Milieux de culture: Litsky, Slanetz, Bile esculine.

Et identification des streptocoques.

Réalisé par: Noura BAHAYON et Asma KINAD

Encadré par: Mme Hikmat Elbakkali
Le Milieu de Litsky
PRINCIPE :
Le Milieu de Litsky est un milieu sélectif utilisé pour la confirmation lors des
recherches et dénombrements des Streptocoques fécaux dans les eaux.
Après une culture positive sur milieu de Rothe, la présence d'éthyl violet et
d'azide de sodium du milieu de Litsky inhibe la croissance des tous les
micro-organismes autres que les Streptocoques fécaux.
Le milieu de Litsky n’est qu’un milieu de Rothe additionné d’éthyl-violet
Composition:

Pour 1L d’eau distillée:

-peptone : 20,0 g (Source d’azote))
-glucose : 5,0 g (Source de carbone)
-azide : 0,2 g (agent sélectif)
-éthyl-violet : 0,5 g (agent sélectif)
-NaCl : 5,0 g
-hydrogénophosphate de potassium : 2,7 g
déterminent le pH
-dihydrogénophosphate de potassium : 2,7 g
pH= 6,8
La préparation:
-Mettre en solution 35,7 g de milieu déshydraté (BK061) dans 1 litre d’eau
distillée ou déminéralisée.
-Agiter lentement jusqu’à dissolution complète.
-Répartir en tubes à raison de 10 mL par tube
-Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
-Refroidir les tubes à température ambiante
Mode opératoire:

Ensemencer le milieu de Litsky à partir d’une culture positive prélevée sur

milieu de Rothe, après agitation des tubes
Incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures
Lecture:
La présence de Streptocoques fécaux est caractérisée par l’apparition d’un trouble
microbien dans tout le milieu.
Observer éventuellement la formation d’un dépôt violet dans le fond du tube,
avec dans ce cas un trouble microbien plus léger.
Contrôle de qualité:
GÉLOSE de SLANETZ et BARTLEY

Principe:
Milieu sélectif pour le dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux
d’alimentation, les boissons, les eaux usées et divers produits biologiques d’origine
animale, par la technique de filtration sur membrane.
Composition (g) pouvant être modifiée pour 1 litre de milieu :
Tryptose : 20,0.
Extrait autolytique de levure : 5,0.
Glucose : 2,0.
Phosphate dipotassique : 4,0.
Azide de sodium : 0,4.( Agent sélectif)
Chlorure de 2, 3, 5, Triphényltétrazolium : 0,1. (indicateur redox qui change de
coloration (blanc-->rouge) après réduction)
Agar agar : 10,0.
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.
Préparation:
-Pour le milieu déshydraté :
1. Dissoudre 42 grammes dans 1 litre d’eau pure.
2. Chauffer sous agitation fréquente et laisser bouillir 1 minute pour dissoudre
complètement la suspension. NE PAS SURCHAUFFER - NE PAS AUTOCLAVER.
3. Bien mélanger, laisser refroidir à 45-50°C et répartir immédiatement en boîtes.
-Pour le milieu en flacons :
1. Liquéfier le milieu à 100°C au bain-marie.
2. Bien mélanger, laisser refroidir à 45-50°C. Ajouter aseptiquement une solution
stérile contenant 100 mg de T.T.C. (triphényl-2,3,5-tétrazolium) par litre de base. Bien
homogénéiser.
3. Répartir immédiatement en boîtes.
CONTROLE DE QUALITE:

