instrumentation rend cette approche moins souhaitable.
Q. : J'ai déjà exploré la possibilité d'autres méthodes de détection.
L'analyte n'est pas fluorescent et la meilleure longueur d'onde UV a déjà
été choisie. D'autres détecteurs ne sont pas disponibles dans mon
laboratoire.
R. : L'approche suivante consisterait à préconcentrer l'échantillon en
utilisant soit une extraction liquide-liquide, soit une technique d'extraction
en phase solide. L'extraction en phase solide est généralement plus
simple et plus prévisible que l'extraction liquide-liquide, surtout si vous
utilisez le même type de sorbant que celui que vous utilisez pour le test
HPLC. Par conséquent, si votre test HPLC utilise une méthode en phase
inversée, il est pratique d'utiliser une technique d'extraction en phase
solide en phase inversée pour enrichir votre analyte.
Q. : C'est exactement ce que je fais. L'échantillon est concentré sur un
sorbant en phase inverse. Ensuite, les interférences sont éliminées
pendant l'étape de lavage, et enfin l'analyte est élué du dispositif de
préparation d'échantillon. Il est ensuite injecté dans l'instrument HPLC.
R.ÿ: Puis-je vous demander quel solvant vous utilisez pour éluer
l'échantillon de l'appareil SPE et quelle est la composition de la phase
mobile HPLCÿ?
Q. : J'utilise 1 mL de méthanol pour éluer l'analyte du dispositif SPE. La
phase mobile HPLC est 50 : 50 acétonitrile : tampon phosphate, pH 7,2.
A.ÿ: Cela éclaire un peu votre problème. Vous avez dit plus tôt que vous
subissiez une détérioration de la séparation lorsque vous injectez 100 µL
d'échantillon. Puisque l'échantillon est dissous dans du méthanol, il ne
s'agit pas d'un cas de surcharge de la colonne, mais d'un cas de
Machine Translated by Google
solvant d'échantillon inapproprié. Le méthanol est un éluant plus puissant
que la phase mobile. Par conséquent, l'analyte se déplacera plus
rapidement dans la colonne tant qu'il y aura une forte concentration de
méthanol autour de la bande de l'analyte. À de faibles volumes d'injection,
l'échantillon est dilué avec la phase mobile dans l'injecteur, la tubulure de
connexion, la fritte de la colonne et le haut de la colonne. L'analyte
s'enrichit alors rapidement en tête de colonne et est séparé du méthanol
en excès du fait que l'analyte descend la colonne beaucoup plus
lentement que le méthanol. À de grands volumes d'injection, la dilution
initiale de l'échantillon avec la phase mobile devient inefficace et la bande
d'échantillon se déplace avec le méthanol à une vitesse plus élevée dans
la colonne. Cela conduit à une distorsion des formes des pics, qui à son
tour vous oblige à injecter seulement 100 µL ou moins.
Q. : C'est effectivement le cas. Que puis-je faire pour résoudre ce
problème ?
A. : Il y a deux possibilités. La première suggestion est d'évaporer
l'échantillon à sec puis de le redissoudre dans la phase mobile ou une
composition de solvant dont le pouvoir d'élution est plus faible que celui
de la phase mobile, par exemple 30% acétonitrile : 70% tampon. Il est
préférable de le faire en présence d'un étalon interne pour surveiller la
concentration de l'analyte, mais vous utilisez probablement de toute façon
un étalon interne pour l'étape de préparation de l'échantillon. Il s'agit de
l'approche classique utilisée pour éliminer les solvants puissants qui
interfèrent avec le test HPLC.
Une autre option consiste à diluer l'échantillon avec de l'eau (ou un
tampon), puis à en injecter davantage (1). Par exemple, si l'échantillon
est dilué 1:1 ou 2:1 avec de l'eau, vous pouvez probablement injecter la
totalité de l'échantillon (2 ou 3 ml) sans distorsion de pic. En supposant
que vous souhaitiez conserver une partie de l'échantillon pour une
nouvelle analyse, vous devez diluer l'échantillon 2:1 avec de l'eau, puis
injecter 1,5 ml de l'échantillon. Dans ces circonstances, l'échantillon
s'enrichit en haut de la colonne et est ensuite élué sous la forme d'une
bande nette avec une hauteur de pic environ 5 fois plus élevée par
rapport à la situation actuelle, sans aucune distorsion des pics. Si votre
système d'injection vous le permet, c'est clairement l'approche la plus
pratique.
Référence :
1. Uwe D. Neue et Ed Serowik, "La dilution d'échantillon augmente la
sensibilité et la résolution", Waters Column VI, 2 (1996), pp. 8-11
23. Mise à l'échelle des dégradés
Q. : J'ai développé une séparation sur une colonne de 150 mm x 4,6 mm.
Il y a une paire qui n'est pas bien résolue, et j'espérais obtenir de meilleurs
résultats avec une colonne plus longue de 250 mm.
Malheureusement, cela ne s'est pas avéré vraiÿ: la résolution de la paire
de pics critiques est pire, et d'autres pics se sont également déplacés
dans le chromatogramme. Le fabricant dit que les deux
29
les colonnes proviennent du même lot de garnissage. Quel est le
problème?
R. : Si le garnissage dans la colonne de 15 cm et dans la colonne de 25
cm est effectivement identique, vous devriez obtenir la même séparation
mais avec une meilleure résolution en utilisant la colonne la plus longue.
Votre observation que la position des pics se déplace indique que le
tassement n'est pas le même dans les deux colonnes. Étant donné que
le fabricant insiste sur le fait que le garnissage des deux colonnes provient
du même lot et que vous utilisez déjà la colonne de 15 cm depuis un
certain temps, on pourrait soupçonner que la colonne de 15 cm a vieilli
pendant le développement de votre méthode et n'est pas représentative
du garnissage matériel plus. Cette situation n'est pas rare et est souvent
la cause d'une frustration importante de la part du chromatographe. Pour
cette raison, je recommande toujours de vérifier et de valider une nouvelle
méthode après le développement des méthodes en utilisant une nouvelle
colonne.
Q. : J'ai en effet une autre colonne de 15 cm du même garnissage autour.
Lorsque j'ai exécuté le même dégradé sur cette colonne, j'ai obtenu des
résultats pratiquement identiques à ceux de l'autre colonne de 15 cm.
Cela devrait prouver que l'emballage n'a pas vieilli, n'est-ce pas ?
A. : C'est effectivement une bonne possibilité. Mais vous avez dit que
vous utilisiez une méthode de gradient. Cela complique un peu la
discussion. Comment avez-vous mis à l'échelle le dégradé de la colonne
la plus courte à la colonne la plus longueÿ?
Q. : Je n'ai pas redimensionné le dégradé. J'ai exécuté le même dégradé
sur la colonne courte et sur la colonne plus longue. J'ai utilisé le même
débit et le même temps de gradient.
R. : C'est très probablement la cause du problème. Lorsque vous utilisez
une méthode de gradient sur différentes colonnes, le volume du gradient
doit être mis à l'échelle proportionnellement au volume de la colonne pour
vous donner des résultats avec des schémas d'élution identiques. Bien
sûr, cela augmente le temps d'analyse pour la colonne plus longue, tout
comme dans la chromatographie isocratique. Quelques complications
supplémentaires peuvent survenir en raison du volume de retard du système.
Dans ce qui suit, je discuterai un peu plus en détail de la mise à l'échelle
des méthodes de gradient.
Pour obtenir le même profil de gradient entre différentes colonnes, le
volume du gradient doit être modifié en proportion directe avec le volume
de la colonne. Vous avez commencé avec une colonne de 15 cm et
vouliez obtenir les mêmes résultats sur une colonne de 25 cm. Les deux
colonnes avaient le même diamètre interne.
Par conséquent, votre volume de gradient doit être de 25/15 = 5/3 plus
grand pour la colonne la plus longue. Si vous conservez le même débit
sur les deux colonnes, la durée du gradient et les autres durées
d'événements de gradient devraient augmenter de 5/3.
La règle de modifier le volume du gradient proportionnellement au
volume de la colonne est également valable lorsque vous modifiez le
diamètre de la colonne. Si vous souhaitez mettre à l'échelle un gradient
d'une colonne de 150 mm x 4,6 mm à une colonne de 150 mm x 3 mm,
vous devez réduire le volume du gradient d'un facteur de 2,35.
Généralement, ce sera automatique, puisque vous réduisez le débit dans
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proportion directe au volume de la colonne de toute façon. Dans ces
circonstances, vous pouvez garder le profil de gradient constant et obtenir
les mêmes résultats.
Tous les calculs jusqu'à présent supposaient que le volume de retard de
gradient de l'instrument que vous utilisez est négligeable et/ou n'a aucune
influence sur la séparation. Ceci est en général vrai pour les composés
bien retenus qui éluent tardivement dans le gradient. Cependant, ce n'est
pas nécessairement le cas pour les composés à élution précoce. Dans les
systèmes à gradient à pompe unique couramment utilisés, le gradient est
généré du côté basse pression de la pompe, et sur les systèmes plus
anciens, il y a un délai important jusqu'à ce que le gradient atteigne le
sommet de la colonne. Le schéma d'élution des composés à élution
précoce peut être affecté par ce volume de retard de gradient. Le rapport
du volume de retard du gradient au volume de la colonne doit être maintenu
constant lorsque nous modifions les dimensions de la colonne.
Malheureusement, cela peut être un problème important, lorsque l'on veut
mettre à l'échelle un gradient d'une colonne de plus grand volume à une
colonne de plus petit volume. Heureusement, vous souhaitez mettre à
l'échelle le gradient d'une colonne de volume plus petite à une colonne de
volume plus grande, ce qui simplifie la situation.
Afin d'ajuster le volume du retard de gradient, vous devez d'abord le
mesurer pour le système que vous utilisez. Ceci est mieux fait en exécutant
un gradient d'étape à 1 ml/min du méthanol au méthanol avec une petite
quantité d'un absorbeur d'UV, par exemple 1 % d'acétone dans du
méthanol, sans colonne en place.
On mesure le temps depuis le début du programme jusqu'au moment où
le pas a atteint la moitié de la hauteur de la concentration finale. En
multipliant ce temps avec le débit, on obtient le volume de retard de
l'instrument. Puisque le début du gradient programmé en tête de colonne
sera retardé de ce volume sur la petite colonne, nous devons retarder le
gradient sur la plus grande colonne du même rapport volume de retard sur
volume de colonne pour obtenir exactement le même profil de gradient sur
les deux colonnes. Par exemple, si le volume de retard du système était de
1 ml lorsque la colonne de 150 mm x 4,6 mm a été utilisée, il doit être de
1,66 ml pour la colonne de 250 mm x 4,6 mm. Par conséquent, nous
devons ajouter un délai isocratique de 0,66 ml au début du programme de
gradient pour la colonne de 250 mm afin de tenir pleinement compte des
différences de profil de gradient entre le gradient réel obtenu sur la colonne
de 150 mm et la colonne de 250 mm. Après cela, des profils d'élution
identiques sont obtenus sur les deux colonnes.
24. Stockage de colonne
Q. : J'ai demandé à mes collègues comment je devais stocker mes
colonnes HPLC. Malheureusement, tout le monde m'a donné une réponse
différente. Que devrais-je faire?
R. : Dans la plupart des cas, il existe de nombreuses manières différentes
de stocker une colonne HPLC qui ont peu d'effet sur la longévité de la
colonne. Par conséquent, il est tout à fait possible que bon nombre des
réponses que vous avez obtenues soient correctes. Cependant, la meilleure
façon de stocker les colonnes dépend du type de phase stationnaire.
De plus, certaines conditions de stockage de la colonne sont plus pratiques
30
que d'autres. Permettez-moi d'abord de discuter de cela en termes
généraux, puis je discuterai des considérations spécifiques et spéciales qui
dépendent de la nature de l'emballage.
Le moyen le plus pratique de stocker une colonne est dans la phase
mobile dans laquelle elle est couramment utilisée. Le plus grand avantage
de cette approche est que le rééquilibrage de la colonne avec la phase
mobile est très rapide. Par conséquent, on peut obtenir des résultats
reproductibles dans un court laps de temps après le démarrage.
Cette approche est particulièrement recommandée pour la chromatographie
en phase normale, où le passage à un solvant de stockage différent de la
phase mobile peut entraîner de longs temps de rééquilibrage. Cependant,
il faut bien réfléchir à cette approche. Les colonnes à phase greffée
changent souvent lentement dans les phases mobiles couramment utilisées.
Par conséquent, la commodité du stockage de la colonne dans la phase
mobile doit être mise en balance avec la réduction de la durée de vie de la
colonne.
Dans ce qui suit, je discuterai des conditions de stockage pour divers
emballages HPLC en fonction de la nature de l'emballage.
Parlons d'abord de la silice et de l'alumine. Ces deux garnitures sont très
stables dans les phases mobiles dans lesquelles elles sont couramment
utilisées. Ces phases mobiles comprennent couramment des solvants
organiques avec de petites quantités de modificateurs polaires, y compris
de l'eau. En raison de la faible concentration des modificateurs polaires, il
faut souvent un temps considérable pour équilibrer les colonnes avec la
phase mobile. Par conséquent, il est préférable et plus pratique de stocker
les colonnes en phase mobile.
La situation est similaire pour les phases greffées polaires utilisées en
chromatographie en phase normale. L'équilibrage avec la phase mobile est
un peu plus rapide qu'avec la silice ou l'alumine ; néanmoins, il est encore
plus rapide de stocker les colonnes en phase mobile. Certains ingrédients
de la phase mobile ne conviennent pas à certaines colonnes. Par
conséquent, ils ne doivent pas non plus être pris en compte pour le
nettoyage ou le stockage des colonnes. Un exemple est l'incompatibilité
des colonnes amino avec l'acétone.
Les garnissages à base de polydivinylbenzène tels que les garnissages
SEC et les échangeurs d'ions sont chimiquement très stables, mais ils
gonflent et rétrécissent dans différents solvants. Les fabricants vous
fournissent généralement des informations sur les solvants compatibles
avec une colonne particulière. Des déclarations générales ne peuvent pas
être faites, car la stabilité des colonnes dépend des conditions de
garnissage. Cependant, le meilleur solvant de stockage pour ces colonnes
est le solvant dans lequel les colonnes sont utilisées.
Pour les colonnes en phase greffée à base de silice utilisées en
chromatographie en phase inverse, la situation est plus compliquée.
L'eau attaque la phase greffée, mais le processus est très lent dans la
gamme de pH couramment utilisée de pH 2 à pH 8. De plus, cela dépend
de la nature de la phase greffée. Les colonnes C18 et C8 couramment
utilisées sont suffisamment stables pour être utilisées pendant plusieurs
mois avec peu de changement dans leur hydrophobicité. Cependant, les
phases liées basées sur des chaînes plus courtes peuvent s'hydrolyser de
manière mesurable en quelques semaines.
Par conséquent, les meilleures conditions de stockage des colonnes à
phase inversée dépendent de la fréquence de leur utilisation. S'ils sont
utilisés tous les jours, voire tous les quelques jours, il est plus pratique
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pour les stocker dans la phase mobile couramment utilisée. D'autre part, s'ils ne
seront pas utilisés pendant une période prolongée, il est préférable de les stocker
dans un solvant qui empêche l'hydrolyse, généralement de l'acétonitrile ou du
méthanol.
Cependant, certaines colonnes en phase inverse ne sont pas stables dans ces
solvants. Certaines colonnes cyano peuvent se vider lorsqu'elles sont stockées
dans des solvants organiques. Pour ces colonnes, il est préférable d'utiliser la
phase mobile pour le stockage, malgré le danger d'une hydrolyse plus rapide. Lisez
les recommandations du fabricant!
Les colonnes amino sont souvent utilisées dans les phases mobiles acétonitrile/
eau pour l'analyse des glucides. Malheureusement, le groupe amino crée un pH
basique dans les pores du garnissage, ce qui conduit à une perte lente du groupe
fonctionnel. Par conséquent, les colonnes amino utilisées pour cette application
sont mieux stockées dans l'acétonitrile au lieu de la phase mobile, au moins pour
un stockage à long terme.
Des considérations supplémentaires doivent être prises pour le stockage à
long terme des colonnes dans des phases mobiles hautement aqueuses qui
permettent la croissance d'algues ou de bactéries. Souvent, l'ajout d'azide de
sodium au tampon de stockage est recommandé. Si possible, les solvants
organiques sont de meilleurs solvants pour le stockage à long terme.
En guise de remarque finale, il convient de souligner qu'il est toujours judicieux
d'enregistrer le solvant de stockage dans un fichier permanent.
Cela peut être fait facilement en enregistrant le type de colonne et le numéro de
série. Lorsque vous créez un tel fichier, il est également intéressant d'enregistrer la
date et l'heure de la dernière utilisation de la colonne, ainsi que le nombre
d'analyses effectuées depuis le dernier stockage. Un tel fichier d'historique de
colonne vous donne un enregistrement permanent qui vous permet de revenir en
arrière et de vérifier l'utilisation et la durée de vie de la colonne. Une méthode
alternative et moins efficace consiste à marquer la colonne avec le solvant de
stockage de votre choix. Bien sûr, cette approche fonctionne mieux si vous utilisez
toujours le même solvant de stockage pour cette colonne particulière.
25. Chromatographie à ions appariés
Q. : J'utilise une méthode chromatographique sur une colonne C18 qui emploie un
réactif d'appariement d'ions, l'acide octylsulfonique. La phase mobile est constituée
de 20 % de méthanol et de 80 % de la solution tampon aqueuse. Le tampon aqueux
est constitué de 5 mM du réactif d'appariement d'ions et de 50 mM de tampon
acétate ; le pH de la solution aqueuse est ajusté à pH 4,0 avec de l'acide acétique.
Ce qui me dérange, c'est le long temps d'équilibrage nécessaire pour obtenir des
temps de rétention cohérents. Qu'est-ce qui ne va pas?
A.ÿ: Très probablement, tout va bien. De longs temps d'équilibrage sont typiques
lorsque des réactifs d'appariement d'ions sont utilisés. Permettez-moi de discuter
de cela en détail. Une fois que nous aurons compris quels sont les problèmes,
nous devrions également être en mesure de trouver un protocole plus rapide.
Les réactifs d'appariement d'ions sont utilisés avec des colonnes en phase
inversée pour ajouter des propriétés d'échange d'ions à la phase stationnaire.
L'interaction purement hydrophobe est très peu influencée lorsque le réactif
d'appariement d'ions est ajouté à la phase mobile. Par conséquent,
31
le réactif d'appariement d'ions ouvre une nouvelle dimension à la séparation.
Les colonnes utilisées dans la chromatographie à paires d'ions sont
principalement des colonnes C18, tout comme dans votre cas, mais les colonnes
C8 fonctionnent souvent aussi. Le réactif d'appariement d'ions est adsorbé sur la
surface du matériau de garnissage en phase inverse. La concentration du réactif
d'appariement d'ions à la surface du garnissage dépend de sa concentration dans
la phase mobile.
Les temps de rétention des composés qui interagissent avec le réactif
d'appariement d'ions dépendent de sa concentration en surface. Si la concentration
de la phase mobile est faible, la rétention des analytes avec une charge opposée à
la charge du réactif d'appariement augmente en proportion directe avec la
concentration du réactif d'appariement ionique. Si la concentration est élevée,
autour de 10 mmol/L, la rétention de tels analytes devient souvent indépendante
de la concentration du réactif d'appariement d'ions.
La rétention des composés non ioniques n'est pratiquement pas affectée par la
concentration du réactif d'appariement d'ions. Par conséquent, on peut utiliser la
concentration du réactif d'appariement d'ions pour influencer la rétention des
composés ioniques par rapport aux composés n'interagissant pas. Cela permet
d'agir sur la sélectivité d'une séparation.
Ces observations ne sont vraies que pour les colonnes parfaitement équilibrées
avec le réactif d'appariement d'ions. Puisque le réactif d'appariement d'ions est
adsorbé sur la surface du garnissage, cela peut prendre un certain temps jusqu'à
ce que la colonne soit équilibrée avec le réactif. La concentration en surface du
réactif d'appariement d'ions dépend de sa concentration en phase mobile ainsi que
de la teneur organique dans la phase mobile. Mais on peut faire une estimation de
la quantité de réactif qui est adsorbée sur la colonne en supposant que la
concentration en surface est d'environ 1 µmol/m2 .
Une colonne peut contenir environ 2 g de matériau de garnissage,
avec une surface spécifique de 300 m2 /g. Cela signifie qu'il contient environ 0,6
mmol de réactif d'appariement d'ions à l'équilibre complet. Si la concentration de la
phase mobile du réactif d'appariement d'ions est de 5 mmol/L, vous avez besoin
d'environ 120 ml de phase mobile pour envoyer suffisamment de réactif
d'appariement d'ions à la colonne pour obtenir une concentration de surface de 1
µmol/m2 .
En réalité, un équilibrage complet
peut en fait prendre un peu plus de temps, peut-être 150 ml de phase mobile. Si
vous équilibrez la colonne à 1,5 ml/min, cela signifie que vous devez attendre 100
minutes - près de deux heures - avant que la colonne soit équilibrée et prête pour
les analyses.
Q. : Cela semble être le problème que je rencontre.
Quelle est la solution?
A.ÿ: Ce que vous êtes probablement en train de faire est de convertir la colonne
en un solvant organique pour le stockage. Bien qu'il s'agisse d'une bonne approche
pour les séparations normales en phase inverse, cela pose un problème lorsque
vous utilisez des réactifs d'appariement d'ions. La meilleure solution au problème
est de stocker la colonne en phase mobile, au moins pour le stockage pendant la
nuit et pour le stockage pendant les week-ends. Si vous procédez ainsi, la colonne
doit être complètement équilibrée avec la phase mobile après seulement une courte
purge de 10 volumes de colonne ou moins. Bien sûr, puisque vous utilisez un
mobile tamponné
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phase, les raccords et les embouts de la colonne doivent être bien serrés pour
éviter que la colonne ne se dessèche pendant le stockage.
Habituellement, je recommande de stocker une colonne dans un solvant
organique, si la colonne n'est pas utilisée pendant une période de temps
supérieure à un week-end. Cependant, dans le cas des réactifs d'appariement
d'ions, je recommande généralement de stocker la colonne en phase mobile en
raison des longs temps d'équilibrage. Ce n'est que si vous avez l'intention de
ne pas utiliser la colonne pendant une période prolongée, peut-être environ un
mois, que vous devriez envisager de stocker la colonne dans un solvant
organique.
Q.ÿ: Cela s'applique-t-il également aux réactifs tels que la triéthylamine, qui
sont souvent utilisés pour supprimer les résidus de composés basiquesÿ?
R. : Non. Ces réactifs sont principalement des constituants des tampons de
phase mobile. Ils sont adsorbés sur le garnissage, mais en raison de la
concentration élevée à laquelle ils sont généralement utilisés, il y a peu de
soucis concernant un équilibrage prolongé. Les tampons sont couramment
utilisés à des concentrations d'environ 50 mmol/L, et la concentration des
réactifs tampons à la surface du garnissage est bien inférieure aux concentrations
courantes des réactifs d'appariement d'ions. Par conséquent, l'équilibrage de la
colonne avec le réactif tampon est beaucoup plus rapide que l'équilibrage avec
les réactifs d'appariement d'ions. Étant donné que le problème des longs temps
d'équilibrage n'existe pas avec ces réactifs tampons simples, les colonnes
doivent être stockées dans un solvant organique si elles ne seront pas utilisées
pendant plusieurs jours ou plus.
26. Stabilité hydrolytique des garnitures en
phase inversée
Q.ÿ: Certains fabricants affirment que leurs colonnes en phase inverse à base
de silice peuvent être utilisées jusqu'à pH 9 ou 10, tandis que d'autres
recommandent de ne pas utiliser un pH supérieur à 8. J'ai récemment été
contraint d'utiliser une colonne en phase inverse à pH 9, puisque c'était la seule
condition qui séparait tous les composés d'intérêt sans interférences. Bien que
cela soit en dehors de la plage d'utilisation recommandée par le fabricant, la
durée de vie de la colonne était tout à fait acceptable. Je me demande
maintenant à quel point il faut prendre au sérieux la recommandation des
fabricants concernant la plage de pH sur laquelle leurs colonnes doivent être
utilisées.
A. : C'est effectivement une bonne question. Il est probablement préférable d'y
répondre par vos expériences : si vous êtes satisfait de la durée de vie que
vous êtes en mesure d'atteindre, il n'y a rien de mal à utiliser un pH plus élevé
que celui recommandé par le fabricant. Cependant, je ferais en sorte que la
même séparation puisse être obtenue sur une colonne toute neuve que sur une
colonne qui a été utilisée pendant un certain temps dans vos conditions.
Si c'est effectivement le cas, alors il n'y a pas de raison de s'attendre à des
problèmes.
La stabilité du pH des garnissages est une question plus complexe que celle
qui peut être énoncée dans une règle simple. Permettez-moi d'expliquer cela
un peu plus en détail pour fournir une meilleure compréhension.
32
A pH alcalin, les ions hydroxyle (OH-) peuvent attaquer et dissoudre la silice.
La vitesse du processus dépend de la concentration des ions hydroxyles dans
la phase mobile, de leur accès à la surface de la silice et de la solubilité de la
silice dissoute dans la phase mobile. Comme vous pouvez le voir, la
concentration des ions hydroxyle, qui est déterminée par le pH de la phase
mobile, n'est qu'une partie de l'histoire. De plus, la vitesse de tous ces processus
est fonction de la température. Ce qui fonctionne bien à température ambiante
peut représenter une durée de vie de colonne trop courte à 60 ºC.
L'accès des ions hydroxyles à la silice joue un rôle crucial dans la stabilité
d'un garnissage. Une couverture dense de la surface de la silice avec un ligand
C18 ou C8 améliore sensiblement la stabilité. De plus, la protection de la
surface par un bon processus de coiffage est importante. La densité totale de
ligands hydrophobes est probablement une mesure raisonnable de la protection
de la surface de silice contre l'attaque des ions hydroxyles hydrophiles. Par
conséquent, on peut s'attendre à ce que les garnitures modernes avec une
couverture de surface élevée soient plus stables que les garnitures avec une
faible couverture de surface. De plus, la qualité du processus de endcapping
peut jouer un rôle important.
A pH alcalin, la silice elle-même se dissout. La nature du ligand ne joue donc
qu'un rôle secondaire. La stabilité d'une phase greffée à base d'un silane
monofonctionnel n'est pas différente de la stabilité d'une phase greffée à base
d'un silane trifonctionnel, à niveau d'enrobage égal. Cependant, l'accès des
ions hydroxyles à la surface de la silice joue un rôle crucial. Par conséquent, la
stabilité d'une phase liée monofonctionnelle avec une chaîne latérale
isopropylique volumineuse est inférieure à une phase liée standard, simplement
parce que la couverture de surface maximale réalisable est plus faible.
Si la colonne fonctionne en continu dans les mêmes conditions de phase
mobile et n'est jamais lavée avec un solvant organique, la désorption et la
dissolution du ligand lié peuvent être très lentes. Par conséquent, les
changements de temps de rétention peuvent être très faibles. Néanmoins, la
silice sous-jacente se dissout lentement. En conséquence, un effondrement
soudain de la colonne peut se produire, avec peu d'indications avant cet
événement quant à la lente détérioration de la colonne.
Bien sûr, la densité de silice est un facteur crucial dans un tel cas. Les silices
à fort volume poreux spécifique sont moins stables que les silices à faible
volume poreux spécifique, simplement du fait qu'elles ont un squelette plus
faible. La porosité d'une silice peut aller de 40% à 70%, mais le changement de
résistance peut facilement être multiplié par 10. Par conséquent, on peut
s'attendre à des différences substantielles dans les propriétés d'une phase
greffée simplement en fonction de la densité de la silice mère. De plus, la
surface spécifique diminue à mesure que la taille des pores du garnissage
augmente. Par conséquent, les garnissages avec une plus grande taille de
pores sont plus stables que les garnissages avec une petite taille de pores, tous
les autres paramètres étant constants (1).
La nature des ingrédients du tampon est également cruciale pour la stabilité
du garnissage. A pH égal, les tampons organiques comme un tampon Tris,
citrate ou HEPES sont beaucoup moins agressifs que les tampons phosphate
couramment utilisés (2). Aussi, borate et
Machine Translated by Google

les tampons glycine se sont avérés moins agressifs même à pH 10. la courbe n'est pas un bon endroit où se trouver, car l'augmentation du
temps d'analyse s'accompagne d'une diminution de la résolution. Lorsque
Il convient de souligner que dans la littérature disponible, la stabilité vous utilisez une colonne 5 microns 4,6 mm à 1 ml/min avec une phase
d'un garnissage est couramment testée dans des conditions opératoires mobile à faible viscosité, vous pouvez être assez proche de ce point de
isocratiques. Si vous êtes obligé de passer occasionnellement à un solvant résolution décroissante avec l'augmentation du temps d'analyse, mais
organique pour nettoyer la colonne des contaminants, vous pouvez l'emplacement exact de ce point dépend de vos analytes et de la
également laver le ligand non lié mais adsorbé. Par conséquent, les cycles composition de la phase mobile. Pour les phases mobiles communes à
de nettoyage peuvent avoir un impact considérable sur la stabilité d'une phase inversée et les colonnes communes à phase inversée, vous pouvez
colonne. être loin du point de performance maximale. Permettez-moi d'examiner
Toutes ces observations sont valables pour les ligands C18 et C8 cela plus en détail.
couramment utilisés. Les ligands plus polaires tels que ceux utilisés pour
la préparation des garnissages CN présentent une stabilité significativement
plus faible, même dans des conditions normales de fonctionnement. A pH
7, l'hydrolyse d'un garnissage CN peut être d'un facteur 1000 plus rapide
que celle d'un garnissage C18 ou C8.
Comme vous pouvez le voir, vous pouvez obtenir une durée de vie
raisonnable de la colonne à un pH plus élevé que celui généralement
recommandé, si vous utilisez la bonne combinaison de conditions de
fonctionnement. Les colonnes les plus stables sont basées sur une silice
haute densité, ont une couverture dense d'une phase greffée C18 ou C8 et sont coiffées.
La nature des ingrédients du tampon peut avoir un effet drastique sur la
durée de vie de la colonne et doit être choisie avec soin. Cependant, si
votre séparation l'exige et si vous obtenez une durée de vie de la colonne
acceptable pour vous, il n'y a rien de mal à explorer les frontières de la
stabilité de la colonne.

