Biochimie

SCIENCES DE LA VIE L1
BIOCHIMIE
Cest la chimie des tres vivants. La matire vivante est constitue de molcules dont la structure et les proprits physico-chimiques suivent les mmes lois de la physique et de la chimie que les molcules du monde inanim. Ces molcules que lon trouve chez les tres vivants ont des proprits extraordinaires par rapport celles de la matire inanime et cest bien le but de la biochimie, de comprendre comment toutes ses molcules inanimes qui constituent un organisme interagissent les unes avec les autres pour maintenir et perptrer la vie. Cela implique, dune part, ltude des biomolcules et, dautre part, ltude de cette logique molculaire de ltat vivant. Cette anne : tude des biomolcules, et des proprits physico-chimiques : biochimie structurale. En deuxime anne : biologie molculaire, cest--dire essayer de comprendre quels sont les mcanismes qui permettent un organisme de perptrer la vie. Les biomolcules entrent dans quatre grandes classes : Les lipides (Premire Anne) Les protines (Premire Anne) Les glucides (Premire Anne) Les acides nucliques (Deuxime Anne)
LES LIPIDES
I) Introduction A) Caractres gnraux des lipides Les lipides sont des biomolcules organiques insolubles dans leau, on va les extraire des cellules ou tissus par des solvants non polaires tel que le chloroforme, lther, le benzne. Il existe diffrentes classes de lipides, mais leurs proprits communes rsultent des chanes hydrocarbones (carbone + hydrogne) qui constituent la majeure partie de leur structure. Ces lipides prsentent plusieurs fonctions biologiques importantes, ils remplissent des fonctions structurales essentielles en tant que composants majeurs des biomolcules membranaires. Ils servent de combustibles pour la cellule et pour cela ils interviennent dans des ractions doxydation dans la cellule, un rle de protection la surface dun grand nombre dorganisme ; ils peuvent aussi tre des constituants de la surface cellulaire et participer la reconnaissance des cellules et de fait jouer un rle dimmunit cellulaire. Enfin, certaines substances telles que les vitamines et les hormones sont classes parmi les lipides et ces substances sont doues dune intense activit biologique. B) Classification des lipides Les lipides peuvent tre classs de plusieurs faons ; la plus satisfaisante tant celle fonde sur la structure de leur squelette carbon. 1re classe : Les lipides complexes : on y range les lipides qui ne contiennent que des acides gras et ces lipides complexes sont dit saponifiables , cest--dire quaprs hydrolyse alcaline (ajout de soude ou potasse), ils donnent des savons. 2me classe : Les lipides simples, ce sont les lipides qui ne contiennent pas dacide gras. On dit quils sont insaponifiables. II) Les acides gras A) Gnralits Malgr leur importance quantitative comme constituants des lipides complexes, ils se trouvent en trs faible quantit ltat libre. On connat et a isol plus de 100 acides gras extraits de tissus animaux, vgtaux et de microorganismes. Ils prsentent une seule fonction carboxylique (COOH.) Ils possdent une longue chane hydrocarbone qui est suprieure 4 carbones. Cette chane va tre sature ou non. Elle est gnralement non ramifie et parfois cyclique. Dans la grande majorit des cas, il y a un nombre pair de carbone.
B) Nomenclature gnrale des acides gras Un acide gras sera donn par : Cn : Xa n est le nombre datome de carbone. X est le nombre de double liaison dans la chane hydrocarbone. signifie quil y a une insaturation dans la chane. a indique la position de la double liaison dans la chane. Si rien nest prcis dautre, cela veut dire que la double liaison est en position cis. Sinon, on crit Cn : Xtrans a, et la double liaison est en position trans. C) tude descriptive 1) Les acides gras saturs (Cn : 0) a) Les acides gras saturs chane droite Ce sont les plus rpandus dans la nature par rapport ceux chanes ramifies. La formule lipide est Cn : 0 La formule brute de lacide gras satur chane droite est : CnH2nO2 n est un nombre paire de carbone qui va de 4 32. b) Les acides gras saturs chane ramifie Pour la plupart, ils ne possdent quune seule ramification. Les deux exemples qui suivent sont les deux plus importants en mdecine. Exemple 1 : Acide tuberculostarique : 18 atomes de carbone, 1 groupement mthyle en position 10. Exemple 2 : Acide mycocrosique : 28 atomes de carbone, 4 groupements. Ces deux acides gras sont dans les bacilles de coques responsables de la tuberculose. 2) Les acides gras insaturs thylniques La formule lipide : Cn : Xa ; ils sont plus abondants que les acides gras insaturs. a) Les acides gras monothylniques (Cn : 1) La double liaison des acides gras se trouve en position 9, 10 : Cn : 19 Acide palmitolque ( savoir) : C16 : 19 Acide olique ( savoir) : C18 :19 Formule brute : CnH2n-2O2 b) Les gras di-, tri-, polythylniques Les acides gras comportent plusieurs double liaisons : 1-Les acides gras polythylniques double liaison en position malonique
Position malonique : Quand deux double liaisons sont spares par un CH 2. Lacide linolique indispensable lhomme car pas de mtabolisme pour la synthse : C18 : 29-10, 12-13 Acide linolnique C18 : 39,12,15 2-Les acides gras polythylniques double liaison en position conjugue Conjugue : Entre deux double liaisons une seule liaison covalente. Acide lostarique : C18 : 39,11, 13 3-Les acides gras polythylniques double liaison en position succinique Position succinique : Entre deux doubles liaisons deux groupements CH2. Exemple : Acide clupanodonique. 3) Les acides gras cycliques Ces acides gras peuvent porter un cycle. Exemple : lacide chaulmoogrique comporte une structure cyclique entre 13 et 18 + une double liaison en position 15-16. 4) Les acides gras porteurs de fonctions diverses En gnral, des fonctions oxygnes qui apparaissent lorsque les acides gras sont en contact de lair. Exemple : Acide vernolique avec une fonction poxy. D) Proprits physico-chimiques des acides gras 1) Proprits physiques a) La solubilit Ils sont insolubles dans leau mais solubles dans des solvants organiques tels que le chloroforme, lther, le benzne. b) Lbullition Le point dbullition est dautant plus lev que le nombre de carbone est plus important et que la chane est plus longue. La prsence de double liaisons na aucune influence sur le point dbullition. 2) Proprits chimiques Elles dpendent de deux paramtres : a) Proprits chimiques dues la prsence du groupement COOH Si on traite un acide gras par de la potasse, on obtient :
b) Proprits chimiques dues la prsence de la double liaison 1-Raction daddition En ajoutant de liode ou du brome, il y a un atome de I qui se fixe sur le carbone de la double liaison. Cela permet de connatre lindice diode. 2-Raction disomrisation : Les acides gras ont la double liaison qui se trouve le plus souvent en position cis, il existe une technique pour passer de cis trans. Cis : groupement dun seul cot de la double liaison. Trans : groupement de part et dautre de la double liaison. 3-Raction doxydation : On introduit des fonctions oxygnes. On obtient diffrentes choses selon la fonction : Par un pracide froid : on obtient un poxyde. Par un acide minral chaud : on introduit deux fonctions OH adjacentes au carbone de la double liaison. Par un oxydant fort : Exemple : Permanganate de potassium : KMnO4 il coupe la double liaison et a oxyde de faon maximum les deux carbones deux fragments qui est doublement carboxyle (deux fonctions carboxyle) et un autre une fois. III) Les lipides complexes Ils sont saponifiables et comportent des acides gras. 5
A) Les glycrides Ils constituent lessentiel, sur le plan quantitatif des lipides naturels. Ce sont des esters du glycrol et dacides gras. Ester : acide gras + alcool ester Pour les glycrides, lalcool utilis est le glycrol : trialcool.
Il contient trois fonctions alcool donc peut se lier trois fois. Il y a donc trois positions : , , '. 1) La nomenclature Elle est la combinaison de deux critres : La nature des acides gras qui estrifient le glycrol. Si les trois acides gras sont identiques, le glycride est dit homogne , sils sont diffrents, il est dit htrogne. Le nombre et la position destrification des acides gras avec le glycrol. 2) Conformation spatiale des triglycrides Quand on cristallise un triglycride pour lanalyse par rayon X, on a la structure 3) Proprits chimiques a) Hydrolyse des glycrides Cette hydrolyse peut tre acide (ajout dacide sulfurique 5%), les molcules deau vont participer couper le triglycride et on obtient du glycrol et trois acides gras. b) Saponification des glycrides Ajout de potasse + chauffage hydrolyse qui coupe le triglycride pour donner un savon. Les acides gras sont sous forme dissoute. Cette raction a reu des applications industrielles et a permis de dterminer des indices dester. IV) Les mthodes dtude A) Dtermination des indices