Résultats
Les Entérocoques donnent des colonies de taille moyenne, roses ou rouges. Les
Bacillus peuvent pousser et donner le même aspect de colonies, mais de taille plus
importante.
Bile esculine (ou Gélose entérocoque ou BEA pour Bile Esculin Agar)
Principe:
La gélose à l'esculine biliaire s’agit d’un milieu sélectif destiné à l’isolement
des entérocoques et des Streptocoques du groupe D. Il a été conclu que le test
de l'esculine biliaire constituait un moyen fiable d'identifier les entérocoques et de
les différencier des non-entérocoques. Ce milieu contient de la bile pour inhiber la
croissance des bactéries gram-positives ainsi que de nombreuses bactéries
gram-négatives. L'azide de sodium supprime également la croissance des bactéries
gram-négatives et des Streptocoques sauf ceux du groupe D. Les entérocoques
hydrolysent l'esculine en esculetine, qui forme un complexe avec le citrate ferrique
pour produire des sels de fer insolubles, ce qui fait que le milieu devient brun-noir ou
noir. Les entérocoques forment donc des petites colonies translucides
entourées d’un halo noir
COMPOSITION (grammes/litre)
Peptone: 8,0
Sels biliaires: 20,0 (agent inhibiteur)
Citrate ferrique: 0,5 (agent révélateur)
Esculine: 1,0 (agent inhibiteur)
Agar: 15,0
pH 7,1 ± 0,2

PREPARATION
Préparation du milieu déshydraté :
-Mettre en suspension 54,6 g de milieu déshydraté (BK158) dans 1 litre d’eau distillée ou
déminéralisée.
-Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le
temps nécessaire à sa dissolution complète
-Répartir en tubes ou en flacons.
-Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes.
-Refroidir et maintenir à 44-47 °C.
-Couler en boîtes de Petri et laisser solidifier sur une surface froide
Contrôle de qualité

Contrôle positif :
Enterococcus faecalis ATCC® 19433
Enterobacter aerogenes ATCC® 13048 (colonies brunes avec hydrolyse de l’esculine)
Contrôle négatif :
Streptococcus pyogenes ATCC® 19615 (inhibition
partielle ou totale)

Lecture:
Les Streptocoques du groupe D se présentent sous
forme de petites colonies translucides entourées d’un
halo noir (esculine positive)
 Identification des streptocoques:
Les streptocoques sont 2 genres bactériens:
Genre Streptococcus (incluant S. pneumoniae)
Genre Enterococcus (incluant les streptocoques entériques)

Ils regroupent plusieurs espèces dont les caractéristiques communes sont les
suivantes: coques à Gram positif, non sporulés, immobiles, dépourvus de catalase et
d'oxydase.
Morphologie:
-Groupement des cocci,
-Présence d'une capsule et l'aspect des colonies.
-Cocci à Gram positif,
-De diamètre inférieur à 2 μm, immobiles et asporulés.
-Ils sont groupés en diplocoques ou en chaînettes de longueur variable
Structure des streptocoques
CARACTÈRES BIOCHIMIQUES :
-Les Streptocoques ne produisent pas d’oxydase ni de catalase => oxydase(-), catalase(-)

-Parmi les streptocoques alpha-hémolytique, le pneumocoque est le seul qui est sensible
à l’optochine

-Et parmi les streptocoques Bêta hémolytiques le Streptocoque A est le seul sensible à la
Bacitracine

-Les streptocoques fermentent plusieurs glucides et métabolisent plusieurs substrats

(acides aminés) avec production de nombreuses enzymes permettant leurs identification
CARACTÈRES CULTURAUX

➢ Bactéries exigeantes (sauf les entérocoques) nécessitant des milieux enrichis

(sang et facteurs de croissance)

➢ aéro-anaérobie facultatif préférant l’anaérobiose , d’autres sont anaérobies strictes

et nécessitent le CO2 pour croître

➢ poussent à une T° optimale de 35°-37°

➢ Il existe des milieux sélectifs permettant un isolement plus facile des

streptocoques
Exemple : Les Streptocoques entériques (entérocoques) sont résistant à la bile et
peuvent pousser sur milieux hostiles Ex : ( sels biliaires , esculine , NaCl 6,5%, Azide)
=> utilisés dans milieu sélectif BEA (bile-esculine-azide) pour Enterococcus
La gélose BEA est un milieu d’isolement sélectif, utilisé pour la recherche des Enterococcus et
Streptococcus du groupe D.
CLASSIFICATION DES STREPTOCOQUES
Selon le phylogénétique:
Les Streptocoques appartiennent à deux familles principalement :
-Streptococcaceae : dont le genre Streptococcus (plus de 50 espèces réparties sur
plusieurs groupes). Parmis les principales espèces du genre : S.pyogenes, S.agalactiae,
S.pneumoniae...
-Enterococcaceae : dont le genre Enterococcus principalement E.faecalis et E.faecium

