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Universit Paris-VI

Biologie Molculaire

Objectifs au cours de
Biochimie PCEM1

2007 - 2008

Pr. C. Housset (Chantal.Housset@st-antoine.inserm.fr)

Pr. A. Raisonnier

Mise jour le 1 juin 2007

Relecture : Pr C Housset
Plan du cours

Plan du cours

3 Plan du cours

9 Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

15 Partie I : La structure des acides nucliques

17 Chapitre 1 : Molcules simples

18 1.1 Phosphates
19 1.2 Ribose, dsoxyribose
20 1.3 Purine, Pyrimidine
21 1.4 Bases puriques
22 1.5 Bases pyrimidiques
23 1.6 Nuclosides et nuclotides
24 1.7 Nomenclature des units nuclotidiques
25 1.8 Adnosine
26 1.9 Dsoxyguanosine
27 1.10 Uridine MonoPhosphate
28 1.11 Dsoxythymidine MonoPhosphate
29 1.12 Adnosine Tri Phosphate
30 1.13 Dsoxycytidine Tri Phosphate
31 1.14 Liaisons hydrogne
32 1.15 Hybridation A - T
33 1.16 Hybridation G - C

35 Chapitre 2 : Les acides nucliques

36 2.1 Acide ribonuclique


37 2.2 Les extrmits 5 et 3 dun acide nuclique
38 2.3 Structure secondaire du RNA
39 2.4 Acides ribonucliques
40 2.5 Acide dsoxyribonuclique
41 2.6 La double hlice (modle rubans)
42 2.7 La double hlice (travers)
43 2.8 La double hlice (axe)
44 2.9 Surenroulement
45 2.10 Nuclosome
46 2.11 Fibre de chromatine
47 2.12 Condensation et hydrolyse des nuclotides
48 2.13 Complmentarit des bases

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 3/204


49 Partie II : Biosynthse des macromolcules

53 Chapitre 3 : DNA Dfinitions

54 3.1 La double hlice


55 3.2 Squence dun gne (apoA-II)
56 3.3 Gne
57 3.4 Expression dun gne

59 Chapitre 4 : La transcription

60 4.1 Transcription
61 4.2 Promoteur
62 4.3 Brins sens et antisens
63 4.4 Rgulation de lexpression
64 4.5 Cis et trans rgulateurs
66 4.6 DNA binding proteins
67 4.7 Interaction Protine DNA
70 4.10 Rgulation de leffort
71 4.11 RNA polymrase II
72 4.12 Initiation de la transcription
73 4.13 Liaison TFIID sur le DNA
74 4.14 Rgulation de la RNA polymrase
75 4.15 Elongation de la transcription
76 4.16 Elongation de la transcription
77 4.17 Discontinuit des gnes
78 4.18 Exon
79 4.19 Exon 1
80 4.20 Fin de la transcription
81 4.21 Modifications du transcrit
82 4.22 Enzyme coiffante
83 4.23 Coiffe dun messager
84 4.24 Queue polyA
85 4.25 Le transcrit primaire
86 4.26 Excision - pissage
87 4.27 Formation du lasso
88 4.28 Epissages alternatifs
89 4.29 Maturation des RNA ribosomiques
90 4.30 Stabilit du messager
91 4.31 Messager
Chapitre 5 : La traduction

94 5.1 Traduction
95 5.2 Expression dun gne
97 5.4 Codon
98 5.5 Code gntique
101 5.8 Ribosome eucaryote
102 5.9 Polyribosome
103 5.10 RNA de transfert (trfle)
104 5.11 RNA de transfert (ruban)
105 5.12 Activation dun acide amin
106 5.13 Srine tRNA synthtase
107 5.14 Cystine tRNA synthtase
108 5.15 Initiation de la traduction
109 5.16 Cadre de lecture
110 5.17 Elongation de la traduction
111 5.18 Incorporation dun acide amin
112 5.19 Transfert du peptide
113 5.20 Translocation des codons
114 5.21 Liaisons riches en nergie
115 5.22 Terminaison de la traduction
116 5.23 Signal-peptide
117 5.24 Polyribosomes lis
118 5.25 Carboxylation de lacide glutamique
119 5.26 Modifications post-traductionnelles

121 Chapitre 6 : La rplication

122 6.1 Rplication


123 6.2 Le cycle cellulaire
124 6.3 Chromatine et ADN
125 6.4 Rplication semi-conservative
126 6.5 Synthse et hydrolyse du DNA
127 6.6 DNA polymrase
128 6.7 DNA polymrase (exonuclase 35)
129 6.8 DNA polymrase : fonction ddition
130 6.9 Boucle de rplication
131 6.10 Fourche de rplication
132 6.11 Topoisomrase I
133 6.12 Primase
134 6.13 DNA ligase
135 6.14 Tlomrase
137 Chapitre 7 : La rparation
138 7.1 Rparation
139 7.2 Bases endommages
140 7.3 Excision de base
141 7.4 Msappariements
142 7.5 Transmission du msappariement
143 7.6 Excision de fragment long
145 7.8 Crossing-over

147 Partie III : Les vnements gntiques

149 Chapitre 8 : Substitutions


150 8.1 Substitution
151 8.2 Somatique, germinale
152 8.3 Faux-sens, non-sens
153 8.4 Polymorphisme Xba I de lapoB
154 8.5 Marqueur gntique

155 Chapitre 9 : Mutations


156 9.1 Mutation
157 9.2 Mutation Arg3500Gln de lapoB-100

159 Chapitre 10 : Insertions - dltions


160 10.1 Dltion
161 10.2 Dcalage du cadre de lecture
162 10.3 Dltion Phe 508 de CFTR
163 10.4 Dltion de lexon 9 de la lipoprotine-lipase
164 10.5 Mutation dun site dpissage
165 10.6 Insertion

167 Chapitre 11 : Transpositions


168 11.1 Transposition
169 11.2 Squence Alu
170 11.3 Virus
171 11.4 Cycle dun rtrovirus
172 11.5 Duplication de gne
173 11.6 Pseudogne
174 11.7 Conversion de gne

175 Partie IV : Lvolution

177 Chapitre 12 : Divergence

178 12.1 Divergence

179 Chapitre 13 : Familles de gnes

180 13.1 Famille de gnes


181 13.2 Gnes des -globines

183 Partie V : Le DNA au laboratoire

185 Chapitre 14 : Mthodes dtude

186 14.1 Extraction et purification du DNA


187 14.2 Synthse dun cDNA
188 14.3 Electrophorse de DNA
189 14.4 Hae III (enzyme de restriction)
190 14.5 EcoR I
191 14.6 Polymorphisme de restriction
192 14.7 Polymorphisme Msp I de lapoA-II
193 14.8 Cartes de restriction
194 14.9 Hybridation dune sonde
195 14.10 Calcul de la Tm
196 14.11 Sonde hybride
197 14.12 Sonde spcifique dallle (ASO)
198 14.13 Southern blot
200 14.14 PCR
201 14.15 Didsoxyadnosine triphosphate
202 14.16 Raction de squence
203 14.17 Squenage dADN
204 14.18 Gel de squence
Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

Objectifs PCEM1 commun


DHU Paris-Est
Biologie molculaire : tude des acides nucliques
Objectifs Gnraux
1. Sur la base dune bonne connaissance de la structure et des proprits des acides nu
cliques, ltudiant doit avoir assimil les grands principes de base impliqus dans la
transmission et la rparation du matriel gntique, ainsi que lexpression des gnes
et sa rgulation.
2. Ltudiant doit tre capable dinterprter des rsultats exprimentaux obtenus par les
techniques les plus courantes de biologie molculaire appliques la recherche bio
mdicale ou lexploration de matriel gntique par les laboratoires de biologie m
dicale.
Ltudiant doit ainsi avoir acquis les bases ncessaires la comprhension ultrieure
des mcanismes molculaires de la physiopathologie ou de laction des mdicaments.
Structure et fonction des acides nucliques
Connatre la structure des acides nucliques, savoir reconnatre1 les molcules sim
ples dont ils sont constitus, les classer daprs leurs proprits ou leurs fonctions.
Cette partie ncessite la reconnaissance des structures de lacide phosphorique, du ribose
et du dsoxy-ribose, des bases puriques et pyrimidiques.
Ltudiant doit savoir reconnatre nimporte quelle base, nucloside, nuclotide ou nuclo
side polyphosphate. Il doit savoir identifier les liaisons riches en nergie des nuclosides
polyphosphates et distinguer les groupements phosphates (, , ) prsents dans ces mol
cules.
Il doit savoir interprter et manipuler les diffrentes reprsentations de la structure primaire
du DNA et du RNA, prciser la nature des liaisons impliques dans lenchanement des nu
clotides, distinguer une extrmit 5 dune extrmit 3 et manipuler les units de taille
(kb, kpb, Mpb...).
Sur des schmas qui lui seront prsents, il doit savoir reconnatre les liaisons impliques
dans la complmentarit des bases ainsi que les lments structuraux essentiels dune dou
ble hlice de DNA, de la chromatine ou des diffrentes espces de RNA.
Connaissant la composition en bases de deux DNA de mme taille, il doit savoir prdire les
diffrences de temprature de fusion et expliciter les raisons de leur choix.

1. Savoir reconnatre
corps chimique : nommer un corps dont on voit la formule dveloppe ;

raction : dsigner lenzyme au vu de lquation chimique ;

voie mtabolique : dsigner la voie mtabolique au vu de son bilan chimique.

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Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

Mthode dtude des acides nucliques


Connatre les mthodes permettant dtudier le DNA des malades (obtention, purifi
cation, conservation) y compris dans leur aspect thique.
Dcrire lactivit de quelques enzymes qui permettent ltude des acides nucliques et
tre capable de montrer leffet de ces enzymes sur un exemple dtaill (squence
dacide nuclique). Cet objectif comprend au moins les activits des endonuclases de
restriction, les polymrases, les ligases et les topoisomrases.
Expliquer le mcanisme de lamplification du DNA par PCR (il ne sagit pas des m
thodes ou des techniques, seulement du principe qui est utilis).
Expliquer le principe de la PCR et de la RT-PCR
Enumrer les principaux constituants du milieu de raction dune PCR
Citer un exemple dapplication de la PCR en diagnostic mdical
Donner un exemple1 de diagnostic fond sur une variation de longueur de fragments
dacides nucliques (RFLP).
Enumrer les facteurs qui permettent lhybridation de deux brins dacides nucliques.
Savoir interprter2 les rsultats dune technique dhybridation avec une sonde
(Southern ou Northern blots, puces DNA) et son application un diagnostic.
Expliquer le mcanisme dun squenage dacide nuclique.
Donner un exemple de prparation et dutilisation dun DNA complmentaire.
Sans avoir mmoriser les dtails des modes opratoires, ltudiant doit avoir acquis la no
tion que des mthodes simples permettent dextraire et de purifier, partir de cellules euca
ryotes, les diffrentes formes de DNA et de RNA quelles renferment. Il doit avoir acquis
la notion des problmes thiques soulevs par la constitution dune banque de DNA gno
mique humain.
Il doit savoir reconnatre/reprsenter le mode daction des principales enzymes impliques
dans la manipulation du DNA : endonuclases, incluant les endonuclases de restriction,
ligases, DNA polymrases.
Il doit tre capable dinterprter des donnes exprimentales obtenues par les mthodes
couplant lectrophorse et hybridation sur filtre (Southern blots).
Ayant acquis la notion doligonuclotides de synthse (sans aucun dtail sur les mthodes
mises en uvre), de cDNA, de vecteurs plasmidiques ou phagiques, il doit savoir expliquer
les grands principes de ltude du DNA gnomique, en matrisant la notion de clonage.
Il doit savoir lire un gel de squence et, laide de la table de code gntique, convertir une
squence nuclique en squence peptidique, manipulant ainsi les notions de brin sens et
non-sens et de cadre de lecture. Sur des squences compares, il doit savoir identifier des
mutations, ponctuelles ou tendues, et leurs consquences fonctionnelles (arrt prmatur
de la traduction, dcalage du cadre de lecture). La connaissance ainsi acquise du squen
age doit lui permettre de matriser les notions de discontinuit des gnes, en distinguant

1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps
dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.
2. Savoir interprter un examen : savoir les valeurs usuelles (95 % de la population adulte saine), savoir
les circonstances physiopathologiques des variations du paramtre, savoir faire la critique de la valeur
dun rsultat en fonction des conditions de son prlvement ou de sa mesure.

10/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

les exons et les introns, et de modifications post-transcriptionnelles, incluant pose de la


coiffe, pissage et polyadnylation.
Ltudiant doit savoir interprter des rsultats exprimentaux obtenus par une technique
damplification gnique (PCR), quil sagisse danalyse du gnome, dtude dexpression
de gne ou de prparation de matriel pour un clonage ultrieur.
Transcription et rgulation de lexpression des gnes
Dfinir1 les termes : gne, transcription, brin sens, promoteur, exon, intron, coiffe,
queue poly-A, excision-pissage.
Montrer le mcanisme2 de la transcription dun gne, en distinguant les tapes dini
tiation, dlongation et de terminaison.
Montrer les mcanismes de la rgulation de la transcription. Donner un exemple de
rgulation dun gne eucaryote sous le contrle dune grande voie endocrinienne
(exemples : CREB, GlucocorticoidRE).
Enumrer et dcrire les principales modifications post-transcriptionnelles : enzyme
coiffante, polyadnylation, dition, excision-pissage. Donner un exemple dexpres
sion alternative dun gne eucaryote.
Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de termes indispensables la com
prhension de la transcription : brin sens et brin antisens, RNA polymrase, promoteur, ini
tiation de la transcription, longation, terminaison. Il doit savoir dcrire le mcanisme
biochimique de la RNA polymrase et mentionner les rles spcifiques des trois types de
polymrases impliques dans la transcription chez les eucaryotes.
Il doit savoir commenter un schma rsumant de faon intgre la rgulation dun gne
dont la transcription est sous le contrle dun messager agissant sur un rcepteur membra
naire (exemple de CREB) ou dun messager interagissant avec un rcepteur nuclaire (hor
mones strodiennes).
En ce qui concerne les modifications post-transcriptionnelles, il doit simplement pouvoir
dfinir ce quest une coiffe, une polyadnylation ou lpissage (ventuellement alternatif)
en identifiant et en explicitant les mcanismes molculaires mis en jeu.
Traduction
Dfinir les termes : traduction, codon et anticodon, polyribosome, signal-peptide.
Montrer le mcanisme de la traduction dun messager, en distinguant les tapes dini
tiation, dlongation et de terminaison.
Montrer les mcanismes de la rgulation de la traduction. Donner un exemple dan
tibiotique intervenant sur la rgulation de la traduction des procaryotes.
Enumrer et dcrire les principales modifications post-traductionnelles (en compl
ment de ce qui aura t trait dans le thme 2)
Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de caractristiques ou de termes
indispensables la comprhension de la traduction : aminoacyl-tRNA synthtase, sens de

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant
toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.
2. Montrer le mcanisme (dune raction) ou
Dcrire les tapes (dune voie mtabolique) : dfinir les corps chimiques en prsence, crire et quilibrer
la (les) raction(s) ; faire le bilan chimique et nergtique.