Références :
1. T. Walter, B. Alden, P. Casellini, article présenté à HPLC '97, 0 0,5 1 1.5 2
Birmingham, Royaume-Uni 2. HA Claessens, MA van Straten, JJ Kirkland,
J. Débit [mL/min]
Chromatogr. A.728 (1996), 259-270
Figure 1
Résolution en fonction du débit pour une colonne de 5 µm 15 cm
pour les conditions supposées ici.
27. Débits optimaux
Tout d'abord, explorons les règles qui déterminent la position de la
Q. : J'utilise toujours ma colonne en phase inverse (5 µm, 4,6 mm x 150 performance maximale de la colonne. Elle peut être calculée en utilisant
mm) à un débit de 1 mL/min. Un collègue m'a dit que je pouvais obtenir l'équation classique de van Deemter, donnée ici sous sa forme réduite :
une meilleure résolution à 0,5 mL/min. En réduisant mon débit selon sa
suggestion, je ne vois pas beaucoup d'amélioration dans ma séparation. B
h A= + + C ÿ ÿ (1)
De plus, le temps d'exécution a été multiplié par 2. Néanmoins, j'aimerais ÿ
comprendre le concept et apprécierais si vous pouviez discuter de
h est la hauteur réduite de la plaque,ÿ est la vitesse réduite, et A, B et C
l'influence du débit sur la résolution.
sont des coefficients décrivant la qualité du lit garni, la diffusion de
l'échantillon dans le lit garni et le transfert de masse de l'échantillon dans
le garnissage, respectivement.
A. : Avec plaisir ! Derrière votre question se cache la dépendance de la
Nous n'avons vraiment pas besoin de passer beaucoup de temps sur cette équation.
hauteur équivalente à une plaque théorique sur la vitesse linéaire. Les
Ce que nous devons faire est de trouver le minimum de cette équation,
deux sont des termes de théorie chromatographique que la plupart des
qui est simplement dérivée en calculant la dérivée première et en
praticiens oublient au moment où ils terminent le cours d'introduction à la
l'assimilant à 0. Lorsque nous faisons cela, nous obtenons pour la vitesse
chromatographie. Ce que je vais essayer de faire dans ce qui suit est
réduite au minimumÿ:
d'expliquer les phénomènes en termes plus simples.
B
En chromatographie isocratique, la résolution diminue généralement ÿ = (2)
min
lorsque le débit augmente et augmente lorsque le débit diminue (voir C

figure 1). Cependant, à un débit particulier, qui est spécifique à l'analyte et La valeur de B est généralement d'environ 1,5 et C est généralement
à la phase mobile, la résolution atteint un maximum. Si je diminue de 1/6, ce qui rend le coefficient sous la racine carrée d'environ 9 (1).
davantage le débit, la résolution diminuera à nouveau. Évidemment, cette En utilisant cette information et en convertissant la vitesse réduite en
région de vitesse linéaire, nous obtenons

33
Machine Translated by Google

D la théorie. La dernière étape est vraiment une simple conversion aux

min = 3ÿ u m
dp
umin est la vitesse linéaire à laquelle les performances maximales de la
colonne sont atteintes. À partir de la dernière équation, on peut voir que la
vitesse linéaire pour atteindre les performances maximales dépend du
coefficient de diffusion de l'analyte, Dm, et de la taille des particules de la
colonne, dp. Plus la taille des particules est petite, plus la vitesse linéaire à
(3)
dimensions couramment utilisées aux États-Unis. J'ai également arrondi
les chiffres pour obtenir une formule simple et facile à retenir. Si vous
utilisez la taille des particules en µm, la longueur de la colonne en mm et
que vous souhaitez obtenir la pression à la vitesse linéaire optimale en psi,
vous devez utiliser la formule simple suivante : L
ÿp [psi =200
]
ÿ

(8)
3
dp
laquelle les performances maximales de la colonne sont atteintes est
élevée. De plus, on peut voir que cette vitesse dépend du coefficient de Par exemple, si je veux connaître la pression au point de performance
diffusion de l'échantillon, qui à son tour dépend de la composition de la optimal pour une colonne de 150 mm remplie de particules de 5 µm,
phase mobile. j'obtiens 240 psi.

Q. : Merci pour votre belle exploration théorique ! Alors, qu'est-ce que je
vais faire avec ça maintenant ? Je ne sais rien du coefficient de diffusion
de mes analytes.
A. : Heureusement, vous n'avez pas besoin de savoir quoi que ce soit à ce
sujet. Il existe un moyen de contourner ce problème qui est très pratique.
Supportez-moi encore un instant. Les théories de la diffusion dans les
liquides relient le coefficient de diffusion d'un analyte à la viscosité du
solvant. Avec quelques hypothèses, on peut relier le coefficient de diffusion
dans un solvant aqueux ou polaire à température ambiante à la viscosité
de la phase mobile en utilisant l'équation suivante : (4)
ÿ
Q. : Cela ressemble à une bonne règle empirique. Dois-je utiliser la colonne
à cette pression ?
R. : Ces considérations représentent un moyen simple de vous étalonner
pour le point auquel les performances maximales de la colonne sont
attendues pour les analytes normaux. Mais vous devez prendre conscience
des limites de cette estimation. Si vos analytes sont inférieurs à environ
200 Dalton ou supérieurs à environ 500 Dalton, cette estimation ne
fonctionnera pas. Pour les analytes plus petits, le nombre maximal de
plaques est atteint à une pression plus élevée, et pour les analytes plus
gros à une pression plus faible.
De plus, je ne ferais généralement pas fonctionner la colonne au nombre

6 1 de plateaux maximum, mais à une vitesse linéaire qui est d'environ un

Dm
ÿ
1,7 10 ÿ ÿ

0,6 facteur 2 supérieure à cette estimation. C'est généralement le point du

ÿ
ÿ

V
meilleur compromis entre les performances de la colonne et le temps
ÿ est la viscosité de la phase mobile en Poise, et V est le volume
d'analyse. Par conséquent, je choisirais le débit qui me donne une contre-
molaire du soluté, en mL. La plupart des analytes ont un poids moléculaire
pression d'environ 500 psi. C'est le meilleur choix du point de vue des
compris entre 200 et 500 Dalton, ce qui se traduit par des coefficients de
performances globales de la colonne.
diffusion allant de Dm ÿ 0,4*10-7 * 1/ Dm ~ 0,7*10-7 * 1/ Supposons ÿ à Bien sûr, de nombreuses séparations n'ont pas besoin des meilleures
ÿ . de0,6*10-7
simplement qu'un coefficient diffusion* typique est d'environlaDm
1/. Par conséquent, ~
vitesse performances de colonne. Cependant, si vous avez optimisé votre
linéaire optimale est ÿ séparation autour de ce point, vous pouvez alors sélectionner d'autres
conditions susceptibles d'accélérer votre séparation. Vous pouvez
1 augmenter le débit ou utiliser une colonne plus courte, ou une combinaison
tu = 1,8 10 ÿ ÿ

(5)
es min
ÿ
des deux.
ÿ dp

Cela signifie que la vitesse linéaire optimale est inversement proportionnelle à la viscosité de la phase mobile. Référenceÿ:
Plus la viscosité est élevée, plus la vitesse est faible ! Cela vaut la peine d'être connu, mais ce n'est pas encore
1. UD Neue, dans "HPLC-Columns, Theory, Technology and Practice",
quelque chose que nous pouvons traiter facilement dans la pratique. Cependant, la contre-pression de la colonne
Wiley-VCH, 1997
dépend de la viscosité de la phase mobile, et c'est quelque chose que nous pouvons lire sur l'instrument. La relation

entre la vitesse linéaire et la contre-pression peut être obtenue à partir de l'équation de Kozeny-Carman : ÿ ÿ p dp

28. Charge de carbone

Q. : J'ai toujours pensé que la charge en carbone d'un garnissage en phase

inverse déterminait la rétention d'un composé - du moins pour les composés
2
qui interagissent avec le garnissage principalement par interaction
tu = (6)
1000
ÿ

ÿ t
ÿ

ÿ
ÿ

L hydrophobe. Un collègue m'a dit que c'était une vision trop simpliste.
J'apprécierais une bonne explication de la dépendance de la rétention sur
En remplaçant cela dans l'équation 5 et en supposant que le = 0,7, nous
la charge de carbone.
la porosité totale typique de la colonne est d'environ ÿ t obtenons
ÿ

4 L
ÿp = 1,25 10
ÿ ÿ
[dyn/cm2] (7) R. : Votre collègue a raison : la « charge carbone » communément citée
3
dp d'un garnissage n'est pas le facteur qui détermine la rétention.
La contre-pression de la colonne au point de performance optimale de L'histoire est un peu plus compliquée. Abordons d'abord le cas simple
la colonne dépend uniquement de la longueur de la colonne et de la taille d'une interaction purement hydrophobe !
des particules. C'est un résultat magnifiquement simple après ce tour de La question de la rétention peut être facilement analysée, si l'on
force à travers trois branches indépendantes de la colonne considère la chromatographie en phase inverse simplement comme une séparation

34
Machine Translated by Google
mécanisme. Dans ce mécanisme, le facteur de rétention k d'un composé
est déterminé par son coefficient de répartition K entre la phase stationnaire
et la phase mobile et le volume de la phase stationnaire VS et de la phase
mobile VM :
VS (1)
kK= ÿ
VM
Le rapport du volume de la phase stationnaire au
volume de la phase mobile est appelé rapport de phase.
Le volume de la phase mobile dans la colonne est juste
le volume de rétention d'un pic non retenu. Donc le
volume de rétention ajusté VR' d'un pic est : VR '=VR
ÿVM =VS ÿ K (2)
Cela signifie que le volume de rétention d'un composé est simplement
proportionnel au volume de la phase stationnaire dans la colonne. Le
volume de la phase stationnaire dans la colonne n'est cependant pas
proportionnel à la charge en carbone communément citée. Cela est dû au
fait que le volume poreux spécifique des différentes silices est différent. Une
silice à faible volume poreux spécifique est plus dense qu'une silice à fort
volume poreux spécifique. Par conséquent, plus de silice peut être
conditionnée dans une colonne, et plus de phase stationnaire est également
conditionnée dans une colonne. La quantité de phase stationnaire dans la
colonne peut être calculée comme suit : (3)
VV
CS(
= ÿ 1ÿ ÿ
je
ÿ
)f
où VC est le volume de la colonne et est la fraction
ÿ je interstitielle dans la
colonne, qui est constante à toutes fins pratiques. Le facteur f contient
toutes les composantes qui varient selon le type de garnissage :
VSt
g (4)
F =
Vpore Vsilice
+
g g
g est le nombre de grammes dans une colonne, Vst est la quantité de
volume de la phase stationnaire dans la colonne, proportionnelle au % de
carbone donné dans la littérature, Vpore/ g est le volume poreux spécifique,
et le dernier facteur Vsilica/ g est l'inverse de la densité de squelette de la
silice, qui est de 2,2 g/mL. Ce facteur f
détermine la rétention de l'emballage. Toutes les composantes de ce facteur
sont couramment données dans la littérature des constructeurs, il peut donc
être utilisé sans difficulté pour estimer la rémanence d'un garnissage par
rapport à un autre.
Permettez-moi de montrer cela dans un exemple simple! Comparons
trois emballages C18 différents : Nova-Pak® C18, Spherisorb®
ODS2 et Lichrosorb® RP18. La teneur en carbone des trois garnissages
est significativement différente (données du catalogue des colonnes et
consommables HPLC de séparation de phase) : 7,3 % pour Nova-Pak®
C18, 11,5 % pour Spherisorb® ODS2 et 16,2 % pour Lichrosorb® RP18.
Ainsi, si la rétention était déterminée par la teneur en carbone du garnissage,
on s'attendrait à une rétention 2,5 fois supérieure pour le Lichrosorb® RP18
que pour le Nova Pak® C18, avec le Spherisorb® ODS2 quelque part entre
les deux.
Cependant, la densité de garnissage des différents garnissages est
significativement différente, du fait des différences de volume poreux
spécifique entre les trois garnissages (tableau 1).
Par conséquent, si l'on calcule le facteur donné dans l'équation 4, on
découvrira que ce facteur est très similaire pour le
35
trois garnissages, et que par conséquent la rétention hydrophobe pour les
trois garnissages est également très similaire.
Tableau 1
Exemple de calcul
% Carbone Vpore/g Facteur f
Nova-Pak C18 7,3% 0,3 0,10
11,5 % 0,5 0,12
Spherisorb ODS2
Lichrosorb RP18 16,2 % 1 0,11
En résumé : la teneur en carbone seule ne permet pas de comparer la
rétention de garnissages de porosités sensiblement différentes. Cependant,
toutes les informations dont on a besoin pour une bonne estimation de la
rétention hydrophobe d'un garnissage sont facilement disponibles dans la
littérature des fabricants.
Q. : C'est éclairant. Ce serait bien si les fabricants de colonnes utilisaient
ce facteur dans leur documentation. Cela faciliterait la comparaison des
emballages. Vous avez mentionné que cela ne s'applique qu'à la rétention
hydrophobe. Je suppose que l'autre facteur à considérer est l'activité silanol
d'un garnissage ?
A. : Oui, vous avez raison. L'activité silanol d'un garnissage est le deuxième
facteur important déterminant la rétention sur les garnissages en phase
inverse, en particulier pour les analytes basiques. Bien entendu, l'influence
des silanols sur la rétention d'un analyte dépend des propriétés d'un analyte.
Pour les analytes hydrophobes neutres, l'activité des silanols à la surface
d'un garnissage est sans importance. Pour les composés basiques, le
facteur de rétention peut être multiplié par 10 en raison de l'activité des
silanols. Pour d'autres composés polaires, des différences de sélectivité
plus subtiles peuvent être observées. Ainsi, la connaissance de l'activité
silanol d'un garnissage joue un rôle dans notre jugement sur l'utilité de ce
garnissage pour une séparation. On peut avoir une première impression de
l'activité silanol d'un garnissage en vérifiant si un garnissage est coiffé ou
non. Les garnissages non coiffés ont une activité silanol plus élevée que les
garnissages coiffés.
La plupart des garnitures modernes à phase inversée sont bien coiffées.
Un endcapping complet permet d'obtenir une bonne forme de pic pour les
analytes de base sans avoir besoin de modificateurs de phase mobile.
Néanmoins, les garnissages à haute activité silanol peuvent être utilisés
même pour les analytes basiques afin d'obtenir des sélectivités différentes
de celles disponibles avec les garnissages entièrement coiffés. Bien
entendu, des modificateurs tels que la triéthylamine ou l'octylamine doivent
souvent être ajoutés à la phase mobile pour améliorer la forme des pics des
composés basiques. C'est une nuisance pour de nombreux
chromatographistes et c'est la raison pour laquelle les garnitures entièrement
fermées sont préférables pour la plupart des applications.
Qu'un garnissage soit coiffé ou non ne donne malheureusement qu'une
impression très approximative de l'activité des groupes silanol de différents
garnissages. Par conséquent, les catalogues de certains fournisseurs de
colonnes contiennent des informations supplémentaires plus détaillées sur
l'activité des silanols (1, 2). Ces informations peuvent ensuite être utilisées
pour sélectionner des garnitures sensiblement différentes les unes des
autres pour votre prochaine
Machine Translated by Google

développement d'applications. Après tout, les différences entre les différentes

colonnes sont un avantage dans le développement des méthodes.

Références :
1. Catalogue des colonnes et consommables HPLC pour les séparations
de phase 2. Catalogue de chromatographie Alltech 400

29. Contrôle du pH
Q. : J'ai lu récemment un article qui préconise l'utilisation de phases mobiles
à pH acide pour les composés acides. Il a été suggéré que l'utilisation de
phases mobiles acides réduit l'ionisation des analytes acides et des silanols.
Ceci est censé améliorer la forme du pic et réduire les traînées. Pouvez-vous
expliquer la raison de ce phénomène ?

R. : En général, les pics de traînée sont observés assez fréquemment sur

les garnissages en phase inversée avec des analytes basiques à pH neutre.
Ce phénomène est dû à l'interaction des bases avec les silanols sur les
garnissages en phase inverse. La traînée d'analytes acides, en revanche,
est assez rare, du moins dans des circonstances où des facteurs de
complication tels que des phénomènes de complexation ou d'exclusion de
taille peuvent être exclus.
Il n'y a aucune raison de s'attendre à ce qu'une interaction entre les analytes
acides chargés négativement et les silanols de surface chargés négativement
puisse provoquer un tel phénomène.
Par conséquent, la recommandation d'utiliser exclusivement des phases
mobiles acides pour la séparation des analytes acides semble assez
limitative. Pouvez-vous me donner un exemple de cette amélioration de la
forme du picÿ?

Q. : Oui. Dans l'article que j'ai lu, l'exemple d'analyte était l'ibuprofène, qui
est un simple analyte hydrophobe avec un groupe fonctionnel acide. Une
colonne C18 a été utilisée et la phase mobile était un mélange d'acétonitrile
et de tampon. Le tampon était un tampon phosphate 5 mM à pH 4,4. Comme
vous pouvez le voir sur le chromatogramme (Figure 1a), une traînée
significative a été observée. Dans l'article, le pH de la phase mobile a ensuite
été modifié de pH 4,4 à pH 3,0, en utilisant le même tampon phosphate 5
mM, et une amélioration significative de la forme du pic a été observée. Des
améliorations supplémentaires ont été montrées à pH 2,5 avec 0,1 % d'acide
trifluoroacétique. Cela démontre assez clairement l'amélioration de la forme
des pics pour l'ibuprofène à pH acide, n'est-ce pasÿ?
A.ÿ: Je ne suis pas du tout d'accord. Cet ensemble d'expériences ne
démontre pas du tout que vous avez besoin d'une phase mobile acide pour
supprimer la traînée des analytes acides. La seule chose que cela démontre
est le fait qu'il faut utiliser un tampon dans la phase mobile. Le phosphate a
deux valeurs de pKa, l'une autour de 2, l'autre autour de 7. Par conséquent,
les tampons phosphate ont leur capacité tampon optimale autour de pH 2 et
autour de pH 7. À pH 4,4, le phosphate n'a aucune capacité tampon. Par
conséquent, la traînée du pic d'ibuprofène avec le « tampon » phosphate à
pH 4,4 est due à l'absence de contrôle du pH dans ces conditions.
Figure 1 : Chromatogramme d'ibuprofène à pH 4,4 en utilisant 60 %
d'acétonitrile et 40 % de a. une solution de phosphate 5 mM et b. un tampon
acétate 5 mM.
Cela peut facilement être démontré dans une expérience simple. Dans
cette expérience, on garde le pH à la même valeur que dans votre exemple,
à pH 4,4, mais on utilise un vrai tampon avec un bon pouvoir tampon à ce
pH. Ceci peut facilement être accompli en utilisant un tampon acétate. La
figure 1b montre le chromatogramme résultant de l'ibuprofène à pH 4,4 en
utilisant un tampon acétate 5 mM. Comme vous pouvez le voir, une bonne
symétrie de pic a été obtenue et aucune traînée n'est remarquée. Cela
démontre clairement que la cause initiale de la traînée n'est pas due au pH
de la phase mobile, mais plutôt au fait que la phase mobile n'est pas
tamponnée. Par conséquent, de bonnes formes de pics et de bons résultats
peuvent être obtenus avec des analytes acides à n'importe quelle valeur de
pH, à condition que la phase mobile soit correctement tamponnée. Cela vous
donne un plus grand choix d'options dans l'optimisation d'une séparation.
Si vous avez affaire à des composés ionisables, la manipulation de la
valeur du pH est un outil très puissant dans le développement d'une
séparation (1). Fréquemment, lorsque le pH est modifié, l'ordre d'élution des
pics change. Les effets que

