Extraction de l’ADN

L’étude de tout organisme vivant par les techniques de biologie moléculaires

implique de disposer de ses acides nucléiques à l’état pur. Pour cela on
procède à une extraction d’ADN ou d’ARN. L’extraction des acides nucléiques
se fait à partir de cellules de l’organisme étudié et doit permettre à la fin
d’obtenir l’acide nucléique recherché à l’état pur et non endommagé.
Plusieurs étapes sont nécessaires afin de réalisé une extraction d’ADN ou
d’ARN et ceci quelque soit l’organisme vivant.
L’extraction d’ADN chez les bactéries a été décrite selon beaucoup de
protocoles qui reposent essentiellement sur le Gram des bactéries. En effet,
selon la nature de la paroi bactérienne la digestion sera plus ou moins simple
(voir figure 1).

Figure 1. Membranes et parois chez les bactéries à Gram positif et à Gram

négatif

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 1 Extraction d’ADN génomique bactérien

Selon que la bactérie soit à Gram positif ou négatif on retrouve les mêmes étapes et qui
sont :

Lyse des cellules.

Elimination des protéines.
Elimination des autres acides nucléiques (ARN, etc.)
Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool.

Cependant les bactéries à Gram positif sont plus difficiles à lyser, puisqu’elle
nécessite une étape de digestion de la paroi de peptidoglycane grâce à des
produits chimiques.
Exemple de protocole :
1. Centrifuger 1,5 ml d’une culture overnight à 6000 trs/min. Eliminer le
surnageant.
2. Digestion de la paroi de peptidoglycane avec du lysozyme.
3. Mettre la solution de lyse (tampon : SDS et proteinase K).
4. Ajouter un volume égal de phénol/chloroforme.
5. Centrifuger pendant 5 min à 12000trs/min.
6. Il y aura un précipité de protéines à l’interphase. Délicatement transférer
la phase aqueuse dans un nouveau tube.
7. L’extraction au phenol/chloroforme peut être répétée. Jusqu’à la
disparition du précipité à l’interphase.
8. Pour éliminer toute trace de phénol faite une extraction avec du
chloroforme seulement.
9. Centrifuger pendant 5 min. Mettre la phase aqueuse dans un nouveau
tube.

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 10. Pour précipiter l’ADN ajouter à la solution aqueuse 2 à 3 volumes
d’éthanol froid (à – 20°C). Puis mélanger doucement. A cette étape l’ADN
peut être visible, s’il est en quantité importante.
11. Mettre au froid (-20°C) pendant au moins 30 min.
12. Eliminer le surnageant. Puis mettre de l’éthanol à 70% à température
ambiante.
13. Centrifuger à vitesse élevée pendant 2 min.
14. Sécher l’ADN par inclinaison sur du papier absorbant. Pour séchage
rapide mettre dans un incubateur à 37°C.
15. Avant l’électrophorèse resuspendre l’ADN dans du tampon TE [10 mM
Tris-Cl (pH 8.0 ; 1 mM EDTA (pH 8.0)]

 De grandes quantités d'ARN peuvent être présentes dans

l'échantillon d'ADN. Ajouter 1 à 5 μl de RNAase (1 mg ml-1) pour une
digestion complète de l'ARN. Ou, ajouter la RNAase directement au
tampon de lyse avec une concentration finale de 1 mg. ml-1.

1. Extraction de l’ADN plasmidique : lyse alcaline

On utilise la lyse alcaline. On procèdera de la même manière que pour l’ADN

génomique jusqu’à la lyse qui sera alcaline. La composition du tampon de lyse
sera différente.
1. Dans le tampon de lyse il y a :
SDS : solubilisation des membranes cellulaires et dénaturation de la plupart des
protéines cellulaires, ce qui permettra leur séparation de l’ADN plasmidique.
NaOH : permet de casser les parois cellulaires mais aussi les liaisons hydrogène
des molécules d’ADN double brin (ADN génomique et plasmidique) la lyse
alcaline.
2. Neutralisation

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Cette étape est réalisée par addition d’acétate de potassium (ou de sodium).
Sous ces conditions il y a rappariement des simples brins en doubles brins de
l’ADN ce qui sera plus facile pour l’ADN plasmidique.

 Pour cela, dés la lyse l’agitation doit se faire tout doucement afin d’éviter
de casser l’ADN génomique. En effet, s’il y a des fragments plus courts d’ADN
génomique, ils pourraient s’apparier et contaminer l’ADN plasmidique.

 Alors que l’ADN plasmidique double brin pourra se dissoudre facilement

en solution, L’ADN génomique simple brin, le SDS et les protéines dénaturées
vont s’agréger et former un précipité blanc. Le précipiter pourra être séparé
de l’ADN plasmidique par centrifugation.

3. L’extraction au phenol/chloroforme peut être répétée. Jusqu’à la

disparition du précipité à l’interphase.
A partir de cette étape on reproduit ce qui est décrit plus haut.

Ensuite on realize les étapes suivantes afin de determiner la quantité et la

qualité de notre ADN.


 Purification

 Quantification

 électrophorèse

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