Les indices sont des caractristiques, des constantes. Pour un lipide, ce sont des nombres qui sont donns sans unit. 1) Lindice dacide IA a) Dfinition Cest le nombre de mg de potasse ncessaire pour neutraliser lacidit dun acide gras dun lipide froid. b) Principe Dans une matire grasse, lacidit rsulte uniquement de la prsence des carboxyles, cest--dire des groupements COOH libres appartenant des acides gras. RCOOH + K+-OH RCOO- K+ + H2O 2) Lindice de saponification IS a) Dfinition Cest le nombre de mg de potasse ncessaire pour neutraliser les acides et saponifier les esters contenus dans 1g de lipide chaud. 3) Lindice dester IE a) Dfinition Cest le nombre de mg de potasse ncessaire pour saponifier les esters contenus dans 1g de lipide. IE = IS IA Il sobtient par calcul avec IS et IA dexprience pralable. 4) Interprtation des indices a) Utilisation de lindice dacide Dans le cas de lipides complexes (qui contiennent des acides gras) purs, lindice dacide = 0 IS = IE Dans le cas dun triglycride homogne (glycrol estrifier par le mme acide gras), le lipide complexe nest pas pur ( IA 0) Le pourcentage dimpuret = IS / IA x 100 Ces manipulations ont lieu dans les contrles alimentaires : le pourcentage dimpurets de lhuile doit tre infrieur 1%. b) Utilisation de lindice dester Il permet de dterminer la masse molaire dun triglycride homogne inconnu. M (gamme) = (56,1.10+3 x 3) / IE 56,1 = masse molaire potasse, 10+3 = mise en gamme, 3 = nombre de molcule de potasse pour estrifier 1g de lipide.
5) Lindice diode Ii a) Dfinition Cest le nombre de grammes diode fixs par 100g de lipides. b) Principe Cet indice ne peut se faire que si on a des acides gras insaturs (prsentant au moins une double liaison.) (Voir raction addition) c) Signification de cet indice Si lindice = 0 acide gras satur. Si lindice 0 dterminer le nombre de double liaison. 6) Oxydation par KmnO4 (Oxydation forte) Permet de dterminer la position de la double liaison dans lacide gras. B) Sparation des acides gras par chromatographie en phase gazeuse - Chromatographie = sparation - Toujours une phase mobile (gaz) et une phase stationnaire (solide.) La sparation se fera suivant laffinit diffrente de chaque molcule pour lune ou lautre phase. C) Sparation des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM) - Technique de sparation - On a une phase mobile (solvant) et une phase stationnaire (solide sur une plaque.) La sparation sera en fonction de laffinit du solvant et du solide. V) Les lipides simples A) Les terpnes Cette classe va avoir comme unit de base lisoprne : 2 mthyl-1,3,butadine (5 carbones.) 1) Les monoterpnes On a deux units de base qui vont se lier (10 carbones.) Il y a deux dispositions : une rgulire (menthol) et une autre irrgulire (geraniol.) Autres exemples : limonne, camphre, pinne. Ces constituants sont notamment responsables des odeurs de la menthe, dans le granium, le citron. 2) Les sesquiterpnes 8
Trois units de base : 15 atomes de carbones, dans une disposition rgulire : Farnesol quon trouve dans les cyclamnes. 3) Les diterpnes Ils sont constitus de quatre units de base : 20 carbones. Ils sont trs nombreux. Exemple : - Phytol : Disposition rgulire, linaire. - Rtinol : (Vitamine A1) : Prsence dun cycle. Le rtinol ou vitamine A1 est un facteur de croissance. Il empche la corne de durcir. Les besoins chez lhomme en vitamine A1 sont de 1mg/jour. Le phytol, on lobtient par hydrolyse de la chlorophylle, on le trouve aussi dans la vitamine E qui possde des proprits anti-oxydantes, en ce sens quelle prvient lauto-oxydation des acides gras insaturs. On le trouve aussi dans la vitamine K1, celle-ci tant dote de proprits antihmorragiques, son action est telle quelle agit de manire directe sur le taux de prothrombine, facteur qui joue sur la coagulation du sang. 4) Les ttraterpnes 8 units de bases = 40 carbones. Exemple : carotnode ; ce sont des composs qui comporte un grand nombre de double liaison ce qui leur donne une coloration rouge jaune trs forte. Le -carotne qui comprend 11 doubles liaisons avec un cycle chaque extrmit que lon trouve dans les carottes et dautres dans le jaune duf. 5) Les triterpnes Ils ont 6 units de bases donc 30 carbones. Le plus important : Le squalne. Il va subir diffrents types de cyclisation pour donner des composs que sont les strols qui vont constituer la deuxime classe des lipides simples. B) Les strols 1) Les prcurseurs du cholestrol Le squalne va subir un certain nombre de cyclisation en donnant plusieurs intermdiaires qui aboutissent au cholestrol. Le cholestrol est le strol animal le plus abondant, on le trouve dans les membranes plasmiques de nombreuses cellules animales et dans les lipoprotines du plasma sanguin. Lipoprotine = lipides + protines (liaison covalente) Ds quil y a cyclisation, le squalne, form de 4 noyaux strol. Le premier intermdiaire est le lanostrol et le dernier est le cholestrol. Le cholestrol est fait de 27 atomes de carbones, il a 3 groupements mthyl en moins + perte dune double liaison et migration dune double liaison de 24-25 56. 9
2) Les drivs du cholestrol A partir du cholestrol, on obtient : - Les acides biliaires, contenu dans la bile ltat de sel. Ils ont des proprits tensioactives et facilitent la digestion des lipides. Les acides biliaires sont synthtiss dans le foie partir du cholestrol. - Les hormones strodes, ces hormones peuvent tre synthtises dans des tissus spcialiss tels les corticosurrnales, ovaires, le placenta ou les testicules. Il va y avoir trois grandes catgories dhormones en C21, C19, C18. Exemple C21 : La progestrone qui est synthtise par le corps jaune de lovaire. Le cortisol qui est synthtis par les corticosurrnales. Elles interviennent dans le mtabolisme des glucides et des protines. Exemple C19 : La testostrone qui est synthtise par les testicules. Exemple C18 : les hormones strognes qui sont synthtises dans les follicules de lovaire. VI) Application Biochimie humaine, nutritionnelle, mtabolique, intrt chimique. Toutes les formules vues sont les bases du mtabolisme des tres vivants. Le mtabolisme lchelle humaine : mtabolisme humain et nutritionnel. A) Le destin des aliments dans lorganisme humain Notre alimentation est forme de diffrents composants. Mais le corps est compos de glucides, protines, lipides et doxygne qui constituent les entres dans un organisme humain. Le mtabolisme, cest la transformation de ces molcules pour vivre. A la sortie, tout est transform en eau, ure, CO2, et ATP. Ces transformations vont se faire en quatre tapes : 1e : Intestin : Aliments digrs et absorbs vont passer dans la lumire intestinale puis dans la cellule intestinale avant, ensuite, de passer dans le sang (glucide glucose ; lipide chylomicron ; protines acides amines.) 2e : Le sang : Ces molcules vont tre vhicules vers les organes (foie, reins) ou dans des tissus (globules rouges, graines corporelles.) 3e : Les organes ou tissus : Lorsque cela passe travers la membrane, ils se retrouvent dans le cytosol des cellules avec un grand nombre dorganites. 4e : Mitochondrie : Importance des mitochondries car cest le lien de production dnergie de la cellule. Quand ils se trouvent lintrieur de la mitochondrie, ils subissent des dgradations par des cycles des Krebs pour aboutir des molcules Actyl-COA : cette molcule actyl-COA avec le cycle de respiration permet dobtenir lATP. B) Le mtabolisme lipidique 10
1) Les lipides alimentaires Cest la biochimie agroalimentaire nutritionnelle. Lhomme ingre 40 140g de lipide par jour. Ce qui reprsente 38 45% de sa ration nergtique ; le reste est apport par les protines (10-14%) et par les glucides (50% 70%.) Les lipides sont apports pour moiti sous forme visible, cest--dire via huile, beurre, et graisses animales. La teneur en lipide de ces constituants est denviron 80g pour 100g de lipides et pour moiti sous forme invisible dans les viandes, poissons, la charcuterie, de teneur variable. Exemple : chips : 36g pour 100g. Les lipides alimentaires contiennent 95% de triglycride avec des acides gras saturs ou insaturs dont la chane est suprieure 12 carbones. Les autres 5% sont constitus par des triglycrides dont la chane est infrieure 12 carbones, des phospholipides du cholestrol sous forme estrifie. 2) Rsum des grandes voies du mtabolisme lipidique Le mtabolisme des lipides alimentaires dbute par leur digestion dans lintestin. Ces lipides passent sous forme de lipoprotines solubles : les chylomicrons. Ensuite, cela transite dans le sang. C) Les anomalies du mtabolisme 1) Aperu des anomalies mtaboliques Elles peuvent tre classes en 4 groupes : a) Les maladies hrditaires du mtabolisme Parmi les 6800 maladies dnombres ce jour, on connat 800 maladies dues une anomalie mtabolique (qui entrane une maladie) ceci a lieu lorsquil y a absence dune enzyme ; ceci va entraner un blocage de la voie mtabolique, ce qui a pour consquence une accumulation en amont dun substrat et dun dficit en aval. Ces malades forment un ensemble htrogne (= maladie rare) et sont difficiles tudier. Pour le moment, les possibilits de traitement sont trs limites, la biologie molculaire a permit lidentification de nombreux gnes responsables de ces maladies. b) Les maladies mtaboliques multifonctionnelles Lobsit, le diabte de type 2, lartriosclrose, sont des maladies dues la fois des facteurs denvironnement (stress) et des facteurs hrditaires mal identifis pouvant impliquer plusieurs gnes de prdisposition. c) Les anomalies secondaires Anomalies lies la perturbation de certaines voies mtaboliques dues des phnomnes extrieurs : insuffisance en oxygne, excs dalcool, carence alimentaire. d) Syndromes biochimiques 11