36
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Les variations de pH ont sur la sélectivité d'une séparation sont généralement
beaucoup plus puissantes que la variation du solvant organique. Par conséquent,
la suggestion de ne pas utiliser l'outil de manipulation du pH dans le
développement de vos méthodes est contre-productive. Pour de nombreux
composés, mais surtout pour les analytes acides, une interaction avec les
silanols de surface est peu susceptible de poser un problème. Si vous utilisez
l'une des nouvelles phases stationnaires à phase inversée à base de silices de
haute pureté, vous ne rencontrerez souvent pas de pics de traînée même à pH
neutre en utilisant des analytes basiques.
Comme nous l'avons vu dans cet exemple, le bon contrôle du pH de la phase
mobile n'est pas seulement important pour la forme du pic, mais il est également
vital pour la robustesse de la séparation. La qualité du contrôle du pH dépend de
la capacité tampon d'un tampon. À son tour, la capacité tampon est fonction de
la concentration du tampon et de la différence entre le pH et le pKa des ions
tampons. Dans la plupart des séparations HPLC, la concentration d'un tampon
est d'environ 50 mM. A cette concentration, le tampon peut être utilisé pour
contrôler le pH de la phase mobile dans une plage de +/- 1,5 unités de pH autour
du pKa du tampon, mais une plage de +/- 1 unité de pH est préférée. Si vous
devez travailler à des concentrations de tampon inférieures, il est certainement
préférable de rester dans la plage la plus petite. Ceci est dû au fait que la
capacité tampon d'un tampon est fonction à la fois de la concentration du tampon
et de la différence entre le pH et le pKa du tampon. Par conséquent, des
concentrations de tampon inférieures correspondent à une plage de tampon plus
étroite.
En résumé : il n'y a aucune raison de se limiter aux phases mobiles acides
lors de l'analyse d'analytes acides. Un bon contrôle du pH de la phase mobile en
utilisant les bons tampons à la bonne concentration est important pour la
reproductibilité de votre méthode et la forme des pics de vos analytes. Et
n'oubliez pas : un tampon est un tampon s'il tamponne le pH. Si ce n'est pas le
cas, ce n'est pas le cas.
Référence : 1.
M. Zoubair El Fallah, « HPLC Methods Development », dans Uwe D. Neue, «
HPLC Columns - Theory, Technology and Practice », Wiley-VCH (1997)
30. Composition de la phase mobile
Q. : Nous avons récemment converti une méthode isocratique d'un ancien
système de gradient à deux pompes en un système HPLC à pompe unique.
Nous avons été surpris de constater des différences significatives dans les
temps de rétention entre les deux systèmes. Les différences sont constantes et
reproductibles. Quelle est la raison?
R.ÿ: La raison la plus probable de vos observations est la contraction (ou
l'expansion) des solvants lors du mélange. Il s'agit d'un problème ancien dans la
préparation des phases mobiles en phase inverse. Cela est dû à la contraction
volumétrique importante des mélanges couramment utilisés d'eau ou de tampon
avec du méthanol, de l'acétonitrile et du tétrahydrofuranne. Je reçois rarement
des questions à ce sujet aujourd'hui, peut-être parce que
37
que les systèmes HPLC utilisés aujourd'hui utilisent couramment des principes
similaires pour le mélange des solvants.
Int. : Notre méthode est bien une méthode en phase inversée. Nous utilisons
une phase mobile de 50% de méthanol et 50% d'eau.
R. : Les mélanges méthanol-eau représentent le pire cas de contraction du
solvant en HPLC. Vous pouvez observer des différences significatives de
rétention, selon la façon dont vous mélangez les solvants. Vous devez
comprendre que si vous mélangez 500 mL d'eau avec 500 mL de méthanol ou
si vous prenez 500 mL d'un solvant et remplissez le gradué avec l'autre solvant
vous n'obtenez pas la même composition. Puisque vous n'obtenez pas la même
composition, la force d'élution des deux mélanges est différente. Comme la force
d'élution n'est pas la même, vous observez des temps de rétention différents.
Des exemples de cet effet ont été publiés dans la littérature (1), alors laissez-moi
utiliser l'exemple de la littérature pour démontrer l'effet.
La séparation utilisée pour démontrer l'effet de mélange est une séparation
d'explosifs dissous dans l'acétone. Elle a été réalisée à l'aide d'une colonne C18
de 4,6 mm x 250 mm utilisant une phase mobile de « 40 % d'eau et 60 % de
méthanol ». Les détails de la méthode sont donnés dans la légende du graphique
qui montre les résultats de l'expérience.
Quatre manières différentes de préparer la phase mobile « 40 % d'eau et 60
% de méthanol » ont été utilisées. Dans le premier cas, 400 ml d'eau ont été
placés dans une fiole jaugée de 1 L, puis la fiole a été complétée avec du
méthanol. En raison de la contraction du mélange lors de la combinaison des
solvants de l'étoupe, plus de 600 mL de méthanol sont ajoutés au ballon. Par
conséquent, la force d'élution de cette préparation de phase mobile est la plus
élevée et les temps de rétention sont plus courts qu'avec les autres techniques
de préparation.
Dans le second cas, 400 ml de méthanol et 600 ml d'eau ont été mesurés
séparément et combinés dans un flacon.
Les temps de rétention étaient plus longs que dans le cas précédent. Comme
nous le verrons plus en détail ci-dessous, il s'agit de l'approche la plus préférée.
C'est aussi la manière dont les phases mobiles sont préparées dans la plupart
des laboratoires.
Dans le troisième cas, le gradient était formé par deux pompes délivrant les
bonnes quantités de méthanol ou d'eau.
Le mélange du gradient a été fait à haute pression. Dans ce cas, la composition
de solvant est identique à la composition de solvant du second cas. Cependant,
la contraction du mélange de solvants se produit derrière la pompe, ce qui
entraîne un débit réel inférieur à 1 ml/min. Par conséquent, le débit plus lent
entraîne des temps de rétention plus longs, tandis que la composition du solvant
est précise.
Le quatrième cas est l'inverse du premier cas : 600 mL de méthanol ont été
ajoutés dans la fiole jaugée, qui a ensuite été complétée par de l'eau. En raison
de la contraction du mélange, plus de 400 ml d'eau ont été nécessaires pour
remplir le flacon.
Par conséquent, cette phase mobile contient la concentration en eau la plus
élevée et les temps de rétention sont plus longs que dans les autres cas.
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Figure 1 : Séparation des explosifs à l'aide de différentes méthodes de
préparation de la phase mobile.
Échantillonÿ: explosifs dissous dans l'acétone (octogène, hexogène, tétryl,
trinitrotoluène, nitropenta)ÿ; colonne : Grom-Sil 80 ODS-7 PH, 4 µm, 4,6 mm
x 250 mm ; détection : UV à 220 nm ; phase mobile : « 40% eau et 60%
méthanol » ; débit : 1 mL/min ; (reproduit à partir de la référence 1 avec la
permission de l'éditeur et de l'auteur)
La deuxième approche est la manière la plus préférée de préparation de
la phase mobile. D'une part, il est le plus similaire aux systèmes de mélange
à gradient basse pression couramment utilisés. En revanche, il ne nécessite
pas de mesure volumétrique après mélange. Par conséquent, cette approche
évite les problèmes qui surviennent du chauffage ou du refroidissement du
mélange de solvants lors du mélange. Il représente la pratique couramment
recommandée dans les formations HPLC. Je pense donc que c'est aussi la
méthode que vous avez utilisée.
Q. : C'est effectivement le cas. D'après votre description du problème, les
différences que nous observons dans les temps de rétention sur nos
différents instruments sont liées aux différentes manières de préparer les
phases mobiles du fait que nous comparons un système à deux pompes à
un système à une pompe .
Ceci est identique aux deuxième et troisième cas de vos exemples. Si je
vous comprends bien, la composition de la phase mobile est identique dans
le cas deux et le cas trois, et
38
la différence est le débit délivré par le système. Est-ce exact?
A. : Oui, ça l'est. La composition de la phase mobile est identique dans ces
deux cas. Par conséquent, la sélectivité de la séparation n'est pas du tout
influencée. La seule différence entre la deuxième et la troisième méthode
est le débit réel dans le système HPLC. De ce fait, les facteurs de rétention
et la sélectivité de la séparation sont absolument identiques. De ce point de
vue, le transfert de la méthode d'un système à l'autre est réussi. Les
différences mineures dans le débit réel
entre les deux systèmes n'a rien d'inquiétant. Vous avez réussi à transférer
la méthode de votre système à deux pompes vers votre système à pompe
unique.
Référenceÿ:
1. Veronika R. Meyer, "Pièges et erreurs de la HPLC en images", 1997,
Hüthig, Heidelberg - Oxford, CT, page 51
31. Contamination de la colonne
Q. : La durée de vie de ma colonne n'est pas très longue. Après seulement
environ 500 injections, les pics s'élargissent et commencent à s'allonger.
Auparavant, la durée de vie de la colonne était d'environ 1000 injections.
Quel est le problème avec la colonne?
A.ÿ: Il est tout à fait possible qu'il n'y ait absolument aucun problème avec
la colonne. Avant de discuter de cela en détail, permettez-moi de vous poser
une question. Utilisez-vous une colonne de gardeÿ?
Q. : Non, je n'utilise pas de colonne de garde. Mais j'utilise un filtre
précolonne. Cela devrait protéger la colonne, n'est-ce pasÿ?
A. : Malheureusement, les filtres précolonne ne sont qu'une protection
partielle de la colonne. Ils servent à éliminer les particules du flux de la
phase mobile. Les particules proviennent soit de votre échantillon, soit des
pièces mobiles de l'instrument HPLC. Les filtres de précolonne ne peuvent
pas protéger votre colonne des matériaux plus petits que le filtre et peuvent
s'adsorber à la surface du garnissage. La plupart du temps, mais pas
toujours, l'origine de ce matériel est l'échantillon. Quel est votre échantillon ?
Q. : Il s'agit d'un extrait de plasma issu d'une procédure d'extraction en
phase solide. Certes, les composants du plasma peuvent réduire assez
rapidement la durée de vie d'une colonne, mais le chromatogramme est
assez propre, avec peu d'interférences de fond. Plus important encore, la
colonne a duré auparavant plus de 1000 injections, et ce n'est que maintenant
que nous observons la détérioration plus rapide.
R. : Dans de nombreux cas, la procédure de préparation des échantillons
n'est pas entièrement parfaite. Après tout, certaines interférences de fond
sont toujours présentes dans le chromatogramme. De même, certaines protéines
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peut rester dans votre échantillon malgré tous vos efforts. Les protéines sont Par conséquent, je privilégie l'utilisation de colonnes de garde. Ils sont
souvent fortement adsorbées sur le matériau de garnissage et peuvent garantis pour capturer les contaminants qui, autrement, encrasseraient votre
s'accumuler lentement au sommet de la colonne. De plus, la concentration de colonne. Ils ne sont pas si chers que ça; le coût n'est qu'une fraction de la
ces contaminants de fond peut varier légèrement selon les échantillons. Par colonne analytique que vous essayez de protéger. Il ne faut que quelques
conséquent, une diminution de la durée de vie de la colonne d'un facteur deux minutes pour remplacer une colonne de garde, tandis qu'un protocole de
ne me choque pas. Ma recommandation serait d'utiliser une colonne de garde lavage approfondi de la colonne, y compris le rééquilibrage de la colonne, peut
pour protéger votre colonne analytique de cette contamination. prendre des heures. Vos économies de temps et d'aggravation sont
importantes. Si vous adhérez aux principes dont nous avons discuté ci-dessus,
ils sont presque garantis pour fonctionner et vous protéger de nombreux maux
Q. : J'ai déjà essayé les colonnes de garde. Les résultats n'étaient pas bons. de tête.
Les pics ont été déformés dès le début.
Par conséquent, je ne pense pas que l'utilisation d'une colonne de garde soit
une bonne solution.
32. Vérification de la méthode
R. : Tout dépend de votre choix de colonne de garde. Je recommande
Q. : Un collègue m'a récemment transmis une nouvelle méthode QC.
généralement d'utiliser une colonne de garde remplie du même matériau de
J'ai acheté une nouvelle colonne pour vérifier sa méthode. Malheureusement,
garnissage que la colonne analytique.
les temps de rétention obtenus dans mon laboratoire étaient différents des
Si vous procédez ainsi, la colonne de garde fonctionne comme une extension
temps de rétention qu'il avait rapportés. Il m'a envoyé son ancienne colonne,
de votre colonne analytique et retient les contaminants qui s'adsorberaient
et en effet j'ai pu obtenir avec sa colonne la séparation qu'il avait signalée. J'ai
normalement à votre colonne principale. Si cette colonne de garde est
ensuite modifié quelques paramètres de la phase mobile et j'ai pu obtenir la
raisonnablement bien garnie, la détérioration des performances de séparation
séparation sur ma colonne également. Je soupçonne que je regarde les
peut être minimisée. Dans certains cas, vous pouvez en fait gagner un peu en
différences d'un lot à l'autre du fabricant, puisque la colonne de mon collègue
performances globales.
date de plus d'un an. Comment puis-je faire face à une telle situation dans un
Cependant, ce n'est pas excitant; l'important est la protection de votre colonne
département QC? Je ne peux pas écrire dans la procédure QC que la méthode
analytique.
doit être réoptimisée à chaque fois que nous achetons une nouvelle colonneÿ!
Si vous choisissez une colonne de garde qui ne contient pas le même
garnissage que votre colonne analytique, vous pouvez obtenir une distorsion
de crête importante. De plus, vous ne pouvez pas prédire dans quelle mesure
cette colonne de garde protège votre colonne analytique. Ces deux effets sont
dus au fait que les propriétés de rétention des différents matériaux de R.ÿ: En effet, vous ne devriez pas avoir à le faire. Il existe des solutions
possibles au problème, mais avant d'en discuter avec vous, je voudrais vérifier
garnissage sont différentes. Par conséquent, il est toujours préférable de faire
un point importantÿ: les deux colonnes que vous avez mentionnées sont-elles
correspondre le matériau de garnissage de la colonne de garde au matériau
les seules colonnes sur lesquelles la méthode a été exécutéeÿ?
de garnissage de la colonne analytique. Cela vous permet à la fois la meilleure
protection de colonne possible et le moins de distorsion de crête.

Q. : Oui, c'est le cas. Mon collègue a développé la méthode sur sa colonne, et

la seule autre colonne sur laquelle la méthode a été essayée est ma nouvelle
Q. : Le problème des colonnes de garde, c'est qu'elles sont très chères. Qu'en
colonne.
est-il des procédures de nettoyage et de lavage des colonnesÿ?

R.ÿ: Dans un tel cas, la toute première chose à faire est de vérifier que vous
examinez bien les différences d'un lot à l'autre. Il n'est pas impossible que les
R.ÿ: Je considère toujours la procédure de nettoyage comme un dernier
différences que vous observez soient dues à une comparaison entre une
recours, si je n'ai pas d'autres options. Le problème avec les procédures de
ancienne colonne et une nouvelle colonne, et non à des différences de lot à
nettoyage est qu'elles fonctionnent mieux si vous savez ce qui contamine la
lot. Après tout, je suppose que votre collègue a dû essayer de nombreuses
colonne. Dans la plupart des cas, nous n'avons aucune idée et ne pouvons
phases mobiles différentes avant d'établir la méthode. Au cours du processus
que faire des suppositions quant à la nature de la contamination. De plus, dans
de développement de la méthode, sa colonne peut avoir vieilli, peut-être perdu
certains cas, il peut être très difficile d'éliminer les contaminants. Votre
une phase liée ou fortement adsorbé un additif de phase mobile qui a été
problème est très probablement un exemple pour ce cas. Je soupçonne que
utilisé pendant le développement de la méthode mais qui n'était pas nécessaire
la contamination se compose principalement de petites quantités de protéines.
pour la méthode finale. Étant donné que de tels événements peuvent se
produire par inadvertance, il est toujours judicieux de vérifier une nouvelle
Trouver un bon protocole de nettoyage de colonne n'est pas facile. Il existe
méthode avec une toute nouvelle colonne du même lot et de vérifier que des
quelques protocoles de nettoyage généralisés disponibles dans la
résultats cohérents sont obtenus sur les deux colonnes.
documentation des fabricants, mais ils sont assez complexes et peuvent ou
non vous aider. Dans tous ces protocoles, vous devez laver la colonne avec
une série de solvants destinés à éliminer les contaminants. Cela peut prendre
Je suggère que la première chose à faire soit de contacter le fabricant et de
beaucoup de temps et vous pouvez réussir ou non.
lui demander de vous emballer une nouvelle colonne à partir de l'ancien lot de
matériel d'emballage. La plupart des fabricants maintiennent un petit

39
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quantité de matière de chaque lot d'emballage dans ce but précis.
Étant donné que la colonne de votre collègue n'a qu'un an environ,
vous devriez pouvoir obtenir une nouvelle colonne à partir de l'ancien
lot de matériel d'emballage. Selon les fabricants, il est même possible
que le lot d'emballage n'ait pas changé sur cette période de temps. Ce
serait le cas le plus simple, car cela prouverait immédiatement que les
différences observées ne sont pas dues à des différences de lot à lot.
Exécutez le test sur la nouvelle colonne remplie avec l'ancien lot, en
utilisant la phase mobile de votre collègue. Si vous obtenez les mêmes
résultats que votre collègue, vous examinez en effet des différences
entre les lots et vous avez du pain sur la planche pour créer une
méthode robuste. Si vous obtenez des résultats identiques ou similaires
à ceux que vous avez obtenus sur votre colonne, le problème est que
la colonne de votre collègue a vieilli pendant le développement de la
méthode. Je vous recommanderais alors de concevoir une étude de
durée de vie de la colonne avec vos nouvelles conditions de phase
mobile pour établir la durée de vie prévue de la colonne lorsqu'elle est
traitée uniquement avec la phase mobile utilisée dans ce test.
Q. : C'est une suggestion raisonnable, et je verrai que je peux obtenir
une nouvelle colonne du même lot que mon collègue a utilisé. Mais
que dois-je faire si le problème s'avère être dû à une différence de lot
à lotÿ?
A. : Ce serait en effet le pire des cas. Tout d'abord, j'essaierais de
juger de la durée du test nécessaire. Parfois, seul un nombre limité de
colonnes est requis et le projet s'arrêtera à un moment donné dans un
proche avenir. Dans ces circonstances, la chose la plus simple à faire
serait de demander au fabricant de réserver suffisamment de matériel
d'emballage de ce lot pour votre projet et de lui demander de vous
préparer des colonnes sur demande. Parfois, le fabricant peut vous
demander un paiement initial pour la quantité d'emballage qu'il a mis
de côté pour vous. Cependant, si vous vous trouvez dans une situation
où le nouveau test sera utilisé pendant une durée indéterminée dans
un avenir lointain, vous devez réfléchir attentivement à ce qui peut être
fait pour rendre la méthode robuste.
Après vous être démontré que le matériau d'emballage que votre
collègue a choisi ne vous donne pas de résultats reproductibles, il peut
être intéressant de redévelopper la méthode sur un autre emballage.
C'est une quantité importante de travail, mais cela pourrait très bien en
valoir la peine. Il existe des différences significatives dans la
reproductibilité des différents emballages. Vous pouvez discuter du
problème avec le fabricant et voir s'il peut vous démontrer qu'un autre
emballage pourrait améliorer considérablement la reproductibilité. Ou
vous pouvez envisager une colonne avec une bonne réputation de
reproductibilité d'un autre fabricant. Dans tous ces cas, le développement
de la méthode recommence par le bas. Vous devez vous renseigner si
le fabricant peut mettre à votre disposition plusieurs lots de l'emballage,
afin que vous puissiez vérifier par vous-même la robustesse de la
méthode. Certains fabricants proposent des ensembles de colonnes
spécialement préparés pour cela
40
objectif. Ils sont constitués de colonnes provenant de différents lots.
Assurez-vous qu'au moins une des colonnes de l'ensemble provient du
même lot que la colonne que vous avez utilisée pour établir la méthode.
De cette façon, vous pouvez vérifier la reproductibilité de colonne à
colonne de votre méthode ainsi que la reproductibilité de lot à lot. C'est
quelque chose que je recommande généralement à tous ceux qui
développent une nouvelle méthode qui est censée être reproductible
sur une période de temps prolongée.
Dans toute la discussion ci-dessus, j'ai supposé que le type de
colonne que vous employez est une colonne grand public, telle qu'une
colonne C18 ou C8 . Si la méthode originale a été développée en
utilisant une colonne cyano ou amino, il est fort probable que le
problème de reproductibilité soit dû aux limitations de la stabilité de la
phase greffée. Si tel est le cas, ma recommandation serait de voir si la
méthode peut être redéveloppée en utilisant une colonne C18 ou C8 .
Bien sûr, le redéveloppement de la méthode représente une quantité
de travail importante, mais c'est peut-être la meilleure solution dans ce
cas.
33. Double pics dans les séparations de sucre
Q. : Je travaille avec une colonne conçue pour la séparation des
sucres. Il s'agit d'une colonne amino spécialement préparée. La phase
mobile est un mélange d'acétonitrile et d'eau. Pour la séparation
standard, nous utilisons une phase mobile de 75 % d'acétonitrile et 25
% d'eau. Récemment, j'obtiens des doubles pics pour tous les
composés. Je pensais que la colonne était vide, mais une nouvelle
colonne donne les mêmes résultats. Quel est le problème?
A. : Malheureusement, le principe de cette séparation est plus
complexe que le principe des autres séparations. Nous devons en
discuter en détail pour aller à la racine du problème.
Il existe un moyen simple de vérifier rapidement si les colonnes sont
vides ou s'il se passe quelque chose d'autre. Utilisez le glycérol comme
composé de testÿ! Cela donnera une rétention plus faible que la plupart
de vos sucres, mais ce n'est pas grave. Si vous obtenez le même
double pic avec le glycérol qu'avec les autres glucides de votre
chromatogramme, la colonne s'est vidée. Si vous obtenez un seul pic
non déformé du glycérol, alors que vous obtenez des pics doubles des
autres glucides, alors la colonne est OK, et le problème n'est pas avec
la colonne, mais avec la phase mobile.
Q.ÿ: Le glycérol est l'un des composés de mon mélange d'échantillons.
Il élue tôt dans le chromatogramme. Je ne vois pas de double pic pour
le glycérol. Cela donne en fait un très beau pic net, plus net que les
autres pics du chromatogramme.
A. : Cela démontre que la colonne est en bon état.
Par conséquent, nous devons chercher ailleurs l'explication des
doubles pics de vos autres analytes.
Les sucres existent sous deux formes anomères. En solution, les deux
formes anomères sont en équilibre l'une avec l'autre. Ces anomères
sont deux molécules distinctes qui peuvent être séparées sans difficulté
par HPLC. Par conséquent, on devrait obtenir deux
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pics pour chaque sucre, et en effet, c'est ce que vous obtenez.
Q. : Mais dans des circonstances normales, je n'obtiens qu'un seul pic pour
chaque sucre. Ce n'est que récemment que j'ai eu ces doubles pics….
R. : Oui, les colonnes amino ne donnent généralement que des pics
uniques pour chaque sucre. La raison en est simplement le pH dans les
pores du garnissage. Le taux de conversion d'une forme anomérique en
l'autre est fonction du pH. A pH alcalin, la conversion est très rapide et on
n'obtient qu'un seul pic raisonnablement net. À pH acide, la conversion est
beaucoup plus lente et on peut obtenir deux pics distincts pour chaque
glucide. C'est la principale raison de l'utilisation de colonnes amino pour
cette séparation. Les groupes amino créent un environnement alcalin dans
les pores, ce qui accélère l'interconversion, et on obtient un pic unique pour
tous les glucides. Si pour une raison quelconque le pH dans les pores de
l'emballage est neutre ou acide, vous obtiendrez des pics larges ou des
pics doubles ou même deux pics très distincts et bien séparés pour chaque
sucre.
Maintenant que nous comprenons qu'il s'agit de la cause la plus probable
de votre problème, nous devons déterminer pourquoi il y a un changement
de pH. Généralement, la raison de ce comportement est le vieillissement
de la phase stationnaire ; au fur et à mesure que la colonne est utilisée,
elle perd une partie de la phase liée basique et forme des silanols plus acides.
Cependant, votre description indique que vous observez le même
comportement sur une nouvelle colonne. Cela parlerait d'un changement
du pH de la phase mobile. Comme la phase mobile ne contient que deux
composants, l'acétonitrile et l'eau, vous pouvez simplement vérifier le pH
de l'eau seule puis du mélange eau/acétonitrile. Espérons que cela
identifiera la source du problème.
L'étape suivante consiste à "régénérer" les colonnes. Puisque très
probablement les colonnes ont été neutralisées par un ingrédient acide
dans la phase mobile, il devrait être possible d'éliminer cet ingrédient par
un lavage de la colonne à un pH alcalin. La meilleure approche consiste
probablement à laver la colonne avec une solution diluée d'un oligomère
d'éthylènediamine, tel que la tétraéthylènepentamine. Ce lavage peut
régénérer la colonne, mais éviter la contamination acide pour commencer
reste la meilleure solution.
34. Contrôle de la méthode
Q. : Je travaille sur une nouvelle procédure HPLC qui sera utilisée dans
notre département QC. J'ai élaboré les détails de la procédure; Je connais
la linéarité, les limites de détection et l'influence du pH de la phase mobile
et de la concentration organique sur la rétention et la sélectivité. Je discute
maintenant avec mes collègues, comment fixer les spécifications de la
méthode : quelle doit être la précision avec laquelle la phase mobile est
constituée, quelles variations du pH de la phase mobile sont tolérables etc.
Pouvez-vous nous aider avec quelques conseils ?
41
A. : Il est bon de savoir que vous avez fait vos devoirs.
Cela aidera considérablement à mettre en place les contrôles nécessaires
sur la composition de la phase mobile et d'autres paramètres. La principale
question à laquelle vous devez répondre est de savoir à quel point de
variation de chaque paramètre la méthode commencera à échouer. Parfois,
cela nécessite un contrôle très strict des paramètres de la méthode, parfois
la spécification de la méthode peut varier considérablement sans effet
négatif sur la qualité des résultats. Malheureusement, il n'est pas possible
de vous donner de bonnes directives générales. Vous devez étudier tous
les paramètres de processus pertinents de votre méthode. Une fois que
vous avez compris l'influence des paramètres de la méthode sur les
objectifs du test, vous pouvez définir les valeurs limites pour chaque
paramètre.
Permettez-moi de vous donner quelques exemplesÿ: un cas complexe
qui nécessite généralement un contrôle assez strict des paramètres de la
méthode est le profil d'impureté d'un composé pharmaceutique. Souvent,
de nombreuses impuretés sont possibles ; ils sont souvent étroitement liés
au médicament parent et certaines paires de pics sont difficiles à séparer.
Dans ces circonstances, un contrôle strict des paramètres de la méthode
est nécessaire. Une situation entièrement différente est donnée pour un
test de dissolution ou une analyse de composition. Dans ces circonstances,
l'intérêt est simplement de quantifier le composé parent, qui doit être séparé
de l'étalon interne. Une telle analyse n'est pas très exigeante et on peut
souvent admettre des variations importantes de la composition de la phase
mobile ou de la température sans affecter les résultats. Dans un tel cas, la
meilleure approche consiste à spécifier les paramètres de contrôle de la
méthode qui sont facilement réalisables par un technicien moyen et à en
rester là.
Cependant, si votre analyse est complexe et nécessite des contrôles
serrés, vous devriez avoir pu démontrer les limites dans les expériences
préliminaires. Quelle variation de pH pouvez-vous tolérer avant que la
résolution entre les pics ne devienne inadéquateÿ? Dans quelle mesure
devez-vous contrôler le contenu organique de la phase mobileÿ? Il existe
certaines règles empiriques qui peuvent vous dire à quelle variation du
temps de rétention on peut s'attendre si un paramètre donné est modifié,
mais la meilleure approche est l'expérience. Étant donné que vous avez
étudié plusieurs des paramètres importants de la méthode et que vous
connaissez leurs effets, vous devriez être en mesure de définir des
spécifications raisonnables. Seules vos expériences peuvent apporter la
réponse à la question des tolérances des directives de méthode.
Pourtant, il semble que vous n'ayez étudié que certains des paramètres
pertinents. Bien que certaines des variables que vous n'avez pas
mentionnées n'aient qu'un effet moindre sur la méthode, il est néanmoins
important de connaître leur influence.
L'influence de la température est souvent faible, mais cela vaut la peine de
le savoir. Un autre effet généralement faible est la concentration du tampon.
Néanmoins, les deux devraient être inclus dans les études de validation de
la méthode.
Un autre paramètre qui est souvent négligé et qui peut causer des
problèmes à l'avenir est la variabilité de la colonne. Je recommande
toujours que les colonnes soient achetées à partir de plusieurs lots de
matériau d'emballage lorsqu'une nouvelle méthode est établie.
De nombreux fabricants offrent un tel service. Bien sûr, cela
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coûte de l'argent, puisqu'il faut acheter quelques colonnes, mais c'est de
l'argent bien dépensé. Une vérification précoce de la variabilité d'un lot à
l'autre d'un emballage peut vous éviter bien des maux de tête plus tard
dans le processus. Si j'étais votre responsable QC, j'exigerais ces données
de votre part avant d'accepter votre méthode.
Une autre chose à incorporer dans une méthode est une procédure de
dépannage. Puisque vous connaissez toutes ou la plupart des variables
affectant la méthode, il est bon de les écrire de manière à permettre à un
futur enquêteur de trouver rapidement un problème. Une telle procédure
devrait également spécifier les critères de remplacement de la colonne par
une nouvelle. Cela peut être une spécification de la sélectivité de la
séparation, ou des critères sur la forme du pic, ou les deux. Les
changements de forme de pic ou de traînée rendent une quantification plus
difficile et sont le plus souvent utilisés comme critères pour la fin de la
durée de vie utile d'une colonne.
35. pH de la phase mobile
Int. : Récemment, nous avons eu des discussions dans mon groupe sur
l'ajustement du pH de la phase mobile. La manière la plus simple et la plus
fiable de le faire semble être dans la phase mobile finale, après l'ajout du
solvant organique. D'autres ont préconisé de mesurer le pH toujours dans
le composant aqueux pur de la phase mobile. En comparant les deux
approches, nous avons trouvé des différences dans le pH final ainsi que
dans la chromatographie. Quelle en est la raison et quelle est la meilleure
façon d'ajuster le pH ?
R.ÿ: C'est une très bonne question, car il y a souvent confusion entre
différents laboratoires utilisant différentes pratiques pour la préparation de
la phase mobile. Permettez-moi d'abord de décrire certains des problèmes
que l'on rencontre. Cela nous conduira ensuite à la meilleure solution.
L'ajustement du pH se fait à l'aide d'une solution tampon. La capacité
d'un tampon à maintenir et à contrôler le pH est appelée capacité tampon.
La capacité tampon est fonction de la différence entre le pH et le pKa du
tampon et de la concentration du tampon. Par exemple, l'acide acétique a
un pKa de 4,75 (dans l'eau), donc les tampons acétate ont la meilleure
capacité tampon à ce pH. Les concentrations de tampon typiques utilisées
en HPLC varient de 20 à 50 mM, par conséquent, de bonnes capacités
tampons sont obtenues à +/- 1 unité de pH autour du pKa d'un tampon.
Pour obtenir des capacités tampons raisonnables, le pH du tampon ne doit
jamais s'écarter de plus de 1,5 unités de pH du pKa du tampon.
Si un solvant organique est ajouté au tampon, le pH mesuré passe à
des valeurs plus élevées. Cela est dû à deux effets distincts.
L'un est un véritable déplacement du pH dû au déplacement de la
concentration de l'ion hydrogène en présence du solvant organique. Le
deuxième effet est lié à la mesure du pH elle-mêmeÿ: étant donné que le
pH-mètre a été calibré et ajusté pour donner des résultats précis dans
l'eau, il présentera un écart par rapport à la valeur réelle si la mesure est
effectuée en présence d'une grande concentration d'un solvant organique.
Cependant, les deux effets ne sont pas pertinents pour la réalité
42
composition du tampon et son pouvoir tamponÿ: une solution tampon
préparée à partir d'un rapport donné de la forme acide et de la forme
basique des composants du tampon aura toujours le même rapport des
deux en présence d'un solvant organique et donc le même pouvoir tampon
comme dans l'eau pure.
Par conséquent, si nous mesurons la composition du tampon et son pH
dans l'eau, nous disposons d'un point de référence constant fixe et d'outils
incontestables pour mesurer la valeur du pH. Par exemple, le tampon
acétate a sa capacité tampon maximale à pH 4,75 dans l'eau. Un tampon
acétate dont le pH est ajusté à cette valeur dans l'eau sera à sa capacité
tampon maximale indépendamment de la valeur de pH lue par le pH-mètre
en présence d'un solvant organique. Pour tous les tampons couramment
utilisés, je peux rechercher les valeurs de pKa dans l'eau dans un tableau.
Ensuite, je peux faire l'ajustement du pH du tampon dans l'eau, en utilisant
le pKa comme point de référence. Puis, comme dernière étape, j'ajoute le
solvant organique.
Cependant, il existe parfois des exceptions inévitables à cette règle. Si
vous utilisez une procédure plus ancienne développée à l'aide d'une
colonne plus ancienne, elle peut spécifier une amine à longue chaîne
comme composant du tampon. Parfois, la solubilité de l'amine dans l'eau
pure est limitée et la manière la plus simple de préparer la solution tampon
consiste à ajouter le solvant organique avant l'ajustement du pH. Il n'y a
rien de mal à cette procédure, tant que vous connaissez la courbe de
titrage et la capacité tampon de votre tampon en présence du solvant
organique. La meilleure façon d'obtenir cette information est d'obtenir une
courbe de titrage en présence de la concentration visée du solvant
organique et de construire la courbe de capacité tampon à partir de cette
courbe de titrage. Une courbe de titrage est un tracé du pH de la solution
en fonction de la quantité de base ajoutée à la solution. La courbe de
capacité tampon est un tracé de la variation (négative) du pH par quantité
de base ajoutée par rapport au pH. Cette courbe présente un maximum au
pKa du tampon en présence du solvant organique.
Étant donné que la capacité du tampon est à son maximum au pKa du
tampon, vous pouvez ensuite utiliser ces informations pour préparer un
tampon pour votre dosage avec une capacité optimale.
La pratique préférée dans l'industrie consiste à préparer le tampon dans
de l'eau puis à mélanger le tampon à pH ajusté avec le solvant organique.
Cela donne des résultats sans équivoque et permet un bon jugement
universel sur la capacité du tampon. Il convient de noter que cela peut être
indiqué clairement dans l'énoncé de la composition de la phase mobile.
Pour éviter toute confusion, la composition doit être indiquée comme le
composant aqueux comprenant le tampon et son pH mélangé avec le
solvant organique. Voici un exemple : « Tampon KH2PO4/K2HPO4 50
mM , pH 7,0 / méthanol 40/60 » ou « Tampon KH2PO4/K2HPO4 50 mM ,
pH 7,0 et méthanol 60 %.
L'énoncé inverse est quelque peu ambigu : « tampon méthanol / KH2PO4/
K2HPO4 , pH 7,0, 60/40 » et ne doit pas être utilisé.
Q.ÿ: Votre proposition est différente de ce que j'avais initialement en tête,
mais elle a du sens.
Qu'est-ce qu'un changement typique de pH avec la composition du solvantÿ?
Machine Translated by Google
R.ÿ: Il est suffisamment pertinent pour provoquer des changements
de rétention mesurables si le tampon est préparé avant ou après
l'ajout du solvant organique. Dans la littérature (1), des déplacements
vers le haut du pKa des acides d'environ 1 unité ont été rapportés
entre 100% eau et 50% eau/méthanol. Pour les bases rapportées, le
pKa s'est déplacé d'environ 0,5 unité entre 100 % d'eau et 50 %
d'eau méthanol. Si les analytes ne sont pas complètement ionisés
ou non ionisés, cette différence provoque des décalages substantiels
dans leurs temps d'élution. Même des changements dans l'ordre
d'élution sont possibles. Par conséquent, d'un point de vue pratique,
la pratique actuelle consistant à normaliser la manière dont le pH de
la phase mobile est spécifié est extrêmement importante. Je suis
heureux d'avoir réussi à vous convaincre de suivre la même pratique
et de mesurer et spécifier le pH dans le composant aqueux de votre
phase mobile.
Référence :
1. E. Bosch, P. Bou, H. Alleman, M. Rosés, Anal. Chim. 68 (1996),
3651
36. Améliorations du rapport signal sur bruit
Q. : J'aimerais améliorer la sensibilité de ma méthode HPLC.
Pourriez-vous s'il vous plaît me donner des conseils sur ce que je
peux faire?
A. : Avec plaisir ! L'histoire comporte de nombreux éléments
différents (1). Voyons d'abord ce que nous pouvons faire pour réduire
le bruit du détecteur. Tout d'abord, nous devons savoir que le
détecteur est en bon état de fonctionnement. Cela signifie, par
exemple, que la lampe fonctionne à pleine capacité et que la fenêtre
de la cellule du détecteur est propre. Les performances du détecteur
sont mieux vérifiées à l'aide d'un ensemble de conditions de test standard. votre échantillon est dissous dans un solvant organique et que votre
Q. : Je sais que le détecteur est en bon état de fonctionnement.
Nous surveillons régulièrement la linéarité du détecteur, son bruit et
sa réponse afin de vérifier qu'il fonctionne pour une analyse de
routine. Ma question porte davantage sur ce que l'on peut faire avec
un détecteur entièrement fonctionnel plutôt que sur le dépannage du
détecteur.
A. : OK La première chose à faire est probablement d'examiner la
réponse du détecteur et le bruit du détecteur en fonction de la
longueur d'onde. Sélectionnez ensuite la longueur d'onde qui donne
le meilleur rapport signal/bruit. Cela varie selon le détecteur, la phase
mobile et l'échantillon que vous essayez d'analyser.
En principe, le bruit d'un détecteur à longueur d'onde variable est
inversement proportionnel à la quantité de lumière reçue par la
photodiode. C'est la raison pour laquelle le bruit du détecteur
augmente à mesure que la source lumineuse vieillit ou que la fenêtre
du détecteur devient sale. C'est aussi la raison de l'augmentation du
bruit, car la phase mobile devient plus adsorbante. Par exemple, les
alcools ont une absorbance importante à 210 nm, tandis que
l'absorbance de l'acétonitrile est très faible. C'est la raison de la
réduction du bruit et par conséquent de la sensibilité accrue de l'acétonitrilelongueur
43
UV faibles. Autour de 250 nm, l'acétonitrile et le méthanol fonctionnent
aussi bien.
Si vous avez besoin d'utiliser une phase mobile qui a un fond aux
longueurs d'onde où votre échantillon a une bonne réponse, le bruit
et la réponse doivent être mesurés en fonction de la longueur d'onde.
Avec ces données, vous pouvez ensuite calculer quelle longueur
d'onde est la mieux adaptée pour atteindre le rapport signal/bruit
maximal. Si vous avez un détecteur à barrette de photodiodes, cet
exercice est très simple et rapide. Vous obtenez simplement un
spectre au maximum du pic et le comparez au spectre de fond de la
phase mobile. Ensuite, vous choisissez la longueur d'onde qui vous
donne le meilleur rapport signal sur bruit. Vous avez maintenant
sélectionné la meilleure longueur d'onde pour une composition de
phase mobile donnée. Si cela ne vous donne toujours pas de
résultats satisfaisants, vous avez du pain sur la planche.
La chose la plus simple à faire ensuite est d'examiner une
augmentation de la constante de temps du détecteur, ou les
mécanismes équivalents de réduction du bruit intégrés dans les
détecteurs modernes. Si vous augmentez la constante de temps ou
son équivalent, les pics deviendront plus larges et le bruit sera réduit.
Si votre chromatogramme est assez vide, cette approche peut
améliorer considérablement le rapport signal/bruit. Cependant, s'il y
a de nombreux pics dans le chromatogramme et que la résolution
entre certains d'entre eux est faible, cette approche a ses limites.
Une autre chose relativement simple à considérer est la quantité
d'échantillon que vous injectez. Si vous constatez des perturbations
dans la séparation bien avant de manquer d'échantillon, vous devez
penser au solvant dans lequel l'échantillon est dissous (2).
Souvent, l'échantillon peut être dissous dans une composition de
solvant qui a une force d'élution beaucoup plus faible que la phase
mobile (3), et vous pouvez injecter de très grands volumes
d'échantillon avant de voir des distorsions de la forme du pic. Si
analyse est effectuée par chromatographie en phase inverse (c'est-à-
dire que la phase mobile est un mélange d'eau et de méthanol ou
d'acétonitrile), vous ne pourrez injecter qu'un petit volume avant que
les pics ne se déforment . D'autre part, si vous préparez l'échantillon
dans une composition de solvant qui contient 20 % d'eau en plus
que la phase mobile, vous pouvez injecter un millilitre d'échantillon
sans distorsion appréciable du pic. L'échantillon s'enrichit simplement
en tête de colonne au début de la chromatographie.
Q. : C'est une astuce qui vaut la peine d'être rappelée. Quelles
autres choses faut-il considérer?
R.ÿ: Une autre approche consiste à réduire le volume de la colonne.
Cependant, plusieurs éléments doivent être pris en compte avant de
mettre en œuvre cette option. Tout d'abord, vous devez déterminer
si la quantité d'échantillon dont vous disposez est effectivement
limitée et qu'une injection de la quantité totale d'échantillon sur la
colonne standard ne révèle aucune autre limitation.
L'approche la plus simple pour réduire le volume de la colonne
consiste à réduire le diamètre de la colonne, en maintenant la
dans le de la colonne et la taille des particules constantes. Par
exemple, une réduction du diamètre de la colonne de 4,6 mm à 2,0 mm
Machine Translated by Google