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Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

la traduction, codon, anticodon, codon dinitiation, code gntique, ribosomes, polyriboso-

mes.

Sur un schma synthtique dcrivant le mcanisme de la traduction, il doit tre capable

didentifier et dexpliciter les grandes tapes mises en jeu.

Il doit avoir la notion que chacune des tapes de la traduction chez les procaryotes peut tre

la cible dantibiotiques, mais aucune connaissance spcifique ne peut lui tre demande,

sauf des exercices de rflexion o ces donnes lui seraient rappeles.

Il doit pouvoir expliquer en termes simples la diffrence entre les protines localisation

cytoplasmique et celles qui empruntent la voie de scrtion, en prcisant les notions de pep-

tide-signal et de modifications post-traductionnelles.

Rplication et rparation du DNA


Dfinir les termes : rplication, rparation.
Montrer le mcanisme enzymatique dune fourche de rplication.
Dcrire les diffrentes ractions catalyses par les DNA polymrases.
Dcrire un exemple de mcanisme de rparation des msappariements.
Dcrire la rplication du DNA linaire et le rle dune tlomrase.
Dcrire lactivit de la transcriptase inverse et donner un exemple de ses consquen
ces physiopathologiques.
Ltudiant doit pouvoir citer et expliciter les grandes caractristiques de la rplication :
semi-conservative, continue/discontinue selon le brin, dbutant une mme origine. Il doit
pouvoir citer les principales protines impliques successivement dans la rplication chez
les eucaryotes et prciser leur rle : hlicases, protines de liaison au DNA simple brin, to
poisomrases, primase, DNA polymrases, ligase.
Ltudiant doit savoir illustrer la notion de fidlit de la rplication en explicitant les prin
cipaux mcanismes mis en jeu (activit 3-exonuclasique des DNA polymrases, rpara
tion des msappariements).
Il doit tre capable de rsoudre le problme pos par la rplication des DNA linaires en
expliquant le rle des tlomrases.
Il doit savoir dcrire les proprits de la transcriptase inverse sans entrer dans les dtails de
la rplication des rtrovirus.
Donner un exemple de rparation du DNA ls.
En appliquant ses connaissances acquises des principales enzymes agissant sur le DNA,
auxquelles seront ajoutes loccasion les glycosylases, ltudiant doit savoir reconnatre
sur un schma les interventions successives des enzymes impliques dans la rparation par
excision de nuclotides.
Recombinaison
Sans avoir reproduire le modle de Holliday qui lui aura t prsent, ltudiant doit tre
capable de dfinir le processus dchange de segments de DNA homologues sur des sch
mas simples et de mentionner limplication de la recombinaison dans des phnomnes fon
damentaux tels que le crossing-over .
Les vnements gntiques
Dfinir les termes : variation (= substitution ou mutation silencieuse), mutation (= ex
prime), dltion/insertion, rptition.

12/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Objectifs PCEM1 commun DHU Paris-Est

Donner des exemples parmi les vnements gntiques suivants qui aboutissent une
pathologie : mutation ponctuelle, dltion (avec ou sans dcalage du cadre de lectu
re), pissage dfectueux, rptitions de triplet.
Dfinir les termes : transposition, pseudogne, conversion de gne, famille ou super-
famille de gnes.
Donner un exemple de lvolution dune famille de gnes.
Grce des exemples de famille de gnes et de leur volution ; ltudiant devra expliciter
le rle des vnements gntiques (duplications, conversions de gnes, inactivations de g
nes) dans la diversification du patrimoine gntique des espces, et montrer quels avanta
ges slectifs les espces acquirent avec ces changements pour ladaptation leur
environnement.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 13/204


La structure des acides nucliques

Partie I

La structure des acides


nucliques
Rappel des objectifs

Structure et fonction des acides nucliques


Connatre la structure des acides nucliques, savoir reconnatre1 les molcules sim
ples dont ils sont constitus, les classer daprs leurs proprits ou leurs fonctions.
Cette partie ncessite la reconnaissance des structures de lacide phosphorique, du ribose
et du dsoxy-ribose, des bases puriques et pyrimidiques.
Ltudiant doit savoir reconnatre nimporte quelle base, nucloside, nuclotide ou nuclo
side polyphosphate. Il doit savoir identifier les liaisons riches en nergie des nuclosides
polyphosphates et distinguer les groupements phosphates (, , ) prsents dans ces mol
cules.
Il doit savoir interprter et manipuler les diffrentes reprsentations de la structure primaire
du DNA et du RNA, prciser la nature des liaisons impliques dans lenchanement des nu
clotides, distinguer une extrmit 5 dune extrmit 3 et manipuler les units de taille
(kb, kpb, Mpb...).
Sur des schmas qui lui seront prsents, il doit savoir reconnatre les liaisons impliques
dans la complmentarit des bases ainsi que les lments structuraux essentiels dune dou
ble hlice de DNA, de la chromatine ou des diffrentes espces de RNA.
Connaissant la composition en bases de deux DNA de mme taille, il doit savoir prdire les
diffrences de temprature de fusion et expliciter les raisons de leur choix.
Mthode dtude des acides nucliques
Connatre les mthodes permettant dtudier le DNA des malades (obtention, purifi
cation, conservation) y compris dans leur aspect thique.
Dcrire lactivit de quelques enzymes qui permettent ltude des acides nucliques et
tre capable de montrer leffet de ces enzymes sur un exemple dtaill (squence
dacide nuclique). Cet objectif comprend au moins les activits des endonuclases de
restriction, les polymrases, les ligases et les topoisomrases.
Expliquer le mcanisme de lamplification du DNA par PCR (il ne sagit pas des m

1. Savoir reconnatre
corps chimique : nommer un corps dont on voit la formule dveloppe ;

raction : dsigner lenzyme au vu de lquation chimique ;

voie mtabolique : dsigner la voie mtabolique au vu de son bilan chimique.

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La structure des acides nucliques

thodes ou des techniques, seulement du principe qui est utilis).


Expliquer le principe de la PCR et de la RT-PCR
Enumrer les principaux constituants du milieu de raction dune PCR
Citer un exemple dapplication de la PCR en diagnostic mdical
Donner un exemple1 de diagnostic fond sur une variation de longueur de fragments
dacides nucliques (RFLP).
Enumrer les facteurs qui permettent lhybridation de deux brins dacides nucliques.
Savoir interprter2 les rsultats dune technique dhybridation avec une sonde
(Southern ou Northern blots, puces DNA) et son application un diagnostic.
Expliquer le mcanisme dun squenage dacide nuclique.
Donner un exemple de prparation et dutilisation dun DNA complmentaire.
Sans avoir mmoriser les dtails des modes opratoires, ltudiant doit avoir acquis la no
tion que des mthodes simples permettent dextraire et de purifier, partir de cellules euca
ryotes, les diffrentes formes de DNA et de RNA quelles renferment. Il doit avoir acquis
la notion des problmes thiques soulevs par la constitution dune banque de DNA gno
mique humain.
Il doit savoir reconnatre/reprsenter le mode daction des principales enzymes impliques
dans la manipulation du DNA : endonuclases, incluant les endonuclases de restriction,
ligases, DNA polymrases.
Il doit tre capable dinterprter des donnes exprimentales obtenues par les mthodes
couplant lectrophorse et hybridation sur filtre (Southern blots).
Ayant acquis la notion doligonuclotides de synthse (sans aucun dtail sur les mthodes
mises en uvre), de cDNA, de vecteurs plasmidiques ou phagiques, il doit savoir expliquer
les grands principes de ltude du DNA gnomique, en matrisant la notion de clonage.
Il doit savoir lire un gel de squence et, laide de la table de code gntique, convertir une
squence nuclique en squence peptidique, manipulant ainsi les notions de brin sens et
non-sens et de cadre de lecture. Sur des squences compares, il doit savoir identifier des
mutations, ponctuelles ou tendues, et leurs consquences fonctionnelles (arrt prmatur
de la traduction, dcalage du cadre de lecture). La connaissance ainsi acquise du squen
age doit lui permettre de matriser les notions de discontinuit des gnes, en distinguant
les exons et les introns, et de modifications post-transcriptionnelles, incluant pose de la
coiffe, pissage et polyadnylation.
Ltudiant doit savoir interprter des rsultats exprimentaux obtenus par une technique
damplification gnique (PCR), quil sagisse danalyse du gnome, dtude dexpression
de gne ou de prparation de matriel pour un clonage ultrieur.

1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps
dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.
2. Savoir interprter un examen : savoir les valeurs usuelles (95 % de la population adulte saine), savoir
les circonstances physiopathologiques des variations du paramtre, savoir faire la critique de la valeur
dun rsultat en fonction des conditions de son prlvement ou de sa mesure.

16/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

Chapitre 1

Molcules simples

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 17/204


Molcules simples

1.1 Phosphates

BM 01

Les molcules biologiques qui contiennent linformation gntique sont les acides nucliques.
Les acides nucliques sont composs de molcules simples comme lacide phosphorique
(PO4H3), des oses 5 carbones (pentoses) et des bases azotes (purines ou pyrimidines).
Le phosphate inorganique est un ion stable form partir de lacide phosphorique PO4H3. On
lcrit souvent Pi.
Des esters de phosphate peuvent se former entre un phosphate et un groupement hydroxyle
libre (alcool, nol, phnol...).
La condensation dun phosphate et dun autre acide, par exemple un autre phosphate, donne
un anhydride. Il y a aussi des anhydrides mixtes avec les acides carboxyliques par exemple.
Le pyrophosphate est un ion driv de lacide pyrophosphorique (P2O7H4), qui est lui mme
un anhydride dacide phosphorique.

18/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.2 Ribose, dsoxyribose

BM 01/1

Le ribose est un pentose de la srie D, dont tous les hydroxyles sont orients droite (repr
sentation de Fisher). Dans les acides ribonucliques (RNA), il est cyclis en ribofuranose :
anomre spcifiquement.
Le dsoxyribose, composant des acides dsoxyribonucliques (DNA) est driv du ribose par
une rduction de la fonction alcool secondaire du carbone n2. Le dsoxyribose confre cet
acide nuclique une plus grande stabilit propre sa fonction de conservation de linformation
gntique.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 19/204


Molcules simples

1.3 Purine, Pyrimidine

BM 02

Les bases azotes des acides nucliques appartiennent deux classes de molcules selon le
noyau aromatique qui en constitue le squelette.
Le noyau pyrimidine est le plus simple : cest un noyau aromatique six atomes, quatre car
bones et deux azotes ; les deux azotes en position mta (n 1 et 3).
Le noyau purine est constitu de deux noyaux htrocycliques accols, un de six atomes et
lautre de cinq atomes, ayant deux carbones en commun au milieu. Par rapport ces carbones
communs, les azotes occupent des positions symtriques (n 1 et 3 gauche, n 7 et 9 droite).
Les diffrentes bases rencontres dans les acides nucliques en drivent selon les substituants
que portent les atomes de ces noyaux. De nombreux mdicaments appartiennent aussi ces
deux classes de bases azotes.

20/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.4 Bases puriques

BM 02/1

Les bases azotes sont des molcules aromatiques dont le noyau est soit une purine (bases pu
riques), soit une pyrimidine (bases pyrimidiques).
Les bases puriques sont au nombre de 2 : ladnine et la guanine.
Les purines ont un double noyau aromatique comportant gauche un cycle hexagonal de
4 carbones et 2 azotes et droite un cycle pentagonal de 3 carbones (dont 2 communs avec le
prcdent) et 2 azotes.
Ladnine est constitue dun noyau purine dont le carbone 6 est substitu par une fonction
amine. Elle est la seule des bases nucliques dont la formule ne contient pas datome doxy
gne.
La guanine est constitue dun noyau purine dont le carbone 2 est substitu par une fonction
amine et le carbone 6 par une fonction ctone.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 21/204


Molcules simples

1.5 Bases pyrimidiques

BM 02/2

Les bases pyrimidiques sont au nombre de 3 : la cytosine, luracile et la thymine.


Les pyrimidines ont un noyau aromatique hexagonal de 4 carbones et 2 azotes.
La cytosine est constitue dun noyau pyrimidine dont le carbone 4 est substitu par une fonc
tion amine et le carbone 2 par une fonction ctone.
Luracile est constitue dun noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4 portent des fonctions
ctone.
La thymine est aussi constitue dun noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4 portent des
fonctions ctone, mais dont le carbone 5 est substitu par un mthyl.

22/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.6 Nuclosides et nuclotides

BM 03

Les sucres (ribose ou dsoxyribose) se lient aux bases azotes par des liaisons impliquant un
des azotes de la base (azote n1 des pyrimidines ou azote n9 des purines) et le carbone n1
de lose (carbone rducteur ou fonction semi-actalique). Ce sont des liaisons N-osidiques.
La liaison dune base azote avec un des sucres donne un nucloside. Un nucloside est donc
form dune base et dun sucre lis par une liaison N-osidique. Dans un nucloside, on num
rote les atomes de la base par des chiffres : 1, 2, 3, etc... et pour les distinguer, les carbones du
sucre sont numrots 1, 2, 3, etc...
La liaison dun nucloside avec un phosphate se fait par une estrification de la fonction al
cool primaire (carbone n5) du sucre et une des trois fonctions acides du phosphate.
Lester obtenu est un nuclotide. Un nuclotide est donc form dune base azote, lie par une
liaison osidique avec un sucre, lui-mme li par une liaison ester avec un phosphate.
Dans le mtabolisme des acides nucliques interviennent des substrats riches en nergie, les
nuclosides triphosphates. Un nucloside triphosphate est un nuclotide dont le phosphate est
lui-mme li un ou deux autres phosphates par des liaisons anhydride dacides.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 23/204


Molcules simples

1.7 Nomenclature des units nuclotidiques

BM 03/1

Les bases azotes sont conventionnellement dsignes par une initiale et par une couleur :
ladnine par A et la couleur verte, la guanine par G et la couleur jaune, etc...
Chaque base peut entrer dans la structure de deux nuclosides, selon que le sucre est un ribose
ou un dsoxyribose.
Chaque nucloside peut tre li un, deux ou trois phosphates. On les dsigne par des sigles
conventionnels : GMP pour guanosine monophosphate, CDP pour cytidine diphosphate, ATP
pour adnosine triphosphate, etc...
On dsigne par nuclotides les nuclosides monophosphates : AMP ou acide adnylique,
dTMP ou acide dsoxythymidylique, etc...
Les nuclosides polyphosphates sont des diphosphates : ADP ou GDP... ou encore des tri
phosphates, les plus riches en nergie : ATP ou GTP ; etc...
Les acides nucliques sont forms par une polycondensation de nuclotides AMP, CMP,
GMP et UMP pour les acides ribonucliques, dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acides
dsoxyribonucliques.

24/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.8 Adnosine

BM 04

Un nucloside est une molcule compose dun pentose (-D-ribose ou 2-dsoxy--D-ribose)


li par une liaison N-osidique une base azote.
Les nuclotides sont des esters phosphoriques des nuclosides.
Les autres ribonuclosides sont : la guanosine, la cytidine et luridine.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 25/204


Molcules simples

1.9 Dsoxyguanosine

BM 04/5

Un nucloside est une molcule compose dun pentose (-D-ribose ou 2-dsoxy--D-ribose)


li par une liaison N-osidique une base azote.
Les nuclotides sont des esters phosphoriques des nuclosides.
Les autres dsoxyribonuclosides sont : la dsoxyadnosine, la dsoxycytidine et la dsoxy
thymidine, souvent appele thymidine tout court.