Sous de nombreuses situations pathologiques (virale ou bactrienne), on constate un disfonctionnement de certaines voies mtaboliques (difficiles interprter.) 2) Anomalies du mtabolisme lipidique Lipides alimentaires 95% triglycrides > 12 carbones et 5% < 12 carbones. Rendre soluble : Enzymes : phospholipase, lipiase-clipase, cholestrol-estrase. Anomalie : - Manque de lipase. Dans ce cas l il faut des carbones < 12 carbones car cela peuvent passer directement dans le sang sans lipase. - Synthse sel biliaire en manque pas de formation de micelle.
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LES PROTEINES
I) Introduction A) Caractres gnraux 1) Les gnralits Protine vient du grec protos, qui veut dire premier, ce terme fut introduit par un hollandais en 1836 avec l'ide que ces molcules avaient un rle de premier ordre et taient trs importantes. Elles rsultent de l'assemblage des acides amins en une chane linaire non ramifie. Les protines existent dans deux tats, et appellent conformation. Le premier tat correspond aux protines globulaires. Exemple : La plupart des enzymes comme le lysozyme, les hormones et les anticorps sont des protines globulaires. Le deuxime correspond aux protines fibreuses : Exemple : La kratine, la soie et le collagne. Protine fibreuse: Protine globulaire :
2) Les principales fonctions des protines Les protines prsentent une grande diversit de fonction : a) le mouvement Les bactries se meuvent l'aide de cils et de flagelles. Les cellules eucaryotes multicellulaires disposent de muscles squelettiques. Les activits locomotrices dpendent de mouvements coordonns d'assemblage de protines fibreuses, qui se trouvent tre l'actine et la myosine. b) Les fonctions mcaniques Les fonctions mcaniques sont aussi assures par des protines fibreuses chez les bactries ; ces protines se situent dans la paroi cellulaire, o elles ont aussi un rle structural. Chez les organismes eucaryotes multicellulaires, les fonctions mcaniques sont assures par le collagne. Il est prsent dans la peau, les tendons les cartilages, les os et les dents. Ces protines fibreuses fournissent aux tissus une grande rsistance la traction.
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c) Le transport et le stockage Beaucoup de molcules et d'ions sont transports dans le sang par des protines. Exemple : L'hmoglobine est la protine qui assure le transport de l'oxygne chez les vertbrs. On trouve aussi les frritines qui transportent et stockent le fer dans l'organisme. d) La catalyse enzymatique Les enzymes sont des catalyseurs protiques de type globulaire. Elles sont capables de multiplier les vitesses de raction par des facteurs allant jusqu' 1012. Leur efficacit et spcificit font delles des molcules-cl du mtabolisme. e) la protection Les anticorps sont des protines qui interviennent dans la destruction des cellules trangres. f) Le traitement de l'information Les neurones rpondent des signaux grce des rcepteurs protiques, situs leur surface. Toutes ces proprits sont dues relation, structure, et fonctions trs prcises entre chaque protine et autres molcules comme l'image d'une cl dans une serrure. Cette reconnaissance est permise grce la structure spatiale de la protine qui mnage sa surface des endroits dans lesquels les autres molcules peuvent s'insrer. Exemple d'une enzyme : Le lysozyme. Elle intervient dans l'hydrolyse (elle catalyse l'hydrolyse.) Elle participe l'hydrolyse de la partie glucidique de la paroi bactrienne. Elle est prsente dans les larves ou la salive comme agent antibactrien.
La paroi est un assemblage de peptidoglycanes :
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Le lysozyme va rompre les liaisons entre les X et Y. II) Les acides amins A) Introduction Les acides amins reprsentent l'alphabet des structures protiques. Ils dterminent la plupart des proprits importantes des protines. On connat 150 acides amins qui ont t isols partir des diffrentes cellules et organismes ; toutefois, seuls 20 acides amins rentrent dans la constitution des protines. B) tude descriptive et classification chimique des diffrents acides amins suivant la nature de leur chane latrale Cette classification ne concerne que les acides amins se prsentant sous forme solide, cristalline non-dissocie. 1) Les acides anims communs toutes les protines. Tous les acides amins rencontrs dans les protines l'exception de la proline ont pour formule gnrale :
Il y a toujours une fonction carboxylique et une fonction amine non-substitue. Chaque acide amin possde une chane latrale R caractristique. Les acides amins sont nomms selon un code trois lettres. (Plus rcemment, cependant, en bio-informatique, on utilise un code une lettre pour conomiser de la place dans la mmoire des ordinateurs.)
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a) Les acides amins aliphatiques
GLYCINE
GLY G
R=H
C'est un acide amin peu encombrant et peu coteux produire pour la cellule. Sa prsence donne une grande flexibilit la protine.
ALANINE
ALA A
R = CH3
C'est l'acide amin le plus frquemment rencontr dans les protines. Il offre l'avantage d'tre peu encombrant mais moins flexible que la glycine.
VALINE
VAL V
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LEUCINE
LEU L
ISOLEUCINE
ILE I
Toutes les trois sont responsables du caractre rigide de l'acide amin ; ces acides amins se trouvent par consquent des endroits charnires de la protine. b) Acide amin imino-acide
PROLINE
PRO P
C'est le seul acide amin ne pas rpondre la formule gnrale des acides amins vus prcdemment. Sa formule a une caractristique : lorsqu'elle se trouve dans une protine, elle doit adopter une forme particulire son voisinage car la fonction imino la rend peu flexible. c) Les acides amins aromatiques
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PHENYLALANINE
PHE F
TYROSINE
TYR Y
TRYPTOPHANNE
TRP W
Ces trois acides amins sont responsables d'interactions hydrophobes, ils se trouvent donc l'intrieur des protines o ils contribuent stabiliser la structure spatiale. d) les acides amins hydroxyls
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SERINE
SER S
THREONINE
THR T
Ces acides amins participent l'tablissement de liaison hydrogne e) Acides amins soufrs
CYSTEINE
CYS C
METHIONINE
MET M
Avec l'atome de soufre, ils vont pouvoir tablir des liaisons covalentes entre eux: pont disulfure entre deux cystines. Le pont va stabiliser la structure de la protine. f) Les acides amins dicarboxyliques amides
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ASPARAGINE
ASN N
GLUTAMINE
GLN Q
g) Les acides amins dicarboxyliques
ACIDE ASPARTIQUE
ASP D
ACIDE GLUTAMIQUE
GLU E
Ces acides amins peuvent tablir des liaisons hydrogne car ils sont donneurs de protons mais galement accepteur de protons. Et lorsqu'ils portent des charges ils 20
peuvent former des liaisons ioniques. Ces acides amins participent la raction de catalyse. h) Les acides amins possdant deux groupements basiques
LYSINE
LYS K
ARGININE
ARG R
HISTIDINE
HIS H
LYSINE et ARGININE possdent une longue chane latrale ; de ce fait, ils sont flexibles. Ils se trouvent la surface des protines, ils sont hydrophiles et peuvent donner des liaisons hydrognes. 2) Les acides rarement rencontrs dans les protines Quelques rares acides amins ont t isols partir de protines, mais tous drivent d'acides amins normaux. Exemple : 5-hydroxylysine 4-hydroxyproline 21
Ces deux acides amins ont t trouvs dans le collagne, qui est une protine fibreuse du muscle. Dans tous les cas connus, ces acides amins apparaissent par modification d'un acide amin prcurseur, aprs incorporation dans la chane protique. Les acides amins rares jouent un rle biologique important dans la fonction de la protine dans laquelle ils se trouvent. 3) Les acides amins n'existant pas dans les protines Environ 150 acides amins apparaissent dans diffrentes cellules et dans divers tissus, sous forme libre ou combine. Mais ils n'existent pas dans les protines, la plupart d'entre eux sont des drivs, des acides amins mais des (bta), (gamma), (delta) sont aussi connus. Lalamine peut donner la -alamine :
La -alamine est un prcurseur d'une vitamine de l'acide pantothnique. Ces acides amins jouent un rle de prcurseur et d'intermdiaire mtabolique, les champignons et les plantes suprieures continent une extraordinaire varit d'acide amin. Les fonctions mtaboliques de ces acides amins spcialiss ne sont pas encore bien connues. C) Proprits physico-chimiques des acides amins 1) Les proprits physiques Les acides amins sous forme de cristaux ont un point de fusion lev (au-dessus de 200C), ils sont beaucoup plus solide dans l'eau que dans d'autres solvants moins polaires tel que l'alcool, l'exception de la proline qui se dissout bien dans l'alcool.
