La chromatographie gel filtration

LA CHROMATOGRAPHIE GEL FILTRATION

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Chapitre II

1) Principe de base
2) Etude théorique de la chromatographie d'exclusion
2.1) Volume total de la colonne
2.2) Signification du coefficient de partage
2.3) Exploitation du graphique
2.4) Représentation des résultats
2.5) Application de la chromatographie sur gel

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1) Principe de base

Cette technique est également appelée : tamisage moléculaire, gel-filtration , perméation

de gel. Ou iffusion –exclusion
Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille .

La phase stationnaire est solide

C est un gel sous forme de granules poreuses
Critère de sélection de la phase stationnaire
La taille des pores
Résultats de sélection des molécules:

Figure 8 : Représentation d'une granule du gel d'exclusion.

Molécules de grosse taille ,Molécules de taille moyenne Molécules de taille petite

Le devenir des molécules est différent selon leur poids moléculaire.

Les grosses molécules

- Dont le diamètre est supérieur à celui des pores

- Sont exclues et sont donc éluées les premières,
- Au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ).

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Les petites et moyennes

- Les molécules seront incluses ou diffusent dans les granules du gel,

- Seront éluées plus tardivement, leur sortie sera retardée

Les molécules seront élués dans l'ordre inverse de leur masse moléculaire. Il existe donc
une relation inverse entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

La figure ci dessous montre bien que les petites molécules ( en bleu) possèdent un trajet
plus lent car traversent plusieurs billes de la phase stationnaire.
Par contre les grosses molécules (rouges) passent entre les billes et donc leur chemin est
plus court et sortiront plus vte.

Figure 9 : Principe de séparation des molécules par la chromatographie de gel

filtration

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Figure 10 : Chromatogramme

: Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à Vt.

: Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à Vo.
: Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des Ve intermédiaires et sont effectivement séparées.

2) Etude théorique de la chromatographie d'exclusion

2.1) Volume total de la colonne

On considère une colonne de volume total Vt remplie d'un gel solvaté

Vt = volume total
V0 = volume d'eau externe aux granules
Vi= volume d'eau interne aux granules
Vg = volume du gel

2.2) Signification du coefficient de partage

Un soluté est distribué entre la phase mobile et stationnaire selon un coefficient de

distribution ou de partage:
Le volume d’élution d’une molécule est lié au coefficient de partage selon la formule
suivante

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Ve : volume d’élution
Vm : Volume mort de la colonne
K : coefficient de partage de la molécule entre les deux phases ce coefficient peut
prendre plusieurs valeurs..

Tableau: Variation de la constante de partage et sa signification

Valeur K constante de partage Signification

K=0 le soluté est totalement exclu .ceci

correspond à toutes les molécules de
grosse taille et dont la taille dépasse la
limite d’exclusion de la phase
stationnaire. Ces molécules sortiront au
niveau du volume mort

si 0 < K <1, le soluté est partiellement les molécules vont diffuser dans les
inclus granules du gel et seront retardées.
. Plus le coefficient de partage est
proche de valeur 1 plus le volume d’élution
sera important.

K = 1,. valeur théorique correspondant à une

inclusion totale d'un composé dans le
gel
K>1 le soluté est inclus et adsorbé

2.3) Exploitation du graphique

La courbe d’élution correspond à la représentation graphique de la variation de la
concentration des molécules en fonction du temps de rétention ou le volume de rétention voir la
figure 10.

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Figure 10 : Variation du volume d’élution en fonction de la taille des molécules en

2.4) Représentation des résultats

Il faut dresser la courbe

Masse molaire ( MM )= f ( Volume d’élution )

Ou

log MM = f (Ve)

C’est une courbe linéaire décroissante

Car il existe une relation inverse entre le Poids moléculaire et le volume d’élutio

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Figure 11 : Relation entre la masse moléculaire, le volume d’élution, et les des valeurs de
K correspondantes

2.5) Application de la chromatographie sur gel

Cette technique sert à déterminer le poids moléculaire d’une protéine inconnue à

condition d’utiliser des molécules étalons ou de références qui ont un poids moléculaire
connu et volumes d’élution obtenus expérimentalement.
En pratique vous disposez :
des valeurs de poids moléculaires des molécules étalon
leur volume d’élution
volume mort de la colonne
Disposer du volume d’élution de la protéine X

Cas d illustration ou d’étude :

Le gel de chromatographie Superdex G200 a été calibré avec les protéines standard
suivantes :
Bleu Dextran : volume mort Vo = 15 mL.

thyroglobuline (669 kDa)

Ferritine (440 kDa)
catalase (232 kDa)
lactate déshydrogénase (140 kDa)
albumine (66 kDa)

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Le profil d’élution est présenté ci dessous

Figure 11 : Chromatogramme pour les molécules étalons

Figure 12 : Profil d’élution de la protéine X

Nom de la protéine Poids moléculaire kDa Volume d’élution ml

thyroglobuline 669 15

Ferritine 440 16
Catalase 232 23
lactate déshydrogénase 140 29
Protéine X 30
Albumine 66 39

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Figure 13 : courbe étalon type pour la détermination du poids moléculaire d une

ou plusieurs protéines à poids moléculaire inconnu

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