26/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.10 Uridine MonoPhosphate

BM 05/3

Un nuclotide est une molcule compose dun nucloside li par une liaison ester un acide
phosphorique.
Les acides nucliques sont des macromolcules rsultant de la condensation de trs nombreux
nuclotides, lis par des liaisons phosphodiester.
Luridine mono phosphate (UMP) ou acide uridylique est un exemple de nuclotide.
Les autres ribonuclotides sont : lAMP, le GMP et le CMP.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 27/204


Molcules simples

1.11 Dsoxythymidine MonoPhosphate

BM 05/7

Un nuclotide est une molcule compose dun nucloside li par une liaison ester un acide
phosphorique.
Les acides nucliques sont des macromolcules rsultant de la condensation de trs nombreux
nuclotides, lis par des liaisons phosphodiester.
Le thymidine monophosphate (dTMP ou TMP) ou acide thymidylique est un exemple de nu
clotide. La thymine tant toujours lie un dsoxyribose on nglige souvent de prciser d
soxythymidine monophosphate ou dTMP.
Les autres dsoxyribonuclotides sont : le dAMP, le dGMP et le dCMP.

28/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.12 Adnosine Tri Phosphate

BM 06

Ladnosine triphosphate est un nuclotide compos. Sa structure comporte une base azote,
ladnine, lie par une liaison N-osidique au -D-ribose et trois phosphates.
Les fonctions acides des acides phosphoriques distaux sont fortement ionises au pH physio
logique. Les liaisons anhydrides unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches en
nergie (G 31 kJ/mol).
LATP est un des substrats des RNA-polymrases.
Le coenzyme ATP/ADP est un coenzyme transporteur dnergie universel.
Les enzymes utilisant un nucloside triphosphate comme substrat ou comme coenzyme, n
cessitent en mme temps la prsence du cation Magnsium comme cofacteur.
Les autres nuclosides triphosphates sont en fonction du sucre ou de la base quils
contiennent : le GTP, le CTP, lUTP, le dATP, le dGTP, le dCTP (voir BM 06/6) et le dTTP.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 29/204


Molcules simples

1.13 Dsoxycytidine Tri Phosphate

BM 06/6

Le dsoxycytidine-triphosphate est un nuclotide compos. Sa structure comporte une base


azote, la cytosine, lie par une liaison N-osidique au -D-ribose et trois phosphates.
Les fonctions acides des acides phosphoriques distaux sont fortement ionises au pH physio
logique. Les liaisons anhydrides unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches en
nergie (G 31 kJ/mol).
Le dCTP est un des substrats des DNA-polymrases.
Les enzymes utilisant un nucloside triphosphate comme substrat ou comme coenzyme, n
cessitent en mme temps la prsence du cation Magnsium comme cofacteur.
Les autres nuclosides triphosphates sont en fonction du sucre ou de la base quils
contiennent : lATP (voir BM 06), le GTP, le CTP, lUTP, le dATP, le dGTP et le dTTP.

30/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.14 Liaisons hydrogne

BM 07

Une liaison hydrogne est une liaison de faible nergie entre deux atomes attirs lun vers
lautre pour des raisons lectrostatiques lun tant riche en lectrons donc nuclophile et
lautre nayant que les protons de son noyau donc lectrophile.
Ainsi latome dhydrogne, dont lunique lectron est par ncessit dans lorbitale qui unit cet
atome au reste de la molcule, ne peut qutre lectrophile et comme tel attir par les atomes
ayant des doublets lectroniques libres.
Les atomes dazote et surtout doxygne possdent respectivement deux et quatre lectrons
de leur couche priphrique qui ne participent pas aux orbitales des liaisons covalentes de la
molcule. Ceci leur confre un caractre nuclophile qui leur permet dexercer une attraction
sur les atomes lectrophiles voisins, en particulier les atomes dhydrogne : cette attraction
constitue une liaison hydrogne.
Lorsque les orbitales qui unissent dun ct latome dhydrogne la molcule de gauche et
de lautre ct les doublets lectroniques libres avec latome nuclophile sont dans le mme
axe, la liaison hydrogne est plus forte.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 31/204


Molcules simples

1.15 Hybridation A - T

BM 07/1

Lorsquun acide nuclique est en solution les molcules forment des liaisons hydrognes as
sociant les nuclotides deux par deux, de sorte quun nuclotide adnine se lie avec un nu
clotide thymine (ou uracile dans un RNA) et un nuclotide guanine avec un nuclotide
cytosine.
On dsigne cette liaison sous le terme dhybridation.
Lhybridation adnine-thymine est moins stable (2 liaisons hydrogne, -21 kJ) que celle entre
guanine et cytosine.

32/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Molcules simples

1.16 Hybridation G - C

BM 07/2

Lorsquun acide nuclique est en solution les molcules forment des liaisons hydrognes as
sociant les nuclotides deux par deux, de sorte quun nuclotide adnine se lie avec un nu
clotide thymine (ou uracile dans un RNA) et un nuclotide guanine avec un nuclotide
cytosine.
On dsigne cette liaison sous le terme dhybridation.
Lhybridation guanine-cytosine est plus stable (3 liaisons hydrogne, -63 kJ) que celle entre
adnine et thymine.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 33/204


Les acides nucliques

Chapitre 2

Les acides nucliques

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 35/204


Les acides nucliques

2.1 Acide ribonuclique

BM 08

Pour former un acide ribonuclique les nuclotides (GMP, AMP, UMP, CMP), sont conden
ss les uns sur les autres avec des liaisons phosphodiester entre le carbone 3 dun premier nu
clotide et le carbone 5 du nuclotide suivant.
De sorte que ces liaisons dfinissent un sens la molcule : le dbut tant le nuclotide dont
le phosphate en 5 ne serait li aucun autre nuclotide et la fin correspond au nuclotide dont
la fonction alcool en 3 nest pas estrifie.
Selon leurs fonctions, on distingue plusieurs espces dacides ribonucliques :
rRNA = acide ribonuclique ribosomique, qui participe la structure des ribosomes ;
tRNA = acide ribonuclique de transfert, transporteur des acides amins activs pour la
traduction ;
mRNA = acide ribonuclique messager, produit de la transcription dun gne qui porte
linformation traduire.

36/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.2 Les extrmits 5 et 3 dun acide


nuclique

BM 08/1

Le premier nuclotide de la chane porte, par une liaison ester sur le carbone 5 de son ribose
un phosphate dont les deux autres fonctions acides ne sont pas estrifies. Cest lextrmit
5-phosphate terminale de lacide nuclique, quon dsigne par convention comme le dbut
de la squence ou du fragment dacide nuclique.
Le dernier nuclotide de la chane porte une fonction alcool sur le carbone 3 de son ribose.
Cette fonction alcool nest pas pas estrifie. Cest lextrmit 3-OH terminale de lacide nu
clique, quon dsigne par convention comme la fin de la squence ou du fragment dacide
nuclique.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 37/204


Les acides nucliques

2.3 Structure secondaire du RNA

BM 09/1

Le RNA diffre du DNA par plusieurs caractres :


1. il est plus court (70 10 000 nuclotides)
2. le squelette de pentoses et de phosphates contient du ribose la place du dsoxyribose
3. parmi les bases azotes luracile (U) remplace la thymine (T)
4. Les RNA sont simple brin mais certaines rgions sont apparies sur une courte distance
par leurs bases complmentaires selon un ajustement au hasard (pingles cheveux).

38/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.4 Acides ribonucliques

BM 10

Il existe de nombreuses molcules dacides ribonucliques dans presque tous les comparti
ments de la cellule et ayant des fonctions varies.
Certains (rRNA) font partie de la structure des ribonucloprotines du ribosome, particule res
ponsable de la synthse des protines.
Dautres sont des coenzymes transporteurs dacides amins pour la synthse des protines, ce
sont les tRNA.
Certains, beaucoup plus rares, participent la structure de ribonucloprotines diverses, res
ponsable de lexcision-pissage des transcrits, de la slection des polyribosomes lis pour
ladressage des protines ou encore dautres activits enzymatiques du mtabolisme (ex. :
ALA synthtase).
Enfin les mRNA sont les produits de la transcription des gnes, grce auxquels les ribosomes
reoivent linformation ncessaire la synthse des protines.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 39/204


Les acides nucliques

2.5 Acide dsoxyribonuclique

BM 11

Les molcules dacide dsoxyribonucliques sont formes de deux chanes dont les nucloti
des sont hybrids deux deux sur toute la longueur.
Les deux chanes sont antiparallles, cest dire que lextrmit 5 de lune est du ct de lex
trmit 3 de lautre.
Pour que tous les nuclotides puissent shybrider ; il faut que lordre dans lequel ils sont lis
ensemble soit complmentaire de la chane oppose.
Les bases azotes lies par les liaisons hydrognes sont tournes vers lintrieur, tandis que
les riboses et les acides phosphoriques, hydrophiles sont tourns vers lextrieur.
La chaleur peut dissocier les deux chanes : cest la fusion du DNA. Cette fusion est
rversible : les deux chanes peuvent shybrider nouveau.

40/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.6 La double hlice (modle rubans)

BM 11/1

La structure secondaire du DNA est telle que les deux brins sont enrouls lun autour de
lautre. Chacun des deux brins est orient (53) dans le sens oppos celui de lautre brin
(35). On dit quils sont antiparallles.
Les bases azotes sont tournes vers lintrieur de la double hlice de faon ce que chacune
shybride avec une base de lautre brin (A avec T, C avec G, etc..). On dit que les bases suc
cessives de chacun des brins sont complmentaires.
La double hlice a un pas de 3,4 nm cest dire quil y a environ 10 paires de nuclotides
pour chaque tour dhlice.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 41/204


Les acides nucliques

2.7 La double hlice (travers)

BM 11/2

Une vue perspective de la double hlice montre bien comment les bases azotes sont parall
les entre elles, leurs noyaux empils comme des assiettes au centre de la double hlice.

42/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.8 La double hlice (axe)

BM 11/3

Lorsquon reprsente la double hlice selon son axe, on met en vidence deux particularits.
Lensemble des dsoxyriboses et des phosphates se trouve lextrieur de la molcule et les
fonctions acides des phosphates sont orientes vers lextrieur.
Les bases azotes sont tournes vers lintrieur de la double hlice et unies la base compl
mentaire par des liaisons hydrogne. Les nuclotides complmentaires ntant pas tout fait
diamtralement opposs, laxe de lhlice est vide.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 43/204


Les acides nucliques

2.9 Surenroulement

BM 12

Lors de la transcrition ou de la rplication, lhlice du DNA est ouverte par une topoisomrase
(hlicase) qui permet aux enzymes laccs au brin modle.
Le fait de sparer les bases complmentaires et les deux brins de la double hlice sur plusieurs
dizaines de nuclotides se traduit par un resserrement des tours dhlice de part et dautre de
la boucle ainsi ouverte.
Ce surenroulement ncessite lintervention dune topoisomrase qui va desserrer les tours
dhlice en coupant un brin ou les deux brins du DNA, puis en les faisant tourner lun autour
de lautre jusqu revenir 10 nuclotides par tour dhlice.
Des protines de stabilisation du DNA simple brin viennent se fixer sur la partie droule pour
protger la molcule.

44/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.10 Nuclosome

BM 12/1

Le DNA a besoin dtre protg par des protines lorsquil nest pas utilis comme modle
pour lexpression des gnes ou la rplication.
Cette protection se fait par enroulement autour de protines basiques (cationiques) capables
de se lier avec le DNA qui est un polyanion. Des octamres dhistones sont au centre de par
ticules quon trouve tous les 200 nuclotides et autour desquels le DNA senroule. La struc
ture voque un collier de perles .
Le DNA ainsi li aux histones est protg contre laction des enzymes. Une endonuclase peut
digrer le DNA entre les perles et dtacher des particules de 11 nm de diamtre appeles
nuclosomes.
Chaque nuclosome est constitu dun fragment de DNA de 145 paires de nuclotides et de
huit molcules dhistones.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 45/204


Les acides nucliques

2.11 Fibre de chromatine

BM 12/2

Le DNA qui entoure chaque nuclosome et le relie en collier de perles aux nuclosomes
suivants, forme la trame dune structure hlicodale qui enroule les colliers de perles sur eux-
mmes. On dcrit aussi cette structure comme un solnode.
Le diamtre de cette hlice est de 30 nm et forme une grande partie de la chromatine dite
compacte o le DNA nest pas accessible.
Toutefois, des squences reconnues spcifiquement par des protines de liaison au DNA in
terrompent de place en place cette structure compacte.

46/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Les acides nucliques

2.12 Condensation et hydrolyse des


nuclotides

BM 13

La croissance des brins dacides nucliques se fait toujours par leur extrmit 3-OH termina
le.
La condensation se fait partir dun substrat activ : un des nuclosides triphosphates.
Lhydrolyse des deux derniers phosphates fournira lnergie ncessaire la condensation. Le
nucloside monophosphate restant sera estrifi par une fonction acide de son phosphate sur
la fonction alcool libre du carbone 3 du ribose qui constitue lextrmit de lacide nuclique.
Une molcule deau sera te.
Inversement, en ajoutant une molcule deau sur cette liaison ester, on provoquera une rac
tion dhydrolyse qui dtachera le dernier nuclotide et librera le carbone 3 du nuclotide
prcdent.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 47/204


Les acides nucliques

2.13 Complmentarit des bases

BM 13/1

Lhybridation des nuclotides complmentaires peut se faire sur toute la longueur dun brin
dacide nuclique : par des liaisons hydrogne, on associe systmatiquement les C avec des
G et les G avec des C, les A avec des T et les T avec des A.
En runissant tous les nuclotides ainsi associs par des liaisons phosphodiester on constitue
une squence complmentaire de la squence originale. Ces deux squences sont obligatoire
ment orientes dans des sens opposs : on dit quelle sont antiparallles.
De cette faon, grce des enzymes spcifiques, une squence dacide nuclique dite
originale est capable de diriger la synthse dune squence dacide nuclique complmen
taire.
Dans un second temps, cette squence complmentaire isole, sera elle aussi capable de diri
ger la synthse de la squence originale dont elle est le complment.