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2) Les proprits chimiques : comportement acido-basique des acides amins en solution aqueuse a) L'ionisation des acides amins en solution aqueuse On utilise plus l'acide amin sous forme cristallise mais sous forme ionise.
En solution aqueuse, l'acide amin s'ionise, et a une forme dissocie appele zwitterion. Le zwitterion a la possibilit d'avoir des charges positives ou ngatives un pH donn. Cette forme dipolaire peut accepter un proton en milieu acide sur le groupement COO-, elle peut perdre un proton en milieu basique provenant de NH3+. L'acide amin en milieu aqueux se comporte donc comme un acide ou comme une base. Ces substances sont dites amphotres. On peut reprsenter le comportement acido-basique des acides amins en terminologie de Bronsted.
On peut considrer l'acide amin comme un diacide. L'acide amin se caractrise par deux constantes d'ionisation ou constantes de dissociation ou encore constantes d'quilibre. A ces constantes, on associe un pK : pK = -logK. 1-Cas des acides amins dont la chane ne s'ionise jamais Il y a 13 acides amins qui rentrent dans ce cas : 23
VALINE, LEUCINE, ISOLEUCINE,
Tous les aliphatiques: GLYCINE, ALANINE, TRYPTOPHANNE, METHIONINE, ASPARAGINE, THREONINE, PHENYLALANINE, SERINE, PROLINE, GLUTAMINE.
2-Cas des acides amins dont la chane latrale s'ionise On en dnombre 7 :
- HISTIDINE
- TYROSINE - CYSTEINE - ACIDE ASPARTIQUE, ACIDE GLUTAMIQUE - LYSINE
- ARGININE
b) Classification des acides amins suivant la polarit de la chane latrale Une chane apolaire est une chane qui ne s'ionise pas, et qui ne porte pas de charge ni partielle ni entire. Une chane polaire est une chane qui s'ionise et qui peut porter des charges partielles ou entires. On dit qu'une molcule est hydrophobe lorsqu'elle n'a pas d'affinit pour l'eau et qu'elle y est insoluble. Une molcule est hydrophile lorsqu'elle interagit avec l'eau, cette molcule est soluble dans l'eau grce la formation de liaison hydrogne. Suivant l'environnement dans lequel se trouve l'acide amin, celui-ci va ou non s'ioniser, d'o cette nouvelle classification. 1- Les acides amins chane latrale apolaire qui ne s'ionise jamais
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Il y a 9 : glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, mthionine, phnylalanine et tryptophane et la proline. Ils ont hydrophobes, parce qu'ils ont une chane apolaire. 2- Les acides amins qui ne s'ionise jamais qui vont donner des liaisons hydrognes Il y a en 2 : asparagine et glutamine. 3-Les acides amins chane latrale polaire qui s'ionise dans un environnement exceptionnel Ils sont au nombre de 4 : tyrosine, srine, thronine, cystine. Possibilit de former des liaisons hydrognes. 4-Les acides amins chane latrale polaire qui s'ionise et porte des charges entires 3 acides amins basiques (car charge positive peuvent accepter des doublets d'lectrons) : arginine, lysine, histidine. 2 acides amins acides : l'aspartate, glutamate. Dans les deux cas, ils sont dits hydrophiles. c) Courbe de titration des acides amins On peut tudier le comportement dipolaire des acides amins en examinant leur titrage.
Exemple : alanine
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1-Cas des acides amins apolaires Ce sont ceux qui ont une fonction acide et une fonction basique et une chane latrale qui ne s'ionise pas : mono-carboxylique et mono-amin. Il y a en a 9. C'est une courbe qui peut tre compare une courbe de dosage des acides faibles par une base forte. C'est une courbe diphasique avec deux segments de courbe nettement spars.
Chaque segment de courbe possde un point mdian qui correspond une modification de pH lorsqu'on ajoute de petite quantit de NaOH. Ce point mdian correspond au pK. PK : c'est le point de demi-titration de chaque tape de dissociation, il correspond la prsence en quantit quimolaire des donneurs de proton et des accepteurs de proton. Exemple : lalanine :
si:
pH = 2,34 pH = pKa1
si:
pH = 9,69 pH = pKa2
2-Cas des acides amins polaires 26
Dans ce cas, la courbe est plus complexe, car la dissociation de la chane latrale est superpose la dissociation de la fonction carboxylique, soit la dissociation de la fonction amin. Exemple : lacide glutamique. Dans le cas de la courbe de titration de l'acide glutamique, le premier segment est beaucoup plus long que le deuxime car ils sont superposs ; la dissociation du groupement COOH et la dissociation du groupement COOH de la chane latrale. Exemple : la lysine. Dans ce cas, le second segment est beaucoup plus long que le premier car, sont superposes la dissociation du groupement NH3+ et la dissociation du groupement NH3+ de la chane latrale. d) Valeurs des pK des acides amins Ces valeurs sont obtenues exprimentalement par l'analyse des courbes de filtration. (voir tableau) e) Le pHi des acides amins 1-Cas des acides amins dont la chane latrale ne s'ionise jamais Sur la courbe de titration de ces acides amins, il existe un point d'inflexion, situ entre les deux segments de courbes, ce point est le pH isolectrique ou pH i. En ce point, il n'y a pas de charge lectrique nette sur la molcule donc celle-ci ne pourrait pas migrer dans un champ lectrique. Exemple : lalanine : A pHi, l'acide amin se trouve 100% sous la forme :
La valeur du pHi est la moyenne arithmtique des pKs qui encadrent la forme lectriquement neutre. Ici : pHi = 2-Cas des acides amins dont la chane latrale s'ionise
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pHi =
= 3,25
f) quation d'HENDERSON-HASSELBACH Chacun des deux segments de la courbe de titration peut tre exprim mathmatiquement avec une trs bonne approximation par cette quation :
Cette quation permet tout moment, et quelque soit le pH, de calculer le pourcentage des espces ioniques prsentes en solution. g) Application de l'quation d'HENDERSON-HASSELBACH Exemple : lalanine. Calcul du pourcentage des espces ioniques pH = 7,7.
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Une forme A- pour 100 formes non dissocis AH.
3) La stro-isomrie des acides amins a) Configuration absolue Tous les acides amins, l'exception du glycocolle, prsentent une dissymtrie dans leur difice molculaire, c'est--dire qu'ils ont au moins un carbone asymtrique, c'est--dire un carbone qui porte quatre substituants diffrents. Ils peuvent donc exister sous deux formes dont les images dans un miroir ne sont pas superposables aprs rotation de 180 en restant dans le mme plan. Il y a trois faons de pouvoir les reprsenter: Formule en perspective, Formule en projection, Projection de Fisher. On a montr que ces deux formes pouvaient tre relies deux standards : le DGlycraldhyde et L-Glycraldhyde. Quand le OH est droite, sa configuration est dite D, et quand OH est gauche, elle est dite L. Ce sont des sucres qui servent de standard pour les acides amins. On note que tous les acides amins trouvs dans les protines naturelles sont de la srie L. On trouve dans la nature des acides amins D par exemple dans les parois des bactries et dans certains peptides antibiotiques.
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b) Pouvoir rotatoire A la seule exception du glycocolle, tous les acides amins obtenus partir des protines ont une activit optique, c'est--dire qu'ils peuvent provoquer la rotation de la lumire polarise. Pour cela utilise un polarimtre :
Si l'acide amin fait tourner la lumire d'un angle dans le sens des aiguilles dune montre, il est dit dextrogyre. Dans le sens inverse, il est dit lvogyre.
Elle est toujours mesure avec une lampe sodium avec une solution 25C. Cette valeur de la rotation spcifique varie avec la temprature, avec la longueur d'onde de la lumire utilise, et avec le pH. En comparant avec les mmes paramtres, la rotation spcifique de plusieurs acides amins, on constate que la rotation spcifique varie en fonction de la chane. Il n'existe pas de relation entre la configuration absolue et le pouvoir rotatoire, c'est--dire que si une molcule prsente une configuration D, je ne peux pas en dduire si cette molcule va dvier ou non la lumire sans faire d'exprience. Si, exprimentalement, je trouve que mon acide amin de configuration D est lvogyre, automatiquement j'en dduis que l'autre de configuration L est dextrogyre. Si on mlange dans des quantits gales des formes D et L d'une mme molcule, le mlange est optiquement inactif, on appelle cela un racmique. Lorsquun acide amin est synthtis chimiquement en laboratoire, c'est la forme optiquement inactive qui est obtenue. 4) Les proprits spectrales des acides amins a) Absorption de la lumire Dans ce cas, on utilise un appareil appel un spectrophotomtre. Il y a la possibilit d'y mettre une cuve en plastique ou en verre, dans laquelle on met une solution d'acides amins, on slectionne une longueur d'onde que l'on fait arriver sur la cuve cette lumire a une certaine intensit I0. Y-a-t-il absorption ou pas de la lumire ? Il y a absorption de la lumire si l'intensit qui en ressort, lintensit mergente I, est infrieure I0. b) Loi de BEER - LAMBERT 30