augmente la sensibilité massique d'environ un facteur 5. Comme avantage
secondaire, il réduit le débit et donc la consommation de solvant d'environ
le même facteur. En contrepartie, les effets de l'étalement des bandes
d'instruments deviennent plus significatifs. L'étalement des bandes de
l'instrument est susceptible de réduire la résolution du chromatogramme,
mais vous pouvez en traiter au moins une partie.
2. UD Neue, "Colonnes HPLC, théorie, technologie et pratique", Wiley-
VCH (1997)
3. UD Neue, E. Serowik, "La dilution d'échantillon augmente la sensibilité
et la résolution", Waters Column VI, 2 (1996), pages 8-11

Il y a deux composants à l'étalement des bandes d'instruments.

37. Surcharge
Le premier est le bandspreading pré-colonne, causé par le volume
d'injection, le bandspreading dans l'injecteur et dans la tubulure menant à
Q.ÿ: Lorsque j'augmente la quantité d'échantillon que j'injecte, les pics
la colonne. Vous pouvez réduire son influence en utilisant l'astuce décrite
commencent à s'allonger et à s'élargir. Je travaille avec des concentrations
ci-dessus : dissoudre l'échantillon dans un solvant avec une force d'élution
assez faibles et, par conséquent, je ne m'attendrais pas à ce que la colonne
inférieure à la phase mobile ou diluer l'échantillon avec un tel solvant et
soit surchargée. J'apprécierais si vous pouviez discuter des phénomènes
injecter plus. Le deuxième élément est plus gênant. Il s'agit de l'étalement
qui pourraient causer un tel événement.
de bande post-colonne, causé par le tube menant de la colonne au
détecteur et par la cellule de détection elle-même. La longueur du tube
R.ÿ: La surcharge de masse de la colonne n'est qu'un des phénomènes
menant de la colonne au détecteur doit être maintenue à un minimum
qui peuvent provoquer une distorsion du pic lors de l'augmentation de la
absolu. Étant donné que vous pouvez traiter l'influence du volume de la
taille d'injection. Il est également possible que la phase mobile soit
tubulure de la pré-colonne par d'autres moyens, il est préférable de
surchargée. Quelque chose comme cela peut se produire si l'échantillon
maintenir la tubulure de la post-colonne à un minimum absolu. La question
n'est pas dissous dans la phase mobile. Cependant, permettez-moi de
du volume de la cellule du détecteur est plus délicate. D'une part, vous
discuter d'abord de la surcharge de masse de la colonne.
souhaitez minimiser le volume pour réduire la propagation de la bande.
La surcharge de masse de la colonne peut être diagnostiquée très
D'autre part, une réduction du volume de la cellule du détecteur augmente
rapidement. Pour les analytes courants, la surcharge de masse commence
le bruit du détecteur. Dans le pire des cas, l'ensemble de l'exercice de
réduction du volume de la colonne et du volume du détecteur peut à une injection d'environ 0,1 mg à 1 mg d'échantillon par millilitre de volume
de colonne. Si vous utilisez un détecteur UV, vous pouvez utiliser une autre
n'entraîner qu'une amélioration marginale de la sensibilité.
règle. Pour la plupart des analytes possédant un fort chromophore UV, la
surcharge de masse commence si la hauteur du pic atteint environ 0,1
AUFS. Bien sûr, ces règles sont des règles approximatives, mais si vous
injectez beaucoup moins d'échantillon, la surcharge de masse ne sera
Q. : Je suppose que cela doit être mûrement réfléchi. Sinon, comment puis-
probablement pas le problème.
je améliorer le rapport signal/bruit de mon testÿ?

Q. : En effet, la quantité d'échantillon injecté est beaucoup plus faible.

A. : Une autre chose relativement simple pourrait être de changer le
Par conséquent, je ne pense pas que la surcharge de masse soit la cause
détecteur. Peut-être qu'un détecteur à fluorescence ou un détecteur
électrochimique est un meilleur choix que le détecteur UV standard. Bien de la distorsion maximale. Quoi d'autre peut être le problème?

sûr, l'achat d'un nouveau détecteur représente une dépense importante.

R. : Un problème courant est le solvant dans lequel l'échantillon est
dissous. Si le diluant de l'échantillon est un éluant plus fort que la phase
Il y a quelques changements plus drastiques à votre test qui peuvent
mobile, une distorsion maximale peut se produire. Il peut y avoir plusieurs
améliorer le rapport signal sur bruit. Souvent, le bruit est causé par des
raisons à cela. Il se peut que l'échantillon provienne d'une procédure
composants de la phase mobile. Plus tôt, j'avais mentionné l'absorption
d'extraction en phase solide nécessitant un solvant plus puissant que la
réduite de l'acétonitrile par rapport au méthanol dans les faibles UV. Un tel
phase mobile pour l'élution de l'échantillon.
changement nécessite le réaménagement de la séparation. Une autre
Dans ces circonstances, une simple dilution de l'échantillon dans l'éluant
cause fréquente de bruit excessif du détecteur sont les additifs dans la
le plus faible peut éviter le problème. Alternativement, l'échantillon peut
phase mobile, par exemple les amines utilisées pour supprimer la traînée
être évaporé à sec puis reconstitué en phase mobile ou avec un éluant
des pics. Vous pouvez éliminer le besoin de tels additifs de phase mobile
plus faible. Un problème similaire est causé par les échantillons générés à
en utilisant une meilleure colonne. Dans le même ordre d'idées, si la faible
partir des tests de dissolution. L'acide dans l'échantillon peut surcharger le
sensibilité est causée par une traînée de pic, une réduction de la traînée
tampon de votre phase mobile et provoquer une distorsion de crête. Cela
en utilisant une meilleure colonne peut augmenter la sensibilité d'un facteur
peut être corrigé en ajustant le pH de l'échantillon ou en utilisant un tampon
d'environ trois. Toutes ces suggestions représentent une quantité de travail
plus fort dans la phase mobile. Pour préparer un tampon plus fort,
importante et les améliorations que vous obtenez sont relativement faibles.
augmentez sa concentration et ajustez le pH à une valeur proche du pKa
Il est préférable de faire ces choix au début du développement d'un
du tampon. Cela nécessite un peu de devoirs, mais est relativement simple.
nouveau dosage.
Dans la plupart des tests de dissolution, le nombre d'analytes dans un
échantillon est très faible, souvent juste le composé d'intérêt plus l'étalon
Références : interne.

1. JB Li, "Optimisation du signal sur bruit dans la détection UV HPLC", LC-

GC 10 (1992), 11, pages 856-864

44
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Si le pH de l'échantillon est la cause de la distorsion du pic, une simple
augmentation de la concentration du tampon est souvent la solution, même si le
chromatogramme est assez encombré.
En règle générale, les changements de rétention sont très faibles même pour des
changements significatifs de la concentration du tampon. Bien sûr, vous devez
vérifier à quelle concentration le tampon commence à précipiter.
Une autre raison des problèmes de distorsion de crête peut être la faible
solubilité de l'échantillon dans la phase mobile. Les effets sont similaires au cas
où l'échantillon est dissous dans un solvant différent. Après tout, l'échantillon a
été dissous dans un solvant différent de la phase mobile pour contourner le
problème de faible solubilité. Heureusement, les cas où c'est le vrai problème
sont très rares. Dans un tel cas, la meilleure approche peut être de vivre avec le
problème, ce qui signifie que la plage de concentration sur laquelle la concentration
de l'échantillon peut être déterminée est plutôt étroite. Alternativement, le choix
d'un mode chromatographique complètement différent peut offrir une solution.
Q. : Aucun de ces problèmes ne semble s'appliquer. Ce qui reste?
R. : L'un des éléments dont nous n'avons pas encore parlé est une simple
surcharge de volume d'échantillon. Si l'échantillon est dissous dans la phase
mobile et qu'un volume important est injecté, les pics deviennent plus larges. Ce
phénomène a plus d'effet sur les pics d'élution précoces et devient moins
problématique pour les pics d'élution tardifs. On peut utiliser cela comme critère
pour distinguer ce problème des autres éléments dont nous avons discuté. La
solution est assez simple : dissoudre l'échantillon dans un solvant d'élution plus
faible que la phase mobile. Vous pouvez vérifier très rapidement si tel est le
problème. Diluer votre échantillon 2x avec l'éluant le plus faible de votre phase
mobile, puis injecter 2 fois le volume d'échantillon. Cela concentrera l'échantillon
au sommet de la colonne et la quantité totale d'échantillon restera la même. Si le
pic de distorsion disparaît, une simple surcharge de volume est le problème.
Dissolvez simplement votre échantillon à l'avenir dans une composition de solvant
qui a une force d'élution plus faible, et le problème disparaîtra. Réfléchir
soigneusement à l'impact potentiel du solvant de l'échantillon sur les résultats
analytiques peut résoudre de nombreux problèmes.
38. Durabilité de la colonne
Q.ÿ: Que puis-je faire pour prolonger la durée de vie d'une colonne HPLCÿ?
R. : Plusieurs options s'offrent à vous pour augmenter la durée de vie de la
colonne. Une durée de vie acceptable de la colonne est d'environ 1 000 injections.
Cependant, j'ai vu des colonnes durer plus de 10 000 injections sans aucune
détérioration des performances. La seule exigence était un soin raisonnable de la
colonne.
Q. : 10 000 injections ? Je n'ai jamais réalisé autant d'injections sur une colonne.
Je trouve cela difficile à croire.
45
R.ÿ: Aujourd'hui, les colonnes préparées par les principaux fabricants sont très
robustes. En général, la détérioration des performances de la colonne est due à
la contamination de la colonne. Si cela est évité, de bonnes durées de vie de
colonne en résulteront. Mes collègues et moi avons étudié en détail les problèmes
de durée de vie des colonnes. Permettez-moi d'expliquer certaines de nos
expériences, puis nous pourrons discuter d'autres problèmes qui affectent la
durée de vie de la colonne.
Nous avons examiné la durée de vie des colonnes en exécutant les colonnes
pratiquement en continu à l'aide d'un seul dosage isocratique. Les colonnes
étaient des colonnes Symmetry C18 de Waters Corporation. L'échantillon était un
mélange d'étalons pharmaceutiques et la phase mobile contenait 79 % d'eau, 20
% de méthanol et 1 % d'acide acétique. Nous avons réalisé deux séries
d'expériences. Dans l'un d'eux, l'échantillon était injecté directement sur la
colonne. Dans le deuxième ensemble, les colonnes étaient protégées par une
colonne de garde.
Les expériences qui ont été réalisées sans l'utilisation d'une colonne de garde
ont entraîné une détérioration irréversible des performances de la colonne quelque
part autour de 1 500 à 2 000 injections. Alors que les temps de rétention sont
restés constants, le nombre de plateaux a chuté peu avant la fin de la vie de la
colonne, la contre-pression a augmenté et, finalement, des doubles pics ont été
observés. Même avec un échantillon propre, la durée de vie de la colonne sans
protection de la colonne semble être limitée.
Nous avons ensuite répété les mêmes expériences avec une colonne de garde
en place. Nous avons utilisé des colonnes de garde hautes performances
préparées à partir du même matériau de garnissage que les colonnes analytiques.
Dans ces circonstances, les colonnes de garde ne modifient pas la séparation et
fonctionnent comme une simple extension de la colonne analytique. Ainsi la
séparation analytique n'est pas affectée.
Nous avons rapidement constaté que la combinaison de la colonne analytique
et de la colonne de garde présentait une détérioration de la séparation après
environ 800 injections au plus tôt. Lorsque nous avons remplacé la colonne de
garde, la séparation a retrouvé les mêmes performances que celles que nous
avions observées initialement. Pour éviter une détérioration des performances de
la colonne, nous avons décidé de remplacer régulièrement la colonne de garde à
un nombre prédéterminé d'injections inférieur au taux de défaillance observé.
Lorsque nous avons fait cela, nous n'avons constaté aucune détérioration de la
séparation jusqu'à plus de 10 000 injections. Puis nous avons arrêté l'expérience.
La colonne était encore en excellent état. Ni un changement appréciable dans la
rétention ni un changement substantiel dans le nombre de plaques n'ont été
observés. Nous n'avons pas non plus trouvé de différence de performances
lorsque nous avons effectué le même test en utilisant des colonnes garnies de
différentes tailles de particules : les garnissages de 3,5 µm ont donné les mêmes
résultats que les garnissages de 5 µm dans ces expériences.
Cet ensemble d'expériences démontre clairement que la durabilité des
colonnes bien garnies est tout à fait excellente. Les limitations de la durée de vie
de la colonne que nous connaissons tous ne sont pas dues à la colonne, mais
sont causées par d'autres facteurs. Certains de ces facteurs sont des matières
étrangères provenant de l'échantillon, de l'injecteur, des joints de la pompe, etc.,
qui s'accumulent normalement au sommet de la colonne et provoquent une
détérioration irréversible de
Machine Translated by Google

les performances de la colonne. Beaucoup de gens croient que les filtres garniture, la durée de vie de la colonne peut se détériorer rapidement même
empêcheront cette détérioration mécanique des colonnes. lorsqu'une précolonne est utilisée. Du point de vue de la stabilité de la colonne, les
Nous avons utilisé les filtres standard dans notre système HPLC, et ils n'ont tout meilleures procédures utilisent un pH intermédiaire. De plus, le choix des ions
simplement pas empêché la détérioration de la colonne. Seul le sacrifice des tampons joue un rôle important dans la dégradation de la colonne (1). Les tampons
colonnes de garde a préservé les performances de la colonne analytique. La raison phosphate couramment utilisés ne sont pas les meilleurs choix. Des résultats
en est simplement que ce qui cause la détérioration de la colonne analytique sera significativement meilleurs ont été obtenus avec des tampons à base organique
retenu sur la colonne de garde, indépendamment de la nature de la cause. tels que TRIS ou des tampons citrate à pH 7-8. De plus, la concentration de
tampon joue un rôle : une concentration de tampon plus faible améliore la durée
de vie de la colonne.
Nous avons également effectué des expériences similaires avec des échantillons Cela doit être mis en balance avec la robustesse de l'analyse, qui est améliorée à
de sérum dopés. Dans ce cas, nous avons fait une simple précipitation des des concentrations de tampon plus élevées.
protéines pour le nettoyage de l'échantillon. Comme dans l'expérience décrite ci- Par conséquent, même dans des conditions plus stressantes, de bonnes durées
dessus, un remplacement régulier de la colonne de garde a préservé la colonne de vie des colonnes peuvent être atteintes.
analytique. Dans ce cas, la colonne de garde devait être remplacée plus
fréquemment en raison de la nature de la matrice de l'échantillon et de la simplicité Référence : 1.
de la procédure de préparation de l'échantillon. HA Claessens, MA van Straten et JJ Kirkland, J.
Malheureusement, il n'est pas possible de donner des conseils généraux quant Chromatogr. A, 728 (1996), 259
au moment où une colonne de garde doit être remplacée. Cela dépend largement
de l'échantillon et de la procédure de nettoyage de l'échantillon qui est utilisée.
Pour les échantillons contenant une faible quantité d'impuretés étrangères, une
colonne de garde peut être un substitut raisonnable à une procédure de préparation
39. Analyse rapide et contre-pression de colonne
et de nettoyage des échantillons. A l'inverse, les procédures de préparation
Q.ÿ: J'essaie actuellement une nouvelle colonne. C'est un nouveau garnissage de
d'échantillons de plasma ou de lait laissent encore suffisamment de matière
3 µm. Il est censé donner une résolution plus élevée et donc une analyse plus
endogène pour que l'utilisation d'une colonne de garde soit absolument nécessaire.
rapide que les garnissages de 5 µm. Cependant, je ne vois pas comment cela peut
Cependant, vous pourrez peut-être réduire la complexité de la procédure de
être plus rapide, car la contre-pression est plus élevée sur le garnissage de 3 µm,
préparation des échantillons en sachant que la colonne est protégée par une
et je ne peux en fait pas le faire fonctionner aux mêmes débits élevés que ceux
colonne de garde. Si la durée de vie de la colonne de garde est inférieure à 100
que j'utilisais pour faire fonctionner ma colonne de 5 µm. N'est-il pas faux de penser
injections, j'envisagerais d'incorporer une procédure de nettoyage des échantillons
que des colonnes de plus petite taille de particules sont plus rapidesÿ?
ou de réviser le processus de préparation des échantillons. Si la colonne de garde
protège votre colonne analytique pour 100 injections ou plus, le coût est inférieur à
50 cents par analyse. A long terme, il est moins cher de remplacer la colonne de
A. : Hmm… C'est plus compliqué. Tout dépend de la façon dont la comparaison
garde que de continuer à acheter de nouvelles colonnes analytiques.
est faite. Nous devons en discuter étape par étape pour voir dans quelles
circonstances chaque avantage peut être le mieux atteint. Beaucoup de cela peut
sembler assez contre-intuitif, et nous devons examiner les détails de plus près.
Toute la discussion précédente suppose que la colonne est utilisée pour un
seul dosage ou dans une seule procédure. Dans ces circonstances, la contamination
Commençons par le cas le plus simple : même longueur de colonne remplie de
de la colonne est assez prévisible. Si un laboratoire utilise de nombreuses
différentes tailles de particules. Je crois que c'est la comparaison à laquelle vous
procédures HPLC différentes, je recommande toujours de dédier une seule
faites référence de toute façon.
colonne, y compris la colonne de garde, à chaque procédure. Cela élimine la
contamination croisée de la colonne d'un test à l'autre et rend la durée de vie de la
Q. : Oui, en effet. Même longueur de colonne et même diamètre de colonne, et
colonne prévisible et contrôlable. Si votre laboratoire ne dispose d'aucun test
différentes tailles de particules.
standard, il s'agit d'un point muet.

R. : Dans ces circonstances, vous obtiendrez un nombre de plaques plus élevé,

Même dans ces circonstances, je garderais la colonne de garde et la colonne
c'est-à-dire une meilleure résolution, pour le garnissage de 3 µm dans la plupart
analytique ensemble jusqu'à ce qu'une détérioration des performances nécessite
des situations. Cependant, vous obtiendrez également une contre-pression plus élevée.
un remplacement de la colonne de garde.
Si vous avez conduit votre temps d'analyse le plus rapidement possible avec une
colonne de 5 µm, et si la limitation était la contre-pression de la colonne, cela n'a
aucun sens d'utiliser une colonne de 3 µm de la même longueur. La contre-pression
Q. : C'est un bon conseil, mais je suis sûr que la colonne analytique ne dure pas
plus élevée de la colonne de 3 µm ralentira l'analyse.
éternellement même si elle est protégée par une colonne de garde.