48/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Biosynthse des macromolcules

Partie II

Biosynthse des

macromolcules

Rappel des objectifs

Transcription et rgulation de lexpression des gnes


Dfinir1 les termes : gne, transcription, brin sens, promoteur, exon, intron, coiffe,
queue poly-A, excision-pissage.
Montrer le mcanisme2 de la transcription dun gne, en distinguant les tapes dini
tiation, dlongation et de terminaison.
Montrer les mcanismes de la rgulation de la transcription. Donner un exemple de
rgulation dun gne eucaryote sous le contrle dune grande voie endocrinienne
(exemples : CREB, GlucocorticoidRE).
Enumrer et dcrire les principales modifications post-transcriptionnelles : enzyme
coiffante, polyadnylation, dition, excision-pissage. Donner un exemple dexpres
sion alternative dun gne eucaryote.
Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de termes indispensables la com
prhension de la transcription : brin sens et brin antisens, RNA polymrase, promoteur, ini
tiation de la transcription, longation, terminaison. Il doit savoir dcrire le mcanisme
biochimique de la RNA polymrase et mentionner les rles spcifiques des trois types de
polymrases impliques dans la transcription chez les eucaryotes.
Il doit savoir commenter un schma rsumant de faon intgre la rgulation dun gne
dont la transcription est sous le contrle dun messager agissant sur un rcepteur membra
naire (exemple de CREB) ou dun messager interagissant avec un rcepteur nuclaire (hor
mones strodiennes).
En ce qui concerne les modifications post-transcriptionnelles, il doit simplement pouvoir
dfinir ce quest une coiffe, une polyadnylation ou lpissage (ventuellement alternatif)
en identifiant et en explicitant les mcanismes molculaires mis en jeu.
Traduction
Dfinir les termes : traduction, codon et anticodon, polyribosome, signal-peptide.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant
toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.
2. Montrer le mcanisme (dune raction) ou
Dcrire les tapes (dune voie mtabolique) : dfinir les corps chimiques en prsence, crire et quilibrer
la (les) raction(s) ; faire le bilan chimique et nergtique.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 49/204


Biosynthse des macromolcules

Montrer le mcanisme de la traduction dun messager, en distinguant les tapes dini


tiation, dlongation et de terminaison.
Montrer les mcanismes de la rgulation de la traduction. Donner un exemple1 dan
tibiotique intervenant sur la rgulation de la traduction des procaryotes.
Enumrer et dcrire les principales modifications post-traductionnelles (en compl
ment de ce qui aura t trait dans le thme 2)
Ltudiant doit tre capable de dfinir un certain nombre de caractristiques ou de termes
indispensables la comprhension de la traduction : aminoacyl-tRNA synthtase, sens de
la traduction, codon, anticodon, codon dinitiation, code gntique, ribosomes, polyriboso
mes.
Sur un schma synthtique dcrivant le mcanisme de la traduction, il doit tre capable
didentifier et dexpliciter les grandes tapes mises en jeu.
Il doit avoir la notion que chacune des tapes de la traduction chez les procaryotes peut tre
la cible dantibiotiques, mais aucune connaissance spcifique ne peut lui tre demande,
sauf des exercices de rflexion o ces donnes lui seraient rappeles.
Il doit pouvoir expliquer en termes simples la diffrence entre les protines localisation
cytoplasmique et celles qui empruntent la voie de scrtion, en prcisant les notions de pep
tide-signal et de modifications post-traductionnelles.
Rplication et rparation du DNA
Dfinir les termes : rplication, rparation.
Montrer le mcanisme enzymatique dune fourche de rplication.
Dcrire les diffrentes ractions catalyses par les DNA polymrases.
Dcrire un exemple de mcanisme de rparation des msappariements.
Dcrire la rplication du DNA linaire et le rle dune tlomrase.
Dcrire lactivit de la transcriptase inverse et donner un exemple de ses consquen
ces physiopathologiques.
Ltudiant doit pouvoir citer et expliciter les grandes caractristiques de la rplication :
semi-conservative, continue/discontinue selon le brin, dbutant une mme origine. Il doit
pouvoir citer les principales protines impliques successivement dans la rplication chez
les eucaryotes et prciser leur rle : hlicases, protines de liaison au DNA simple brin, to
poisomrases, primase, DNA polymrases, ligase.
Ltudiant doit savoir illustrer la notion de fidlit de la rplication en explicitant les prin
cipaux mcanismes mis en jeu (activit 3-exonuclasique des DNA polymrases, rpara
tion des msappariements).
Il doit tre capable de rsoudre le problme pos par la rplication des DNA linaires en
expliquant le rle des tlomrases.
Il doit savoir dcrire les proprits de la transcriptase inverse sans entrer dans les dtails de
la rplication des rtrovirus.
Donner un exemple de rparation du DNA ls.
En appliquant ses connaissances acquises des principales enzymes agissant sur le DNA,

1. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps
dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

50/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Biosynthse des macromolcules

auxquelles seront ajoutes loccasion les glycosylases, ltudiant doit savoir reconnatre
sur un schma les interventions successives des enzymes impliques dans la rparation par
excision de nuclotides.
Recombinaison
Sans avoir reproduire le modle de Holliday qui lui aura t prsent, ltudiant doit tre
capable de dfinir le processus dchange de segments de DNA homologues sur des sch
mas simples et de mentionner limplication de la recombinaison dans des phnomnes fon
damentaux tels que le crossing-over .

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 51/204


DNA Dfinitions

Chapitre 3

DNA Dfinitions

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 53/204


DNA Dfinitions

3.1 La double hlice

BM 21

Lacide dsoxyribonuclique (ADN ou DNA) est constitu de deux chanes de nuclosides


monophosphates lis chacun par une liaison ester entre son carbone 3 (alcool secondaire) et
le carbone 5 (alcool primaire) du nuclotide suivant.
Ces deux chanes de nuclotides sont unies entre elles par des liaisons hydrognes pour former
un hybride en forme de double hlice (modle de J.D. Watson et F.H.C. Crick, 1953) dont les
deux brins sont :
antiparallles : lun est constitu dun enchanement commenant gauche et se pour
suivant vers la droite, lautre commenant droite et se poursuivant vers la gauche ;
complmentaires : chaque adnine (A) dun des deux brins est lie par deux liaisons hy
drogne avec une thymine (T) de lautre brin, et chaque guanine (G) dun brin est lie
par trois liaisons hydrogne avec une cytosine (C) de lautre brin.
De sorte que si on dsigne les nuclotides par les lettres A, C, G et T en fonction des bases
azotes quils contiennent, on peut lire sur cette figure le texte suivant :

...AGAGTCGTCTCGAGTCA...
...TCTCAGCAGAGCTCAGT...

54/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


DNA Dfinitions

3.2 Squence dun gne (apoA-II)

BM 22

Ecrire la suite les lettres A, C, G et T dans lordre o on rencontre les nuclotides sur lun
des brins du DNA de lextrmit 5 lextrmit 3 aboutit un texte indchiffrable (voir
limage).
Pourtant sur cette diapositive le texte ainsi transcrit contient toute linformation ncessaire
pour la synthse dune protine (lapolipoprotine A-II). Cest pourquoi on appelle ce brin de
DNA le brin sens . Lautre brin est le brin complmentaire ou brin antisens .
Lensemble de linformation gntique transmise par chacun des parents un enfant (gnome
haplode) peut scrire ainsi en 3 milliards de lettres (une bibliothque de 7000 livres de
300 pages chacun !)
Les protines du noyau savent chercher sur les brins de la double hlice du DNA des suites
de lettres (squences) sur lesquelles elles se fixent spcifiquement. Les effets de cette fixation
de protines sur le DNA vont permettre lexpression de linformation contenue dans le DNA
pour faire vivre un individu.

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DNA Dfinitions

3.3 Gne

BM 23

Pour permettre la biosynthse dune protine, il doit y avoir dans la structure du DNA dun
sujet, une squence de nuclotides qui constitue le gne de cette protine.
Dans la squence du gne on distingue des squences en amont (lments rgulateurs, promo
teur), un site dinitiation de la transcription, une suite variable dexons et dintrons : exons
non-traduits ou traduits, introns comportant ventuellement dautres squences rgulatrices,
et enfin la fin de la transcription la fin du dernier exon.
Lensemble des mcanismes qui partir de la squence du gne conduisent la production
dun acide ribonuclique ou dune protine est dsign sous le terme dexpression de ce gne.

56/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


DNA Dfinitions

3.4 Expression dun gne

BM 23/1

Lexpression dun gne est une suite de synthses chimiques et de ractions aboutissant la
production dun acide ribonuclique ou dune protine.
Dans un premier temps a lieu la synthse dun acide ribonuclique, dont la squence est com
plmentaire dun des deux brins du gne donc identique celle de lautre brin : cest la trans
cription.
La squence de lacide ribonuclique est identique celle du brin sens et oriente dans le
mme sens. Elle se construit de 5 vers 3 en complmentarit de celle qui est lue sur le
brin antisens.
Aprs des ractions de maturation le transcrit primaire (RNA) devient RNA messager (mR-
NA) et sort du noyau vers le cytoplasme.
Dans le second temps, le RNA messager est lu par groupe de trois nuclotides (lettres) gr
ce un RNA complmentaire qui porte lacide amin correspondant.
La lecture du mRNA se fait de 5 vers 3 et la synthse de la protine se fait en mme
temps de lextrmit NH2 terminale vers lextrmit COOH terminale.
Aprs des ractions de maturation, la protine mature est prte remplir sa fonction dans
la cellule.

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La transcription

Chapitre 4

La transcription

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La transcription

4.1 Transcription

BM 24

Lexpression du gnome aboutit la synthse dans les cellules de macromolcules acides nu


cliques et protines, dont la structure primaire est dtermine par celle du DNA.
Cette expression se fait par deux mcanismes principaux :
la structure primaire du DNA sexprime dabord par la synthse dacides ribonucliques
dont la structure primaire est parallle celle du DNA. Cest la transcription.
la structure transcrite sur certains RNA, dits messagers , sexprime enfin par la syn
thse de protines dont la structure primaire traduit en acides amins linformation por
te par la structure primaire du DNA. Cest la traduction.
La transcription est conduite par plusieurs enzymes :
RNA-polymrase I qui synthtise les RNA cytoplasmiques : RNA ribosomiques (18 S
5,8 S- 28 S)
RNA-polymrase II qui synthtise les RNA messagers qui contiennent linformation
destine la traduction et certains des snRNA
RNA-polymrase III qui synthtise les petits RNA (tRNA, rRNA 5 S, snRNA, 7SL
RNA).

60/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.2 Promoteur

BM 25

La dernire ligne de cette image (en bleu) est la squence du premier exon du gne de
lapolipoprotine A-II.
Les 900 nuclotides qui prcdent contiennent de nombreuses squences reconnues par des
protines nuclaires qui permettent le dbut de la transcription ou la rgulation de cette tape.
On distingue en particulier :
vers -20 -30 (20 30 nuclotides en amont de lexon 1 en direction de lextrmit 5 du
brin sens) une squence TATATA appele bote TATA , qui est spcifiquement re
connue par la protine TFIID, cofacteur de la RNA-polymrase II ;
vers -80 une squence GGCCCATCCAT la fois bote CAT ou CAAT et bote
GC , sur laquelle viennent se fixer dautres protines de la transcription (CTF et Sp-1) ;
de nombreuses autres squences (en jaune) o se fixent des protines rgulatrices de la
transcription. Par exemple, une squence TRE (TGACTCA) au dbut de la troisime li
gne de cette image, sur laquelle vont se fixer des protines de la famille AP-1 pour acti
ver la transcription.

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La transcription

4.3 Brins sens et antisens

BM 25/1

Les gnes sont situs sur les deux brins du DNA, de gauche droite ou de droite gauche,
indiffremment. Ainsi les gnes des apolipoprotines A-I et C-III qui sont voisins sont orien
ts en sens opposs. Le dbut du message (exon 1) est gauche pour lapoA-I et droite pour
lapoC-III. Le message cod doit tre lu en commenant par le dbut donc dans un sens dif
frent pour ces deux gnes.
Pour servir de modle la transcription doit faire la copie de la squence dun brin de DNA,
qualifi de brin sens ; lautre brin en est le complmentaire on le dit antisens . La trans
cription se fait en synthtisant un RNA complmentaire de la squence du brin antisens, donc
identique celle du brin sens.
Lors de la formation du complexe dinitiation de la transcription la fixation de TFIID sur la
bote TATA se fait en premier et sur les deux brins de faon symtrique. Lors de la fixation
des autres protines du complexe (NF-I ou NF-Y sur la bote CAAT) il y a un brin sur lequel
la bote TATA est en aval (ct 3) de la bote CAAT, cest le brin sens qui contient le
message et un brin sur lequel la bote CAAT est en aval (ct 3) de la bote TATA, cest le
brin antisens qui doit servir de modle pour la transcription.

62/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.4 Rgulation de lexpression

BM 26

La rgulation de toute voie mtabolique se fait principalement la premire raction pour ne


pas synthtiser dintermdiaires inutiles.
Pour lexpression dun gne, la rgulation lieu quatre niveaux :
1. lors de la transcription
2. lors de la maturation du transcrit
3. lors de la traduction
4. lors de lactivation de la protine mature.
Le point de contrle principal est la transcription : la RNA polymrase est lenzyme-cl de
lexpression dun gne.

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La transcription

4.5 Cis et trans rgulateurs

BM 26/1

Les squences de nuclotides du promoteur (facteurs cis-rgulateurs) sont reconnues par une
classe de protines spcifiques (facteurs trans-rgulateurs) dont la structure permet une liaison
avec le DNA (DNA binding proteins).
Les facteurs trans-rgulateurs ont des effets sur la vitesse de la transcription : activateurs (s
quences enhancer) ou inhibiteurs (squences silencer). Leur liaison avec le DNA dpend le
plus souvent de circonstances physiologiques qui induisent ou rpriment lexpression du g
ne.
Il existe des lments essentiels et prsents dans la plupart des gnes :
lment principal comme la bote TATA,
lments de base comme loctamre reconnu par le facteur OCT-1 prsent dans presque
toutes les cellules.
Il existe des lments qui rpondent des facteurs dont la prsence dpend des signaux qui
parviennent la cellules, principalement les hormones comme linsuline ou les second mes
sagers comme lAMP cyclique.
Il y a encore des lments spcifiques dun type cellulaire permettant lexpression diffrente
des gnes dans chaque tissu.
Ainsi, le promoteur de la lipoprotine lipase contient la bote TATA, des lments du promo
teur de base, des lments de rponse aux hormones et des lments dexpression tissulaire
spcifique. Dans le promoteur des gnes il y a souvent 20 ou 30 sites de fixation pour des facteurs
trans-rgulateurs dont beaucoup ont un effet inducteur ou rpresseur sur l'expression du gne.

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La transcription

4.6 DNA binding proteins

BM 26/2

Les protines qui reconnaissent et se lient au DNA (DNA binding proteins) sont des enzymes,
des protines de structure, des facteurs de transcription et des lments trans-rgulateurs.
Dans la structure spatiale de ces protines, on reconnat des domaines propres cette liaison
spcifique :
Le domaine hlice-boucle-hlice permet le lien spcifique des hlices avec les nuclotides
dans le grand sillon sur une longueur de 10 paires de bases environ.
Les doigts de Zinc sont des domaines forms dun ion Zn++ ttracoordonn avec deux histi
dines (H) et deux cystines (C) de la protine. Chaque doigt de Zinc se lie cinq nuclotides
dans le grand sillon du DNA. Il y a souvent plusieurs doigts de Zinc la suite dans la mme
protine.
Certaines protines ont un domaine riche en acides amins basiques (K,R) qui se lie aux phos
phates des nuclotides. Ces protines se lient des squences rptes inverses sur le DNA,
lorsquelles sont associes en dimres par la liaison hydrophobe de deux domaines riches en
leucine (fermeture Eclair leucines).