Cette loi est fondamentale en biologie, car elle permet de quantifier la concentration d'une solution de biomolcules, parce que l'absorption de la lumire est proportionnelle la concentration de la solution, c'est--dire que plus la solution dans la cuve est concentre, plus la lumire qui va en sortir sera faible. Cette loi est-elle que: Sans dimension, la densit optique est : DO = * L * C L reprsente le trajet optique, C = concentration de la solution en mol/L, = coefficient d'extinction molaire. c) Spectres d'absorption des acides amins aromatiques Dans la zone des ultraviolets, il ny a que trois acides amins qui absorbent : les acides amins aromatiques : chaque acide amin prsente un spectre d'absorption spcifique. Si lon mlange ces trois acides amins en concentration gale, on obtient un spectre d'absorption qui prsente un maximum 280nm. 5) Les proprits spectrales des protines a) Spectre d'absorption des protines Les protines sont formes d'un enchanement d'acides amins, quand on met une solution de protine dans un spectrophotomtre et que l'on fait varier la longueur d'onde dans le domaine de l'UV, on obtient un spectre d'absorption avec un maximum 280nm. b) Mthodes de dosage des protines Ces mthodes sont utilises quand la concentration de protines est trs faible. Dans ce cas : pas de spectre, il est ncessaire de mettre en uvre des mthodes colorimtriques. Il y a trois mthodes : 1-Dosage du biuret Il est utilis quand la concentration est comprise entre 1 20 mg/ml. Il se fait en ajoutant le ractif de biuret, qui est compos de cuivre, qui forme un complexe avec la protine. Ce complexe est bleu, et est d'autant plus bleu que la concentration en protine est leve. = 540nm 2-Le dosage de Folin-Ciocalteu Utilis dans le cas ou la concentration de protine est comprise entre 0,1 1mg/ml. On utilise le ractif de Folin qui ragit spcifiquement avec les acides amins aromatiques. Il donne une coloration bleue qui absorbe une longueur d'onde caractristique de 750nm. 3-Le dosage de Folin-Lowry 31
Ce dosage permet de pouvoir dterminer la concentration d'une solution de protines entre 0,05 0,1 mg/ml. Cette mthode utilise la combinaison des deux autres mthodes, on ajoute le ractif de biuret et le ractif de Folin, la longueur d'onde est 750nm. III) Analyse d'un mlange d'acides amins L'analyse d'un mlange de molcules, quel qu'il soit, ncessite quatre tapes : Sparation des molcules, Dtection de la molcule spcifique tudier, Identification de la molcule, analyse qualitative de la molcule, valuation, analyse quantitative. A) Les techniques de sparation : la chromatographie 1) Dfinition - principe La chromatographie permet la sparation de molcules dans un mlange, condition que ces molcules soient diffrentes entre elles par au moins un critre ; c'est--dire que les molcules doivent diffrer soit par leur taille, leur forme, leur poids molculaire, ou leur charge. Le principe de la chromatographie est bas sur les interactions entre trois acteurs : Le mlange sparer qu'on appelle solut, Une phase stationnaire, c'est un solide, Une phase mobile, qui est un solvant (liquide ou gaz.) Chaque molcule du mlange est soumise une force de rtention du fait de l'affinit du solut pour la phase fixe stationnaire et une force de mobilit qui dpend de la solubilit de la molcule dans la phase mobile. La rsultante de ces deux forces, rtention et mobilit, est variable selon chaque molcule et chacune migrera une vitesse qui lui est propre. 2) Le matriel utilis a) Le support de la phase stationnaire : la colonne de verre La colonne de verre dans laquelle on va y mettre un solide, on place le mlange de molcules tester et au-dessous une ampoule dcanter avec le solvant. Et on laisse couler gouttes gouttes le solvant. Et chaque molcule va migrer sa vitesse en fonction de son affinit avec la phase solide et mobile. Au fur mesure, la phase mobile va sortir puis on la collecte dans des petits tubes de faon que le volume soit identique pour tous les tubes. b) Le support de la phase stationnaire : la feuille de plastique ou la plaque de verre ou chromatographie en couche mince
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Le support de la phase stationnaire est une couche mince, on y dpose le mlange tudier et les tmoins, on plonge cette plaque dans une cuve en verre dans le solvant. 3) Les diffrents types de chromatographie Chaque technique se rfre une proprit qui doit tre diffrente pour les molcules sparer. (Voir tableau) Si les molcules se diffrencient par la taille, forme et masse : on effectue un tamisage molculaire. Si diffrencies par absorption : chromatographie d'absorption. a) La chromatographie d'exclusion d'ions (tamisage molculaire ou permation de gel) Pour pouvoir mettre en uvre un tel type de technique, il faut que le solut, c'est-dire les molcules que l'on veut sparer, soit dune taille, soit dune forme, soit dune masse molaire diffrentes. On utilise comme phase stationnaire, c'est--dire phase solide, des gels sphadex. Un gel sphadex est un sucre, form de longues chanes polyoside, et on va fabriquer comme des microbilles, synthtises partir du polyoside. La taille des pores est la mme dans une microbille. Si j'achte un gel sphadex G-10, cela veut dire que je pourrais tamiser des molcules ayant un poids molculaire (sans unit) compris entre 0 et 700. G-200 entre 2000 et 50000.
Pour la phase mobile, elle est un tampon. Un tampon, c'est de l'eau dans laquelle on met une certaine proportion d'un acide et d'une base d'une telle faon que le pH soit bien prcis. Principe de la sparation : (Cf. page 13) Domaines d'utilisation et d'application : on utilisera la chromatographie pour la sparation de peptides, de protines, de glucides et dans le cas des triglycrides. Elle permet de pouvoir dterminer la masse molaire ou poids molculaire des molcules inconnues, condition d'utiliser des tmoins de masse molaire connue. b) La chromatographie d'changes d'ions Cette chromatographie sera utilise pour la sparation de molcules ionises, c'est-dire des molcules qui vont s'ioniser en fonction du pH et qui porteront des charges nettes diffrentes. La phase solide est constitue de molcules charges attaches une matrice, les groupements chargs dfinissent la nature et la force de l'changeur d'ions. 33
Groupement anionique :
Cette phase stationnaire s'appelle une rsine polystyrnique sulfonate. A pH acide, il va y avoir liaison ionique entre les H + de la phase mobile et les SO3de la phase stationnaire. (t = 0) Quand on ajoute le solut, on le met un tel pH qu'il porte une charge positive, et va se substituer la place du H+. On appelle cette rsine une rsine anionique changeuse de cations. Groupement cationique :
Cette phase stationnaire s'appelle rsine polystyrne ammonium ou Rsine D.E.A.E. polyoside : dithyle aminothyle. Au dpart, pH basique, donc ions OH- de la phase mobile. Introduction dun solut charg ngativement qui va se substituer la place de OH-. On l'appelle rsine cationique changeuse d'anions. Au dpart, le tampon est un pH bien prcis, que je ferai varier au cours de la chromatographie. Principe de la sparation : changeurs de cations : lorsque j'ai un mlange d'acides amins et que j'augmente le pH de la phase mobile, ce sont les acides amins les plus acides qui vont sortir en premier : acide glutamique, aspartique puis aprs les neutres : alanine, valine, leucine, isoleucine et en dernier les basiques : arginine et lysine. changeurs d'anions : ceux qui vont sortir en premier sont les plus basiques : lysine et arginine, ensuite les neutres et enfin les plus acides. 34