R. : C'est effectivement exact. Il existe d'autres éléments qui limitent la durée de Ce que vous devez vraiment faire pour obtenir l'avantage de vitesse de la plus
petite taille de particule, c'est d'utiliser une colonne plus courte avec le garnissage
vie de la colonne, même lorsqu'une précolonne est utilisée. Les garnissages en
de 3 µm. La meilleure chose à faire est de réduire la taille des particules et la
phase inverse sont très stables entre pH 2 et 8 à température ambiante. Cependant,
longueur de la colonne dans la même proportion. Si vous
si vous augmentez la température, en particulier lorsque vous travaillez près des
limites de pH du

46
Machine Translated by Google
avez utilisé une colonne de 5 cm de long avec un garnissage de 5 µm, vous
souhaitez utiliser une colonne de 3 cm de long avec un garnissage de 3 µm.
Si vous utilisez maintenant le même débit sur les deux colonnes, la contre-
pression sur la colonne de 3 µm sera toujours plus élevée, mais aussi, puisque
vous utilisez une colonne plus courte, le temps d'exécution sera plus court. De
plus, si vous réduisez le débit proportionnellement à la réduction de la longueur
de la colonne, votre contre-pression sur la colonne 5 cm 5 µm et sur la colonne
3 cm 3 µm sera à peu près la même. Si vous faites cela, votre temps d'analyse
sera également à peu près le même.
Q. : C'est un peu compliqué. Laissez-moi répéter ! J'ai commencé avec une
colonne de 5 cm remplie de particules de 5 µm à un débit de 1 mL/min. Ce que
vous recommandez est d'utiliser une colonne de 3 cm remplie de particules de
3 µm à un débit de 3/5 du débit précédent, c'est-à-dire à un débit de 0,6 mL/min.
Ensuite, le temps d'analyse et la contre-pression de la colonne de 3 µm et de la
colonne de 5 µm sont les mêmes. Alors pourquoi envisagerais-je d'utiliser la
colonne de 3 µm, s'il n'y a aucun avantage ?
A. : Ce que vous n'avez pas encore pris en compte, c'est le fait que dans ces
conditions la colonne 3 µm vous donnera une meilleure performance que la
colonne 5 µm. Ainsi, si la vitesse de votre séparation était limitée par la contre-
pression de la colonne, vous aurez toujours une séparation supérieure sur la
colonne 3 µm dans des conditions qui donnent une contre-pression et un temps
d'analyse équivalents.
Supposons pour le moment que vous puissiez tolérer une contre-pression un
peu plus élevée et que vous puissiez fonctionner à 1 mL/min sur la colonne de
3 µm. Ensuite, si la vitesse de votre séparation est limitée par la résolution d'une
paire de pics, la colonne de 3 µm vous permettra d'effectuer la séparation plus
rapidement qu'avec la colonne de 5 µm. Le temps d'exécution plus court vous
permet d'augmenter le débit. C'est le principal avantage de la taille plus petite
des particules. Dans le monde d'aujourd'hui, où il y a beaucoup de pression sur
tout le monde pour augmenter la production d'un laboratoire, un gain de temps
d'analyse d'environ 50 % est une grande amélioration. Pour cette raison, de plus
en plus de personnes utilisent des colonnes remplies de particules plus petites.
S'il y a beaucoup de résolution dans votre chromatogramme, la première
chose à faire est d'explorer la vitesse à laquelle vous pouvez aller avec votre
colonne de 5 µm, ou mieux encore, la longueur d'une colonne de 5 µm que vous
pouvez utiliser pour effectuer l'analyse. Dans de nombreuses applications QC
simples, la longueur de la colonne est beaucoup plus grande que nécessaire
pour le dosage. Souvent, tout ce qui est nécessaire est une séparation adéquate
de l'analyte de l'étalon interne, et il y a un écart énorme entre ces pics. Dans ces
circonstances, vous devez simplement explorer une colonne plus courte de 5
µm à des débits plus élevés.
Par exemple, un test d'uniformité du contenu est exécuté à 1 mL/min sur une
colonne de 15 cm 5 µm, et la contre-pression est d'environ 1000 PSI. Le test
dure environ 12 minutes. Il y a deux pics dans le dosage, le composé d'intérêt
et l'étalon interne, et ils sont bien séparés l'un de l'autre. La première chose à
faire est de diminuer la longueur de la colonne, peut-être à environ 5 cm. En
utilisant le même débit que sur le
47
longue colonne, votre temps d'exécution est réduit à environ 4 minutes, et les
pics sont toujours bien séparés. Mais votre contre-pression n'est plus que
d'environ 350 PSI maintenant. Vous pouvez en profiter en augmentant le débit.
3 ml/min vous donneront à peu près la même contre-pression que celle que
vous aviez sur la colonne de 15 cm, mais maintenant votre temps d'exécution
est inférieur à 1,5 minute. Vos pics ne seront pas aussi bien séparés qu'ils
l'étaient lors du test initial, mais vous êtes toujours en mesure de les résoudre
proprement dans ces conditions rapides.
Suivant cette logique, le temps nécessaire à de nombreux tests simples peut
être considérablement réduit.
x2 _
un. 5 µm 0,7 mL/min
10.00 20.00 30.00
x2 _
b. 3,5 µm 1,4 mL/min
10.00 20.00
minutes
Figure 1 : Séparation des produits de dégradation du chlordiazépoxyde à l'aide
d'un Symmetry® C18 de 150 mm x 3,9 mm 5 µm
colonne (a) ou une colonne Symmetry® C18 de 100 mm x 4,6 mm 3,5 µm
colonne. Le nombre de plaques du pic 2 est pratiquement identique pour les
deux chromatogrammes.
Bien sûr, de nombreux exemples d'application ne tolèrent pas une réduction
aussi radicale du temps d'exécution. Dans de nombreux cas, il existe plusieurs
paires de pics dans le chromatogramme qui ne tolèrent pas un changement
significatif du nombre de plaques. Dans de telles circonstances, un passage à
une colonne plus courte garnie d'une taille de particules plus petite entraîne
principalement une amélioration de la résolution entre les paires de pics. La
mise à l'échelle de la colonne et du débit selon les règles mentionnées ci-dessus
peut vous permettre d'obtenir une résolution égale mais un temps d'exécution
réduit. Un exemple d'un tel cas est illustré à la figure 1. Une colonne de 150 mm
x 3,9 mm garnie de particules de 5 µm est comparée à une colonne de 100 mm
4,6 mm garnie de particules de 3,5 µm pour l'analyse des produits de dégradation
du chlordiazépoxyde. La colonne plus courte de 3,5 µm a fonctionné à un débit
plus élevé, permettant une réduction du temps d'analyse d'un facteur 2 à
résolution égale des paires de pics critiques. Une considération importante dans
cette comparaison est le fait que les deux colonnes ont le même
Machine Translated by Google

volume de la colonne, ce qui rend les effets extra-colonne et la sensibilité
indépendants du choix de la colonne.
Ceci est un exemple de la mise à l'échelle d'une séparation au même
pouvoir de résolution. Dans un tel cas, la colonne la plus courte avec la
plus petite particule entraîne un temps d'exécution plus court. La contre-
pression sera plus élevée, mais tant qu'elle est inférieure aux limites de
l'instrument, ce n'est pas un problème. Dans de nombreuses analyses
typiques, la limitation de pression de l'instrumentation est encore loin des
conditions de fonctionnement réelles d'un essai.
Comme vous pouvez le constater, la meilleure solution pour une
analyse plus rapide dépend du dosage. S'il existe une grande séparation
entre les différents pics et que le chromatogramme ne contient que
quelques pics, le moyen le plus simple de réduire le temps d'exécution
consiste à utiliser une colonne plus courte avec la même taille de
particules. Si vous avez un chromatogramme compliqué, le meilleur choix
est de réduire la longueur de la colonne et la taille des particules en même
temps. Si vous réduisez uniquement la taille des particules sans modifier
la longueur de la colonne, vous obtiendrez un plus grand nombre de
plaques à une contre-pression plus élevée, mais vous passerez à côté
des avantages réels des particules plus petites : un temps d'analyse plus court à résolution égale.
pendant ou simplement en rétrobalayant la fritte. Vous pouvez le faire en
utilisant le baril vide d'une ancienne colonne. C'est une procédure assez
rapide.
Cependant, le remplacement de la fritte ne fonctionnera que si la fritte
est le problème. D'après mon expérience, c'est rarement le cas. La plupart
du temps, quelque chose s'est accumulé en tête de colonne. Le simple
fait que l'accumulation se produise indique que le matériau est fortement
adsorbé en tête de colonne, dans une bande relativement étroite. S'il y a
une augmentation simultanée de la contre-pression, cela indique que le
contaminant a un poids moléculaire raisonnablement élevé ou une faible
solubilité et obstrue les canaux entre les particules. Au fur et à mesure
que la contre-pression augmente, cela signifie qu'une force importante est
appliquée aux premières couches de particules dans la colonne, et que
ces couches se réarrangent et provoquent finalement une détérioration
de la forme du pic. Réparer ce type d'endommagement de la structure du
lit garni est très difficile voire impossible. C'est la raison pour laquelle le
rétrobalayage des colonnes est au mieux un pari.
Q. : Au moins on peut tirer un peu plus de vie de la colonne. Le
rétrobalayage n'est peut-être pas une très bonne solution, mais cela aide.

40. Rétrolavage de colonne

A.ÿ: Bien sûr, cela aide, mais je préférerais une solution plus fiable et
Q.ÿ: Le rétrobalayage des colonnes est une pratique courante dans notre laboratoire.
plus permanente. Avez-vous déjà utilisé des colonnes de garde ? Ils
Lorsqu'une colonne présente une détérioration de la forme du pic, nous
protègent la colonne de tous les types de débris, provenant de l'échantillon
la connectons à une HPLC qui n'est pas utilisée à ce moment-là et la
ou de l'instrumentation. Si votre échantillon est relativement propre, une
traversons dans le sens opposé au sens d'écoulement normal. Parfois,
colonne de garde peut durer jusqu'à mille injections. La colonne analytique
nous utilisons différents solvants pour ce rétrobalayage. Bien que j'aie vu
est souvent comme neuve par la suite. Si votre échantillon est assez sale,
quelques améliorations, cela ne fonctionne pas de manière fiable; en fait,
une colonne de garde ne durera peut-être que 50 injections. Vous saurez
la plupart du temps, les améliorations sont minimes et après une centaine
à quoi vous attendre, puisque la durée de vie d'une colonne de garde est
d'autres injections, nous jetons quand même la colonne. Que pouvons-
à peu près la même que la durée de vie de votre colonne analytique
nous faire pour améliorer cette procédure ?
aujourd'hui.
Bien sûr, les colonnes de garde ne sont pas gratuites. Cependant, le
prix que vous payez pour la colonne de garde est relativement faible par
A. : En fait, je ne suis pas partisan du backflushing de colonne.
rapport au coût d'une colonne analytique. Souvent, un support est
La plupart du temps, cela ne fonctionne pas, et quand cela fonctionne, je
nécessaire, car la plupart des colonnes de garde se présentent sous la
pense que l'amélioration peut être accomplie de manière plus rationnelle.
forme d'une colonne à cartouche. Mais ce coût ponctuel est rapidement
De plus, je pense qu'il existe des solutions plus efficaces pour améliorer
récupéré par la durée de vie plus longue de vos colonnes analytiques.
la durée de vie des colonnes. Laissez-nous discuter des questions en
Quelle colonne de garde devez-vous utiliserÿ? Toute la discussion
détail!
supposait que vous utilisiez le même garnissage dans votre colonne de
Quel serait un événement qui nous inciterait à essayer un rétrobalayage
garde que dans votre colonne analytique. La plupart du temps, c'est la
de la colonneÿ? Il pourrait y avoir deux raisons; l'un est une augmentation
meilleure solution, pour plusieurs raisons. Le plus important est que l'ajout
de la contre-pression et l'autre une détérioration significative des
de la colonne de garde n'affecte pas votre séparation de manière
performances de la colonne. On pense que les deux sont causés par
appréciable si vous utilisez le même garnissage que dans la colonne
l'accumulation d'ingrédients d'échantillon ou de débris provenant de la
principale. Dans le même temps, cette approche est généralement aussi
phase mobile ou de l'instrumentation HPLC en tête de colonne.
la meilleure façon de protéger la colonne analytique. L'utilisation de
différents emballages de différents fabricants n'est généralement pas
La première question est, où ces débris s'accumulent-ils ? S'il est
recommandée. Les phases greffées des différents fabricants sont très
suffisamment grand, il va s'accumuler sur la face externe de la fritte. Dans
différentes et une précolonne fabriquée à partir d'un garnissage différent
ces circonstances, un remplacement de la fritte aurait le même effet qu'un
ne peut pas garantir une protection aussi bonne qu'une précolonne
rétrobalayage. Une fritte de remplacement coûte peut-être 10 $. Si vous
fabriquée à partir du même garnissage. De plus, les différences entre les
avez une fritte de remplacement sous la main, vous pouvez remplacer
garnitures peuvent entraîner un étalement supplémentaire de vos
l'ancienne fritte par une nouvelle et vous êtes à nouveau opérationnel.
analytes. Comme vous pouvez le voir, il y a
Ensuite, vous pouvez vérifier si l'ancienne fritte peut être rajeunie, peut-
être en la plaçant dans un bain à ultrasons pendant une

48
Machine Translated by Google
plusieurs bonnes raisons de garder le garnissage identique dans la
colonne de garde et dans la colonne analytique.
Il existe quelques rares occasions où le contaminant qui réduit la
durée de vie de la colonne est connu et l'utilisation d'une colonne de
garde différente capturerait ce contaminant plus efficacement. Vous
devez y réfléchir très attentivement.
Un exemple pourrait être le cas où les échantillons, qui sont analysés
à l'aide d'un garnissage C18 , sont contaminés par une polyamine.
Cette polyamine s'adsorbe beaucoup mieux sur un échangeur de
cations que sur une colonne de garde C18 . Si vous utilisez un
garnissage différent dans la colonne de garde, vous devez vous
assurer qu'il n'interfère pas avec votre analyse. Dans l'exemple donné
ici, tous les analytes d'intérêt sont des composés acides ou neutres.
Par conséquent, l'ajout d'un échangeur de cations pour capter la
polyamine est tout à fait envisageable. Si les analytes d'intérêt
contiendraient des composés basiques, l'utilisation d'un échangeur de
cations comme précolonne est plus problématique et nécessite une
investigation approfondie. Cependant, des cas comme celui décrit ici
sont assez rares, et la plupart du temps la meilleure colonne de garde
contient le même garnissage que la colonne analytique.
Q.ÿ: De nombreuses conceptions différentes de colonnes de garde sont
disponibles dans le commerce. Lequel dois-je utiliserÿ?
R. : L'important est d'utiliser une colonne de garde qui contient le
même garnissage que votre colonne analytique.
Par conséquent, vous devriez discuter avec le fournisseur de votre
colonne analytique pour savoir quelle colonne de garde il recommande.
Parfois, plusieurs types sont disponibles, avec des prix différents et
des fonctions différentes. Pratiquement toutes les colonnes de garde
que je connais sont du type colonne à cartouche. Cela réduit le coût
de la colonne de garde car les embouts peuvent être réutilisés.
Certains sont conçus pour être connectés à votre colonne analytique
avec un morceau de tube supplémentaire, d'autres se connectent
directement à votre colonne analytique. Bien que certaines conceptions
de colonne de garde puissent être meilleures que d'autres, le point
important est d'utiliser une colonne de garde avec le même garnissage
que le garnissage de votre colonne analytique. Avec cette approche,
la durée de vie de la colonne peut être augmentée beaucoup plus
efficacement qu'avec le rétrobalayage de la colonne.
41. Changement de sélectivité
Q. : Nous déterminons le profil d'impureté d'un médicament. Pour le
médicament mère et tous les pics d'impuretés sauf un, le temps de
rétention est constant. Pour l'un des pics d'impuretés, la rétention
diminue lentement, jour après jour. La principale différence entre le
composé à rétention décalée et tous les autres composés est le fait
qu'il contient un groupe acide carboxylique. La colonne utilisée est une
colonne à phase inversée avec un groupe polaire intégré. La phase
mobile est constituée de méthanol et d'un tampon acétate d'ammonium
ajusté à pH 4,9. Que se passe-t-il? Pourquoi ce pic se déplace-t-il,
alors que tous les autres ont une rétention constante ?
49
A. : L'observation que la rétention reste solide pour la plupart des pics
nous indique que les propriétés globales de la colonne et de la phase
mobile ne changent pas. Les décalages généraux de rétention
pourraient s'expliquer par exemple par l'accumulation d'impuretés sur
la colonne. Comme ce n'est pas le cas, nous devons examiner
spécifiquement les propriétés de l'analyte, pour lequel ce changement
se produit.
Vous décrivez l'analyte comme étant le seul à contenir un groupe
acide carboxylique. Cela indique que la raison du changement dans la
rétention est spécifiquement liée à ce groupe. Ce n'est pas impossible
car vous avez décrit que vous utilisez une colonne à phase inversée
avec un groupe polaire intégré. Ce ligand lié pourrait être l'explication
du phénomène observé.
Il existe plusieurs types de phases greffées à groupement polaire
incorporé. Ils contiennent différents groupes polaires intégrés et la
procédure de préparation peut être différente.
Les colonnes SymmetryShield™ et XTerra™ RP (1,2,3) fabriquées
par Waters Corp. contiennent un groupe carbamate, les colonnes
Prism® et Spectrum (4) de Keystone une fonction urée, et la
Discovery™ RPAmideC16 de Supelco un groupe amide (Fig. 1).
Toutes ces colonnes sont préparées dans une réaction de liaison en
une seule étapeÿ: les ligands sont d'abord assemblés, puis fixés à la
surface en une seule étape, ou du moins il n'y a aucune preuve d'une
réaction de surface en plusieurs étapes.
O
Moi
C R SymmetryShield™ RP (Eaux)
Si N
O H XTerra™ RP (Eaux)
Moi
O
C
Si N R Discovery™ RP Amide 16
H
O
C R Prism® (clé de voûte)
Si N N
H H
Figure 1. Phases greffées commerciales avec groupe carbamate
incorporé
Certains des anciens garnissages (5) avec un groupe amide
incorporé, et malheureusement aussi certains des plus récents (6),
sont préparés dans une réaction de surface en plusieurs étapes. Dans
ce cas, un aminosilane est d'abord fixé à la surface. Ensuite, la phase
à liaison amino est mise à réagir avec un chlorure d'acide à longue
chaîne ou quelque chose de similaire pour créer le caractère de phase
inversée de la phase. Malheureusement, du fait des effets stériques,
une telle réaction de surface est toujours incomplète et laisse de
nombreuses amines résiduelles en surface. Des tentatives sont alors
faites pour éliminer les amines résiduelles avec quelque chose comme
l'anhydride acétique ou un autre acide à chaîne courte activé, mais
même de telles tentatives n'ont pas été couronnées de succès. La
surface d'un tel garnissage est représentée sur la figure 2. Il s'avère
qu'il est aussi difficile d'éliminer les groupes amino résiduels sur un tel
garnissage que d'éliminer les silanols résiduels sur une phase liée classique.
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O OH
H
Si N interactions gênantes avec les silanols résiduels sont largement éliminées.
R
O et elles sont utilisées dans de plus en plus d'applications. De bonnes
O phases sont disponibles auprès de plusieurs fabricants, mais vous devriez
OH
Si
NH 2
O rencontrées dans votre application.
O
Si
O N
OH H CH3 _
Figure 2. Phase amide préparée via une réaction en deux étapes.
La phase contient des quantités mesurables d'amines résiduelles.
Int. : En effet, la phase que j'utilise est une phase amide. Mais pourquoi
la rétention de mon analyte acide change-t-elle avec le temps ?
R.ÿ: Si votre phase contient de tels groupes amino résiduels, on
s'attendrait à ce que l'analyte acide interagisse avec ces groupes par
échange d'ions. Cela entraînerait une rétention accrue, tout comme
l'interaction des analytes basiques avec les groupes silanol entraîne une
rétention accrue sur les garnissages classiques. Il est également connu
de la préparation de phases aminées que la stabilité du groupement
aminé dans une phase mobile aqueuse n'est pas très bonne. Il semble
que votre colonne perde lentement les groupes amino résiduels, et que
cela soit la cause de la rétention réduite de votre analyte acide d'un jour
à l'autre. Tous les autres analytes n'interagissent pas avec le groupe
amino, donc leurs temps de rétention restent stables.
Q.ÿ: C'est une explication possible du problème, mais je ne sais rien de
la procédure de préparation de cet emballage particulier. Comment puis-
je résoudre mon problème ? Je dois dire que j'aime ces phases avec les
groupes polaires intégrés. Ils donnent de bonnes formes de pics pour
pratiquement tout.
R. : Tout d'abord, j'appellerais le fabricant et discuterais du problème
avec lui. Si un fabricant est conscient d'un problème, il peut le résoudre
dans un produit de nouvelle génération. Ou, vous pouvez choisir l'un des
produits qui est exempt de ce problème.
Généralement, je suis d'accord avec vousÿ: les phases liées avec des
groupes polaires intégrés donnent en effet une forme de pic supérieure,
même pour les échantillons les plus difficiles. Sauf erreur dans le choix
de la phase mobile, aucune traînée n'est observée pour pratiquement
tous les analytes. Un autre avantage de ces garnissages est le fait qu'ils
peuvent être utilisés sans difficulté avec des phases mobiles contenant
100% d'eau. Cela signifie que même des composés assez polaires
peuvent être analysés sans difficulté en utilisant des garnissages avec un
groupe polaire intégré. Bon nombre des meilleurs garnissages en phase
inverse ne tolèrent pas bien les phases mobiles très aqueuses en raison
de
50
effondrement hydrophobe, mais ce n'est pas un problème pour les phases
greffées avec des groupes polaires intégrés. Le mécanisme de rétention
n'est pas différent du mécanisme standard en phase inverse, et les
De plus en plus de personnes découvrent les avantages de ces phases,
vous renseigner sur le processus de liaison. Les processus en une seule
étape sont préférés; ils sont exempts des complications que vous avez
Références :
1. J. O'Gara, B. Alden, TH Walter, C. Niederländer, UD
Neue, "Préparation simple d'une phase stationnaire HPLC C8 avec un
groupe fonctionnel polaire interne", Anal. Chim. 67, 3809 (1995)
2.JE O'Gara, DP Walsh, BA Alden, P. Casellini, TH
Walter, "Étude systématique du comportement chromatographique par
rapport à la longueur de la chaîne alkyle pour les phases liées HPLC
contenant un groupe polaire intégré", Anal. Chim. 71, 2992 (1999)
3. UD Neue, TH Walter, BA Alden, Z. Jiang, RP
Fisk, JT Cook, KH Glose, JL Carmody, JM Grassi, Y.-F. Cheng, Z. Lu,
RJ Crowley, "Utilisation de garnitures LC hautes performances de pH
1 à pH 12", American Laboratory, novembre 1999, 36
4. KJ Duff, "Séparations HPLC améliorées à l'aide de colonnes
intrinsèquement désactivées", American Laboratory, février 1998, 32AA
5. TL Askah, KMR Kallury, CA Szafranski, SD
Corman, F. Liu, "Chractérisation et évaluation HPLC d'une nouvelle
colonne en phase inverse fonctionnalisée par un amide", J.
Liquide. Chrom. Rel. Technol., 19, 3049 (1996)
6. JJ Kirkland, JW Henderson, JD Martosella, BA
Bidlingmeyer, J. Vasta-Russell, JB Adams, Jr., "Un garnissage de
colonne à base de silice alkyl-amide hautement stable pour HPLC en
phase inversée de composés polaires et ionisables", LC-GC 17 (1999),
634
42. Nouvelle méthode
Q. : Dans mon département, nous développons constamment de
nouvelles méthodes HPLC, dont des versions seront utilisées à des fins
multiples. La plupart du temps, l'objectif principal est d'établir un profil
d'impuretés pour les nouvelles substances médicamenteuses. Des
versions de ces méthodes seront ensuite utilisées pour les tests de
dissolution ou de stabilité, et finalement des versions simplifiées seront
utilisées pour tester l'uniformité du contenu. Actuellement, les méthodes
sont souvent réinventées au fur et à mesure qu'elles passent d'un département à l'autre.
Existe-t-il un moyen de rationaliser ce processusÿ?
R. : C'est une question difficile qui a à la fois une composante technique
et une composante managériale. Parlons simplement de la composante
technique iciÿ!
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Les tâches que vous décrivez me suggèrent que vous travaillez dans
l'industrie pharmaceutique. Certaines des réponses peuvent être spécifiques
à votre industrie, mais je suis sûr que des problèmes similaires existent
également dans d'autres industries. Néanmoins, je vais aborder votre
question dans le contexte de l'industrie pharmaceutique.
Une méthode de profil d'impureté nécessite souvent la résolution d'un grand
nombre de composés. Le temps d'analyse n'est souvent pas un facteur, car
une telle analyse n'est effectuée qu'une fois de temps en temps. Dans les
tests de dissolution, en revanche, vous n'êtes intéressé que par un seul pic
et vous souhaitez disposer d'une méthode rapide avec une bonne durée de
vie de la colonne. Les différences entre les besoins des deux types d'analyse
sont grandes, et il y a en principe de bonnes raisons pour une « réinvention
» de la méthode, comme vous l'avez appelée.
Certains composants de ce processus peuvent être simplifiés et même
optimisés. Tout d'abord, vous devez choisir une famille de colonnes dans
laquelle le même garnissage est disponible dans de nombreuses
configurations de colonnes différentes. En principe, cela ne devrait pas être
difficile, puisque presque tous les fournisseurs de colonnes ont un grand
nombre de configurations de colonnes. Par exemple, la famille de colonnes
XTerra™ (1) de Waters Corp. comprend plus de 270 références. Un grand
nombre de configurations de colonnes devrait vous permettre de sélectionner
la bonne colonne pour les différents besoins des différents services.
Ensuite, vous devez sélectionner une configuration de colonne adaptée à
la génération d'un profil d'impuretés. C'est souvent le type d'analyse le plus
complexe. Heureusement, c'est aussi l'analyse qui est nécessaire en amont
d'un projet. Par conséquent, d'autres méthodes peuvent être dérivées de la
méthode développée pour le profil d'impureté.
Le développement de méthodes pour un profil d'impuretés est souvent
une tâche des plus exigeantes. Souvent, les colonnes avec le meilleur
satisfaisants pour ces tests, le temps d'exécution est beaucoup plus court et
pouvoir de résolution (colonnes longues remplies de petites particules) sont utilisées.
L'élution par gradient est la plupart du temps le seul moyen d'obtenir un
chromatogramme raisonnable de toutes les impuretés possibles. Une
méthode avec un profil d'élution complexe doit également être robuste : vous
devez démontrer que les résultats de la méthode peuvent être obtenus en
utilisant différentes colonnes et différents instruments dans différents
services. La bonne nouvelle est que la personne qui a développé la méthode
pour le profil d'impureté a fait une grande quantité de devoirs utiles pour le
développement de méthodes ultérieures. Ces connaissances peuvent être
utilisées pour les méthodes plus simples soit dans le même département,
soit dans d'autres départements.
Comment passer de cette méthode complexe de profilage des impuretés
à une méthode plus simple ? Dans certains cas, les gens utilisent simplement
la même colonne et développent une séparation isocratique pour les autres
besoins, par exemple, pour les tests d'uniformité du contenu. D'une part,
l'utilisation du même matériau d'emballage a ses mérites.
Après tout, les études du profil d'impuretés viennent d'établir que la méthode
est reproductible avec ce garnissage. En revanche, pour un simple
chromatogramme à deux pics, on n'a pas besoin d'une colonne haute
résolution. On peut utiliser le même garnissage dans une colonne plus
courte pour accélérer la séparation. Ou on peut utiliser une colonne plus
courte remplie avec une plus grande taille de particules du même garnissage
pour améliorer la robustesse de la méthode.
51
Le passage d'une méthode de gradient complexe à une méthode
isocratique simple peut être très rapide et simple, si vous disposez des
bonnes informations. Vous devez déterminer à quelle composition de solvant
le pic parent s'élue dans la méthode du gradient. En d'autres termes, vous
devez connaître exactement
composition du solvant en sortie de colonne au point d'élution
du pic parent. Cela nécessite une bonne connaissance de votre instrument,
car il y a un délai entre le moment où le gradient se forme et le moment où il
atteint la sortie de la colonne (2). Vous devez connaître le volume de retard
de gradient de l'instrument et le volume mort de la colonne. Le volume mort
de la colonne est facile à obtenir : il suffit d'injecter un pic non retenu, comme
la dihydroxyacétone pour une colonne en phase inverse. Le volume de
retard de gradient de l'instrument est obtenu en exécutant un gradient avec
un absorbeur d'UV. Le volume de retard est calculé à partir de la différence
entre le début programmé du gradient et le temps pendant lequel l'absorbeur
UV apparaît dans le détecteur.
Le développement de la méthode isocratique devrait commencer avec le
même matériau de garnissage et la composition de solvant à laquelle le
composé s'élue dans le gradient. Si vous faites cela, vous devriez obtenir un
facteur de rétention autour de 2 et pas moins de 1.
Vous avez maintenant le début d'une méthode isocratique simple et rapide
pour les autres dosages. Il peut être tout à fait suffisant d'avoir un facteur de
rétention aussi faible. En revanche, les gens préfèrent un facteur de rétention
un peu plus élevé, peut-être entre 2 et 5. Pour l'obtenir, il suffit d'ajuster
légèrement la composition du solvant.
Pour l'uniformité du contenu, les tests de stabilité et les tests de
dissolution, vous n'avez pas besoin d'une colonne aussi puissante que pour
le profil d'impuretés. Vous devez sélectionner une colonne plus courte.
Souvent, même une colonne de 5 cm 5 microns donne des résultats
la contre-pression est beaucoup plus faible qu'avec une colonne de 25 cm 5
microns. Pour le test de dissolution, vous pouvez envisager une colonne de
garde pour protéger la colonne analytique de l'échantillon acide. Cependant,
aucun redéveloppement majeur des méthodes n'est nécessaire. En fait, la
même méthode isocratique simple peut être utilisée pour l'uniformité du
contenu, les tests de stabilité et les tests de dissolution. Cela devrait
également rationaliser le processus de validation de la méthode (3).
Bien sûr, dans de nombreux endroits, les différentes tâches sont
exécutées dans différents départements. Cela nécessite donc une
coordination des efforts dans les différents départements. Dans le monde
d'aujourd'hui, avec l'importante charge de travail de chacun, une telle
rationalisation ne peut être que bénéfique.
Références
1. UD Neue, TH Walter, BA Alden, RP Fisk, JL
Carmody, JM Grassi, Y.-F. Cheng, Z. Lu, R. Crowley, Z.
Jiang, "Family of new high-performance LC-packings can be used from
pH 1 to pH 12", American Laboratory 31, 22 (1999), 36 - 39
2. UD Neue, dépannage HPLC, laboratoire américain, octobre 1997
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3. ME Swartz, IS Krull, "Développement et validation de méthodes
analytiques", Marcel Dekker Inc., New York, Bâle, Hong Kong, 1997
43. Pics négatifs
Q.ÿ: J'effectue une séparation en phase inverse avec un tampon phosphate
à pH 2,5 et 20ÿ% de THF sur une colonne C18.
Le détecteur est un PDA et la longueur d'onde est de 225 nm. J'obtiens un
pic négatif au milieu du chromatogramme, entre le deuxième et le troisième
pic. J'ai l'habitude de voir des pics négatifs au début du chromatogramme,
autour de V0, mais je n'en ai jamais vu au milieu du chromatogramme.
Pouvez-vous expliquer ce qui se passe ?
traiter. Comme ce n'est pas le cas, je rejetterais le processus d'injection
comme source du problème.
La phase mobile elle-même et tous les composants avec lesquels elle
est en contact sont la source la plus probable du problème. Imaginez un
ingrédient dans la phase mobile qui est présent à très faible concentration
et qui a une certaine rétention sur la colonne. Si vous injectez une phase
mobile qui ne contient pas cet ingrédient, vous obtiendrez un pic négatif
avec le même facteur de rétention que l'ingrédient aurait, si vous l'injectiez
comme échantillon.
C'est ce qu'on appelle la chromatographie de vacance. Pour résoudre votre
problème, il suffit de trouver cet ingrédient. Le malheur est que vous
travaillez à une très faible longueur d'onde. Vous verrez plus de composés
à une sensibilité plus élevée dans la région des UV faibles. Je suis sûr que
c'est la raison pour laquelle vous avez choisi cette longueur d'onde pour
commencer.