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La transcription

4.7 Interaction Protine DNA

BM 26/21

Les protines rgulatrices (facteurs trans-rgulateurs) ont la capacit de se lier de faon sp


cifique de courtes squences de DNA et de rguler de faon positive ou ngative la trans
cription dun gne.
Dans la plupart des cas la protine sinsre dans le grand sillon de lhlice et ralise une srie
de contacts molculaires avec les paires de bases. La liaison avec le DNA se fait par linter
mdiaire de plusieurs types interactions (liaisons hydrogne, liaisons ioniques ou interactions
hydrophobes).
Ici on a reprsent un point de contact entre un rsidu asparagine dune protine rgulatrice
et une adnine dun brin du DNA.
Linteraction DNA-protine comporte 10 20 de ces points de contact, impliquant chacun un
acide amin.

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La transcription

4.10 Rgulation de leffort

BM 26/4

Les stress provoquent la mise en veil de lorganisme et sa prparation leffort physique qui
ncessite lutilisation du glycogne pour la contraction musculaire. Le cerveau active les m
dullosurrnales par voie nerveuse pour produire de ladrnaline. Si le taux de glucose dans le
sang est bas (hypoglycmie), le pancras scrte du glucagon.
Ces deux hormones agissent sur les muscles et sur le foie en activant la synthse de lAMP
cyclique. Ce dernier est un activateur de la protine kinase A qui est capable de phosphoryler
la CREB (cyclic AMP responsive element binding protein). La CREB phosphoryle constitue
un facteur trans-rgulateur.
Le facteur trans-rgulateur (CREB-P) va dans le noyau des cellules se lier au DNA au niveau
du promoteur de certains gnes qui ont un lment cis-rgulateur spcifique : le CRE (cyclic
AMP responsive element).
La liaison du facteur trans-rgulateur (CREB phosphoryle) sur la squence de llment cis
rgulateur (squence TGACGTCA) va activer la transcription du gne en aval de ce promo
teur, do une synthse accrue de messager.
Les messagers ainsi produits vont induire la synthse denzymes appartenant la voie de la
glycognolyse. Laugmentation du taux de ces enzymes dans les muscles va permettre la
transformation du glycogne en nergie qui sera utilise pour la contraction musculaire.

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La transcription

4.11 RNA polymrase II

BM 27

La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes exprims sous forme de pro
tines. Elle est inhibe spcifiquement par un poison extrait de lAmanite phallode, l-ama
nitine.
Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse molculaire est de 500000 daltons
pour 10 sous-units.
La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides triphosphates comme substrats
(ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protiniques (transcription factors TFIIA
TFIIJ). Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons riches en nergie des
nuclosides triphosphates.

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La transcription

4.12 Initiation de la transcription

BM 28

Linitiation de la transcription sur un promoteur humain implique plusieurs facteurs de trans


cription, connus sous les noms de TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH et TFIIJ en plus
de la RNA polymrase II elle-mme.
Au centre de ce mcanisme initial, il y a lassociation de TBP, la sous-unit reconnaissant le
DNA du facteur TFIID, avec la bote TATA du promoteur. Ladjonction successive de TFIIB
et de RAP30, petite sous-unit de TFIIF, sont ensuite ncessaires pour la fixation de la poly
mrase et dterminent la fois le brin transcrit et le sens de la transcription. A ce complexe
DNA-TFIID-TFIIB-RAP30-polymrase II, sajoutent encore successivement la grand sous-
unit de TFIIF (RAP74), TFIIE et TFIIH. Alors la transcription peut commencer si les ribo
nuclosides substrats sont prsents.
Le complexe dinitiation de la transcription recouvre une squence denviron 100 nuclotides
du brin antisens du DNA. TFIIH provoque louverture et le droulement partiel de la double
hlice cet endroit.
La transcription commence environ 22 nuclotides de la bote TATA en direction oppose
celle des lments GC-CAAT et se poursuit en remontant le brin antisens en direction de
son extrmit 5.
La formation de ce complexe est active ou inhibe par les facteurs trans-rgulateurs lis aux
squences cis-rgulatrices du mme promoteur.

72/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.13 Liaison TFIID sur le DNA

BM 28/1

La fixation du facteur TFII D sur la bote TATA est la premire tape de la constitution du
complexe dinitiation de la transcription.
La bote TATA est symtrique, cest dire quelle est identique sur les deux brins antiparal
lles et complmentaires du DNA.
La protine TFII D se fixe sur le DNA, en reconnaissant llment TATA et dforme la double
hlice de faon importante en se fixant.
Cet ensemble va servir de point dancrage pour les autres facteurs dinitiation de la transcrip
tion.

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La transcription

4.14 Rgulation de la RNA polymrase

BM 28/2

Les activateurs ou inhibiteurs de la transcription (facteurs trans-rgulateurs) sont des proti


nes produites par dautres gnes qui interviennent pour activer ou pour inhiber la RNA poly
mrase II et par suite induire ou rprimer lexpression du gne transcrire.
Ces facteurs trans-rgulateurs se lient au DNA (DNA binding proteins) dans la rgion du gne
situe en amont de la partie transcrite. Les sites de fixation de ces facteurs trans-rgulateurs
sur le DNA sont des squences spcifiques appeles lments cis-rgulateurs.
Le couple lment cis-rgulateur plus facteur trans-rgulateur li entre en contact avec le
complexe dinitiation de la RNA polymrase par lintermdiaire dun ensemble de protines
appel mdiateur.
La RNA polymrase peut donc dmarrer la transcription lorsquelle est active par les fac
teurs de transcription dont certains sont lis ces lments comme les botes TATA ou CAAT
et lorsque par lintermdiaire du mdiateur elle reoit un signal dactivation ou dinhibition.
Ce signal dpend de la prsence dun facteur trans-rgulateur li un autre lment du pro
moteur. La liaison du rgulateur et du mdiateur ncessite un repliement du DNA du promo
teur pour permettre la liaison de ces protines.

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La transcription

4.15 Elongation de la transcription

BM 29

Chaque nucloside triphosphate est choisi spcifiquement pour tre complmentaire de la


base du brin antisens qui va lui faire face. La liaison riche en nergie entre le premier phos
phate estrifiant le carbone 5 du ribose et les deux autres phosphates est hydrolyse, librant
un pyrophosphate qui sera hydrolys ensuite par une pyrophosphatase. Le phosphate restant
est li par une liaison ester au carbone 3 libre du dernier nuclotide du transcrit en cours de
synthse.
La RNA polymrase construit un RNA hybrid avec le brin antisens du DNA, dont la squen
ce primaire est la copie du brin sens mais compose de ribonuclotides au lieu des dsoxyri
bonuclotides et duracile la place des thymines.
Au cours de cette longation la RNA polymrase II est accompagn dune srie de facteurs
dlongation qui modifient la chromatine pour permettre lavance de lenzyme, empchent
la formation dobstacles comme des pingles cheveux ou facilitent lavance de la polycon
densation.

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La transcription

4.16 Elongation de la transcription

BM 29/1

La transcription commence au point dinitiation (environ 25 nuclotides avant la bote TATA


sur le brin antisens) par lhybridation et la condensation des premiers ribonuclotides du
transcrit primaire (futur mRNA).
La double hlice est ouverte en une boucle o se place la RNA polymrase II.
Le transcrit primaire reste hybrid sur quelques nuclotides avec le brin antisens puis sen d
tache pour permettre la double hlice de se reformer aprs le passage de la polymrase. Lex
trmit 5 du transcrit primaire libre se condense en diverses structures secondaires
(pingles cheveux).
Les substrats de la RNA polymrase sont les quatre ribonuclosides triphosphates.
La polymrase lit le brin antisens en allant dans le sens 3 5. Elle poursuit la synthse du
transcrit primaire en condensant les ribonuclotides jusqu ce quelle rencontre les signaux
de terminaison.
A la rencontre des signaux de terminaison, la polymrase se dtache du DNA, libre le trans
crit primaire et la double hlice se referme.

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La transcription

4.17 Discontinuit des gnes

BM 30

Les molcules de DNA de chaque chromosome sont trs longues : jusqu plusieurs centaines
de millions de paires de nuclotides et contiennent plusieurs milliers de gnes. Chez lhomme,
les gnes sont trs disperss et ne reprsentent que 10 % du DNA gnomique total.
Chaque gne comprend des rgions qui contiennent les squences codes qui seront traduites,
les exons ; mais aussi, des rgions de rgulation comme le promoteur et des rgions non tra
duites appeles introns qui sparent les exons. Un gne peut ne contenir quun seul exon et
pas dintron, mais il y a des gnes de plus de cent exons.
Aprs la transcription le RNA produit de la RNA polymrase ou transcrit primaire contient
encore les introns et les exons, mais pas le promoteur.
Aprs lexcision des introns et lpissage des exons, le messager ne contient plus que les
exons runis en une seule squence codante.

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La transcription

4.18 Exon

BM 30/1

Les exons sont des fragments de squence primaire dun gne qui seront recopis dans la
structure primaire du RNA messager, aprs lpissage.
Il existe des exons de longueur trs variable : courts (34 nuclotides pour lexon 1 de lapoA-
II) longs (7572 nuclotides pour lexon 26 de lapoB).
Un exon code le plus souvent pour un domaine fonctionnel de la protine ou une partie dun
tel domaine, de sorte que les protines des eucaryotes formes de plusieurs domaines, sont co
des par des gnes possdant au moins autant dexons.
Au cours de lvolution le gne peut tre modifi par la substitution, linsertion ou la dltion
dun exon entier (conversion de gnes) ce qui modifie, apporte ou retire la protine un do
maine fonctionnel en entier.

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La transcription

4.19 Exon 1

BM 31

Aprs la fixation de la RNA-polymrase sur la bote TATA par lintermdiaire du facteur


TFIID, la transcription va commencer 23 nuclotides au del de cette bote.
A ce point, la squence du brin sens est 5AGGCACAGA...3, celle du brin antisens est donc
3TCCGTGTCT...5 (complmentaire et antiparallle).
En choisissant comme substrats les ribonuclotides complmentaires de ce brin antisens, la
RNA-polymrase va composer 5AGGCACAGA...3 qui sera le dbut de la squence du
RNA transcrit. Lorsque la polymrase rencontre un A sur le brin antisens, elle incorpore un
nuclotide Uracile dans le mRNA : 5...GCUGGCUAG...3.
La squence du RNA transcrit recopie donc celle du brin sens du DNA.
La transcription se poursuit alors tout au long du brin antisens en incorporant 1329 nuclotides
dans le RNA transcrit de lapoA-II.

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La transcription

4.20 Fin de la transcription

BM 32

La transcription du gne de lapoA-II se poursuit donc durant 1329 nuclotides.


Vers la fin du gne des facteurs lis la RNA-polymrase reconnaissent sur le brin antisens
une squence 3-TTATTT-5 suivie dans la plupart des gnes dun autre signal 3-ATA
CAAAC-5 qui librent la RNA polymrase. La transcription sarrte en effet peu aprs le
premier signal et la fin du transcrit scrit 5-AAUAAAUGCUGAAUGAAUCC-3OH.
La RNA-polymrase ayant libr le DNA et le transcrit primaire qui contient la copie de lin
formation gntique qui va permettre lexpression du gne sous forme de protine.

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La transcription

4.21 Modifications du transcrit

BM 33

Chapeau : une enzyme ajoute un nuclotide Guanine sur les phosphates du Carbone 5 du
premier nuclotide du transcrit et transfre des radicaux mthyl sur les premiers nuclotides.
Ces modifications font un dbut commun tous les transcrits primaires, prcurseurs des RNA
messagers.
Queue poly-A : une enzyme coupe le transcrit environ 10 20 nuclotides au del de la s
quence AAUAAA et synthtise sur le Carbone 3 libre du dernier nuclotide du transcrit res
tant une longue chane de 500 2000 nuclotides Adnine polycondenss.
Edition : Des enzymes peuvent diter (au sens anglais du terme) la structure primaire du
transcrit en modifiant certaines bases (exemple : CU par une cytosine dsaminase spcifi
que dans les apolipoprotines B).
Excision - pissage : les parties non codantes de la structure primaire du transcrit sont coupes
et les parties codantes rassembles.

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La transcription

4.22 Enzyme coiffante

BM 33/1

Lorsque llongation du transcrit primaire commence, lextrmit COOH terminale de la po


lymrase est phosphoryle. Cette phosphorylation permet de librer les protines du comple
xe dinitiation et de commencer aussitt les modifications sur la partie du RNA qui est dj
transcrite.
Pour ajouter la coiffe, un complexe multienzymatique exerce trois activits :
1. lhydrolyse du phosphate du nuclotide 5 terminal du transcrit primaire
2. le transfert sur le phosphate restant dun guanylate partir dun GTP
3. la mthylation de ce guanylate sur lazote n7.
Les deux premires activits sont catalyses par une protine de 68 kDa et la mthylation par
une autre sous-unit de 57 kDa.

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La transcription

4.23 Coiffe dun messager

BM 33/2

Les RNA messagers sont dtruits par des ribonuclases dans le cytoplasme. Leur hydrolyse
libre des nuclotides qui seront remploys la synthse de nouveaux acides nucliques.
Pour protger les RNA messagers de ce catabolisme, une structure particulire dissimule lex
trmit 5 terminale de ces RNA aux exonuclases spcifiques de cette partie du RNA. Cette
structure est appele coiffe du messager (cap).
Au minimum, il y a fixation dun GMP sur le deuxime phosphate du nucloside triphosphate
qui se trouve lextrmit 5 du transcrit. Ce GMP est mthyl sur son azote n7.
Si le nuclotide initial comprend une adnine celle-ci peut tre mthyle sur lazote n6. Les
riboses des nuclotides initiaux sont quelquefois mthyls sur loxygne de la fonction alcool
en 2.

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La transcription

4.24 Queue polyA

BM 33/3

Des signaux de fin de transcription se retrouvent la fin de la plupart des gnes des
Mammifres : TATGTTTC.
A la lecture de ces signaux la RNA polymrase II sarrte de transcrire et quitte le DNA en
librant le transcrit primaire.
Aussitt une endonuclase coupe la fin du transcrit environ une quinzaine de nuclotides
aprs un autre signal : AAUAAA dit bote de polyadnylation (ou bote polyA).
Sur lextrmit 3OH de cette coupure, une polyA polymrase va condenser un grand nombre
de nuclotides, tous adnine. Le transcrit primaire se trouve allong dune queue
poly(A) de plus de mille nuclotides.
Cette queue polyA est indispensable la maturation et lactivit du RNA messager qui la
porte. Elle sera lentement digre par les exonuclases du cytoplasme lorsque le messager
sera actif. Lorsquelle sera rduite quelques centaines de nuclotides le messager vieilli sera
dtruit totalement pour tre remplac par un messager neuf.

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La transcription

4.25 Le transcrit primaire

BM 34

Le transcrit primaire de lapoA-II contenait donc 1329 nuclotides.