Domaine d'utilisation : On l'utilise lorsqu'on a un mlange d'acide amin, lorsqu'on a des peptides, des protines et dans le cas des acides nucliques: ADN ARN. Ainsi que dans le cas de lipides ioniss: phospholipides, et les glucides. c) La chromatographie d'affinit d) La chromatographie d'adsorption e) La chromatographie de partage 4) Dtection des acides amins Les acides amins, les peptides, les protines sont incolores. Ils prsentent au moins un groupement -amin libre qui va former un compos bleu, avec un ractif spcifique appel la ninhydrine. La ninhydrine va former, en prsence de protines, un compos bleu qui absorbe la longueur d'onde de 570nm. 5) Identification Cela correspond une analyse qualitative. L'analyse qualitative doit tre faite avec des tmoins et avec la mme manipulation chaque fois. On la refait 20 fois. 6) valuation : analyse quantitative L'absorption est base sur la loi de BEER-LAMBERT, c'est--dire que la densit optique de l'absorption est d'autant plus grande que la concentration est plus forte. C'est--dire que la hauteur des pics reprsente la plus ou moins grande quantit d'acides amins. Je mesure la hauteur de mon pic et, grce l'chelle, peux dterminer la concentration de l'acide amin. Dans les appareils automatiques, des quantits infrieures 50 nmol (50.10-9M) peuvent tre mises en vidence avec prcision en quelques heures. L'analyse peut aussi tre faite par une machine appele H.P.L.C. (High Performance Lipid Chromatography), on travaille sous pression et on peut dtecter des molcules en quelques minutes et pouvant descendre la picomol (10-12 M.) B) Les techniques de sparation : l'lectrophorse 1) Dfinition Cette technique permet la sparation de molcules porteuses de groupements ionisables qui prsentent des charges nettes qui varient en fonction du pH. Si elles sont places dans un champ lectrique, il y a prsence dun dplacement ou dune migration. Acides amins, peptides, protines, acides nucliques. 2) Principe Ce dplacement ou migration : d = U * d : dplacement, U : mobilit, t : temps d'lectrophorse, *t
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: intensit du champ lectrique. La mobilit dpend de la charge de la molcule, des forces ioniques du tampon, et des forces de frottements. 3) Technique de l'lectrophorse On prend une bande de papier, on dpose le mlange avec une micro-pipette et cette bande est place de telle faon que les extrmits trempent dans un tampon un pH bien prcis. Dans la cuve, il y a des lectrodes relies un gnrateur, on applique une diffrence de potentiels, le courant va de l'lectrode ngative l'lectrode positive. Donc, en fonction de la charge nette des molcules, elles vont se dplacer diffremment. Les molcules charges positivement (cations) vont vers la cathode (-), celles qui ont une charge nulle n'ont pas de dplacement, et celles charges ngativement (anions) vont vers l'anode (+.) IV) tude de la structure primaire d'une protine A) La liaison peptidique 1) Dfinition La raction du groupe carboxylique d'un acide amin avec le groupe amin d'un autre acide amin permet ces deux acides amins de s'unir par la formation d'une amine secondaire, cette liaison s'appelle la liaison peptidique.
Si on a deux acides amins dipeptide. Trois acides amins tripeptide. On parle de peptide jusqu' 10 acides amins, d' oligopeptide jusqu' 50 acides amins, et de protine pour un total suprieur 50 acides amins. 2) Caractristiques de la liaison peptidique Les six atomes (vert) sont situs dans un mme plan. Les acides amins sont situs en position trans par rapport la liaison peptidique. Dans une proportion de 1 pour 1000 on peut aussi trouver des liaisons cis. En position trans, l'encombrement est minimum. Cette liaison peptidique volue entre deux structures de rsonance, c'est--dire 70% cette liaison est sous forme simple et 30% sous forme double. Ce caractre de double liaison entrane une certaine rigidit et empche la libre rotation. Du fait de ces deux structures de rsonance, la fonction amine n'est pas une fonction qui s'ionise. Dans un peptide ou dans une protine, le seul compos qui va s'ioniser sera la premire fonction amine, appele extrmit N-terminale et le dernier groupement carboxylique, appel extrmit C-terminale. 36
B) La structure primaire d'une protine 1) Dfinition On appelle structure primaire d'une protine , la squence des acides amins dans la chane peptidique, c'est--dire le nombre des acides amins, leur nature, et la position exacte dans la chane. Une protine porte un nom : exemple : insuline, qui a 51 acides amins, la ribonuclase, 124 acides amins, c'est--dire que chaque protine comporte un nombre prcis d'acides amins qui se succdent dans un ordre bien dtermin et c'est cela qui diffrentie les diverses protines. 2) Reprsentation d'une squence peptidique Quand on reprsente une squence peptidique, on doit obligatoirement commencer gauche par le groupement amine de telle faon que tout soit crit horizontalement, et d'une faon verticale on place les groupements R. C) tude chimique de la structure primaire d'une protine 1) tapes prliminaires Il faut broyer le tissu, lorgane, la cellule tudier : on parle d'hydrolyse (ajout d'un tampon + broyage), Dtecter s'il y a des protines, on ajoute un ractif spcifique tel que le ractif de Biuret ou Folin-Lowry, Sparer les protines : chromatographie ou lectrophorse. 2) Dtermination de la composition en acide amin C'est--dire comment passer d'un peptide ou d'une protine la somme d'acides amins. a) Hydrolyse totale des liaisons peptidiques 1-Hydrolyse chimique Hydrolyse acide
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On veut couper toutes les liaisons peptidiques on veut faire une hydrolyse totale. Inconvnient : on sait que certains acides amins sont dtruits ou partiels. Exemple : MET, SER, THR qui sont dtruits partiellement. Dans ce cas, il faut faire un traitement protecteur pour viter leur destruction. Le TRP, lui, est compltement dtruit.
Hydrolyse alcaline
Avantage : le TRP rsiste. Par contre, d'autres acides amins peuvent tre dtruits : CYS, SER, THR. A la fin de ces temps d'hydrolyse, on se retrouve avec un mlange d'acides amins. b) Sparation, analyse qualitative et quantitative des acides amins Aprs limination de l'acide chlorhydrique ou de la soude, on utilise les techniques de sparation vues prcdemment. Aprs cela, on connat le nombre et la nature des acides amins qui entrent dans la composition de votre peptide ou protine. 3) Dtermination de la squence des acides amins C'est--dire dans quel ordre les acides amins sont enchans les uns aux autres. La premire squence tre dtermine est celle de l'insuline en 1955 par SANGER. Insuline : 51 acides amins. a) Gnralits sur la squence des acides amins Les acides amins qui entrent dans la composition d'un peptide ou d'une protine peuvent se lier entre eux dans n'importe quel ordre, il n'existe aucune rgle thorique ou empirique dterminant cet enchanement. Le nombre des arrangements possibles de n acides amins diffrents est gal n! (Factorielle n) La dtermination des squences des acides amins dans les peptides ou protines naturels est d'ordre strictement gntique. b) Principes gnraux de dtermination d'une squence primaire 1-Dtermination des acides amins N et C terminaux. 38
(page 23) Dtermination de l'acide amin N terminal Mthode de SANGER Il a invent le ractif de Sanger : FDNB : 1-FLUORO-2,4-DINITROBENZENE. Une fois la raction faite, le ractif DNP-acide amin est jaune et absorbe des longueurs d'onde de 360.
Puis on fait une chromatographie par rsine changeuse d'ions, on spare les protines, on les passe au spectrophotomtre cal la longueur d'onde 360, et on trouvera le DNP-acide amin terminal. Mthode d'EDMAN (Page 24) L'intrt de ce ractif est qu'il permet de dtacher les acides amins les uns aprs les autres. C'est ce type de ractif qui est utilis dans les appareils
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automatiques appels Squenceurs. Mais on ne peut pas dpasser les peptides de 50 acides amins, dans le squenceur, car il se produit des erreurs au fil du cycle.
Ici longueur d'onde = 259. Dtermination de l'extrmit C-terminale Mthode chimique Principe de l'hydrazinolyse. L'hydrazide va couper tous les groupements sauf le dernier qui se trouve sous forme libre. Mthode enzymatique On utilise un enzyme appel la carboxypeptidase A, elle a la particularit d'attacher l'extrmit C-terminale. 2-Hydrolyse des squences peptidiques intra-chanes Il faut faire des hydrolyses partielles : Mthodes enzymatiques Nous avons notre disposition un certain nombre d'enzymes qui vont agit de faon spcifique sur certains acides amins et lon va ainsi se retrouver avec un petit nombre de peptides. D'autres par, la spcificit de ses enzymes est que les coupures sont trs localises dans la protine. Enzymes utilises avec son site d'action : Enzyme TRYPSINE Site d'action : Extrmit C-terminale Spcificit : LYS , ARG (sauf si PRO est droite)
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Ex:
CHYMOTRYPSINE Extrmit C-terminale Ex:
PHE TYR TRP (sauf PRO est droite)
PEPSINE Ex:
Extrmit N-terminale
PHE, TYR, TRP, LEU, ASP, GLU (sauf si PRO est gauche)
THERMOLYSINE Extrmit N-terminale Ex:
LEU, ILE, VAL (sauf si PRO est gauche)
Mthodes chimiques Enzyme Br CN Ex: Site d'action : Extrmit C-terminale Spcificit : MET
Voir page 25
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3-Dtermination des acides amins N et C terminaux de chaque oligopeptide 4-Dgradation rcurrente d'EDMAN 5-Dgradation et mme tude avec un autre enzyme Reprendre un nouveau peptide et reprendre un autre enzyme qui va couper en un autre endroit un autre peptide. 6-Recoupement gnral des diffrents rsultats = SEQUENCE 4) Applications La connaissance des squences permet la synthse des peptides par voies chimiques, ce qui est la base de toute l'industrie pharmaceutique. Exemple de quelques peptides d'intrts biologiques : - Premire synthse chimique en 1953 : deux hormones : LOCYTOCINE (9 acides amins): CTIQNCPLG

