1.

Prélèvement de la tumeur

Les prélèvements adressés à l’anatomopathologiste sont d’origines diverses.

 1.1. Biopsie

Elle consiste, classiquement, à prélever un fragment de tissu vivant et

à en préserver la morphologie par une fixation immédiate. Elle nécessite
un matériel simple : un bistouri froid à lame pointue, une paire de
ciseaux et une pince biopsique. La biopsie est pratiquée le plus souvent
sous anesthésie locale en utilisant un liquide dépourvu de
vasoconstricteurs, injecté autour de la lésion et non en plein cœur de
celle-ci, afin d’empêcher toute dilacération artificielle des tissus. Le
fragment doit être prélevé en pleine lésion, en évitant les territoires
nécrotiques, il doit être suffisamment volumineux (0,5 à 1 cm de long en
moyenne) pour permettre une orientation ultérieure correcte lors de
l’inclusion en paraffine et de la coupe.
 Figure 1 : Biopsie des glandes salivaires accessoires.
Technique biopsique : la lèvre inférieure est tenue
par une pince à chalazion. Les glandes salivaires émergent dès l’incision.
 1.2. Biopsie - exérèse

Prélèvement de la totalité d’une lésion dans le double

but d’en faire le diagnostic anatomopathologique et d’en
assurer la cure radicale. Elle est couramment utilisée en
matière de tumeur présumée bénigne et de petite taille.
 1.3. Ponction biopsique

Prélèvement d’une carotte tissulaire à l’aide d’une

aiguille ou d’un trocart en vue d’un examen anatomo-
pathologique.

1.4. Biopsie extemporanée (ou biopsie préopératoire)

Ce type d’examen permet un diagnostic en quelques

minutes. Il est pratiqué en cours d’intervention chirurgicale.
Le plus souvent, le fragment est durci par réfrigération et
coupé avec un microtome à congélation.
Les coupes à 5 μm d’épaisseur, recueillies dans l’eau, sont
ensuite placées sur une lame et colorées par le bleu de
toluidine par l’hématéine-éosine.
 1.5. Pièce opératoire

La pièce opératoire est un prélèvement effectué par le chirurgien au

cours d’une intervention chirurgicale. Elle doit être systématiquement
examinée mesurée, pesée, palpée puis disséquée par l’anatomo-
pathologiste. Pour notre cas le diagnostic anatomopathologique a été
fait sur un échantillon de prélèvement chirurgical (pièce opératoire).

Figure 2 : Cavité opératoire, masse tumorale polynodulaire.

2. Fixation

Elle a pour but de conserver aux tissus un aspect aussi proche que possible de
celui qu’ils avaient à l’état vivant. Elle doit être rapide, sans laisser le fragment se
dessécher sur une compresse. Elle nécessite une quantité suffisante de liquide (en
moyenne 10 fois le volume de fragment). On vérifie toujours que le fragment est
correctement immergé, parce que toute fixation défectueuse rend l'étude
anatomopathologique difficile voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu).
Deux fixateurs sont surtout utilisés : le formol (dilution à 10 % du formol commercial)
est le plus couramment utilisé; le liquide de Bouin (mélange d’acide picrique, de formol
et d’acide acétique), est parfois préféré pour les petits prélèvements. La durée de la
fixation dépend de la taille du prélèvement : au minimum 2 à 5 heures pour une
biopsie et 48 heures pour une pièce opératoire.
 Remarque:
Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en
plastique, directement s’il s’agit de biopsies ou, s’il s’agit de pièces opératoires,
après l’étape d’examen macroscopique au cours de laquelle sont prélevés des
fragments de petite taille (en moyenne 2x 2x 0,3 cm).

Figure 3 : Réalisation d’un petit échantillon tissulaire ensuite placé dans

une cassette (Photos prises au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
3. Inclusion ou déshydratation
C’est une étape très importante, automatisée dans des appareils à inclusion
(Figure 4), qui dure 16 heures et 20 min, durant laquelle les cassettes vont être
plongées successivement dans 12 bains. Elle a pour but la réalisation des blocs tissulaires
aboutissant grâce au microtome à des coupes fines et régulières.

 Milieu d’inclusion

Le plus utilisé est la paraffine, et comme la paraffine est hydrophobe, le

prélèvement doit d’abord subir une déshydratation (par immersion dans des bains
d’alcool de degré croissant puis dans des bains de toluène) avant d’être coulé
dans un moule contenant de la paraffine fondue par chauffage et devenue liquide,
qui infiltre alors toute la pièce. Après refroidissement, nous obtenons un bloc de
paraffine dur, à l’intérieur duquel la pièce prélevée est incluse. Le tableau ci-
dessous illustre le protocole d’inclusion.
 Tableau 1 : Protocole d’inclusion de prélèvement.
Bains Solutions Durée

1 Formol 1h 20min

2 Alcool à 95% 1h 30min

3 Alcool à 95% 1h 30min

4 Alcool à 100% 2h

5 Acétone 1h 30min

6 Acétone 1h 30min

7 Xylène 1h

8 Xylène 1h

9 Xylène 1h

10 Paraffine 1h

11 Paraffine 1h 30min

12 Paraffine 1h 30min
 Figure 4 : Technique d’inclusion (Leica)
(Photo prise au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
 4. Enrobage (paraffinage et moulage)
C’est mettre le prélèvement dans un moule et l’enrober de paraffine pour obtenir un bloc
solide contenant le fragment tissulaire à l’intérieur afin de faciliter la coupe (Figures 5 & 6) .