Il a reu une coiffe (cap), GMP mthyl qui se fixe sur le phosphate de lATP en 5 du trans
crit primaire.
Il reoit une queue poly-A synthtise en 3 aprs la fin du transcrit.
Trois introns vont tre exciss : ils seront reconnus par
un site donneur GU en 5 de chaque intron, suivi dune squence riche en purines
un site receveur AG en 3 de chaque intron, prcd dune squence riche en pyrimidi
nes.
Aprs cette maturation le transcrit primaire devenu RNA messager sera transport vers le cy
toplasme pour la traduction.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 85/204


La transcription

4.26 Excision - pissage

BM 35

Les introns, parties non codantes des gnes des eucaryotes, sont coups (excision) de la struc
ture primaire des RNA au cours de la maturation des messagers.
Les exons, parties codantes, sont ensuite lis entre eux bout bout (pissage), pour tablir la
squence primaire du RNA messager.
Lexcision et lpissage reprsentent donc laction denzymes et de ribozymes qui catalysent
la coupure du RNA (endoribonuclase) et la fermeture de la brche (RNA ligase).
Lpissage peut tre alternatif, cest dire peut conduire plusieurs structures de RNAm : les
RNAm alternatifs ont chacun en propre certains exons ainsi que des exons en commun.

86/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.27 Formation du lasso

BM 36

Lexcision des introns et lpissage des exons est ltape la plus importante de la maturation
du transcrit dans le noyau cellulaire.
Elle fait appel des facteurs spcifiques : ribonucloprotines contenant des petits RNA (snR-
NP), ribozymes (RNA ayant des proprits catalytiques), enzymes spcifiques (maturases)...
La structure secondaire du transcrit met en contact trois squences de lintron : la squence du
dbut de lintron (extrmit 5 ou site donneur), la squence de la fin de lintron (extrmit 3
ou site accepteur) et un nuclotide adnine (A du branchement) environ 40 nuclotides avant
le site receveur.
Le site donneur commence habituellement par un nuclotide guanine dont le phosphate est
dtach de lexon prcdent pour tre transfr sur le carbone 2 de lA du branchement. Le
dernier nuclotide du site accepteur, aussi une guanine, est dtach de lexon suivant, dont le
premier nuclotide est li par son phosphate 5 au carbone 3 du dernier nuclotide de lexon
prcdent.
Lintron, libr sous forme de lasso, est dtruit par des nuclases. Le transcrit perd successi
vement tous ses introns et les exons pisss constituent la squence codante du messager.

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La transcription

4.28 Epissages alternatifs

BM 36/1

Du fait de la prsence de protines rgulatrices sur le transcrit primaire, lpissage peut quel
quefois se faire de faon diffrente dune cellule lautre.
Il est possible de garder alternativement soit lexon 3 soit lexon 4 du gne de la troponine T
(exemple n2). Si lexon 3 est conserv on obtient l-troponine T et si lexon 4 est conserv
on obtient la -troponine T. Cet pissage alternatif est lorigine de nombreuses protines iso
formes.
Il est aussi possible (exemple n1) de faire dpendre lexpression dun gne de deux promo
teurs diffrents, rpondant des rgulations diffrentes. Chacun de ces promoteurs est li
un exon 1 ou 1bis qui seront pisss alternativement avec la suite du transcrit.
On peut encore (exemple n3) avoir plusieurs exons la fin du gne contenant des codons
Stop en phase. Dans ce cas lpissage alternatif donnera des protines de longueurs diffren
tes.

88/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.29 Maturation des RNA ribosomiques

BM 36/2

Pour transcrire les RNA des ribosomes, la RNA polymrase I synthtise un transcrit primaire
de 13000 nuclotides (nt), et la RNA polymrase III synthtise le petit rRNA 5 S de 120 nt.
La maturation du transcrit primaire prcurseur des rRNA se fait par excision de trois
fragments : le rRNA 28 S de 4718 nt, le 18 S de 1874 nt et le 5,8 S de 160 nt.
Les rRNA 28 S, 5,8 S et 5 S vont sassocier avec 49 protines pour former la grande sous par
ticule. Le rRNA 18 S formera la petite sous-particule avec 33 protines.

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La transcription

4.30 Stabilit du messager

BM 36/3

Lacide ribonuclique messager est une copie de travail du gne destin diriger la traduction
catalyse par les ribosomes.
Son extrmit 5-phosphate est protge par la coiffe sans laquelle le RNA est dgrad ds la
transcription par des 5 exonuclases.
Son extrmit 3-OH est constitue dune longue queue poly(A) qui est lentement digre par
des 3 exonuclases. Lorsque cette hydrolyse est avance, le messager est alors inapte la tra
duction et sera dtruit par les endonuclases.
Les messagers qui portent peu de ribosomes (parce que linitiation de la traduction est ralentie
ou inhibe) sont dtruits directement par les endonuclases.
Certains messagers ont une dure de vie courte : beaucoup de ceux qui interviennent dans les
mcanismes post-prandiaux (aprs les repas) ont une dure de vie de lordre de 2 heures et
doivent tre entirement resynthtiss chaque repas.
Dautres messagers, dans le systme nerveux central par exemple, sont compltement stables
durant des annes.

90/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La transcription

4.31 Messager

BM 37

Le RNA messager comprend plusieurs squences :


une squence 5 non-codante, qui ne sera pas traduite, qui correspond lexon 1 et une
partie de lexon 2 dans le gne de lapoA-II ;
un codon AUG qui fixe le tRNA de la mthionine initiale ;
des squences de codons pour incorporer les acides amins du signal-peptide (en vert) et
du propeptide (souligne) ;
la squence des codons dont les acides amins formeront la squence primaire de la
protine ;
le codon de terminaison (ici, UGA) ;
une squence 3 non-traduite qui sachve par la queue poly-A.
Sur la squence 5 non-traduite, va se construire le complexe dinitiation de la traduction o
les ribosomes vont sassembler successivement pour commencer la traduction.

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La traduction

Chapitre 5

La traduction

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La traduction

5.1 Traduction

BM 38

Lexpression du gnome aboutit la synthse dans les cellules de macromolcules acides nu


cliques et protines, dont la structure primaire est dtermine par celle du DNA.
Cette expression se fait par deux mcanismes principaux :
la structure primaire du DNA sexprime dabord par la synthse dacides ribonucliques
dont la structure primaire est parallle celle du DNA. Cest la transcription.
la structure transcrite sur certains RNA, dits messagers , sexprime enfin par la syn
thse de protines dont la structure primaire traduit en acides amins linformation por
te par la structure primaire du DNA. Cest la traduction.
La traduction est faite dans le cytoplasme des cellules :
soit pour librer des protines cytoplasmiques,
soit pour conduire ces protines dans les membranes ou les organites de la cellule (reti
culum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane plasmique, lysosomes, mitochon
dries, noyau, etc...),
soit pour excrter ces protines travers les membranes vers lextrieur de la cellule.

94/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.2 Expression dun gne

BM 23/1

Lexpression dun gne est une suite de synthses chimiques et de ractions aboutissant la
production dun acide ribonuclique ou dune protine.
Dans un premier temps a lieu la synthse dun acide ribonuclique, dont la squence est com
plmentaire dun des deux brins du gne donc identique celle de lautre brin : cest la trans
cription.
La squence de lacide ribonuclique est identique celle du brin sens et oriente dans le
mme sens. Elle se construit de 5 vers 3 en complmentarit de celle qui est lue sur le
brin antisens.
Aprs des ractions de maturation le transcrit primaire (RNA) devient RNA messager (mR-
NA) et sort du noyau vers le cytoplasme.
Dans le second temps, le RNA messager est lu par groupe de trois nuclotides (lettres) gr
ce un RNA complmentaire qui porte lacide amin correspondant.
La lecture du mRNA se fait de 5 vers 3 et la synthse de la protine se fait en mme
temps de lextrmit NH2 terminale vers lextrmit COOH terminale.
Aprs des ractions de maturation, la protine mature est prte remplir sa fonction dans
la cellule.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 95/204


La traduction

5.4 Codon

BM 39/1

La liaison de lacide ribonuclique de transfert (tRNA) avec lacide ribonuclique messager


(mRNA) porteur de linformation, se fait par complmentarit entre 3 nuclotides de chacun
de ces deux RNA. Les 3 nuclotides du mRNA constituent un codon et les 3 nuclotides du
tRNA un anticodon. Au cours de la traduction lanticodon et le codon se lient de manire an
tiparallle, et lacide amin port par le tRNA est incorpor la protine en cours de synthse.
La squence primaire du mRNA est donc traduite par groupes de 3 nuclotides (codons). Un
nuclotide du mRNA au cours de la traduction peut se trouver en position 1, 2 ou 3 dans un
codon si le nombre de nuclotides qui le sparent du codon dinitiation AUG est ou nest pas
un multiple de 3. Cette position porte le nom de cadre de lecture.

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La traduction

5.5 Code gntique

BM 40

La squence codante est une suite de codons dont chacun permet dincorporer spcifiquement
un acide amin dans la synthse dune protine.
Le code gntique est le mme pour tous les tres vivants de la biosphre (universel). Il existe
quelques variations (codons propres la biosynthse des protines dans les mitochondries).
Le code gntique comporte 61 codons pour signifier les 20 acides amins qui participent
la synthse des protines : chaque acide amin peut tre cod par plusieurs codons (de un
six) qui diffrent en gnral par leur troisime nuclotide. On dit que le code est dgnr.

98/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.8 Ribosome eucaryote

BM 41

Les ribosomes du cytoplasme des cellules eucaryotes sont des complexes multienzymatiques
qui associent 82 chanes dacides amins et 4 acides ribonucliques. Ces molcules sont as
socies entre elles pour former deux particules distinctes : la sous-unit 60S
(Large = 2800000 daltons) et la sous-unit 40S (Small = 1400000 daltons) qui peuvent se
dissocier facilement.
Les acides ribonucliques ribosomiaux et les protines ont des sites de fixation pour la s
quence du messager, pour les RNA de transfert qui portent lacide amin incorporer (site A)
et le peptide en cours de synthse (site P), un site catalytique pour former les liaisons peptidi
ques, des sites de fixation pour les cofacteurs protiques de linitiation (eIF2, eIF3), de llon
gation et de la terminaison et des sites de rgulation (protine S6).

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La traduction

5.9 Polyribosome

BM 42/1

Sur le mme messager plusieurs ribosomes effectuent la traduction de la mme protine les
uns aprs les autres : le tout constitue un polyribosome.
Linitiation est un phnomne permanent lextrmit 5 dun RNA messager et les riboso
mes se succdent sur le messager raison dun tous les 100 nuclotides environ. Le premier
acide amin incorpor constitue lextrmit NH2 terminale de la protine.
A lextrmit 3, en arrivant au codon de terminaison, les sous-particules du ribosome se s
parent et librent la protine synthtise. Le dernier acide amin incorpor constitue lextr
mit COOH terminale de la protine.
Les polyribosomes prsentent un aspect diffrent selon la rgulation des diffrentes tapes de
la traduction. Plus linitiation est active plus les ribosomes sont nombreux sur le messager. Si
llongation est lente, les ribosomes vont mettre plus de temps lire la squence codante. Une
activation brutale de la terminaison dissocie tous les ribosomes du messager. De nombreux
antibiotiques sont capables dinterfrer avec chacune des tapes de la synthse des protines
(streptomycine, cycloheximide, puromycine).

102/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.10 RNA de transfert (trfle)

BM 43

Les RNA de transfert constituent le lien chimique ncessaire entre la structure du codon, re
connu par lanticodon, et lacide amin spcifique port par le tRNA. Cest en quelque sorte
le dictionnaire de la traduction.
Lanticodon est une squence de trois nuclotides situe lextrmit de la boucle infrieure
du tRNA, complmentaire et antiparallle de la squence du codon de lacide amin corres
pondant.
Chaque acide amin est li spcifiquement (code gntique) par une amino-acyl-tRNA-syn
thtase lextrmit 3 du tRNA dont lanticodon lui correspond (tRNA charg).
Les ribosomes lient les tRNA chargs sur le site A de llongation si leur anticodon sapparie
avec le codon du messager cet endroit. Llongation transfre alors le peptide sur lacide
amin nouveau, lui-mme port par le RNA de transfert.

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La traduction

5.11 RNA de transfert (ruban)

BM 43/1

Lanalyse cristallographique des RNA de transfert a montr que les extrmits des deux bras,
boucle des dihydrouraciles et boucle GTCG, se referment lune sur lautre en changeant
des liaisons hydrogne. En sorte que dans ce modle le RNA de transfert affecte une forme
en L o seuls le bras de lanticodon et le bras accepteur de lacide amin sont aux extrmits
de la molcule.

104/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.12 Activation dun acide amin

BM 44

Les acides amins libres du cytoplasme sont les substrats de la synthse des protines. Pour y
participer ils doivent tre activs.
Lactivation des acides amins est catalyse par des enzymes spcifiques : les aminoacyl
tRNA synthtases. Il en existe au moins une pour chacun des 20 acides amins.
Ces enzymes ont une double spcificit : elles reconnaissent spcifiquement un acide amin
et elles reconnaissent spcifiquement le tRNA non charg correspondant.
Laminoacyl-tRNA synthtase hydrolyse un ATP en AMP (liaison riche en nergie) puis ac
tive lacide amin en liant sa fonction acide avec la fonction acide du phosphate de lAMP
(liaison anhydride mixte riche en nergie). Le pyrophosphate est aussitt dtruit par une py
rophosphatase.
Lacide amin ainsi activ est transfr ensuite avec sa liaison riche en nergie sur une des
fonctions alcool secondaires du ribose de lAMP 3-terminal du tRNA. Le tRNA charg se lie
ensuite au ribosome pour la synthse de la protine.

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La traduction

5.13 Srine tRNA synthtase

BM 44/1

Les aminoacide-tRNA-synthtases sont les enzymes qui chargent les acides amins libres du
cytoplasme sur les RNA de transfert correspondants. Le coenzyme ATP est hydrolys en
AMP et en pyrophosphate pour fournir lnergie ncessaire. La liaison ester constitue entre
lacide amin et son tRNA est riche en nergie et sera hydrolyse au cours de ltape dlon
gation de la traduction.
Les aminoacide-tRNA-synthtases ont une double spcificit trs troite pour les deux
substrats : lacide amin reconnu (ici, la srine) et les tRNA dont les anticodons sont compl
mentaires des codons correspondant cet acide amin dans le code gntique. Lexactitude
de la traduction repose entirement sur cette double spcificit.
Les aminoacide-tRNA-synthtases sont en quelque sorte les auteurs du dictionnaire de la tra
duction.
La reconnaissance du tRNA se fait par lanticodon dans certains cas (lenzyme ne tenant pas
toujours compte de la premire base de lanticodon, ce qui explique la dgnrescence du
code gntique) ou bien encore par dautres squences du tRNA communes aux tRNA syno
nymes. Certaines aminoacide-tRNA-synthtases sont rgules par phosphorylation.