La VASOPRESSINE (9 acides amins)
Locytocine est un vasoconstricteur qui est utilis pour dclencher les accouchements. La vasopressine est un antidiurtique qui rgle la pression en eau. - Synthse en 1953 : hormone : Insuline (51 acides amins) Elle est constitue de deux chanes : l'une de 20 (chane A) et l'autre de 31 acides amins (chane B) relies par deux ponts disulfure.
Il faut 89 tapes de synthse pour la chane A et 132 tapes pour la chane B. V) Conformation tridimensionnelle des protines A) Introduction Une protine a l'tat naturel n'existe jamais sous une forme compltement linaire. En effet, sous l'influence des nombreuses forces attractives ou rpulsives qui se manifestent tout au long de la chane, la protine subit une mise en pli automatique avec une volution tridimensionnelle. Une protine prsente donc une structure en 3D.
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B) Relation structure primaire - forme spatiale C'est la squence primaire d'une protine qui dtermine sa structure dans l'espace (y compris son activit biologique.) Ribonuclase (124 acides amins) : protine doue d'activit biologique, car c'est une enzyme dont la spcificit est de couper les liaisons phosphodiesters dans les ARN. C'est une protine dite compacte et qui a une structure bien prcise. Si lon ajoute de l'ure (8M), elle coupe les liaisons H et du Mercaptothanol qui coupe les liaisons disulfures (4 S-S dans la ribonuclase.) Dans le cas de dnaturation rversible, on retrouve la forme initiale. La structure tridimensionnelle est due la squence primaire. Et ceci s'appuie sur le principe selon lequel la molcule tend prendre spontanment l'nergie libre la plus basse possible, c'est--dire l'tat thermodynamique le plus stable. Dans certains cas, on ne retrouve pas la forme initiale, on parle alors de dnaturation irrversible. Cela serait d une perte d'un cofacteur indispensable ou bien au fait que la protine ait subit des dgts non-dtectables par l'exprimentateur. C) Les structures secondaires 1) Dfinition Les structures secondaires rpondent deux critres : - Elles sont dues des liaisons hydrogne l'intrieur mme de la chane, - Les liaisons hydrognes tablissent exclusivement entre les groupements peptidiques COOH de la chane principale donc selon ce schma :
2) Caractristiques des liaisons hydrognes dans les structures secondaires
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Chacune des liaisons hydrognes C=O-NH met en jeu une nergie de 20 25 kCal/mol, ce qui reprsente moins d'une liaison covalente alors que les liaisons hydrognes avec l'eau constituent une nergie plus faible (de 11 kcal/mol.) Il y a toujours comptition entre la formation de liaisons hydrognes soit CONH soit avec H2O. Deuxime particularit, le nombre de liaison hydrogne s'explique par le caractre double de la liaison CONH qui empche la rotation autour de cette liaison. Les six atomes du groupe peptidique se situe dans un mme plan. La chane peptidique va donc se comporter comme une succession de plans articuls entre eux au niveau du carbone . La disposition des deux plans successifs l'un par rapport l'autre se dfinit par deux angles variables : et . 3) Les diffrents types de structures secondaires ordonnes a) L'hlice Lorsque les deux angles et prennent une mme valeur tout au long de la chane ; tel que = 123 et = 132, la structure est une hlice. Hlice droite : tous les acides amins sont de srie L. Hlice gauche : tous les acides amins sont de la srie D. Donc cette conformation en hlice est trs rpandue dans les protines. Mais une protine ne se prsente pas exclusivement sous forme d'hlice , on dfinit un taux d'hlicit. b) Les feuillets plisss ou types 1-Le type -parallle Page 20, 2-Le type -antiparallle Page 20. 4) La structure secondaire non-ordonne Dans ce genre de structure, les angles et changent de valeur d'un acide amin un autre dans la chane. La chane peptidique prend dans l'espace une forme qui n'est pas rgulire. Exemple : un coude :
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D) La structure tertiaire 1) Dfinition Cette structure tertiaire va tre dtermine par l'assemblage dans l'espace des formes de types ou ou des structures non-ordonnes, selon les trois directions de l'espace. Le tout tant stabilis par des interactions qui s'tablissent entre les groupements des chanes latrales. 2) Interaction responsable de la structure tertiaire Page 21. La seule liaison forte covalente. E) Structure quaternaire Dans le cas o une protine comporterait plusieurs chane peptidiques, le mode d'assemblage dfinirait sa structure quaternaire. Exemple : 4 chanes :
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F) Rsultats Il existe 20573 protines dont on connat la structure tridimensionnelle exacte. 1) Les protines globulaires Elles se trouvent sous une forme compacte. On y trouve les enzymes, des hormones et des anticorps. Les plus tudies sont la myoglobine et l'hmoglobine. Toutes les deux transportent de l'oxygne. 2) Les protines fibreuses Elles ont la particularit d'tre rigides et forment des btonnets : Kratines, les soies, et le collagne
LES GLUCIDES
I) Introduction A) Caractres gnraux Ce sont des polyols (plusieurs fonctions alcool.)
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Ils ont de plus une fonction aldhyde :
Ou bien une fonction ctone :
Ou bien une fonction acide : Ou bien amine : Lorsque les glucides sont associs par liaison covalente avec d'autres macromolcules, ils sont dits glyco-conjugus , c'est--dire que des glucides associs des protines donneront une glycoprotine, avec un lipide glycolipide. B) Rpartition dans la nature Les glucides sont des composs naturels largement rpandus chez les tres vivants, soit comme des lments de structures : exemple : la cellulose des vgtaux, la kitine des invertbrs, les polysaccharides des parois cytoplasmiques des bactries, soit comme des rserves nergtiques : exemple : le glycogne des animaux, l'amidon des vgtaux, le granulose des bactries. Ce sont aussi des composants fondamentaux, ils entrent dans la composition des acides nucliques et dans la composition de co-enzymes. On sait d'autre part qu'ils sont impliqus dans la reconnaissance intercellulaire, dans les mcanismes de la diffrenciation, ainsi que dans l'expression et dans la rception des dterminants antigniques.
C) Classification
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Un ose est un compos de formule brute (CH2O)n, il comprend une fonction carboxylique et n-1 fonction alcool. On classe les oses selon deux critres: Le nombre d'atomes de carbones, exemple : 3 atomes carbones triose ; 7 : heptose, etc. La nature de la fonction carboxylique, elle peut tre une fonction aldhyde (aldoses) ou une fonction ctone (ctoses.) On fait une combinaison de ces deux critres. Exemple : aldohexose (glucose), ctohexose (fructose.) Un oside : ce sont des molcules qui vont rsulter de l'association de plusieurs molcules d'oses avec ventuellement une substance non glucidique. On va avoir des htrosides et des holosides. Les htrosides vont rsulter de la condensation de plusieurs molcules d'oses avec une fraction non glucidique appele aglycone. Dans les holosides, on trouve les oligosides qui sont constitus de l'association de 2 10 molcules d'oses et les polyosides quand c'est suprieur 10. II) Les oses A) Structure linaire des oses 1) Nomenclature des oses La nomenclature est telle qu'on numrote les carbones de sorte que le carbone 1 soit le plus oxyd et on crit la molcule de haut en bas. 2) Le pouvoir rotatoire des oses Si on fait traverser une solution d'ose par une lumire polarise, la lumire est dvie d'un certain angle : si c'est dans le sens des aiguilles d'une montre, cette molcule est dite dextrogyre d(+) et si elle dvie vers la gauche alors elle est lvogyre : l(-) Donc tous les oses, sauf un, ont la proprit de dvier la lumire polarise, elles sont dites chirales. L'exception est la dihydroxyacetone :
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Tout ose peut exister sous deux formes. 3) La configuration D et L La proprit de pouvoir rotation est due au fait qu'il existe sur cette molcule au moins un carbone asymtrique, c'est--dire un carbone qui porte quatre constituants diffrents ; dans ce cas, il va exister sous deux formes : image l'une de l'autre dans un miroir.
Quand le groupement OH du carbone asymtrie est droite, la molcule est dite D et quand il est gauche, elle est dite L. Par rayon X, on a isol et dtermin la structure de ce qu'on avait appel Dglycraldhyde et on a trouv que c'tait le groupement OH droite qui faisait dvier de 14 ([]D20 = + 14) et que l'autre L : []D20 = -14. 4) Filiation des oses a) Synthse cyanhydrique de KILIANI-FISCHER Il est possible, par cette synthse chimique, de passer d'un ose qui a n carbone(s) un ose n+1 carbone(s.)
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b) Dgradation de WOHL-ZAMPLEN Chimiquement, il est possible en partant par un ose n carbones de passer un ose n-1 carbone(s.) c) Consquences de la filiation des oses Chaque ose peut tre rattach un triose initial D ou L glycraldhyde suivant la configuration spatiale de la fonction OH porte par le carbone n-1. On distinguera donc les oses de la srie D dont le groupement OH sur le carbone n-1 se trouve droite et les oses de la srie L dont le carbone n-1 est gauche. D'o table de filiation. B) Structure cyclique des oses
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1) La reprsentation de FISCHER Les oses en solution aqueuse n'existent qu' 1% sous forme linaire. En fait, ils subissent une cyclisation.
On aboutit deux formes en solution aqueuse car apparat un nouveau carbone asymtrique : deux formes anomres. Ces trois formes existent. Le passage se fait toujours par la forme centrale, jusqu' quilibre avec 90% , 1% central et 9% . Si on mesure le pouvoir rotatoire de l'-D-glucose sous forme de cristal. Son pouvoir rotatoire est []D20 = +159. Pour le -D-glucose : []D20 = - 34. Si le -D-glucose dans l'eau: []D20 = + 52. Si le -D-glucose dans l'eau: []D20 = + +52 Une forme pyranose : si pont oxydique entre le carbone n1 et n5. (5C et 10) Une forme furanose : cyclisation entre le carbone n1 et n4. 2) La reprsentation de HAWORTH Convention : crire le cycle de telle faon que le cycle traverse le plan du tableau. On met dans le plan du tableau en haut pour la srie D le groupement CH2OH. Tout ce qui est crit droite de la reprsentation de FISCHER sera crit en dessous du cycle et gauche au-dessus. On ne met pas les hydrognes. Par convention, pour la forme , on crit le groupement OH du carbone 1 l'oppos du groupement CH2OH.
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3) La conformation spatiale des oses Les oses peuvent exister sous deux formes : la forme chaise ou la forme bateau. C'est la forme chaise qui est la plus reprsente d'un point de vue de la stabilit maximale et au niveau thermodynamique. Cette conformation va faire qu'il y a un plan quatorial.
La forme la plus frquente sera la forme o l'accommodement sphrique sera minimum. C) Proprits chimiques des oses 1) Stabilit chimique des oses a) En milieu acide fort et chaud Acide fort : c'est--dire milieu d'acide chlorhydrique ou sulfurique fortement concentr. Dans ce milieu, la molcule d'ose va subir une dshydratation interne avec cyclisation. Dans le cas dun pentose donne un furfural. Pour un hexose hydroxyfurfural. Ces deux composs furfural et hydroxyfurfural, ont la proprit de se condenser avec des phnols qui donneront naissance des matires colorantes. Les diffrentes colorations varient avec la nature de l'ose utilis. Si ces colorations sont suffisamment stables, elles peuvent servir au dosage de l'ose. 52
Exemple : raction de Molish :
Raction de SELIWANOFF:
b) En milieu alcalin et froid Les oses vont subir soit une raction d'interconversion : passage d'un aldose un ctose et inversement ; ou bien une raction d'pimrisation : l'ose obtenu ne diffre que par la strochimie d'un seul carbone asymtrique. En milieu alcalin et chaud, on a une dgradation totale. 2) Proprits chimiques dues la fonction carboxylique
a) Rduction des oses 1-A partir d'un aldose
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A partir d'un aldose, pour faire une rduction, on se sert du NaBH4 (hydrure de bore et de sodium.) On ajoute le suffixe "OL" au nom du glucose. 2-A partir d'un ctose On obtient deux alcools. On passe d'un aldhyde ou ctone un alcool. b) Oxydation des oses 1-Oxydation chimique douce Dans ce cas l, on utilise du brome, de l'iode en milieu alcalin ou de l'acide nitrique dilu. Dans le cas des aldoses : exemple : D-glucose. On ajoute un suffixe "-onique" au nom de lose. C'est lacide aldonique en solution aqueuse. La forme aldonique est en quilibre avec les formes lactones. 2-Oxydation chimique nergique On utilise de l'acide nitrique concentr. On obtient des acides glucariques. On ajoute le prfixe "arique-". Dans le cas des ctoses, cela conduit une coupure de la molcule. 3-Oxydation chimique par des ions mtalliques Raction avec la liqueur de Fehling, cela rend un mlange de sulfate de cuivre et de tartrate double de sodium et de potasse. Quand c'est rouge, c'est qu'il y a eu rduction. D) tude descriptive des oses d'intrt biologique et de leurs drivs Page 9 16. A savoir 9 12 + acide uronique. III) Les oligosides A) Introduction Ce sont des oligosides qui rsultent de la condensation de 2 10 molcules d'oses par formation entre ces molcules d'une liaison appele liaison glycosidique.
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Cette liaison est stable en milieu alcalin mais peut tre (difficilement) rompue en milieu acide, ou bien en utilisant des enzymes spcifiques qui peuvent couper cette liaison appele osidase. On classe les oligosides en fonction du nombre de molcules doses qui entrent dans sa constitution, donc on aura des diholosides, triholosides,... jusqu' 10. B) Dtermination de la structure d'un oligoside 1) Dtermination de la nature des oses Il faut couper la liaison par hydrolyse acide et on se retrouve avec un mlange d'oses. Donc il faut faire une sparation des oses. La technique de sparation sera la technique de chromatographie : a) Chromatographie sur couche mince
b) Chromatographie en phase gazeuse Trois acteurs : Solvants : gaz (azote-argon), Phase stationnaire : silice dans la colonne, Un solut.
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2) Dtermination du mode de liaison des oses a) Liaison oside-oside (diholoside) Dans le cas d'un aldose, sa fonction rductrice est porte par le carbone 1. Dans le cas d'un ctose, sa fonction rductrice est porte par le carbone 2.
b) Liaison oside-ose
Il y a conservation des proprits rductrices pour le deuxime ose.
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C) Dtermination de la position de lhydroxyle engag dans la liaison osidique 1) Oxydation par lacide priodique (HIO4) a) Proprits de l'acide priodique HIO4- possde la proprit de couper les chanes carbones en provoquant la rupture de la liaison covalente entre deux atomes de carbones porteurs de fonction -glycol.
Si on a deux fonctions adjacentes :
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b) Application un ose Voir TD 2) Rduction d'un ose par l'hydrure de bore et de sodium (NaBH4) Mthode utilise quand la mthode prcdente ne nous permettra pas de connatre le mode de liaison. C'est quand on a deux hypothses sans abouti. Le carbone 1 aldhyde alcool primaire. 3) Mthylation dhydroxyles libres d'un ose On utilisera des agents mthylants, tel le sulfate de mthyle ou l'iodure de mthyle.
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D) Dtermination de la configuration anomrique a ou b de la liaison osidique
Biochimie - 137 pages