Q. : Cela ressemble à une bonne description de ce que pourrait être mon

A. : Peut-être que la meilleure chose à faire est de commencer par une
problème. Que puis-je faire pour le réduire davantage afin de pouvoir
philosophie simple : un pic indique une différence dans la composition de l'éliminerÿ?
l'échantillon et la phase mobile. Peu importe que le pic soit positif ou négatif
La première chose à faire est de vérifier la phase mobile elle-même.
ou qu'il soit retenu ou non. Par conséquent, ce que nous devons faire est
Quelle est la qualité du THF ? Quelle est la qualité de l'eau ? Vous pouvez
de déterminer quelle est la source du pic supplémentaire dans le
simplement injecter un échantillon de THF et un échantillon d'eau et voir si
chromatogramme. Le fait qu'il soit négatif est une information supplémentaire
vous rencontrez un pic au même temps de rétention que votre pic négatif.
utile.
Si vous pouvez créer un pic, vous avez trouvé la source du problème, et
Vous déclarez que vous êtes habitué aux pics négatifs au début du
vous pouvez alors passer à l'étape suivante. S'il s'agit du THF, vous pouvez
chromatogramme. Ces pics sont principalement dus à des différences dans
étudier la qualité et la pureté du THF. Le THF a tendance à former des
la composition de la matrice de l'échantillon et de la phase mobile.
peroxydes et certaines formes de THF contiennent des composants conçus
Il peut s'agir de la composition du solvant utilisé pour préparer l'échantillon
pour inhiber la formation de peroxydes. Vous devriez pouvoir obtenir ces
ou du pH. A moins d'être extrêmement prudent dans la préparation de
informations sur l'étiquette de votre bouteille de solvant. Le THF est
l'échantillon en phase mobile, des pics supplémentaires peuvent provenir
également un excellent solvant pour les pièces en plastique et pour extraire
de cette différence. Pour la plupart d'entre nous, ce n'est pas une
les additifs de ces plastiques. Tout ce qui est en contact avec votre ligne de
préoccupation. Nous réalisons qu'il existe des différences entre le solvant
solvant THF est suspectÿ: les filtres, les tubes, les joints, les ferrules,
de l'échantillon et la phase mobile. Parfois, nous créons également de telles
n'importe quoi...
différences exprès, par exemple pour un enrichissement de l'échantillon sur
la colonne.
L'eau est également une source possible. Dans la plupart des endroits,
des dispositifs de purification d'eau tels qu'un système Milli-Q™ de Millipore
Q. : C'est effectivement exact. Souvent, mes échantillons contiennent des
Corp sont utilisés. Les filtres de ces appareils ont une capacité limitée et
ingrédients étrangers tels que des excipients. Cependant, ils éluent
doivent être remplacés après un certain temps.
généralement avec le front de solvant. C'est le cas ici aussi. De plus,
l'échantillon n'est pas exactement dissous dans la phase mobile, mais est-il
Une autre source possible de contamination est le tampon ou la
dilué avec la phase mobile.
préparation de tampon elle-même. Qu'avez-vous utilisé pour agiter le flacon
lors de la préparation du tamponÿ? Le flacon était-il propre ? Si vous avez
R. : Pour faire le tri, si le pic supplémentaire vient des excipients ou
mesuré le pH avec un pH-mètre, avez-vous nettoyé l'électrode avant de
d'ailleurs, il suffit d'injecter des standards. S'il s'agit d'un pic d'excipient, il
l'utiliserÿ?
devrait disparaître.
Après avoir vérifié tous les composants de la phase mobile et les
appareils en contact avec la phase mobile et le problème n'a toujours pas
Q. : J'y ai déjà pensé. Le pic supplémentaire est toujours présent, lorsque été résolu, je vérifierais l'instrument HPLC en détail. Y a-t-il des composants
j'injecte des standards ou même de la phase mobile. incompatibles avec votre phase mobile, notamment avec le THF ? Y a-t-il
des poches dans l'instrument qui n'ont pas été purgées correctementÿ?
A. : D'accord. Maintenant, c'est une information importante. Si vous obtenez Existe-t-il une possibilité de croissance bactérienne dans votre parcours de
le même phénomène indépendamment de la nature de l'échantillon, nous solvantÿ? Je placerais mes paris sur le solvant, l'eau et la préparation du
pouvons exclure l'échantillon comme cause du problème. Par conséquent, tampon et regarderais de très près ces étapes.
nous devrions nous concentrer sur les composants de l'instrument ou sur la
phase mobile elle-même.
Si votre pic supplémentaire était positif, on pourrait envisager une Q. : Cela sonne bien, mais c'est aussi beaucoup de travail.
contamination dans l'injecteur, la seringue utilisée, les joints dans les flacons Y a-t-il un moyen de le réduire davantage?
d'échantillon ou des éléments connexes associés à l'injection

52
Machine Translated by Google
A. : A première vue, je ne vois pas comment. D'un autre côté, vous voudrez
peut-être vous poser la question, pourquoi voulez-vous éliminer le pic
négatif. D'après la description du problème, il apparaît que le pic négatif
n'interfère pas avec l'analyse. Par conséquent, vous pouvez simplement
déclarer que c'est un fait de la vie et l'ignorer. Bien sûr, si vous êtes dans
un environnement réglementé, cela doit être mûrement réfléchi.
44. Délicat, fastidieux, chronophage
Q. : Nous réalisons un très grand nombre d'analyses de routine d'échantillons
issus d'essais cliniques. Les échantillons sont des échantillons de plasma
de patients, et nous déterminons le devenir métabolique du médicament
parent et de ses métabolites. C'est un travail très important, et les
échantillons sont précieux, mais le travail est aussi très laborieux. La
préparation des échantillons est le problème majeur. Nous utilisons des
cartouches C18 pour éliminer les constituants du plasma, et toute la
procédure de préparation des échantillons doit être effectuée avec une
grande précision. Si nous ne le faisons pas, les résultats varient beaucoup.
La méthode d'analyse proprement dite est une méthode HPLC. Existe-t-il
une meilleure façon de préparer l'échantillonÿ?
A. : En effet, ce type de travail est délicat, fastidieux et prend beaucoup de
temps. Cela s'applique à la fois au développement des méthodes et à la
manipulation des échantillons eux-mêmes.
Cependant, ces dernières années, une série d'évolutions ont rendu cette
tâche plus facile (1).
Le premier problème rencontré avec les garnissages classiques de type
C18 est la difficulté rencontrée avec la mouillabilité de tels garnissages
avec des échantillons aqueux. Le préconditionnement typique de la
cartouche SPE nécessite un mouillage avec du méthanol, puis un bref
conditionnement avec de l'eau ou un tampon avant le chargement de
l'échantillon. Si la cartouche SPE sèche entre l'étape de préconditionnement
et le chargement de l'échantillon, de faibles récupérations des analytes
d'intérêt sont rencontrées. Cela nécessite de faire très attention afin que
cela ne se produise pas. Ce n'est pas un si gros problème, quand on a
affaire à des échantillons individuels. Mais cela crée des difficultés lorsqu'il
faut traiter de nombreux échantillons en même temps, comme dans une
plaque à 96 puits. Par conséquent, les fabricants ont introduit des produits
SPE améliorés qui ne souffrent pas de ce problème. Un exemple est
l'Oasis®
Gamme de produits HLB SPE de Waters Corp. Ce matériau de garnissage
contient un mélange de groupes hydrophobes et hydrophiles. Les groupes
hydrophobes confèrent une rétention exceptionnelle, supérieure à la plupart
des garnitures C18, tandis que les groupes hydrophiles offrent un bon
mouillage avec des échantillons aqueux. La conséquence est que ces
matériaux d'emballage peuvent se dessécher pendant l'étape de préparation
de l'échantillon sans perdre de capacité. Cela rend l'étape de préparation
de l'échantillon beaucoup moins fastidieuse. Désormais, vous n'avez plus
besoin de vous asseoir et de surveiller attentivement le niveau de liquide
dans votre appareil SPE pour vous assurer qu'il ne sèche pas.
53
Q.ÿ: Cela semble intéressant. Quel est le secret derrière cela ?
R. : C'est très simple. La raison de la perte de capacité lorsqu'une cartouche
C18 sèche est le fait que C18 n'est pas mouillé par l'eau. Ce qui empêche
l'eau de pénétrer dans les pores est le mauvais angle de mouillage entre
l'eau et la surface hydrophobe du C18. Si l'on prévoit des groupements
hydrophiles en surface, le mouillage est amélioré et l'eau reste dans les
pores ou pénètre facilement dans les pores. Par exemple, la garniture
Oasis® HLB est préparée à partir d'un mélange de divinylbenzène comme
composant hydrophobe qui assure la rétention et de N-vinyl pyrrolidone, qui
assure la mouillabilité à l'eau. Le contrôle de la quantité des deux
composants fournit le bon équilibre entre l'hydrophobicité pour la rétention
du soluté et l'hydrophilie ou la mouillabilité à l'eau.
Q. : D'accord. Je comprends l'amélioration de la mouillabilité.
Cependant, comment se comporte-t-il en tant qu'adsorbant ? J'aime la
façon dont les garnitures en phase inversée agissent. Il est facile à
comprendre et pas difficile à faire fonctionner.
R.ÿ: Il existe de nombreuses similitudes entre ces absorbants hydrophobes
et un garnissage C18. Généralement, le mécanisme de rétention est
similaire : tout ce qui est fortement retenu sur un garnissage C18 en raison
d'un mécanisme de phase inversée est également fortement retenu sur ces
garnissages. En revanche, ils ne sont pas à base de silice, ce qui signifie
que le mécanisme de rétention n'est pas compliqué par les silanols. De
plus, pour la même raison, ils peuvent être utilisés sans difficulté avec des
solutions alcalines, ce qui ouvre de nouvelles portes dans le processus de
préparation des échantillons.
Q. : Le fait qu'il n'y ait pas de silanols est un bienfait mitigé. Je peux voir
comment cela peut rendre le protocole d'élution plus simple. Mais nous
utilisons également l'interaction silanol pour améliorer la rétention, si nous
en avons besoin….
R. : Sur les garnitures C18 classiques, les silanols résiduels sont un produit
secondaire. Le contrôle de leur activité est généralement moins bon que le
contrôle de l'activité hydrophobe de ces garnissages.
Alors que les silanols résiduels peuvent en effet aider à retenir les analytes
basiques, la reproductibilité d'une telle procédure est plus délicate que celle
d'un garnissage qui ne présente qu'un caractère de phase inversée.
D'autre part, ces garnitures polymères sont stables à des valeurs de pH
plus élevées que les garnitures à base de silice. Cela vous permet d'utiliser
le pH comme un outil plus puissant dans SPE qu'il n'était possible avec les
garnitures à base de silice. Vous pouvez améliorer sélectivement la
rétention des analytes basiques en effectuant le protocole de lavage à des
valeurs de pH basiques. Ou vous pouvez obtenir une élution sélective en
modifiant le pH. Des procédures génériques pour cela ont été élaborées
(2,3). La manipulation de l'interaction ionique est désormais entièrement
sous votre contrôle, et ne dépend plus de la concentration en groupements
silanols "résiduels".
Machine Translated by Google
La bonne mouillabilité de ces garnissages polymères ouvre également
une nouvelle voie : ils peuvent être utilisés sans difficulté dans des
schémas de traitement parallèle tels que les plaques 96 puits (2). Le fait
que vous n'ayez pas à vous soucier du séchage de chaque puits simplifie
simplement l'ensemble du processus de préparation de l'échantillon. De
plus, le traitement simultané de plusieurs plaques élimine de nombreuses
sources d'erreur. Par exemple, les étalons peuvent être traités avec les
échantillons pour contrôler le processus ou corriger les résultats. En
outre, des gains de temps significatifs sont réalisés par le traitement
parallèle de nombreux échantillons.
Résumer:
La mouillabilité favorable des sorbants SPE de deuxième génération
rend la préparation des échantillons moins fastidieuse. L'absence
d'interactions secondaires fortes telles que les interactions silanol des
garnissages C18 rend la préparation des échantillons moins délicate.
L'utilisation de plaques à 96 puits pour le traitement parallèle des
échantillons rend la préparation des échantillons beaucoup moins longue
qu'auparavant. Il y a du progrès…
Références
1. Y.-F. Cheng, DJ Phillips, UD Neue, M. Capparella, L.
L. Bean, "Méthodes d'extraction simples pour la détermination des
médicaments dans le sérum", American Biotechnology Laboratory
décembre 1997
2. Y.-F. Cheng, UD Neue, LL Bean, "Méthode d'extraction en phase
solide simple pour la détermination du vérapamil et de ses métabolites
dans le plasma dans une plaque d'extraction à 96 puits", J.
Chromatogr. A 828 (1998), 273-281 3. Y.-F. Cheng, UD Neue, LL
Woods, "Nouvelles méthodes d'extraction par chromatographie liquide
et en phase solide à haute performance pour quantifier la méthadone
et son métabolite dans l'urine humaine enrichie", J. Chromatogr. B
729 (1999), 19-31
45. Séparations rapides
Q. : J'ai beaucoup entendu parler récemment de séparations ultra-
rapides, avec une analyse complète en moins de 5 minutes. Un autre
sujet qui m'intéresse est celui des gradients « balistiques ». Je serais
intéressé d'en savoir plus à ce sujet, et ce que l'on peut faire aujourd'hui.
A. : C'est effectivement un sujet très intéressant. Bien que ce ne soit
pas un sujet de dépannage, je pense que cela vaut la peine d'en discuter.
Le développement de ces techniques de séparation très rapides est
motivé par la capacité à générer très rapidement de nouvelles entités
chimiques grâce à la chimie combinatoire. On aimerait avoir de bonnes
informations sur le succès de ces techniques de synthèse rapide. La
spectrométrie de masse ou RMN peut vous aider à déterminer si vous
avez synthétisé l'entité chimique que vous vouliez créer, mais seule une
technique de séparation telle que la HPLC peut vous renseigner sur la
qualité ou le rendement de votre synthèse et les éventuels sous-produits.
La
54
la meilleure approche est donc une combinaison de LC avec MS. Si
vous pouvez synthétiser 1000 nouvelles entités par jour, votre temps
d'analyse ne peut pas dépasser 1 minute pour répondre aux demandes.
Jusqu'à il y a peu de temps, la difficulté était que la HPLC était
considérée comme trop lente pour obtenir un temps d'analyse aussi
court (1, 2). Cependant, en repensant certains détails du processus, des
analyses de plus en plus rapides sont devenues possibles (3).
Deux éléments y ont contribué. L'un est un réexamen des paramètres
sous-jacents à la séparation des gradients. L'autre élément est la
disponibilité commerciale de colonnes très courtes garnies de très
petites tailles de particules (4). La combinaison des deux éléments est
le secret des séparations ultra rapides.
Afin de maximiser le nombre de pics pouvant être séparés dans un
gradient, il faut considérer deux contributions distinctes. Le premier est
la largeur des pics résultant de la manipulation du débit, ou mieux de la
vitesse linéaire, le second est l'interaction entre le volume du gradient et
la largeur des pics lorsque le volume du gradient augmente. Les deux
paramètres déterminent ensemble combien de pics peuvent être
entassés dans un temps d'analyse limité.
Le nombre maximal de pics pouvant être générés dans un gradient est
appelé capacité de pic. Comme les pics dans les gradients sont pour la
plupart de même largeur, cela peut être calculé facilement en divisant la
durée du gradient tg par la largeur du pic w :
tg
P =1 + (1)
w
La théorie de la chromatographie nous permet de calculer la
capacité de pointe en fonction des conditions de fonctionnement (3).
N.-B. c ÿÿ (2)
P = +1 ÿ
4 t0
ÿ ÿJCÿ
Avant + 1
gt
N est le nombre de plateaux de la colonne dans les conditions de
fonctionnement, B . ÿc est un paramètre lié au type d'échantillons à
séparer et à la plage de solvant ÿc sur laquelle le gradient est exécuté,
t0 est le temps mort de la colonne et tg est la durée du gradient, comme
ci-dessus. On peut prendre le facteur B . ÿc
être une constante qui ne dépend que du type d'analyse qui est exécuté.
Il y a deux raisons à cela : l'une est le fait que les types de composés à
analyser dans une banque combinatoire sont tous similaires entre eux
avec une structure similaire et un poids moléculaire similaire. L'autre est
le fait que nous appliquons toujours le même gradient, principalement
de 5ÿ% de bio à 95ÿ% de bio. Le nombre de plateaux de colonne est
une fonction de la vitesse linéaire, qui à son tour dépend du temps mort
de la colonne t0, et la durée du gradient détermine le temps d'analyse
total.
À partir de l'équation 2, nous pouvons générer un graphique
tridimensionnel montrant la capacité maximale en fonction de la vitesse
linéaire - ou mieux du débit - et de la durée du gradient (Figure 1). Il peut
être vu comme un graphique qui mesure la capacité de résolution d'une
colonne. Pour chaque longueur de colonne
Machine Translated by Google

et la taille des particules, différents graphiques peuvent être générés. de l'interaction entre l'expansion du gradient telle qu'exprimée par le rapport
L'exemple de la figure 1 montre les performances d'une colonne de 5 cm 5 t0/tg dans l'équation 2 et la dépendance du nombre de plateaux sur la vitesse
µm avec un diamètre interne de 4,6 mm. Pour chaque durée de gradient, le linéaire ou le débit. Pour la colonne illustrée à la figure 1, le meilleur débit est
graphique présente un optimum de performance à un débit différent. De plus, d'environ 7 mL/min pour un gradient de 1 minute. Il s'agit d'un débit plus élevé
des gradients plus longs donnent une capacité de crête plus élevée que des que ce que la plupart des gens considèrent comme le meilleur.
gradients plus courts. Le débit maximum pouvant être utilisé avec chaque
colonne dépend de la limitation de pression de l'instrument. Nous voyons immédiatement que les performances optimales sont plus
élevées aux temps de gradient rapides. Nous voyons également que le débit
auquel la performance optimale se produit est similaire à la colonne de 5 cm
5 µm. On peut voir que le même gradient "balistique" d'une minute peut
toujours être exécuté sur ces colonnes très courtes et très rapides avec un
5 cm 5 µm Colonne, 4,6 mm d.i. meilleur pouvoir de résolution qu'avec la colonne plus traditionnelle de 5 cm 5
µm illustrée à la figure 1.
Le transfert de masse plus rapide des particules de 2,5 µm déplace l'optimum
de la courbe vers une valeur de résolution plus élevée. Cela signifie que des
200
séparations assez puissantes peuvent être réalisées dans des délais
compatibles avec les besoins de la chimie combinatoire à haut débit – du
150 moins pour le moment. Si la production de la chimie combinatoire s'accélère
encore, les chimistes analytiques devront repenser à la manière d'accélérer
100
encore la chromatographie.
maximale
Capacité
>

50
Références 1.
32,0
16.0 JN Kyranos, JC Hogan, Jr., Anal. Chim. News & Features, 1er juin 1998,
8.0
0
0,12
0,16
4.0 389A 2. WK Goetzinger, JN Kyranos, Laboratoire américain,
0,23
0,33
0,47
0,66
2.0 [min]
0,93
1.32
1,86 dégradé
Durée
du
2.63
3,72
5.26
1.0
7.45

avril 1998,
10.53

F [mL/min] >
3. UD Neue, JL Carmody, Y.-F. Cheng, Z. Lu, CH
Phoebe, TE Wheat, "Conception de méthodes de gradient rapide pour
Figure 1. Capacité maximale en fonction du débit et de la durée du gradient l'analyse de bibliothèques de chimie combinatoire et la préparation de
pour une colonne de 5 cm 5 µm composés purs", Advances in Chromatography, sous presse 4. Y.-F.
Cheng, TH Walter, Z. Lu, P. Iraneta, BA Alden, C. Gendreau, UD Neue,
Comment l'image change-t-elle si nous utilisons une autre colonneÿ? JM Grassi, JL Carmody, J.
La figure 2 montre le même graphique pour une colonne de 2 cm 2,5 µm avec
le même diamètre interne.
E. O'Gara, RP Fisk, « Hybrid Organic/Inorganic Particle Technology :

Colonne 2 cm 2,5 µm, DI 4,6 mm Breaking Through Traditional Barriers of HPLC Separations », LC-GC,
novembre 2000

200

180

160
46. Tampons pour LC/MS
140

120 Q.ÿ: Quels additifs de phase mobile peuvent être utilisés avec les colonnes
100
de phase inversée et la détection LC/MSÿ?
maximale
Capacité
80

60
R. : Étant donné que l'instrumentation LC/MS à trait d'union est devenue de
40
plus en plus populaire au cours des dernières années, les tampons standard
20
23
d'autrefois, par exemple le phosphate, sont tombés en désuétude. Le
0 8
0,05
0,07
0,09
0,13
0,19
3
Pente Durée
[min] problème est que l'on aimerait utiliser des additifs de phase mobile volatils.
0,26
0,37
0,53

Les phosphates ne sont pas volatils et, avec le temps, obstrueront l'interface
0,74

1
1.05
1.49
2.11
2,98
4.21
5,96
8.42

Débit [mL/min]
LC/MS.
Cela entraîne des temps d'arrêt importants et, plus important encore, une
grande quantité de travail pour nettoyer à nouveau l'interface.

