COMPTE-RENDU DE TP EXTRACTION DE

L'ENZYME
-,

I. BUT ET PRINCIPE :
Le DNS (3,5- dinitrosalicylique) en prsence de sucres
rducteurs dveloppe un produit rduit de couleur brune en
milieu basique.
La technique du DNS est un moyen de dtermination de la
teneur en sucres rducteurs libres prsents dans les
chantillons doser.

II. RSUM :

On a extrait lenzyme partir de la levure boulangre. Puis,

effectu une raction dhydrolyse du saccharose par linvertase
avec :

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Temprature = 30.
Ph=4.7.
Aprs 5 min on a arrt la raction en ajoutant le DNS.

On prparer :
Une gamme talonne (DNS + sucre rducteur)
Deux tubes pour tester la puret de saccharose et
linvertisse
On chauff les tubes en 100C et mesurer la densit du sucre
rducteur dans les tubes de la gamme talon en utilisant le
spectrophotomtre.

III. MATRIEL ET RACTIFS :

a.MATRIEL :
Pour linvertase :
Pipette
Fioles jauges
Becher
Centrifugeuse
Mortier et pilon

Pour le dosage des sucres rducteurs :

Bain marie 100c.
bain marie 30c
Tubes numrots
Pipetes

b. RACTIFS
Pour linvertase :
La levure de boulangerie
Tampon citrate 10Mm ph 6
Tolune/ thanol.

Pour le dosage des sucres rducteurs :

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Solution talon de saccharoses hydrolys 5mM
Tampon actate de sodium 50mM ph 4,7
Ractif au DNS

IV. METHODE :
a) EXTRACTION DE LINVERTASE :

Dans un mortier, suspendre 20 g de levure de boulangerie

dans 10 ml de tampon rfrigr de citrate de sodium 10
Mm (pH = 6).
On ajoute ensuite et en ordre les solutions rfrigres
suivantes :
10 ml du la mme tampon citrate.
0.5 ml du mlange de tolune/thanol.
Transvaser le contenu du mortier dans un tube
centrifuger. Boucher le tube et agiter vigoureusement au
vortex.
Centrifuger 15 min 3000 rpm .
Verser lentement le surnageant, lgrement ambr, dans
une fiole jauge 50 ml et complter avec du tampon citrate
Ph=6.

b) PRPARATION DES TUBES :

On a utilis 7 tubes sont numrots 0 7 .

Les tubes de numro 0 5 sont les tubes de la gamme talon,
le tube N6 et le tube N7 sont des tubes pour tester la puret.
On met 1 ml de DNS dans tous les tubes.et on ajoute la solution
du saccharose hydrolys (5 ml) dans les six tubes de la gamme
talon.

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Pour les tube N 6 et N 7 : on met 1 ml de la solution du
saccharose 0.03 M dans le tube N6 ,et lextrait de linvertase
dans le tube N7.
Puis, on ajoute le tampon actate dans tous les tubes, aprs on
chauffe 100 pendant 5 min et on met 5 ml deau distill
Enfin, on mesure la densit des tubes 0 5 laide dun
spectrophotomtre 540 nm.

c) RSULTA :
Afin de calculer le nombre de moles des sucres rducteurs, on
utilise la relation suivant :

n=
CV
Exemple pour le tube N1 : on a : c= 5 x 10^(-3) , v=0.1 ml
n=cv = 5 x 10^(-3) x 0.1 x 10^(-3) =0 .5 mol
on prsente les rsultats obtenu dans ce tableau :
Tube 0 1 2 3 4 5
Nombre 0 0.5 1 2 3 4
de
micromol
es
De sucre
rducteu
rs
DO 0 0,126 0,248 0 ,491 0,780 1,201

Ces rsultats nous ont permet de tracer la courbe de la

gamme talon
Excel- papier millimtr
La courbe dtalonnage DO=F(n)

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DO(N)
1.4
1.2
1.2

1 f(x) = 0.28x
R = 0.99 0.78
0.8
DO
0.6 0.49

0.4 0.25
0.2 0.13
0
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

nombre de micromoles de sucres rducteurs

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V. LES LIMITES DE DNS :

RESSOURCE: HTTP://WWW.AJUR .UNI.EDU/V7N2/M ILOSKI%20ET%20AL%20PP
%207-18.PDF

- Le dosage des sucres par DNS, est une mthode utilise pour
dtecter les sucres rducteurs (glucose, fructose et autres
monosaccharides) . Cependant, cette mthode a quelques
limites qui diminuent son utilisation. Dabord, le saccharose ne
peut pas tre directement dtect par le DNS. Les chantillons
contenant du saccharose doivent en consquent subir des
ractions, permettant l'apparition du glucose et du fructose, et
ce sont ces produits qui vont tre dtects par le ractif DNS :
Si les chantillons en question contiennent du
Saccharose ainsi que d'autres monosaccharides, La
concentration totale (finale) du saccharose ne sera donc
calcule qu'aprs l'hydrolyse complte de l'chantillon tudi.
Nanmoins, lajout du DNS arrte la raction de lhydrolyse par
voie enzymatique ce qui peut entrainer des erreurs. En
revanche, dautres ractifs tels que lhexokynase sont
compatibles avec linvertase et donc lhydrolyse est complte.
Ensuite, le DNS prsente une large spcificit, il peut dtecter
tous les sucres rducteurs, ce qui pose
Problme lorsquon veut dterminer la concentration de lun de
ces sucres sans les autres. Enfin la mthode du DNS est connue
tre moins sensitive et elle ne permet pas davoir des
donnes stchiomtriques pour les oligosaccharides, donnant
des valeurs plus leves que celles obtenues par Dautres
mthodes Pour conclure en dpit des limites que cette mthode
Prsente, elle a t recommande par L IUPAC commission
dans le domaine de biotechnologie. De plus ses applications
multiples sont trs utilises dans les laboratoires partout dans
le monde.
Cette mthode est trs bnfique car elle nous permet de
raliser lexprience dans des conditions faciles en termes de
pH et de temprature, par elle ne peut tre utilise en cas de
dosage dun mlange complexe de glucides rducteurs.

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VI. CONCLUSION :
Aprs avoir chauff les tubes 100 C avec un bain marie, on
remarque que la couleur des tues N6 et N7 qui contenait
linvertase et du DNS est jaune, ce qui prouve les deux solutions
ne sont pas contamins par des sucres rducteurs et quils sont
pures.