Selon HÉMOLYSE
*En raison de leurs exigences nutritionnelles (sauf les entérocoques), les
streptocoques sont cultivés sur des géloses au sang frais.
*Sur ce milieu , les streptocoques entraînent un changement de l’aspect du milieu au
voisinage des colonies , ce phénomène est « l’HÉMOLYSE »
3 types sont observés:
-HÉMOLYSE TOTALE dite
HEMOLYSE β : résulte de la
destruction totale des
hématies dans le milieu de
culture qui se décolore autour
des colonies
-HÉMOLYSE PARTIELLE DITE
-Non hémolytiques dite
HÉMOLYSE α : résulte de
l’oxydation du fer de l'hème (avec Y hémolytique: si aucun
virage de la coloration du rouge au changement n’est induit.
vert) , le milieu de culture prend une
couleur verdâtre au voisinage des
colonies: la biliverdine.
Selon LANCEFIELD
Basée sur les propriétés antigéniques du polyoside C présent dans la paroi de
certain streptocoques
* Elle permet de différencier plusieurs groupes antigéniques désignés par des lettres
(A,B,C,D,G….)
* les streptocoques possédant le polyoside C sont dit « groupables » ceux ne le
possédant pas sont dit « non groupables »

Ex :
*Streptococcus pyogenes est un groupe A (seule espèce)
*Streptococcus agalactiae est un groupe B (seule espèce)
*Plusieurs autres espèces peuvent grouper dans le C et G
*Les entérocoques sont soit non groupables soit groupent dans le D
Selon le pouvoir pathogène:

• Les streptocoques pyogènes: a l’origine d’affections suppuratives , il s’agit

essentiellement des streptocoques du groupe A,B,C,G (beta hémolytiques)
● S. agalactiae ou streptocoques ß-hémolytiques du groupe B
● S. pneumoniae ou pneumocoques.
Les espèces commensales:
• Les streptocoques oraux: ils sont non groupables.

• Les streptocoques entériques: Regroupe les Enterococcus et les espèces

entériques du genre Streptococcus. Ces espèces sont soit non groupables ou
groupent dans le group D.
Streptocoque du groupe A: Streptococcus pyogenes
Ce groupe ne comporte qu'une seule espèce : Streptococcus pyogenes, qui ne se
rencontre que chez l'homme.
*Caractères importants pour l'identification de Streptococcus pyogenes :
- Groupement en longues chaînettes -> examen à l’état frais ou coloration de Gram à
partir d'un bouillon
- β hémolytique -> test sur gélose au sang
- Sensible à la bacitracine -> test de Maxted
*Sécrétion de substances conférant un pouvoir pathogène
1) les toxines
• Streptolysines O et S: La streptolysine O est la plus importante, de nature
protéique, thermostable, elle entraîne la lyse des hématies et d'autres cellules.
Elle est antigénique: suscite la formation d'antistreptolysine O (ASLO)
--> test ASLO = recherche indirecte d'une infection à Streptococcus pyogenes par
dépistage des anticorps spécifiques et il s'effectue dans le cadre de rhumatisme
articulaire aigu ou de glomérulonéphrite: (complications d’infection non traité
des voies aériennes supérieures par streptococcus pyogenes)
• Toxine érythrogène: Toxine protéique, thermostable, antigénique, responsable de
la scarlatine.
2) les enzymes
• Streptokinase (SK) ou fibrinolysine, qui dissout les caillots de fibrine. Entraîne la
formation d'anticorps : ASK -> Recherche indirecte, ASLO
• Hyaluronidase (SH), détruit l'acide hyaluronique de la matrice extracellulaire =>
dissémination du germe. Entraîne la formation d'anticorps : ASH -> Recherche
indirecte, ASLO
• Streptodornase (SD) ou désoxyribonucléase, qui détruit l'ADN cellulaire. Entraîne
la formation d'anticorps : ASC) -> Recherche indirecte, ASLO
Streptocoques du groupe B: Streptococcus Agalactiae
Ce groupe ne comporte qu'une seule espèce : Streptococcus agalactiae, qui se
rencontre aussi bien en pathologie humaine que vétérinaire. Elle est une bactérie
commensale de l’intestin , Elle provoque des méningites chez le nouveau-né, et
des infections cutanées, urinaires ou génitales chez l'adulte, parfois
accompagnées de septicémie