Figure 2. Capacité maximale en fonction du débit et de la durée du gradient Certaines nouvelles conceptions de source peuvent maintenant accueillir

pour une colonne de 2 cm 2,5 µm On constate que le maximum de jusqu'à 10 mM d'un tampon phosphate pendant une période prolongée, mais

performance se produit à un débit assez élevé pour des gradients très un nettoyage régulier est toujours nécessaire.
Par conséquent, les méthodes HPLC standard utilisées avec la détection
rapides. C'est le résultat
MS utilisent des additifs de phase mobile qui sont volatils. La

55
Machine Translated by Google

les additifs les plus simples sont des acides simples, tels que l'acide être juste un additif de sel. Cela peut aider dans le processus d'ionisation
formique ou l'acide acétique. Ils sont souvent utilisés à une concentration MS, mais il a peu de fonction dans le processus de séparation.
de 0,1% jusqu'à 1%. Cela fournit un environnement acide, suffisant pour Pour la plage de pH neutre, la meilleure solution est de commencer avec du
protoner complètement les analytes basiques. Dans de nombreux cas, cela bicarbonate d'ammonium et d'ajouter de l'acide formique. Le tampon réel
suffit pour assurer un bon contrôle de la rétention des analytes acides et est fourni par la première dissociation de l'ion carbonate. À des concentrations
basiques. élevées, l'acide carbonique se dissocie pour former du dioxyde de carbone
Cependant, il existe des exceptions, où une telle approche a ses limites. et de l'eau. Mais aux faibles concentrations des tampons utilisés en LC-MS,
L'un des inconvénients d'un environnement de phase mobile fortement il s'agit d'une approche fonctionnelle et aucun dégazage n'a été trouvé.
acide est le fait que l'ionisation des analytes acides est supprimée. Par
conséquent, une meilleure condition pour la détection MS est d'utiliser un
pH légèrement plus élevé en conjonction avec la détection en mode ions
négatifs. Dans un tel cas, des tampons d'acétate d'ammonium et de formiate
47. Tampons alcalins pour RPLC
d'ammonium sont utilisés, et le contrôle du pH est important pour contrôler
la rétention. Le pKa de l'acide formique est de 3,75 et le pKa de l'acide
Q.ÿ: Ces dernières années, des garnissages en phase inversée sont
acétique est de 4,75. Par conséquent, ce sont les valeurs de pH optimales
apparus, stables dans la plage de pH alcalin. J'aimerais explorer certaines
pour ces tampons. Les concentrations typiques sont d'environ 20 mM ou
de ces nouvelles capacités. Quels tampons peuvent être utilisés avec des
moins, même aussi bas que 5 mM sont possibles.
colonnes en phase inverse dans la plage de pH alcalinÿ?

À une concentration de tampon aussi faible, il est certainement préférable

d'utiliser les tampons à un pH très proche du pKa de l'ion tampon.
Une règle empirique raisonnable pour des concentrations aussi faibles A. : En effet, l'exploration d'une gamme de pH plus large ouvre de nouvelles
possibilités qui n'étaient pas accessibles dans le passé. Certains des
consiste à utiliser un tampon à +/- 1 unités de pH autour du pKa du tampon.
garnissages les plus récents sont stables jusqu'à pH 10, et d'autres même
Une autre difficulté qui peut être évitée avec un choix correct du pH est
jusqu'à pH 12. Même les garnissages classiques peuvent souvent être
la suppression de l'ionisation des analytes due aux interférences de la
utilisés dans la plage de pH alcalin, si des tampons moins agressifs sont choisis.
matrice. Il s'agit d'un problème courant dans l'analyse d'échantillons de
plasma par LC/MS.
Cependant, la plupart des interférences de matrice sont de nature ionique Q.ÿ: Quels sont les tampons les plus agressifs à éviterÿ?

ou ionisable, et les analytes d'intérêt sont souvent ioniques également.

Par conséquent, le schéma de coélution peut être modifié en modifiant le
R. : De toute évidence, le phosphate s'est avéré plus agressif dans la plage
pH de la phase mobile. Avec un changement approprié du schéma d'élution
de pH alcalin que les autres tampons. Par conséquent, je ne recommande
des analytes et des interférences, la suppression des ions peut être évitée.
pas d'utiliser des tampons de phosphate alcalin avec des garnitures à base
de silice ou des garnitures apparentées à base d'hybrides organiques
Occasionnellement, il peut être souhaitable d'exécuter la chromatographie
inorganiques. Le phosphate a de toute façon une plage de pH limitée.
à pH alcalin. Cela peut être dû au fait d'éviter la suppression d'ions ou au
L'ammoniac est également assez agressif, mais il peut être remplacé sans
désir d'améliorer la sensibilité en améliorant l'ionisation des analytes
difficulté par des amines organiques. De plus, les amines organiques
d'intérêt. Les analytes acides donnent la meilleure réponse MS dans la
couvrent une large gamme de pH, avec des valeurs de pKa allant de 9 à
plage de pH alcalin. D'autre part, nous avons constaté que même les
11,5.
analytes basiques réagissent encore étonnamment bien dans des conditions
alcalines. L'additif de phase mobile que nous utilisons pour les phases
Q. : OK, alors quels tampons sont recommandés ?
mobiles faiblement alcalines est le bicarbonate d'ammonium. Le pKa

les valeurs des constituants du tampon sont 9,2 et 10,2. Par conséquent, le R. : Nous avons réuni trois tableaux (1) de tampons adaptés à la gamme de

bicarbonate d'ammonium peut être utilisé sur une large plage de pH alcalin, pH alcalin. Le tableau 1 contient des tampons inorganiques, des tampons

avec la valeur la plus préférée à pH 10. Ce tampon est entièrement organiques du tableau 2 et des tampons zwitterioniques du tableau 3, tels

compatible MS. Lors du chauffage, le bicarbonate d'ammonium se qu'ils sont couramment utilisés dans les applications biochimiques. Certains

décompose uniquement en composants volatils : ammoniac, eau et dioxyde des tampons peuvent également être utilisés comme additifs de phase
de carbone. mobile, tout comme l'acide formique et l'acide acétique sont utilisés dans la

Pour résumerÿ: nous avons de bonnes solutions pour les tampons plage de pH acide. Les additifs de phase mobile peuvent être utiles pour le

compatibles MS dans la plage de pH acide de pH 3 à pH 5,5 et dans la contrôle de l'ionisation des analytes en dehors de +/- 2 unités de pH autour

plage de pH alcalin de pH 8,5 à pH 10.
Q.ÿ: Qu'en est-il du sel d'acétate d'ammoniumÿ? Je l'ai vu utilisé à pH neutre.
A. : Oui, j'ai vu ça aussi. Cependant, nous devons réaliser que ce n'est pas
du tout un tampon. À pH 7, l'acétate d'ammonium n'a aucun pouvoir tampon.
On devrait le considérer comme
du pKa de l'analyte. Cependant, si le pKa de l'analyte et le pKa de l'additif
de phase mobile sont dans la même plage de pH, un contrôle de la rétention
ou de la forme du pic peut ne pas fonctionner aussi bien qu'avec un vrai
tampon.
Parmi les tampons inorganiques, le bicarbonate d'ammonium est un très
bon choix pour une multitude de raisons. D'une part, il couvre une large
gamme de pH en raison des capacités tampons combinées de l'ion
carbonate et de l'ion ammonium. Dans

56
Machine Translated by Google

De plus, il est compatible avec la détection MS, car il se décompose en varie de 6 à 10,5. Il existe un tampon approprié pour toutes les plages de
composants volatils. Bien qu'il ait un faible fond dans la plage des UV pH d'intérêt dans cette discussion.
faibles, l'absorbance est à peu près la même que le fond de l'acide formique
ou acétique ou du TFA dans la plage acide. Ce n'est pas parfait, mais il Références :
peut être utilisé même dans des gradients dans les faibles UV avec une 1. Données rassemblées par Charles H. Phoebe, Waters Corporation 2.
bonne adéquation dans la composition de la phase mobile. UD Neue. TH Walter, BA Alden, Z. Jiang, RP

Fisk, JT Cook, KH Glose, JL Carmody, JM Grassi, YF Cheng, Z. Lu, R.

Tableau 1, Tampons inorganiques Crowley, American Laboratory 31, 22 (1999), 36 - 39
Valeur pKa du tampon Phosphate
2 7,21 Borate Plage de pH
1 9,14 Ammoniac 9,25 CarbonatePhosphate
2 10,25 3 6,2 – 8,2 8,1
12,33 Bicarbonate d'ammonium 9,25
8,2 –et10,5
10,25 – 10,1 8,2 –
10,3 9,2 – 48. Dérivatisation post-colonne
11,3 11,3 –
13,3
Q. : J'envisage la dérivatisation post-colonne pour améliorer la spécificité
et les limites de détection d'une méthode. Que dois-je prendre en compte
pour réussir ?
Tableau 2, Tampons
organiques Valeur pKa du tampon Glycine Plage de pH
8,8 – 10,8 A. : Beaucoup de choses ! Tout d'abord, vous devez trouver un schéma de
9,8 Triméthylamine 9,74 1-Méthylpipéridine
10,3
8.7 – 10.7 réaction rapide pour le ou les composés d'intérêt. Pour être compatible
Triéthylamine 10,75 Pipéridine 11,2
11,3
Pyrrolidine
avec une méthode HPLC, la réaction doit vous donner une bonne réponse
9,3 – 11,3
en moins de 5 minutes, préférentiellement en moins de 2 minutes.
9,7 – 11,8
Deuxièmement, la réaction doit être compatible avec la phase mobile HPLC.
10,2 – 12,2
10,3 – 12,3 Plus précisément, si vous utilisez une méthode en phase inverse pour votre
séparation, la réaction doit être compatible avec un milieu aqueux.

Tableau 3, tampons zwitterioniques

Ce n'est peut-être pas toujours le cas. Troisièmement, le ou les produits de

Amortir réaction doivent être facilement détectables avec des détecteurs HPLC
Valeur pKa Plage de pH
courants. Pour atteindre des limites de détection basses, le ou les produits
SEM 6,2 5,2 – 7,2 7,0 6,0
MOPSO – 8,0 7,3 6,3
7,5– –8,3
9,58,5 de réaction doivent être détectables dans des conditions où il y a peu
VADROUILLES
d'interférences natives d'autres composés. Des exemples de cette condition
sont la détection d'absorbance dans la plage de longueur d'onde visible ou
ROBINETS

CAPSO 9,7 8,7 – 10,7 10,5 9,5 la détection de fluorescence. Quatrièmement, la détection doit être
CASQUETTES – 11,5 suffisamment spécifique pour les objectifs de votre analyse.
Par exemple, un schéma de réaction générique pour les amines améliorera
la détection de toutes les amines dans le monde, mais si votre échantillon
Parmi les bases organiques (tableau 2), plusieurs options sont disponibles
ne contient que les amines que vous souhaitez détecter, cela peut être la
qui couvrent une large gamme de valeurs de pKa, de 9,7 pour la
meilleure solution à votre problème.
triméthylamine à 11,3 pour la pyrrolidine. La triméthylamine a un point
d'ébullition très bas et est compatible avec la détection MS. Bien sûr, vous
Q. : En effet, il y a beaucoup d'exigences. J'aimerais les comprendre un
devez utiliser un contre-ion compatible MS tel que le formiate ou vous
peu mieux. Pourquoi ai-je besoin d'un temps de réaction aussi court ?
pouvez utiliser la triméthylamine simplement comme additif de phase
mobile, comme vous utiliseriez de l'acide formique ou de l'acide acétique
dans la plage de pH acide. Nous avons utilisé avec succès des tampons
A. : Je viens de vous donner une règle générale. Cela signifie qu'il y a une
de pyrrolidine à pH 11,5 pendant de longues périodes (2) avec des colonnes
certaine flexibilité autour de cela. Considérons, ce qui est nécessaire! La
en phase inverse XTerra®.
séparation HPLC nécessite un flux constant de phase mobile. Ce flux de
La triéthylamine est l'additif traditionnel des tampons en phase inversée
phase mobile est mélangé post colonne avec le réactif de dérivatisation.
utilisés pour supprimer la traînée des analytes basiques. Les gens essaient
Ensuite, les flux combinés doivent être stockés quelque part jusqu'à ce que
d'éviter de l'utiliser en raison de son odeur désagréable.
la réaction ait développé les signaux souhaités. La manière courante de le
L'odeur est un inconvénient général des bases. Cependant, il existe
faire est dans un flux qui coule. La phase mobile peut s'écouler à 1 mL/min.
également une solution à cela : les tampons zwitterioniques, présentés
A cela, vous ajoutez du réactif au même débit.
dans le tableau 3. Ils ne sont pas volatils, donc il n'y a pas d'odeur.
D'autre part, cela les rend plus compatibles avec la détection MS.
Si votre réaction prend 5 minutes, vous avez besoin d'un volume de
Cependant, si votre méthode ne verra jamais un spectromètre de masse,
stockage de 10 mL entre la colonne et le détecteur. Il s'agit d'environ 250
les tampons zwitterioniques peuvent être un très bon choix. Ils sont utilisés
m de tube capillaire standard 9/1000. Même si vous utilisez un tube avec
dans de nombreuses applications en biochimie et sont disponibles en
un diamètre intérieur de 0,5 mm, vous avez encore besoin d'environ 50
bonne pureté. Les valeurs pKa du tableau 3

57
Machine Translated by Google
m de tube. C'est beaucoup de tubes. Vous devez également vous soucier de
la propagation de la bande dans le tube. Si vous utilisiez un tube ordinaire,
l'étalement de la bande serait de l'ordre d'un millilitre ou plus. La largeur de pic
d'un pic éluant à un facteur de rétention de 2 à partir d'une colonne de 4,6 mm
x 150 mm n'est que d'environ 0,2 ml. Les pics bien résolus dans la colonne
seraient dilués et mélangés les uns aux autres.
Par conséquent, l'étalement de bande extra-colonne dans notre exemple
détruirait la séparation que vous avez obtenue dans votre colonne HPLC haute
performance. Vous voyez maintenant pourquoi on veut avoir des temps de
réaction courts.
Q. : OK, je vois. Vous avez dit que cela s'applique lorsque l'on utilise un tube
"ordinaire". Qu'est-ce que cela signifie et quelles autres options ai-je ?
R. : Ce à quoi je faisais référence était un morceau de tube droit ou de simples
bobines. Si vous utilisez des tubes en téflon, vous pouvez faire quelque chose
pour l'étalement de la bande. Vous pouvez le "tricoter".
Q. : Qu'est-ce que c'est ? Tricoter un morceau de tube en téflon ???
A. : Vous avez bien entendu. Il s'agit d'une technique d'application d'un motif
de déformation contrôlée au tubage (1, 2, 3). Ce modèle contrôlé crée un flux
secondaire à l'intérieur du tube qui fournit un mélange radial. Le flux secondaire
réduit considérablement l'étalement des bandes dans le tube.
Le HETP peut être 100 ou même 1000 fois plus petit dans un tube
géométriquement déformé bien conçu que dans un tube droit. L'effet coûte un
peu en pression, mais ce n'est pas un problème dans des conditions de
fonctionnement typiques.
La partie importante de la technique de tricotage est le modèle de
déformation du chemin d'écoulement (1). On veut obtenir un déplacement
constant de la direction de la force centrifuge qui agit sur l'écoulement dans la
tubulure et crée le mélange radial. Quelque chose comme des montagnes
russes en trois dimensions.
Les meilleures configurations ont un HETP d'environ 0,5 cm, ce qui donne
environ 10 000 plaques dans 50 m de tube. Ces configurations hautes
performances rendent la dérivatisation post-colonne compatible avec les
séparations HPLC et éliminent largement le problème d'étalement de bande
décrit ci-dessus.
Les tubes en téflon sont également un bon choix pour d'autres raisons (3). Il
est inerte vis-à-vis de pratiquement tous les milieux réactionnels et phases
mobiles auxquels on peut penser, et il a une bonne stabilité à la température.
Afin d'accélérer une réaction, vous pouvez travailler à température élevée.
D'autres tubes en plastique peuvent devenir mous dans les conditions que
vous souhaitez utiliser.
Les tubes en acier ou en cuivre sont d'autres choix pour votre réacteur post-
colonne. Ils peuvent être suffisamment inertes vis-à-vis du milieu réactionnel
de votre réaction de dérivatisation. Cependant, les déformer dans les formes
optimales des morceaux de tube "tricotés" n'est pas une tâche simple. Vous
compromettez les performances d'étalement de bande par rapport à ce qui peut
être fait avec des tubes en téflon.
58
Q. : Parlons des conditions de réaction ! A quoi dois-je penser ?
R. : Tout d'abord, la réaction doit satisfaire vos besoins. Est-il suffisamment
spécifique et la détection est-elle suffisamment sensible. Un grand nombre de
réactions ont déjà été explorées, et un livre a été compilé sur le sujet (4). Cela
devrait vous aider à obtenir les informations de base dont vous avez besoin.
Vous devez explorer les différences entre les analytes d'intérêt et la matrice.
Plus votre réaction et vos schémas de détection sont spécifiques, plus vous
pouvez tolérer les interférences de matrice. De plus, la réponse des composés
inerest devrait être significativement différente du bruit de fond non réactif.
C'est la raison pour laquelle la plupart des schémas réactionnels publiés
entraînent la formation de couleur ou de fluorescence.
Ensuite, vous voulez avoir un temps de réaction raisonnablement court.
Des réactions lentes et des temps d'analyse courts ne sont pas compatibles.
Dans la plupart des cas pratiques, le temps de réaction ne doit pas dépasser 5
minutes. Vous pouvez accélérer la plupart des réactions en augmentant la
température ou en augmentant la concentration du réactif. La réaction n'a pas
besoin d'aller jusqu'au bout. En raison de l'effet combiné de la progression de
la réaction et de l'étalement de la bande dans le tube, vous obtiendrez la
réponse maximale du détecteur avant la fin de la réaction. Cependant, vous
devez trouver des conditions dans lesquelles de petites variations de la
concentration du réactif ou de la température n'affectent pas la réponse de
manière appréciable. Il n'est généralement pas difficile de trouver un plateau
dans le modèle de réponse. Bien sûr, cela peut également être analysé
mathématiquement (1), mais dans la plupart des cas pratiques, quelques
expériences fourniront la bonne réponse.
Vous envisagez de vous impliquer dans une technologie passionnante, et
je vous souhaite beaucoup de succès.
Références :
1. UD Neue, Ph.D. Thèse, Universität des Saarlandes,
Sarrebruck (1976)
2. H. Engelhardt, UD Neue, "Détecteur de réaction avec tubes ouverts enroulés
tridimensionnels en HPLC", Chromatographia Vol. 15 (1982) n° 7, 403-408
3. I. Krull, "Reaction Detection in Liquid Chromatography",
Marcel Dekker, New York (1986)
4. G. Lunn, LC Hellwig, "Manuel des réactions de dérivatisation pour HPLC",
Wiley & Sons, Inc., New York (1998)
49. Volume de maintien dégradé
Q.ÿ: Quel est le volume de gradient d'un système HPLC et comment affecte-t-
il l'analyseÿ?
A.ÿ: Le volume de séjour du gradient est le volume entre le point où le gradient
est mélangé et l'entrée de la colonne. Ce volume retarde l'apparition du
gradient, et est donc également appelé volume de retard de gradient.
Machine Translated by Google
La plupart des systèmes HPLC à gradient modernes sont des systèmes
à gradient basse pression à pompe unique. Cela signifie que le gradient
est mélangé en amont de la pompe. Le premier composant du volume de
retard de gradient est le volume du mélangeur de gradient.
A cela, il faut ajouter les connexions entre le mélangeur à gradient et les
têtes de pompe. Vient ensuite le volume des têtes de pompe. Ce qui suit
est la tubulure de connexion à l'injecteur.
Souvent, ce volume est augmenté pour fournir un mélange des
composants du gradient afin de lisser le gradient. Le volume de l'injecteur
et la connexion entre l'injecteur et la colonne représentent la partie
suivante du volume de séjour du gradient. Comme vous pouvez le voir,
avec un système de gradient à basse pression typique, il y a beaucoup
de volume où le gradient peut demeurer…
Il est également possible de générer le gradient du côté
haute pression. Cela nécessite au moins deux pompes, mais nous
permet d'éliminer tout le volume de retard de gradient.
Cependant, les systèmes à gradient haute pression ne sont généralement
pas configurés de cette manière. Normalement, la connexion entre les
deux pompes se fait en amont de l'injecteur. Cela présente l'avantage
que l'échantillon est toujours transporté vers la colonne et ne dépend
pas du débit dans l'une ou l'autre des pompes. Une meilleure approche,
quoique nécessitant un peu plus de précautions, consiste à injecter
l'échantillon dans le flux de la pompe qui délivre la totalité ou la majeure
partie de la phase mobile de démarrage. Cela signifie que le gradient est
mélangé derrière l'injecteur, et le volume de retard de gradient peut être
rendu complètement négligeable. Un petit inconvénient de cette
technique est que l'échantillon est un peu dilué avec le deuxième
composant de la phase mobile. Ce n'est qu'un problème mineur si le
dégradé commence avec 90 % de la composante A du dégradé. Ensuite,
l'échantillon n'est dilué qu'à 10 %. L'autre chose est qu'en général, la
plupart des pics d'un gradient sont concentrés sur la colonne. Par
conséquent, ce petit inconvénient peut affecter dans une faible mesure
seulement quelques pics qui éluent dans la partie isocratique du
chromatogramme avant le début du gradient. Dans ces circonstances,
nous devons nous assurer que le volume entre l'injecteur et la colonne
est négligeable. Les systèmes à gradient haute pression nous permettent
d'éviter complètement tout retard de gradient.
Voyons maintenant comment le volume de retard de gradient affecte
la séparationÿ! Puisqu'il faut du temps pour que le gradient atteigne la
colonne, le début du gradient est retardé. Il existe donc une période de
temps où la colonne fonctionne de manière isocratique dans la phase
mobile utilisée au début du gradient. Le premier effet peut être que les
pics d'élution précoces sont affectés par le volume de retard de gradient
et peuvent éluer différemment sur un autre instrument avec un volume de
retard de gradient différent. Si le volume de retard du gradient est une
partie substantielle de l'analyse chromatographique, on peut observer des
différences assez importantes dans le profil d'élution au début de l'analyse.
Tard dans le gradient, le schéma d'élution reste le même indépendamment
du volume de retard. Cependant, le temps d'élution se déplacera en
proportion directe avec le changement du volume de retard de gradient.
Ces deux conditions sont plutôt ennuyeuses.
Ce sont les raisons pour lesquelles les méthodes de gradient sont souvent
évitées dans un laboratoire de CQ. Après tout, les analytes sont
généralement identifiés à l'aide du temps de rétention, et si les temps de rétention
59
changer d'instrument en instrument, on a du mal avec l'identification. Bien
sûr, il existe des moyens de contourner cela. Par exemple, on peut
spécifier le modèle de rétention sous la forme de différences par rapport
aux temps de rétention d'un standard. Cependant, cela complique les
choses…
Q. : Je suis d'accord, c'est un peu plus compliqué, mais ce n'est pas un
obstacle insurmontable. Y a-t-il d'autres problèmes à considérer?
A.ÿ: S'il y a un volume de mélange important dans un système à gradient
basse pression, on observera également que le gradient n'est pas net.
Cela ne joue généralement pas un grand rôle dans les gradients linéaires
standard, mais cela peut affecter le schéma d'élution si des étapes sont
utilisées dans le gradient. Généralement, on préfère utiliser des systèmes
à gradient avec un petit volume de retard. De nombreux systèmes HPLC
modernes sont conçus pour un retard de gradient minimal.
Pour des gradients très rapides avec un temps de cycle minimal, même
un très petit volume de retard de gradient peut ne pas être suffisant.
D'autres solutions ont donc été mises en place. Pour des analyses de
routine très rapides, la technique d'injection différée peut être utilisée. En
principe, le gradient lui-même est exécuté comme dans des conditions de
fonctionnement normales. Cependant, la première injection est retardée
jusqu'à ce que le gradient atteigne l'injecteur.
Juste à ce moment, l'échantillon est injecté. L'échantillon est maintenant
essentiellement séparé par le gradient comme si aucun volume de retard
de gradient n'était présent. Bien entendu, il existe un petit volume de
retard comprenant le volume de la boucle d'injection et de la tubulure
entre l'injecteur et la colonne. Mais cela peut être rendu négligeable.
Après l'exécution du gradient, la colonne est rééquilibrée avec la phase
mobile de départ. Bien entendu, le rééquilibrage sera retardé du même
temps que le gradient lui-même. Par conséquent, nous n'avons pas besoin
d'attendre que la colonne soit rééquilibrée pour démarrer la prochaine
analyse de gradient. Nous devons simplement nous rappeler que ce que
nous programmons dans l'instrument et ce que la pompe exécute est
différent de ce qui se passe réellement à l'entrée de la colonne. L'exécution
du gradient et le rééquilibrage de la colonne sont juste compensés par le
temps nécessaire pour purger le volume de retard du gradient. Cette
solution moderne au problème du retard de gradient nous permet
d'exécuter des gradients rapides sans retard sur des instruments à pompe
unique. De plus, si nous exécutons le même programme avec différents
instruments, les différences possibles dans le volume de retard de gradient
peuvent être rendues négligeables. Cela devrait nous permettre d'exécuter
de vrais gradients de manière reproductible sur différents instruments.
Bien sûr, tout cela suppose que le générateur de gradient fonctionne de
manière fiable et reproductible et génère effectivement le gradient que
nous aimerions voir.
Q. : OK, ça sonne bien. Comment puis-je mesurer le volume de retard de
gradient et comment puis-je m'assurer que le système délivre avec
précision le gradient que je souhaite ?
R.ÿ: Il existe un test standard qui est très utile. Vous pouvez exécuter
votre gradient sans colonne en place avec une petite quantité d'un
absorbeur d'UV dans la phase mobile B. Cela vous permet d'observer
l'exécution réelle du gradient. Du
Machine Translated by Google
différence entre le programme et l'exécution réelle du gradient, vous
pouvez déterminer le volume de retard du gradient de votre système.
C'est quelque chose que vous voudrez peut-être savoir de toute façon,
si vous voulez profiter pleinement de l'astuce avec l'injection retardée.
Plus vous en savez sur votre système, plus vous réussirez à éliminer
le temps perdu dans les séparations de gradient.
50. Capacité tampon
Q.ÿ: Qu'est-ce que la capacité tampon et pourquoi est-elle importanteÿ?
R. : La capacité tampon est une mesure de la force du tampon.
Mathématiquement, c'est la valeur réciproque de la pente de la courbe
de titrage d'un tampon. Il spécifie la quantité d'ions hydronium ou
d'ions hydroxy nécessaires pour modifier le pH du tampon d'une
certaine valeur. Plus la capacité tampon est grande, plus la quantité
d'acide ou de base pouvant être ajoutée à la solution sans modification
du pH est importante.
Cela montre également pourquoi la capacité tampon est importante
en chromatographie. On sait que la rétention d'analytes ioniques ou
ionisables peut dépendre du pH de la phase mobile. Si nous sommes
dans une situation comme celle-ci, il est important d'avoir un bon
contrôle sur le pH de la phase mobile. Si nous n'avons pas un bon
contrôle, la rétention des analytes et même la sélectivité de la
séparation peuvent varier d'un jour à l'autre avec la préparation de la
phase mobile. Ceci bien sûr n'est pas souhaitable.
Permettez-moi de vous donner quelques exemples pour clarifier cela.
Supposons que nous séparons deux acides avec un pKa similaire
entre 4 et 5 en utilisant une colonne en phase inverse. Nous avons
préparé la phase mobile avec KH2PO4, ce qui nous donne un pH
d'environ 4,5. C'est à peu près la pire situation que l'on puisse rencontrer.
En chromatographie en phase inversée, la rétention des deux acides
de nos échantillons dépendra fortement du degré d'ionisation des
acides. La forme ionique d'un analyte est toujours beaucoup moins
retenue que la forme non ionique. Une bonne règle empirique est que
la rétention des deux formes est différente d'environ un facteur de 30.
Par conséquent, la rétention de nos deux analytes peut changer
beaucoup, si le pH varie juste un peu. De plus, le changement de
rétention peut être différent pour les deux acides, surtout si l'on
considère que les deux ont un pKa similaire, mais pas le même pKa.
Par conséquent, la résolution entre les deux composés changera, car
il y a de petits changements dans le pH de la phase mobile. Bien sûr,
si les pics sont séparés d'un mile, ce n'est pas pertinent, mais s'ils
s'éluent proches les uns des autres, un petit décalage de pH peut
signifier que parfois nous obtenons une résolution parfaite et une
autre fois les pics se chevauchent. La conséquence en est que nous
avons besoin d'un bon contrôle du pH de la phase mobile pour obtenir
une bonne reproductibilité de la rétention et de la résolution.
Cependant, cela n'est pas réalisable avec la phase mobile que
nous utilisons. Nous avons préparé la phase mobile avec KH2PO4,
qui n'a aucun pouvoir tampon à pH 4,5. Les valeurs de pKa du
phosphate sont à 2 et 7 Si seulement une petite quantité d'acide ou
de base est ajoutée à cette phase mobile,
60
le pH change radicalement. Puisque le pH change, la rétention de
mes deux analytes changera et la résolution changera également.
Avec cette configuration, nous avons maximisé l'irreproductibilité de
la séparation. Bien sûr, d'autres problèmes sont également possibles.
Il est fort probable que la forme du pic d'un ou même des deux
analytes souffre également, surtout si la quantité d'échantillon injectée
sur la colonne est élevée.
Q. : OK, je suis d'accord que nous avons un problème. Que pouvons-nous faire pour
le résoudre ?
R. : Le plus simple est d'utiliser un tampon avec une bonne capacité
tampon. Si le pH peut être contrôlé de manière à ce qu'il soit le même
d'un jour à l'autre avec chaque préparation de la phase mobile, nous
avons de bien meilleures chances d'obtenir une chromatographie
reproductible. Nous voulons maintenir le pH pour maintenir
l'espacement des pics. Par conséquent, nous avons besoin d'un
tampon qui a une bonne capacité tampon autour de pH 4,5. Un
tampon a toujours la meilleure capacité tampon autour de son pKa.
L'acide acétique a un pKa de 4,75. Il est parfaitement adapté au
problème de séparation en question. Il a un très bon pouvoir tampon
à pH 4,5. Si effectivement la meilleure séparation et la meilleure
rétention est obtenue à pH 4,5, on peut utiliser un tampon acétate à pH 4,5.
En revanche, si la séparation est toujours satisfaisante à pH 4,75, il
est encore préférable de sélectionner ce pH car le pouvoir tampon
d'un tampon est toujours le plus élevé au pKa du tampon.
Q. : C'est intéressant. Pouvez-vous fournir un peu plus d'informations
sur la capacité de la mémoire tamponÿ?
A.ÿ: Oui, laissez-moi décrire la théorie derrière tout celaÿ! La capacité
tampon estÿ définie comme suit :
ÿ = 2.303
ÿ
C ÿ
KH
un
ÿ
[] +
(1)
(KH un
+ [ ) ]2+
C est la concentration totale du tampon, Ka est la constante de
dissociation du tampon et [H+ ] est la concentration en ions hydrogène.
Dans notre nomenclature commune de pKa et de pH, cela peut être
réécrit pour lire : pK pH
ÿÿ
un
dix
ÿ = 2.303 C
ÿ ÿ
(2)
(dix ÿ
paquetun
+ dix
ÿ
pH
)2
Avec cette équation, nous pouvons calculer la capacité tampon de
n'importe quel tampon. La courbe de capacité tampon pour un tampon
acétate est illustrée à la figure 1. La courbe ressemble à un pic
chromatographique. On peut voir que la capacité tampon est la plus
élevée autour du pKa du tampon, à pH 4,75. Elle chute lentement
dans les deux sens, et à pH 3,15 et 6,35 elle n'est qu'à 1/10 de la
valeur qu'elle avait au maximum. C'est la raison de la règle empirique
selon laquelle un tampon ne doit jamais être utilisé en dehors de 1,5
unités de pH autour de son pKa, car il perd sa capacité tampon en
dehors de cette plage. Nous utilisons couramment des tampons avec
une concentration de 50 mM, et la règle a été créée pour les tampons
de cette concentration. Cependant, dans les applications LC/MS, la
concentration du tampon n'est souvent que d'environ 10 mM. Cela
signifie qu'à un tampon aussi faible
Machine Translated by Google