106/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.14 Cystine tRNA synthtase

BM 44/2

Les aminoacide-tRNA-synthtases sont les enzymes qui chargent les acides amins libres du
cytoplasme sur les RNA de transfert correspondants. Le coenzyme ATP est hydrolys en
AMP et en pyrophosphate pour fournir lnergie ncessaire. La liaison ester constitue entre
lacide amin et son tRNA est riche en nergie et sera hydrolyse au cours de ltape dlon
gation de la traduction.
Les aminoacide-tRNA-synthtases ont une double spcificit trs troite pour les deux
substrats : lacide amin reconnu (ici, la cystine) et les tRNA dont les anticodons sont com
plmentaires des codons correspondant cet acide amin dans le code gntique. Lexactitude
de la traduction repose entirement sur cette double spcificit.
Les aminoacide-tRNA-synthtases sont en quelque sorte les auteurs du dictionnaire de la tra
duction.
La reconnaissance du tRNA se fait par lanticodon dans certains cas (lenzyme ne tenant pas
toujours compte de la premire base de lanticodon, ce qui explique la dgnrescence du
code gntique) ou bien encore par dautres squences du tRNA communes aux tRNA syno
nymes. Certaines aminoacide-tRNA-synthtases sont rgules par phosphorylation.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 107/204


La traduction

5.15 Initiation de la traduction

BM 45

Linitiation de la traduction est ltape limitante de la traduction.


Les sous-units des ribosomes sont dissocies dans le cytoplasme. Une cascade dvnements
va former un complexe dinitiation.
Au repos, le facteur eIF2 (eucaryotic initiation factor 2) est porteur dun GDP, coenzyme
quil a hydrolys au cours du cycle dune initiation prcdente. En prsence du facteur eIF2B,
un nouveau GTP est substitu ce GDP. Le facteur eIF2 ainsi activ, peut alors lier le tRNA
charg dune mthionine dont lanticodon est complmentaire du codon dinitiation (AUG)
du messager. En prsence du cofacteur eIF4C, la petite sous-unit va fixer le facteur eIF3 et
le facteur eIF2 activ qui porte le tRNA charg de la mthionine initiale. Lnergie de la for
mation de ce complexe a t fournie par lhydrolyse de la liaison riche en nergie du GTP por
t par le facteur eIF2.
La squence 5 non traduite du RNA messager est reconnue par les cofacteurs eIF4A, eIF4B
et eIF4F qui sy fixent. Grce lhydrolyse dun ATP pour fournir lnergie, le messager est
alors transfr sur la petite sous-unit, en regard du site P, de faon hybrider les nuclotides
du codon dinitiation avec ceux de lanticodon de le tRNA de la mthionine initiale.
En prsence du dernier cofacteur eIF5, le complexe va se lier une grande sous-unit pour
constituer un ribosome fonctionnel. Les cofacteurs dinitiation sont librs et la traduction
commence. Le cofacteur eIF2 toujours porteur de son GDP, se libre pour recommencer un
nouveau cycle dinitiation.

108/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.16 Cadre de lecture

BM 45/1

Le positionnement du messager par rapport au RNA de transfert de la Mthionine initiale d


termine le cadre de lecture de la traduction du messager.
Le RNA de transfert de la mthionine occupe un des deux sites de fixation des tRNA sur le
ribosome : site P (ou peptidique, car il contiendra le peptide en cours de synthse). Le codon
AUG du messager, en shybridant dans le site P avec lanticodon CAU du RNA de transfert
de la mthionine, place le messager de telle sorte que le codon suivant (N1N2N3) apparaisse
dans lautre site de fixation : site A (ou acide amin, car il servira la fixation des nouveaux
acides amins incorpors).
Le nuclotide N1 sera toujours le premier de chaque codon.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 109/204


La traduction

5.17 Elongation de la traduction

BM 47

Les ribosomes initis ont leur site A vacant. Le facteur dlongation eEF1B catalyse lchange
du GDP par un GTP sur le facteur eEF1A. Celui-ci, activ, va recevoir un tRNA charg quil
viendra fixer sur ce site A, en hydrolysant le GTP en GDP. Ds que le codon du messager au
fond du site A a pu se lier complmentairement avec lanticodon du tRNA apport, le facteur
eEF1A est libr avec son GDP.
Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situ sur le tRNA du site P sur la fonction
amine de lacide amin du tRNA du site A. Il utilise pour cela, lnergie de lhydrolyse de la
liaison ester riche en nergie entre le peptide et le tRNA du site P.
Enfin, grce au facteur eEF2 et lhydrolyse dun autre GTP, le tRNA du site P est libr, le
messager, le tRNA restant et le peptide en cours de synthse sont alors dplacs (transloca
tion) du site A vers le site P, sans quil y ait de sparation entre le codon et lanticodon.
Le site A est nouveau libre pour recevoir le tRNA de lacide amin suivant.

110/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.18 Incorporation dun acide amin

BM 47/1

Un tRNA charg vient se fixer sur le site A libre. Le codon du messager au fond du site A va
se lier complmentairement avec lanticodon du tRNA du nouvel acide amin ce qui va per
mettre lincorporation de cet acide amin dans le peptide en cours de synthse.

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La traduction

5.19 Transfert du peptide

BM 47/2

Le ribosome catalyse alors le transfert du peptide situ sur le tRNA du site P sur la fonction
amine de lacide amin du tRNA du site A. Il utilise pour cela, lnergie de lhydrolyse de la
liaison ester riche en nergie entre le peptide et le tRNA du site P.

112/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.20 Translocation des codons

BM 47/3

Le tRNA libre du site peptidique quitte le ribosome.


Le messager, le tRNA restant et le peptide en cours de synthse sont alors dplacs (translo
cation) du site A vers le site P, sans quil y ait fusion de lhybride entre le codon et lantico
don.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 113/204


La traduction

5.21 Liaisons riches en nergie

BM 47/4

Le bilan nergtique de la traduction dpend du nombre dacides amins de la protine syn


thtise.
Pour chaque acide amin, on utilise dabord un ATP AMP pour la synthse du tRNA char
g (aminoacyl-tRNA synthtase). LAMP produit est ractiv en ADP par un autre ATP (nu
closide-P2 kinase). Lensemble quivaut la consommation de deux liaisons riches en
nergie ATP ADP.
Pour lincorporation de ce tRNA charg dans le site acide amin du ribosome, le facteur
eEF1B utilise un GTP GDP.
Pour la translocation du peptidyl-tRNA du site acide amin au site peptidique, le facteur eEF2
utilise encore un GTP GDP.
En tout chaque acide amin incorpor dans la protine cote la cellule quatre liaisons riches
en nergie.

114/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.22 Terminaison de la traduction

BM 48

Lorsque le site A se trouve en regard dun codon non-sens annonant la fin de la traduction,
le complexe va se dissocier du messager en prsence dun dernier cofacteur eRF.
Les deux sous-units du ribosome se dissocient, la protine synthtise est libre, ainsi que
le dernier tRNA.

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La traduction

5.23 Signal-peptide

BM 50

Lorsquune protine est synthtise, sa structure secondaire ou tertiaire se construit au fur et


mesure de la traduction et elle est libre dans le cytoplasme.
Lorsque cette protine est destine tre incorpore dans les membranes ou les organites de
la cellule, la partie codante du RNA messager commence par une squence de quelques acides
amins qui sert dadresse pour lincorporation de cette protine dans la membrane.
Ces peptides orientent la destine de la protine : incorporation dans les membranes (reticu
lum endoplasmique, appareil de Golgi, membrane plasmique, lysosomes...), entre dans les
mitochondries, excrtion hors de la cellule via lappareil de Golgi, etc...
Le signal-peptide est un peptide dadressage situ lextrmit NH2-terminale des protines
excrter. Parce que sa fonction est de pntrer dans la membrane du reticulum endoplasmi
que, sa structure est riche en acides amins hydrophobes (Phe, Leu, Ile, Met, Val).

116/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.24 Polyribosomes lis

BM 51

Les polyribosomes qui se forment sur un messager comportant un signal peptide ont une vo
lution lgrement diffrente. La traduction sarrte peu aprs la synthse du signal-peptide,
ds que celui-ci apparat hors de la structure du ribosome et se lie avec la SRP (SRP = Signal
Recognition Particle), qui inhibe llongation.
Pour que llongation puisse se poursuivre, il faut que la SRP soit reconnue spcifiquement
par un rcepteur de la membrane du reticulum endoplasmique. Ds que cette liaison est ta
blie, le ribosome est li par la ribophorine, toujours dans la membrane du reticulum, prs
dune protine qui ouvre un pore travers cette membrane. Le SRP cart, llongation va
reprendre. Le peptide en cours de synthse est alors dirig travers cette membrane pour se
dvelopper dans la lumire du reticulum endoplasmique.
A la face interne de la membrane une endopeptidase spcifique va couper le signal peptide et
la synthse se poursuivra jusqu la terminaison. La protine sera enfin incorpore dans une
membrane ou exporte, travers lappareil de Golgi, vers lextrieur de la cellule.
Ladressage des protines vers les mitochondries fait appel un autre type de peptide dadres
sage qui conduit les peptides traverser la membrane mitochondriale.

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La traduction

5.25 Carboxylation de lacide glutamique

BM 52/1

Lacide carboxyglutamique est un acide amin propre aux protines fixant le calcium : pro
tines des os, protines de la coagulation du sang.
Cet acide amin est cr par une modification post-traductionnelle de ces protines.
Lenzyme qui effectue la carboxylation a pour coenzyme la vitamine K (ou naphtoquinone),
aliment indispensable quon trouve dans les feuilles vertes. Cette vitamine K est un transpor
teur dhydrogne qui en soxydant, va retirer un hydrogne au carbone n4 dun acide gluta
mique, et transfrer cet endroit une molcule de gaz carbonique issue dun ion bicarbonate.
La vitamine K oxyde doit tre rduite par une diaphorase NADH pour retrouver sa forme
initiale avant de participer nouveau cette carboxylation.
Les inhibiteurs de la rduction de la vitamine K (antivitamines K) vont empcher la raction
de carboxylation, faute de vitamine K rduite, et par consquent empcher la coagulation du
sang.

118/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La traduction

5.26 Modifications post-traductionnelles

BM 53

De nombreuses modifications chimiques se produisent aprs lincorporation des acides ami


ns dans la structure primaire de la protine (traduction) ; on les appelle modifications post
traductionnelles.
On distingue des modifications cotraductionnelles qui se produisent alors que la traduction se
poursuit encore et que le peptide naissant est encore attach au ribosome qui la construit, des
modifications post-traductionnelles proprement dites qui ont lieu dans la cellule, dans les or
ganites ou hors de la cellule.
On appelle protine mature la forme chimique dfinitive que la protine montrera au moment
o elle remplira sa fonction dans lorganisme.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 119/204


La rplication

Chapitre 6

La rplication

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La rplication

6.1 Rplication

BM 54

Au cours de la vie de la cellule (cycle cellulaire, dune division mitotique la suivante), le


DNA doit tre ddoubl pour que chaque cellule fille reoive un gnome complet dans son
noyau.
Cette synthse se produit la phase S (au milieu du cycle cellulaire) grce lactivit de la
DNA-polymrase et . Dautres DNA-polymrases participent la rparation du DNA ls
(DNA-polymrase ) ou la rplication du DNA mitochondrial (DNA-polymrase ).

122/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rplication

6.2 Le cycle cellulaire

BM 55

La vie de la cellule se droule entre deux mitoses. Chez les Mammifres, cette priode dure
en moyenne 30 heures bien quil y ait des cellules dont la vie soit trs courte ou au contraire
trs longue.
Durant ces trente heures la cellule traverse quatre phases :
la phase G1 o le gnome tant diplode, chaque gne est reprsent en deux exemplai
res. La chromatine est accessible aux RNA-polymrases qui transcrivent les gnes en
messagers, qui seront leur tour traduits.
vers la moiti du cycle commence la rplication du DNA : les DNA-polymrases vont
mettre environ 8 heures (phase S) pour recopier en double le DNA de chaque chromoso
me. Durant cette phase la transcription est inhibe.
puis la cellule entre en phase G2 o chaque gne est reprsent en quatre exemplaires.
La chromatine est nouveau accessible aux RNA-polymrases qui recommencent
transcrire.
enfin survient la mitose, qui donne naissance deux cellules filles. Chacune recevra une
des copies identiques du DNA de chaque chromosome et chaque gne y sera reprsent
en deux exemplaires.

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La rplication

6.3 Chromatine et ADN

BM 55/1

Au cours des phases du cycle cellulaires les chromosomes voluent pour prparer les mitoses.
Pendant la phase G1 la chromatine est dcompacte et les gnes peuvent sexprimer. Chaque
chromosome ne contient quune chromatide.
Pendant la phase S, les bulles de rplication souvrent et la rplication commence.
Pendant la phases G2 les deux chromatides issues de la rplication sont lis par leurs
centromres : il y a deux chromatides par chromosome.
Pendant la mitose le centromre se lie au fuseau achromatique et prpare la sparation. La
chromatine est compacte au maximum.
Aprs la mitose, la chromatine est dcompacte et les gnes peuvent sexprimer dans chacune
des deux cellules filles.

124/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rplication

6.4 Rplication semi-conservative

BM 55/2

Les deux brins du DNA parental au cours de la rplication servent chacun de modle pour la
synthse dun nouveau brin.
De cette faon les deux brins, au lieu de rester ensemble chaque synthse (rplication con
servative), se sparent toujours chaque cycle (rplication semi-conservative)
A la premire gnration un brin de chaque double hlice provient de la cellule-mre. A la
deuxime gnration il nexiste plus que deux brins de DNA de la cellule-mre pour quatre
doubles hlices, etc...

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La rplication

6.5 Synthse et hydrolyse du DNA

BM 55/3

La croissance des brins dacides nucliques se fait toujours par leur extrmit 3-OH termina
le.
La condensation se fait partir dun substrat activ : un des nuclosides triphosphates.
Lhydrolyse des deux derniers phosphates fournira lnergie ncessaire la condensation. Le
nucloside monophosphate restant sera estrifi par une fonction acide de son phosphate sur
la fonction alcool libre du carbone 3 du ribose qui constitue lextrmit de lacide nuclique.
Une molcule deau sera te.
Le pyrophosphate rsultant de lhydrolyse des deux derniers phosphates sera lui-mme aus
sitt dtruit par une pyrophosphatase, de sorte que la condensation des nuclotides sera irr
versible.
Inversement, en ajoutant une molcule deau sur cette liaison ester, on provoquera une rac
tion dhydrolyse qui dtachera le dernier nuclotide et librera le carbone 3 du nuclotide
prcdent.

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La rplication

6.6 DNA polymrase

BM 56

Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle
pour doubler systmatiquement lensemble du gnome diplode.
Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la
rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA.
Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du
ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide
complmentaire qui sert de modle.
Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclosides triphosphates (dATP, dCTP,
dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA poly
mrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nu
clotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20
dsoxyribonuclotides environ).
Elles synthtisent le DNA nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis
entre eux par une DNA-ligase.
Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le der
nier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nu
clotide complmentaire du brin modle.

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La rplication

6.7 DNA polymrase (exonuclase 35)

BM 56/1

Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle
pour doubler systmatiquement lensemble du gnome diplode.
Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la
rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA.
Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du
ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide
complmentaire du brin modle.
Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclosides triphosphates (dATP, dCTP,
dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA poly
mrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nu
clotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20
dsoxyribonuclotides environ).
Elles synthtisent le DNA nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis
entre eux par une DNA-ligase.
Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le der
nier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nu
clotide complmentaire du brin modle.