Caractères importants pour l'identification de Streptococcus agalactiae :

- Groupement en longues chaînettes -> examen à l’état frais ou coloration de Gram à
partir d'un bouillon
- β hémolytique -> test sur gélose au sang
- Camp-Test positif -> test sur gélose au sang en présence d'une souche de
Staphylococcus.
Streptocoques non groupables
Ces streptocoques ne sont pas groupables sérologiquement, soit parce qu'ils ne
possèdent pas de substances C, soit parce qu'elle ne peut pas être extraite par les
techniques utilisées. On distingue :
Les streptocoques commensaux de la cavité buccale et Les pneumocoques,
-Les streptocoques commensaux de la cavité buccale appelés "streptocoques
viridans": - Streptococcus salivarius, - Streptococcus sanguis, - Streptococcus mitis, -
Streptococcus mutans, - Streptococcus milleri. Leur identification repose sur l'étude de
leurs caractères culturaux et biochimiques.

-Les pneumocoques, correspondant à l'espèce Streptococcus pneumoniae: Bactérie

commensale des voies aériennes
Caractères importants pour l'identification de l'espèce :
- Groupes par 2 en diplocoques, aspect en 8 -> Gram
- Capsulés -> coloration négative à l'encre de Chine
- α hémolytiques -> gélose au sang
- Exigeants -> gélose au sang
- Culture favorisée par une atmosphère anaérobie et enrichie en CO2
- Sensibilité à l'optochine -> test à l'optochine
- Lyse par la bile -> phénomène de Neufeld
Les caractères biochimiques des différents types de streptocoques
TAXOS A (SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE)
Il s'agit d'un test différentiel utilisé pour distinguer les organismes sensibles à
l'antibiotique bacitracine de ceux qui ne le sont pas. La bacitracine est un antibiotique
peptidique produit par Bacillus subtilis. Il inhibe la synthèse de la paroi cellulaire et
perturbe la membrane cellulaire. Ce test est couramment utilisé pour distinguer les
streptocoques bêta-hémolytiques: Streptococcus agalactiae (résistant à la bacitracine)
et Streptococcus pyogenes (sensible à la bacitracine)

Principe du test CAMP

Certains organismes (y compris les streptocoques du groupe B) produisent une
protéine hémolytique thermostable diffusible extracellulaire (facteur CAMP) qui agit en
synergie avec la bêta-lysine de Staphylococcus aureus pour provoquer une lyse
accrue des globules rouges. Les streptocoques du groupe B sont striés
perpendiculairement à une strie de S. aureus sur gélose au sang de mouton. Une
réaction positive apparaît comme une zone d'hémolyse en pointe de flèche adjacente à
l'endroit où les deux lignes de stries se rapprochent
 Cocci gram (+)
si catalase (-)

hémolyse sur
gélose au sang

b hemolyse a ou Y hemolyse

bile esculin
+ -
groupage de Lancefield
bouillon Nacl
streptocoque group D
6,5g%
Streptocoques de
bouillon
groupe
Nacl 6,5g%
-
A,B,C,F,G...
+ - S.pneumoniae
Vrai entérocoque: D
enterococcus D non enterococcus
MERCI