concentration, on peut vouloir limiter la règle de l'utilité du tampon à environ
+/- 1 unité de pH autour du pKa du tampon.
Vous pouvez utiliser les équations présentées ici pour calculer la
capacité tampon d'autres tampons, tels que les tampons phosphate ou les
tampons citrate. Pour les tampons à constantes de dissociation multiples,
les capacités tampons des différentes espèces peuvent simplement être
additionnées. Cependant, le point important de cette discussion est le fait
que nous devons choisir des tampons avec une bonne capacité tampon
au pH que nous devons utiliser pour optimiser une séparation.
détecteur. Si je laisse un échantillon reposer dans la cellule de détection
d'un détecteur sensible à la concentration, le signal restera constant, au
moins dans des délais raisonnables.
L'aire du pic est déterminée par l'intégration du signal dans le temps. Cela
signifie en termes simples que si je laisse le même signal être émis par le
détecteur pendant le double du temps, j'obtiens également le double de la
zone de crête. C'est exactement ce qui se passe lorsque vous modifiez le
débit de 1 mL/min à 0,5 mL/min.
Voici le calcul. L'aire du pic A est le signal S multiplié par le temps tÿ:

Capacité tampon d'un tampon acétate

A = S ÿt (1)
0,07

0,06 Le signal S est proportionnel à la concentration c de l'analyte :

0,05

0,04 S=pÿc (2)

0,03
UNE = p ÿ c ÿ t (3)
0,02

0,01 La concentration est la masse m divisée par le volume V :

0
0 2 4 6 8 dix 12 14 m
A=pÿ
ÿ

t (4)
pH V
Figure 1 : Capacité tampon d'un tampon acétate 0,1 M.
Et enfin, le volume divisé par le temps n'est rien d'autre que le débit F :

51. Changements de débit et quantification Uwe D. Neue et

1
Tony Gilby Un=h (5)
ÿ ÿ

Q. : Mon injecteur fait quelque chose de très particulier que je ne

Comme on peut le voir, la surface du pic est proportionnelle à la masse
comprends pas. Il injecte le double de la quantité d'échantillon à 0,5 mL/
injectée divisée par le débit. C'est la raison pour laquelle vous obtenez le
min qu'à 1 mL/min, et il le fait de manière reproductible.
double du signal intégré à la moitié du débit.
Que ce passe-t-il?

Q. : D'accord. Je comprends. Vous avez dit que cela vaut pour les
A. : Comment arrivez-vous à la conclusion que c'est le cas ?
détecteurs sensibles à la concentration. Qu'est-ce que ça veut dire?
Tous les détecteurs ne sont-ils pas sensibles à la concentration ?
Q. : Eh bien, j'ai mis dans la table d'injection d'échantillon un volume
d'injection de 5 µL d'échantillon. J'exécute la méthode à des débits de 1
R. : Non, tous les détecteurs ne le sont pas. Dans le cas évoqué ci-dessus,
mL/min et 0,5 mL/min, à l'aide d'un détecteur UV. Les aires de pic que
le signal reste le même, même si je modifie le débit. Tous les détecteurs
j'obtiens à 0,5 mL/min sont presque exactement le double des aires de pic
LC classiques sont de ce type : détecteurs photométriques comme les
que j'obtiens à 1 mL/min.
détecteurs d'absorbance UV et UV-Vis ou photodiodearray, détecteurs,
fluorescence
réfractomètres ou détecteurs mesurant la constante diélectrique,
détecteurs
ou
A. : OK, maintenant je comprends. Voici ce qui se passe : votre injecteur
de conductivité comme ceux utilisés en chromatographie ionique.
fonctionne très bien, mais l'intégration de la zone de pointe dépend du
débit. Laisse-moi expliquer!
D'autres détecteurs rarement utilisés entrent dans la même catégorie.
Des exemples sont des détecteurs qui mesurent la rotation optique d'un
Presque tous les détecteurs HPLC classiques sont conçus pour donner un
échantillon.
signal de sortie qui mesure la quantité d'échantillon dans la cuve à
circulation à un moment donné - le nombre de molécules d'analyte si vous
Un test simple peut être effectué pour montrer s'il s'agit ou non d'un vrai
le souhaitez. Le volume cellulaire étant constant, cela équivaut à mesurer
détecteur sensible à la concentration : on pompe un liquide porteur
la concentration moyenne dans la cellule. Un exemple typique de ceci est
d'analyte dans le détecteur, puis
l'absorbance UV

61
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arrête le flux. Si le signal reste constant, on a affaire à un vrai détecteur
sensible à la concentration.
Q.ÿ: Une fois, j'ai utilisé un détecteur de radioactivité et j'ai remarqué que si
le flux s'arrêtait, la sortie du détecteur continuait d'augmenter.
Est-ce différent des détecteurs sensibles à la concentration que vous décrivez
ci-dessusÿ?
R.ÿ: Non, il s'agit toujours d'un détecteur sensible à la concentration. Les
coups par seconde sont une mesure du nombre d'atomes d'isotopes
radioactifs dans la cellule. Ce qui est déroutant, c'est que la sortie du
détecteur, les comptages totaux, est en fait l'intégrale du taux de comptage
dans le temps. La sortie du détecteur vous donne directement le signal
intégré sur le pic. À des débits plus lents, vous obtiendrez un signal plus
élevé à partir du même pic, et donc une sensibilité plus élevée. Vous pouvez
optimiser le signal en fonction des besoins de l'analyse en arrêtant le flux au
moment où l'échantillon entre dans le détecteur.
La détection par dérivatisation post-colonne peut également être compliquée.
Les détecteurs réels utilisés sont sensibles à la concentration
détecteurs tels que les détecteurs d'absorbance ou de fluorescence
détecteurs. Cependant, uniquement pour les réactions très rapides, la
réaction est conduite jusqu'au point final. La plupart du temps, la réaction est
incomplète. Dans ces circonstances, le rendement dépendra du débit, des
débits plus lents entraînant un temps de réaction plus long et par conséquent
un rendement plus élevé et une sensibilité plus élevée.
Un cas intéressant est l'utilisation de détecteurs électrochimiques tels que
les détecteurs ampérométriques et les détecteurs coulométriques (1). Pour
les détecteurs ampérométriques, l'électrolyse des espèces détectées n'est
pas complète. Seuls 1 à 10 % de l'analyte sont consommés. Par conséquent,
le détecteur ampérométrique fonctionne comme un détecteur sensible à la
concentration. Dans la détection coulométrique, tout l'analyte est consommé
dans le processus de détection. Ainsi, le signal intégré total est indépendant
du débit. C'est l'inverse de ce dont nous avions parlé plus haut pour un
détecteur UV. La détection coulométrique est donc une technique de détection
proportionnelle à la masse.
La principale caractéristique d'un vrai détecteur proportionnel à la masse est
le fait que le signal intégré ne dépend pas du temps qu'il a fallu pour acquérir
le signal. C'est la chose la plus importante à retenir à propos de la détection
proportionnelle à la masse. Voici un exemple. Un simple détecteur
proportionnel à la masse a été rapporté dans les premiers temps de la HPLC
(2). L'effluent de la colonne a été recueilli sur une balance, le solvant a été
évaporé et le résidu a été pesé. Bien que cela soit intéressant, cela ne s'est
pas avéré pratique. Cependant, il montre clairement comment fonctionne un
détecteur proportionnel de masse. Dans ce cas, la hauteur du signal est la
masse qui s'est accumulée sur la balance. Ainsi, le signal est toujours un
signal intégré, et sa hauteur ne dépend pas, si je transporte l'échantillon vers
le détecteur rapidement ou lentement. Si j'injecte la même masse dans le
système HPLC à haut débit ou à faible débit, il
62
reste la même masse, et ma balance me donne le même signal.
D'autres détecteurs proportionnels à la masse sont certains détecteurs GC
tels que le détecteur à ionisation de flamme (FID), qui entraîne la destruction
complète des molécules d'analyte. Le FID a été utilisé en LC grâce à
l'utilisation d'interfaces spécifiques, telles que l'interface de courroie mobile
ou de fil mobile. L'utilisation de détecteurs GC en LC est cependant restée
rare.
Aujourd'hui, les spectromètres de masse sont souvent utilisés en combinaison
avec la LC. Le fait qu'un spectromètre de masse soit un détecteur
proportionnel de masse ou de concentration dépend de l'interface.
Les interfaces d'électronébulisation actuelles se comportent comme des
détecteurs sensibles à la concentration sur la plage de débit couramment utilisée.
On pourrait s'attendre à ce que le nombre d'ions analytes mesurés par le
spectromètre de masse par seconde (son signal, un courant ionique)
augmente si le nombre de molécules d'analyte atteignant la pointe
d'électrospray par seconde était augmenté - c'est-à-dire en augmentant le
débit. Cela ne se retrouve pas dans la pratique, en raison de la concurrence
dans l'interface pour ioniser les molécules de solvant, qui arrivent également
à un rythme plus rapide. Sans injection fréquente d'étalons de masse, les
spectromètres de masse et l'interface HPLC associée rendent les détecteurs
quantitatifs peu fiables.
J'espère que cette petite excursion dans la réponse du détecteur a clarifié
les problèmes de quantification. La chose la plus importante à retenir pour
l'utilisateur de la chromatographie liquide est le fait que la plupart des
détecteurs LC sont des détecteurs sensibles à la concentration et que le
signal intégré des détecteurs sensibles à la concentration dépend du débit.
Références :
1. CF Poole et SK Poole, « Chromatography Today », Elsevier, 1994, pp.
586 ff.
2. WW Schulz, WH King, Jr., J. Chromatogr. Sci. 11 (1973), 343
52. Analyse des composés polaires
Q. : J'ai quelques composés très polaires à analyser. J'ai des problèmes de
rétention sur les colonnes C18 standard. Que puis-je faire?
A. : Vous n'êtes pas seul. Cette question apparaît de plus en plus
fréquemment sur les panneaux d'affichage discutant des problèmes HPLC.
La bonne nouvelle est qu'il existe quelques solutions à ce problème, et l'une
ou l'autre est susceptible de fonctionner pour votre problème spécifique.
Q. : Ah bon. Je suis content d'entendre cela. Quelles sont ces solutions ?
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R. : Dans l'ensemble, il existe trois possibilités qui peuvent être utilisées pour
obtenir une bonne rétention des composés très polaires. La première consiste
à passer des colonnes à phase inversée au HILIC…
Q. : HILIC ? Qu'est-ce que c'est?
R. : HILIC signifie chromatographie d'interaction hydrophile, terme utilisé pour
la première fois par Andy Alpert (1). Il fonctionne avec des phases stationnaires
polaires telles que la silice et des phases mobiles avec une forte teneur en
solvant organique et une plus faible teneur en eau. Le mécanisme de rétention
est à l'opposé de la phase inversée. Les composés polaires sont plus fortement
retenus, et la rétention diminue lorsque la teneur en eau de la phase mobile
augmente. L'exemple le plus connu est la séparation des sucres sur colonnes
aminées, une technique publiée pour la première fois par Fred Rabel et Art
Caputo (2). Dans ce cas, la phase mobile est constituée d'environ 75 %
d'acétonitrile et 25 % d'eau. Le principe sous-jacent de cette technique est la
séparation de l'analyte en une couche superficielle fortement enrichie en eau
(3). Par conséquent, plus l'analyte est soluble dans l'eau, plus la rétention est
observée. A l'inverse, moins l'analyte est soluble dans la phase mobile, plus on
observe de rétention.
Cette technique peut être encore améliorée via d'autres mécanismes de
rétention, tels que les interactions ioniques ou l'échange d'ions (4).
Une des difficultés de cette technique est la faible solubilité des échantillons
très polaires dans une phase mobile à forte concentration en acétonitrile.
Cependant, ce n'est pas aussi mauvais qu'on pourrait le penser. Entre autres
choses, vous pouvez dissoudre l'échantillon dans une composition de solvant
avec une teneur en eau plus élevée que la phase mobile, ou même dans de
l'eau pure. Si vous faites cela, il vous suffit de réduire le volume d'injection afin
de ne pas obtenir de distorsions maximales.
En général, la chose importante à retenir est que HILIC fonctionne mieux pour
les échantillons très polaires avec une bonne solubilité dans l'eau.
Q. : OK, ça sonne bien. Quelles sont les autres options ?
R. : La deuxième possibilité est l'utilisation de colonnes en phase inverse
spécialement conçues pour la rétention de composés très polaires. Le problème
avec certaines des meilleures colonnes à phase inversée standard est qu'elles
ne peuvent pas être utilisées avec des phases mobiles contenant 100 % d'eau.
Q. : Exactement. Lorsque j'ai essayé d'utiliser une phase mobile avec une
teneur en eau très élevée, je n'ai pas pu obtenir une rétention reproductible, et
parfois j'ai obtenu une rétention inférieure à ce que je pensais devoir obtenir.
R. : Oui, c'est le problème auquel je faisais référence. On l'appelle parfois «
effondrement hydrophobe », mais une meilleure expression est « démouillage
des pores ». Les phases modernes très hydrophobes et très désactivées
perdent leur rétention en phases mobiles fortement aqueuses. Le problème
sous-jacent est la mouillabilité de la phase stationnaire avec l'eau. Depuis l'eau
63
ne mouille pas la surface, elle est chassée de tout ou partie des pores du
garnissage. La surface devient « non mouillée » et la rétention est perdue.
Il existe deux manières de rendre un garnissage en phase inverse plus
compatible avec une phase mobile aqueuse.
La première est l'incorporation d'un groupe polaire dans la phase stationnaire,
soit intégré au ligand, soit en seconde réaction. Les groupes fonctionnels
typiques pour les phases avec des groupes polaires incorporés sont les groupes
amide ou carbamate (5). Ces groupes fonctionnels polaires empêchent
l'effondrement hydrophobe, mais ils réduisent également quelque peu
l'hydrophobicité de la phase stationnaire. Par conséquent, ils améliorent les
propriétés de rétention d'un garnissage, mais il existe une solution encore
meilleure.
Cette deuxième solution est simplement une réduction de l'effet hydrophobe qui
provoque l'effondrement hydrophobe. L'effondrement hydrophobe est un
phénomène de mouillage. Si je réduis la densité de ligand du ligand C18, je
peux créer un garnissage en phase inverse qui est toujours très hydrophobe,
mais qui est également mouillable à l'eau. Cela nécessite une bonne
compréhension des propriétés sous-jacentes du garnissage et de l'influence
des différents paramètres sur la mouillabilité et la rétention. Des garnitures ont
été préparées qui équilibrent délibérément l'hydrophobicité avec la mouillabilité
à l'eau (6). Un garnissage en phase inversée soigneusement conçu comme
celui-ci obtient toujours une bonne rétention dans les phases mobiles entièrement
aqueuses sans subir l'effondrement hydrophobe.
Q. : OK, et quelle est la troisième option ?
R. : La dernière option dépend du type d'analytes que vous utilisez. S'il s'agit de
composés ioniques tels que des amines ou des acides, ils peuvent être convertis
en une forme neutre en modifiant le pH de la phase mobile. Les amines peuvent
spécifiquement être converties en une forme neutre non chargée à pH alcalin,
autour de pH 10. Dans ces circonstances, la rétention chromatographique
augmente d'un facteur important. Souvent, une augmentation de 10 à 30 fois
de la rétention est trouvée en changeant le pH et en changeant l'analyte de la
forme ionique à la forme non ionique. Bien sûr, vous avez besoin d'un emballage
qui a été conçu pour une utilisation à pH élevé. Heureusement, des garnitures
de ce type sont aujourd'hui disponibles (7), et ce procédé peut être utilisé très
efficacement et sans difficulté.
Q. : Merci pour votre description des différentes options !
Mes composés sont des composés très polaires avec des groupes acides et
basiques. Il semble que l'une ou l'autre de ces solutions pourrait fonctionner
pour moi. Lequel recommandez-vous?
R. : Sans détails expérimentaux, cela peut être difficile à prévoir.
J'ai déjà mentionné la difficulté avec la solubilité de l'analyte dans la phase
mobile avec HILIC. Parmi les solutions en phase inverse, j'opterais pour la
solution qui a été optimisée spécifiquement dans le but d'obtenir une rétention
élevée pour le type de composés polaires dont vous avez besoin
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séparer. Cependant, vous devez également considérer que

chacune de ces solutions peut vous apporter l'amélioration dont
vous avez besoin. De plus, la sélectivité de la séparation est
susceptible d'être différente entre les différentes solutions. Dans
la plupart des cas, il peut donc être intéressant d'explorer plus d'un outil.

Références :
1. AJ Alpert, J. Chromatogr. 499 (1990), 177-196 2. FM
Rable, AG Caputo, ET Butts, J. Chromatogr. 126 (1976),
731-740 3. UD Neue, Colonnes HPLC, Wiley-VCH (1997)

4. MA Strege, S. Stevenson, SM Lawrence, Anal.

Chem 72 (2000), 4629-4633
5. UD Neue, Y.-F. Cheng, Z. Lu, BA Alden, PC
Iraneta, CH Phoebe, K. Tran, Chromatographie 54
(3/4) (2001), 169-177
6. DM Wagrowski-Diehl, ES Grumbach, PC Iraneta, «
Development of New HPLC Columns for the Retention and
Separation of Highly Polar Compounds », présentation à la
Pittsburgh Conference 2002 7. UD Neue, CH Phoebe, K.
Tran, Y.-F. Cheng, Z. Lu, J. Chromatogr. A 925 (2001), 49-67

64
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Indice

Matière Matière 6 , 31
Alumine Pages 10, 11, Stabilité hydrolytique 3, 6,
Bulle d'air 22, 30 6, 18, Hydrolyse 22, 31, 33 6,
Colonnes amino 26 4, 10, 11, 22, 30, 31, Effondrement hydrophobe 23, 24, 50, 63
40, 41 Impuretés 19, 26, 41, 46, 49, 51
Volume d'injection 11, 18, 28, 29, 44 18
Rétroconsommation 3, 48
L'intégration
18, 23, 24, 28 , 32,
Contre-pression 14, 15, 16, 17, 18, 23, 34,
Ingérence 38, 56, 58 49 31, 32
45, 46, 47, 48, 51 11, 12,
57, 58 32, 38-40, 45,
Diffusion de bande 27, 28, 44, 48, 58 4, 7, 12, 13,
Échangeur d'ions 46, 48, 51
Ligne de base 18, 25 , 26 23 3, 6-11, 22-24,
Sang 30-33, 39-41, 48-50 4, 8, 14-17, Appariement ionique
Tubes tricotés
Phases greffées 20, 23-26, 28, 29, 31-33, 36, 37,
Durée de vie
41-44, 46, 49, 52, 53, 55, 56, 60,
Amortir 61 20, 42, 60 22, 24, 31, 40, 41 Extraction liquide-liquide 23, 28
Contrôle de la méthode 41
34, 35 19 14
Développement de méthodes 29, 39, 40, 51, 52
Vérification de la méthode 39
Détection MS 55, 56
Capacité tampon
Colonnes à alésage étroit 26
Les glucides
Charge de carbone
Bruit 18, 20, 25, 26, 28, 43, 44

Reporter Chromatographie en phase normale 5, 10, 22, 30

Surcharge 9, 28, 44, 45 4, 6, 8, 20-22, 24, 25, pH 30-33, 36, 37,
Système bouché
Chauffe-colonne 14 20, 25, 36, 37, 42-44, 56, 57, 60 31, 32 17-19 9,41-43, 46, 52,
29, 35-37, 42,53,
43,55,
48,56
50,

22-25, 53 5, 56, 60 23, 24, 38, 46, 53, 54, 56

Conditionnement
Contamination 6, 26,38, 39, 41,45, 46, 53 7 , 15, 16, 27, 34, 45-48, 54, 55

10, 11, 31, 40 11, 27, 51 4, pKa 62 57, 58 14, 19, 23, 26, 46 3,

56 12, 29, 30, 51, 58, 59 9, 14, 15, 26, 28, 38, 49 28 3, 8,
Colonnes cyano
Volume mort 11-13, 18-20, 25-28, 43, 44, Chromatographie ionique appariée 15, 18 , 19, 23, 24, 38, 39, 46 7,
Zone de pointe 8, 23, 24 5, 6, 7, 10, 22, 24, 40
Dégazage 51, 57, 58, 61, 62 15, 16, 34
40, 41, 45 5, 6, 22 10, 12-14, Forme de pic 7, 24, 40 5, 6, 24 4, 22 4 5 20 3,
Volume de retard
Détecteur 58, 59 4 -6, 8, 10, 19, 21-22, 7, 8, 23, 28, 29, 38, 46, 53, 54
Plasma 46, 52 28, 29, 45, 52 3, 14, 18,
25, 30-32, 39, 59 4, 6, 22 9, 27,
Coefficient de diffusion 28, 48 46 3, 14, 15, 17, 38, 46,
Numération sur plaque 45, 52

Double pics 52 11, 15-18, 23, 26-27, 29-

Dérive Composés polaires
Volume d'attente Dérivatisation post-colonne

Equilibration Précipitation
Précolonne
Préconcentration
Évaporation
Effets extra-colonne Protéine

Analyse rapide
Filtre Récupération
Débit Reproductibilité
Lot à lot
30, 33, 37-38, 44, 47, 54-55,
Colonne à colonne
57 18,19 6, 12-14, 18, 19,
Rétention
Pics fantômes 21, 26, 29, 30, 37, 38, 51,
Pente Variable
54, 55, 57- 59 29-30 57-59 3,
14, 15, 17, 38, 39, 46, 48, 49, Dérive

51 16, 57, 58 63 Rétention et pH

La préparation des échantillons
Mise à l'échelle

Gradients balistiques
Colonne de garde Exemple de matrice
Solvant d'échantillon
HETP Scellés

HILIC

65
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Matière Pages
Sélectivité 7, 10, 21, 22, 37, 38, 41,
42, 49, 60, 64 28, 29, 43,
Sensibilité 44, 51, 56, 62 6, 8, 9, 22,
Silanols 24, 34-37, 49 , 50, 53 4, 5,
10, 11, 16, 21, 22, 30, 32,
Silice 33, 35, 37, 50, 53, 56. 63
Chromatographie d'exclusion
stérique 23 Extraction en
phase solide Consommation de solvant Solubilité Spécifications
Stockage ( colonne) 7, 8, 15, 24, 28, 38 26,
28, 44 3, 5, 32, 42, 45,
48, 63 6, 7, 22 5, 14, 23,
30-32, 57 40, 41 11, 12
8-10, 18, 32, 36, 37, 44, 50,
Séparation du sucre 57 4, 6, 14, 17, 18, 22, 24,
Volume du système 25, 32, 41, 46, 58 9, 43 16,
Résidus 33 14-17 , 33, 34 5, 10

Température

Constante de
temps équation de van Deemter
Viscosité
Solvants saturés d'eau

66
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Australia Allemagne Porto Rico

Waters Australia Pty. Limited Eaux GmbH Société des technologies des eaux
Tél. : 2 9933 1777 Fax : 2 9898 Tél. : 49 6196 400600 Tél : 787 747 8445

1455 Télécopie : 49 6196 482388 Télécopie : 787 747 8448

Autriche et exportation européenne Hongrie Russie/CEI

(Europe centrale, CEI, Moyen-Orient, Kft des eaux Waters Ges.mbH

Inde et eaux du sous-continent indien Tél : 36 1 350 5086 Bureau de représentation

Ges.mbH Télécopie : 36 1 350 5087 Tél : 7 095 931 9193

Tél : 43 1 877 1807 Fax : Télécopie : 7 095 336 7000

India
43 1 877 1808
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Eaux belges et Tél. : 91 80 837 1900 Fax : Waters Asia Ltd. (siège social en Asie)
luxembourgeoises SA-NV 91 80 839 2157 Tél. : 65 6278 7997 Fax :

Tél : 32 2 726 1000 Fax : 65 6278 7557

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Brésil Tél : 44 208 238 6100 Espagne Eaux Chromatografia SA
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Canada Tél : 39 02 274 211 Fax : Eaux Sverige AB

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