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Biologie cellulaire 

: CM1(08/09/2013)

Techniques microscopiques :

On a besoin des microscopes , il y a plusieurs types , microscope photonique ( MP), les


microscopes électroniques (ME) , ce qui fait la différences c’est la sources de rayonnement
soit par les protons ou les électrons qui se déplacent dans le vide et qui ne sont pas visible,
on a les microscopes électroniques ( par transparence à travers l’échantillon) première
contrainte c’est la finesse et le contraste  valables pour MET et MEB à transmission et à
balayage.

MEB :

Surface on a 2 contraintes : le traitement de la surface on doit préparer la surface de


l’échantillon pour l’observer.

Les grandissements : pour MP : *2,*10,*20,*60,*100  objectif

*10 oculaires donc le grandissement max : *1000

ME : G=*300000 c’est le max

MP : Il y a un autre facteur pour ces dispositifs qui est le pouvoir séparateur c’est 0.5
micromètre c’est la distance minimale qu’on doit avoir sur deux éléments pour pouvoir les
observer distinctement l’un de l’autre.

ME : 1 nm  le pouvoir séparateur

I- LE MICROSCOPE PHOTONIQUE :

A- description du microscope :

Condenseur et diaphragme qui permettent de bien observer l’échantillon.

B- Préparation des échantillons biologiques :

Technique de préparation : si on a des échantillons liquides (cellules agglutinée) il faut


réaliser un étalement  frottis
1-réalisation d’un étalement : Frottis sanguin

On va prélever une goutte de sang, on va tout d’abord désinfecter le doit , avec une lancette
stérile on pique le doit , on fait sortir une goutte de sang on la pose sur la lame en verre et
ensuite avec une autre lame on réalise l’étalement puis on remonte pour que le sang se
répartisse, la queue du frottis qu’on doit visualiser pour bien observer les cellules , une fois
l’étalement réaliser on deux couches de sang sur la lame.  on réalise le contraste mais
avant on doit faire la fixation.

LA FIXATION :  dessiccation  sécher  on agite vigoureusement la lame pendant


plusieurs minutes.

CONTRASTE : colorant aqueux qui est l’Hemoquick il colore rapidement le sang en trompant
la lame dans le colorant pendant 10 seconde ensuite on fait un rinçage à l’eau distillée et on
sèche à T ambiante .

On peut observer toutes les cellules qui baignent dans le plasma sanguin on peut donc
visualiser des hématies ( les érythrocytes  globules rouges) ces cellules n’ont pas de noyau
( transportent l’oxygène par l’hémoglobine) , on visualise aussi les leucocytes ( GB) qui sont
nucléés, on a trois types de leucocytes : lymphocytes, monocytes ( réniforme),granulocyte
( noyau plurilobé), on va visualiser aussi des plaquettes qui sont des fragments cellulaire et
qui joue le rôle de la coagulation.

2- coupes histologiques : 4 étapes :

-FIXATION : Si on ne fixe pas on aura dégradation des échantillons donc elle fige les
échantillons.

-INCLUSION

-COUPE : coupes fines , pour les réaliser on doit inclure l’échantillon pour le durcir.

-COLORATION

FIXATION :

Les moyens sont des fixateurs chimiques qui est le Carnoy c’est un mélange de chloroforme
(3v) /acide acitique (1v)/l’alcool 100(6v). Quand on prélève l’échantillon on le fixe 1h à 2h.

Une fois atteint le temps de fixation on arrête en rinçant à l’eau distillée et donc on doit tout
d’abord inclure et le but c’est de durcir l’échantillon.

On utilise la paraffine elle est solide à T ambiante 60°C , et hydrophobe et pas miscible à
l’alcool 100, on déshydrate l’échantillon et donc on utilise l’alcool 100 on passe à l’inclusion .

La paraffine est non miscible à l’alcool 100 donc on utilise le butanol qui va permettre de
faire des bain intermédiaire  butanol T ambiante 1h  butanol à 60°, 1h ( dans l’étuve)
tout ca dans un flacon fermer , puis on commence à faire la paraffine on commence par la
pré inclusion  on fait un mélange butanol paraffine 60° 1h ( 50/50)  1h à 60° paraffine
pure puis on réalise l’inclusion  des blocs de paraffine on utilise des barres de Leuckaert
qui sont métalliques qu’on associe pour délimiter une petite cavité et à l’intérieur on remet
une plaque sous ces barres et on verse rapidement de la paraffine et on inclue l’échantillon il
faut que ce dernier soit centré , la paraffine va figer et on va démouler pour obtenir un bloc
et on repère la section de l’organe.

Réalisation des coupes :

On réduit la surface du bloc par un scalpelle sans lame et donc on va pouvoir tailler le bloc ,
on délimite l’organe.

On réalise les coupes en utilisant un microtome , on réalise des coupes à 5 micromètres


d’épaisseur. Après avoir réalisé les coupes, on les colles par de l’eau albumineuse, on pose
les lames sur la platine chauffante 37°  on chauffe l’eau pour ramollir la paraffine on
ajoute quelques gouttes d’eau distillée et la paraffine devient grise  on arrête de chauffer
et donc en utilisant le papier absorbant on déshydrate la lame. Une fois les coupes sont
faites, on les fait sécher pendant 24h à 37°.

CONTRASTE :

On le fait par coloration : on utilise des colorants aqueux , le but c’est de contraster les
échantillons, on a deux types de colorations : anatomique et histochimique ( en faisant une
réaction chimique), on peut faire des colorations anatomique toutes seules mais
l’histochimique non .

Pour que la coloration se fasse on doit hydrater l’échantillon : on retire la paraffine

- Déparaffinage et hydratation :

On les réalise par une batterie de Borel on commence par l’histolemon ( HTL)  la paraffine
se dissous ( 2min) une fois retirer la paraffine on doit hydrater l’échantillon on commence
par l’alcool 100  A 95 A 70  l’eau

Coloration : soit en un temps ou successive dans un ordre précis. ( C1 eau distilléeC2…)

MONTAGE :

On utilise le baume du canada il est hydrophobe, et pas miscible à l’alcool 100 mais miscible
à l’histolemon. 1 min dans chaque bac on monte et on fait sécher.

On va travailler sur de l’intestin de rat, où il y a un système d’amplification de surface chez


l’homme on a 3 niveaux :

- Valvule connivente (grand replis de la paroi )


- Villosités intestinales : des replis de la muqueuse intestinale
- Bordure en brosse : absorbe les nutriments

Structure de la villosité intestinale : voir feuille 1

Le rat n’a que des villosités et les bordures en brosse.