En prs de 1600 pages abondamment illustres et en couleurs, la deuxime dition franaise de cet ouvrage livre tous les secrets dcouverts ce jour des biomolcules, des mcanismes d'action des enzymes, du mtabolisme, de l'expression et de la transmission de l'information gntique. Dans cette nouvelle dition, les auteurs ont ajout un grand nombre de notions nouvelles acquises au court des huit dernires annes, ce qui enrichit presque toutes les sections. Mais ce renouvellement de contenu, ils ont galement revu entirement leur approche pdagogique, prsentant la matire de manire aussi complte et prcise que possible. Les auteurs ne se contentent pas d'exposer les connaissances mais ils attirent l'attention du lecteur sur la manire dont ces connaissances ont t acquises. Ils mettent par ailleurs en vidence les consquences concrtes des recherches, notamment leurs applications mdicales. Les professeurs et les chercheurs en biochimie auront entre les mains une rfrence parfaitement jour. Quant l'tudiant en sciences de la vie et en sciences mdicales, il pourra non seulement revoir les notions de base mais aussi s'initier la dmarche scientifique et approfondir des sujets la pointe de la recherche. II sera invit la rflexion la fin de chaque chapitre, par une srie de problmes de difficult variable.
NOTE : Ce que vous pouvez tlcharger (en cliquant sur limage du livre tout en maintenant la touche Ctrl.) nest quune partie du livre (137 pages), savoir : - La Partie 1 : Introduction et contexte - Chapitre 1 : La vie - Chapitre 2 : Les solutions aqueuses - Chapitre 3 : Principes de thermodynamique : vue densemble - La Partie 2 : Biomolcules - Chapitre 4 : Acides amins - Chapitre 5 : Acides nucliques
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SCIENCES DE LA VIE L1

La paroi est un assemblage de peptidoglycanes :

a) Les acides amins aliphatiques

g) Les acides amins dicarboxyliques

VALINE, LEUCINE, ISOLEUCINE,

2-Cas des acides amins dont la chane latrale s'ionise On en dnombre 7 :

- TYROSINE - CYSTEINE - ACIDE ASPARTIQUE, ACIDE GLUTAMIQUE - LYSINE

2-Cas des acides amins polaires 26

Une forme A- pour 100 formes non dissocis AH.

CHYMOTRYPSINE Extrmit C-terminale Ex:

PHE TYR TRP (sauf PRO est droite)

THERMOLYSINE Extrmit N-terminale Ex:

LEU, ILE, VAL (sauf si PRO est gauche)

La VASOPRESSINE (9 acides amins)

2) Caractristiques des liaisons hydrognes dans les structures secondaires

Ils ont de plus une fonction aldhyde :

Ou bien une fonction ctone :

Exemple : raction de Molish :

a) Rduction des oses 1-A partir d'un aldose

Il y a conservation des proprits rductrices pour le deuxime ose.

Si on a deux fonctions adjacentes :

D) Dtermination de la configuration anomrique a ou b de la liaison osidique

Biochimie - 137 pages

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