 Imprégnation par la paraffine

L’imprégnation par la paraffine se fait à une température de 56 °C (qui est le point de fusion
de la paraffine).
Figure 5 : Appareil de l’enrobage (Leica) (Photo prise au service d’Anatomie
pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
Figure 6 : Enrobage. Installation de l’échantillon tissulaire dans un petit moule
rempli de paraffine liquide
(Photos prises au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
 5. Inclusion proprement dite et coupure à l’aide d’un microtome

Après son imprégnation par la paraffine terminée, l’échantillon tissulaire est placé
dans un petit moule rempli de paraffine liquide. Sur une plaque réfrigérée, la
paraffine se solidifie, et on obtient un bloc que l’on coupe au microtome (Figure 7).

Figure 7 : Obtention d’un bloc (Photo prise au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
Les coupes du bloc de paraffine sont faites avec un microtome permettant de réaliser
des tranches de section (coupes). Les coupes ainsi obtenues ont une épaisseur moyenne
de 3 à 5 microns (Figures 8 & 9).

Figure 8 : Coupe du bloc de paraffine à l’aide d’un microtome (Leica)

(Photos prises au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
Figure 9 : Obtention de ruban de coupe.
6. Étalement des coupes
Les tranches sont déposées à la surface d’un bain-marie dont la température est
portée à une valeur sensiblement inférieure à celle de la fusion de la paraffine,
et recueillies sur des lames de verre (Figures 10).
Le liquide du bain-marie peut être de l’eau distillée.
Les lames porte-objet sont identifiées individuellement par une inscription gravée ou
écrite du côté des coupes.

a b
Figure 10 (a & b) : Étalement de la coupe dans un bain-marie (Leica)
(Photos prises au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
 7. Déparaffinage
L’imprégnation des coupes par la paraffine ne permet pas la diffusion des
colorants utilisés comme agent de contraste. Pour cela, on met les lames
comportant l’échantillon sur la plaque chauffante (ou en étuve) pendant
quelques secondes afin d’éliminer la paraffine (Figure 11).
Figure 11 : Séchage des lames dans l’étuve
(Photos prises au service d’Anatomie pathologique, CHU de Sidi-Bel-Abbès).
8. Coloration
Elle est le plus souvent entièrement automatisée et effectuée sur toutes les coupes.
Les colorations réalisées sur lames, accentuent les contrastes pour mieux
reconnaître les différents éléments de la préparation. Comme les colorants sont en
solution aqueuse, les coupes doivent d’abord subir une réhydratation. Celle-ci est
effectuée après déparaffinage des coupes (par la chaleur et des bains de toluène)
en immergeant les lames dans des bains d’alcool de degré décroissant puis dans
l’eau distillée. Les colorations de routine utilisent un hématéine ou deux colorants
différents : l’Hématéine-Eosine (HE) associe, l’hématéine qui colore les noyaux en
violet et l’éosine les cytoplasmes en rose.

Les colorations trichromiques usuelles sont l’Hématéine-Eosine-Safran (HES) par

ajout de safran colorant en jaune les fibres de collagène, et le trichrome de Masson
(TM) qui associe un colorant nucléaire (hématoxyline), un colorant cytoplasmique et
un colorant bleu ou vert colorant les fibres de collagène.
Les lames vont être plongées successivement dans 15 bains (Le tableau suivant
illustre le protocole de coloration).
 Tableau 2 : Protocole de coloration.

Bains Solutions Durée

1 Xylène 2 min
2 Alcool absolu à 100 2 min
3 Alcool à 95° 2 min
4 Alcool à 75° 2 min
5 Rincer par l’eau 10 sec
6 colorer par l’hématoxyline 5 sec
Harris
7 Rinçage à l’eau 10 sec
8 Acide chlorhydrique (Hcl) 8 sec
9 Carbonate de lithium 10 sec
10 Rinçage à l’eau 10 sec
11 Alcool à 95° 1 min
12 Eosine alcoolique à 2% 10 sec
13 Alcool absolu à 100° 2 min
14 Alcool absolu à 100° 2 min
 Figure 12 : Automate de coloration (Leica).
Les lames sont passées dans des bains successifs
appropriés pour l’automate.
9. Montage
Il consiste à recouvrir les lames de lamelles de verre pour protéger définitivement les
préparations, mais aussi pour réaliser les observations microscopiques dans les
meilleures conditions, pour cela, on met dessus quelques gouttes de baume de Canada
(résine végétale naturelle), et on place délicatement la lamelle, tout en évitant la formation
des bulles d’air.

Figure 13 : Montage et collage des lames.

10. Séchage

Nous plaçons les lames dans l’étuve afin de sécher le baume de Canada.
11. Observation microscopique
L’observation microscopique s’effectue à l’aide d’un microscope optique. On peut
réaliser des images du tissu pathologique, on intègre au microscope optique, un
appareil photo commandé par un ordinateur.

Figure 14 : Observation microscopique (Photo prise au service d’Anatomie pathologique,

CHU de Sidi-Bel-Abbès).