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La rplication

6.8 DNA polymrase : fonction ddition

BM 56/2

Les DNA polymrases ont la fois une activit de polymrase pour ajouter des nuclotides
au nouveau brin de DNA, et une activit de 35 exonuclase pour hydrolyser le dernier nu
clotide incorpor.
Si le nuclotide incorpor est complmentaire du nuclotide du brin modle et donc que lhy
bridation des bases se fait normalement, lactivit de polymrase est plus rapide que celle
dexonuclase et le nuclotide suivant va tre incorpor.
Si le nuclotide incorpor nest pas complmentaire du nuclotide du brin modle et donc
quil y a msappariement, lactivit dexonuclase est plus rapide que celle de polymrase et
ce nuclotide sera hydrolys.

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La rplication

6.9 Boucle de rplication

BM 57

Les DNA-polymrases commencent leur synthse en de nombreux points dinitiation. Suite


la liaison de protines spcifiques, la double hlice souvre pour permettre le dmarrage.
La synthse de DNA commence sur des amorces de RNA/DNA constitues par la primase et
la DNA polymrase a. La rplication se poursuit dans une direction : dans ce sens lun des
deux brins du DNA (brin direct ) est parcouru par lenzyme dans le sens 3 5 ce qui
permet la synthse dun autre brin dans le sens 5 3. Les DNA-ligases assurent ensuite la
liaison entre les diffrents fragments du DNA nouveau.
La synthse de lautre brin (brin retard ) est plus complexe parce que lenzyme parcourt
ce brin de 5 3. La primase et la DNA polymrase synthtisent des amorces de 30 nu
clotides en avant de la zone de rplication, et la DNA polymerase construit la suite de petits
fragments de DNA dans le sens 5 3 (environ 200 nuclotides ; fragments dOkazaki).
Des ribonuclases dtruisent les amorces de RNA/DNA du fragment prcdent et les frag
ments sont ensuite relis entre eux par la DNA-ligase.
Il existe une dizaine disoenzymes de DNA polymrases chez les eucaryotes. La DNA poly
mrase , associe la primase est responsable de la synthse des amorces. La DNA polym
rase est la principale enzyme de la rplication en synthtisant sur le brin direct aussi bien
que sur le brin retard. Les autres DNA polymrases interviennent dans la synthse du DNA
mitochondrial ou dans les processus de rparation du DNA gnomique.

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La rplication

6.10 Fourche de rplication

BM 57/1

La rplication commence par la sparation des deux brins du DNA par lhlicase. Chacun des
deux brins est stabilis par des protines SSB (single strand bound).
Sur le brin direct, en remontant de 3 vers 5, une DNA polymrase synthtise un brin com
plmentaire en ajoutant des dsoxyribonuclosides triphosphates lextrmit 3OH libre.
Une nouvelle double hlice se forme entre le brin modle direct et le nouveau brin synthtis.
Sur le brin retard, une DNA polymrase progresse de 5 vers 3. Pour pouvoir synthtiser
un brin complmentaire, il faut que la primase et la DNA polymrase fabriquent des amor
ces assez rapproches (amorce 3 sur limage) quelques centaines de nuclotides de distance
sur le brin modle au fur et mesure que celui-ci est dtach du brin direct. A partir de lex
trmit 3OH dune amorce (amorce 2 de limage) la DNA polymrase synthtise un frag
ment dOkazaki jusqu ce quelle rencontre lextrmit 5-triphosphate de lamorce
prcdente (amorce 1 sur limage). Cette dernire est hydrolyse par une nuclase, ce qui per
met la DNA polymrase dachever la synthse du fragment dOkazaki que la DNA ligase
va lier dfinitivement avec le DNA du fragment prcdent. Une nouvelle double hlice se for
me entre le brin modle direct et le nouveau brin synthtis.
Toutes ces protines sont associes en une structure du noyau (usine rplication) que traver
sent les molcules de DNA. Cette usine rplication comprend aussi des enzymes de prpa
ration des substrats : nuclotide kinases, ribonuclotide rductase, etc...

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La rplication

6.11 Topoisomrase I

BM 58/1

La rplication ou la transcription du DNA ncessite une fusion partielle de la double hlice et


modifie lenroulement des deux brins.
Afin de permettre ces ractions, la topoisomrase est capable de modifier lenroulement en
hydrolysant un brin du DNA et en le reconstituant aprs avoir fait le tour de lautre brin.
Aprs cette opration, la torsion de la double hlice tend se rapprocher de la valeur normale :
pas de lhlice = 10 paires de nuclotides par tour. Au cours de la rplication et de la traduction
le pas de lhlice diminue en avant des polymrases et lhlicase (une des topoisomrases) tra
vaille alors pour augmenter le pas. Au contraire en arrire des polymrases les topoisomrases
ajoutent des tours pour reconstituer la double hlice.

132/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rplication

6.12 Primase

BM 58/2

La DNA polymrase , enzyme principale de la rplication chez les eucaryotes, ncessite de


dmarrer son action lextrmit 3OH terminale dun brin de DNA dont le dernier nuclotide
soit hybrid avec le brin de DNA servant de modle. Si ce nuclotide nest pas appari, elle
lhydrolysera au lieu de pour suivre la synthse. Cest pourquoi elle ne peut pas dmarrer une
synthse de DNA sans amorce.
Lamorce est cre au dpart par une RNA polymrase particulire (sans rapport avec celles
de la transcription) qui peut commencer sur environ 10 nuclotides la synthse dun RNA hy
brid avec le DNA modle. Le premier ribonuclotide de cette amorce garde ses 3 phosphates.
Au bout de 10 ribonuclotides, une DNA polymrase prend le relai et poursuit la conden
sation de 20 dsoxyribonuclotides.
Lamorce sera donc constitue dun brin mixte comprenant RNA puis DNA sur 30 nucloti
des environ. Le dernier dsoxyribonuclotide de lamorce, li avec le brin de DNA qui sert de
modle, servira de point dinitiation lactivit de la DNA polymrase .

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La rplication

6.13 DNA ligase

BM 58/3

Les DNA ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphoester
entre le carbone 3-OH et le phosphate-5 de deux nuclotides voisins sur un brin de DNA.
Elles interviennent dans la rplication pour lier ensemble les brins de DNA ou les fragments
dOkazaki synthtiss par les DNA polymrases.
Elles interviennent aussi dans de nombreux processus de rparation du DNA gnomique.

134/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rplication

6.14 Tlomrase

BM 58/4

La synthse du brin retard du DNA ne peut pas se faire lorsque la DNA polymrase atteint
lextrmit 3 du brin modle, faute de place pour une amorce complmentaire. Sil ny avait
pas de mcanisme particulier, chaque rplication le DNA du chromosome serait raccourci.
Le tlomre ou squence du DNA lextrmit des chromosomes humains est une squence
5-TTAGGG-3 rpte quelques centaines de fois avant le 3OH final.
La tlomrase est une DNA polymrase qui peut continuer la synthse dun DNA simple brin.
Cette enzyme comprend un RNA de 450 nuclotides dont lextrmit 5 terminale est 5
CUAACCCUAAC... Cette extrmit sert de modle pour lenzyme en vue de la synthse de
quelques units de la rptition TTAGGG. Aprs cette synthse lenzyme glisse le long du
brin de DNA et recommence de nouvelles units.
Lextrmit 3 du brin modle ainsi allonge peut servir la pose dune amorce nouvelle :
lextrmit 3-OH de cette amorce sert alors de point de dpart pour la DNA polymrase
pour synthtiser lautre brin.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 135/204


La rparation

Chapitre 7

La rparation

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 137/204


La rparation

7.1 Rparation

BM 59

La rplication ou la conservation de la structure primaire du DNA peuvent ntre pas parfai


tes. Lorsque le DNA est endommag ou rpliqu de faon incorrecte, il en rsulte que les nu
clotides situs sur les deux brins ne sont plus complmentaires (A-T ou C-G). On dit quil y
a msappariement entre les nuclotides.
La rparation vise remplacer une base azote, ou un nuclotides ou un fragment dacide nu
clique par des nuclotides complmentaires de la squence de lautre brin.
La rplication tant semi-conservative, lun des deux brins est identifi en tant que matrice et
cest lautre brin qui sera rpar en cas de msappariement.
Plusieurs mcanismes de rparation permettent respectivement de remplacer une base, un nu
clotide ou un fragment plus ou moins long dun brin de DNA.

138/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rparation

7.2 Bases endommages

BM 60

La nature chimique des bases azotes est essentielle pour le message gntique. De nombreu
ses modifications de ces bases peuvent entraner des mutations.
Des modifications chimiques (nitrites) comme la dsamination des adnines en hypoxanthi
nes. Or, lhypoxanthine est prfrentiellement complmentaire de C plutt que de T. De
mme la mthylation des cytosines en 5-mthyl cytosine qui est le complment de A plutt
que de G.
Des mutations rsultent de liaisons anormales entre les bases de nuclotides voisins, comme
les dimres de thymine. La chaleur engendre des ractions dhydrolyse des bases, surtout des
purines, aboutissant des sites sans bases ou des sites apuriniques (sans purines)
Des agents chimiques de lenvironnement peuvent tre mutagnes. Ainsi il y a des analogues
structuraux des bases qui donnent des nuclotides anormaux comme le 5-bromouracile qui
shybride prfrentiellement avec les guanines ou la 2-aminopurine qui se lie aux cytosines.
Certains agents mutagnes comme la 2-mthyl nitrosamine ragissent avec les bases en ajou
tant des radicaux (alkylations) ou en sintercalant entre les bases au sein de la double hlice
(bromure dthidium).

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 139/204


La rparation

7.3 Excision de base

BM 60/1

Devant une base endommage, la rparation peut tre faite par une simple excision de base
suivie du remplacement de la base par un nuclotide normal.
Lexcision est faite par une DNA glycosylase qui ouvre la double hlice, puis hydrolyse la
liaison N-glycosidique de la base endommage et laisse un nuclotide apurinique (dpourvu
de base).
La rparation sera faite par une des DNA polymrases de rparation : la DNA polymrase
qui hydrolyse le nuclotide apurinique, puis le remplace par le nuclotide attendu sur lextr
mit 3OH libre et la brche sera referme par la DNA ligase qui reconstitue la liaison phos
phodiester en 3 du nuclotide ajout.

140/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rparation

7.4 Msappariements

BM 61

Certaines bases azotes du DNA existent sous plusieurs formes tautomres rsultant du d
placement inconstant des hydrognes des fonctions amine ou nol. Ces formes sont plus rares
que les formes habituelles des bases azotes mais dans un DNA modle en cours de rplica
tion certaines bases peuvent tre momentanment sous une forme tautomre.
La forme tautomre de ladnine est limino-adnine, qui ne shybride pas avec la thymine
mais avec la cytosine. De mme lnol-thymine shybride mieux avec la guanine au lieu de
ladnine et lnol-guanine se lie avec la thymine plutt quavec la cytosine. Ainsi la DNA
polymrase va condenser sur le DNA quelle construit des bases azotes diffrentes de celles
attendues.
Lorsque la base azote du brin modle aura repris sa forme habituelle elle ne pourra plus shy
brider avec la base du brin nouveau et il en rsultera des msappariements.

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La rparation

7.5 Transmission du msappariement

BM 61/1

Un msappariement fait apparatre deux nuclotides non complmentaires la mme position


sur les brins du DNA.
Chacun des deux brins au cours de la mitose suivante se rpliquera en produisant un nuclo
tide complmentaire. Le nuclotide anormal engendrera une transition permanente dans une
des deux cellules filles.
Ici nous avons sur les brins parentaux une paire de nuclotides A=T. A la gnration suivante
le brin qui porte le A, par suite dune iminisation, produit un brin complmentaire avec un C
la place du T attendu (C=A). Dans lautre cellule la squence est normale (T=A).
A partir de l, toutes les cellules dont le DNA a t rpliqu partir du brin porteur de la subs
titution auront ce niveau une paire CG. La substitution est devenue permanente. Si elle est
situe dans un gne, elle peut engendrer une mutation.

142/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


La rparation

7.6 Excision de fragment long

BM 61/3

Lorsquun fragment de DNA est endommag, la simple excision de base ne suffit plus r
parer. En particulier les msappariements qui ne seraient pas rpars par la DNA polymrase
au cours de la rplication, sont immdiatement reprs parce que la double hlice ne se for
me pas normalement.
Une endonuclase coupe alors le brin porteur de la lsion une distance de cinq nuclotides.
Puis sous leffet dune topoisomrase (hlicase ou facteur TFIIH) le brin ls est spar du
brin sain. A partir de lextrmit 3OH de la brche ainsi cre, une DNA polymrase re
constitue le fragment complmentaire et la dernire liaison sera referme par la DNA ligase.

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La rparation

7.8 Crossing-over

BM 62/2

Les changes entre chromosomes homologues peuvent conduire des changes de fragments
ou des changes de brins entiers de DNA.
Au cours de la miose en particulier, de tels changes se produisent frquemment entre les
chromosomes dorigine paternelle ou maternelle de telle sorte que les gnes des chromosomes
des cellules filles (gamtes) sont une recombinaison htrogne de fragments des deux origi
nes.
Le rsultat implique un mlange de caractres hrditaires des deux parents qui constituent le
patrimoine du nouvel individu, bien que lhomologie des changes garantisse le maintien de
chaque gne sur chaque locus avec un allle (homozygote) ou deux (htrozygote).

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Les vnements gntiques

Partie III

Les vnements gntiques


Rappel des objectifs

Dfinir1 les termes : variation (= substitution ou mutation silencieuse), mutation (= expri


me), dltion/insertion, rptition.
Donner des exemples2 parmi les vnements gntiques suivants qui aboutissent une
pathologie : mutation ponctuelle, dltion (avec ou sans dcalage du cadre de lecture), pis-
sage dfectueux, rptitions de triplet.
Dfinir les termes : transposition, pseudogne, conversion de gne, famille ou superfamille
de gnes.
Donner un exemple de lvolution dune famille de gnes.

Grce des exemples de famille de gnes et de leur volution ; ltudiant devra expliciter le rle
des vnements gntiques (duplications, conversions de gnes, inactivations de gnes) dans la di
versification du patrimoine gntique des espces, et montrer quels avantages slectifs les espces
acquirent avec ces changements pour ladaptation leur environnement.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant
toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.
2. Donner un exemple : choisir, dcrire et expliquer une situation dans laquelle un concept ou un corps
dfini joue le rle principal et met en vidence ses proprits essentielles.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 147/204


Substitutions

Chapitre 8

Substitutions

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 149/204


Substitutions

8.1 Substitution

BM 63

Au cours de lvolution, la transmission du message gntique de cellule cellule, dindividu


individu, despce espce se fait avec des modifications ponctuelles de la structure primai
re du DNA, qui sont transmises hrditairement si elles sont compatibles avec la reproduction.
Ces modifications sont de trois sortes :
substitution, cest dire remplacement dun nuclotide par un autre
dltion, cest dire suppression dun ou de plusieurs nuclotides
insertion, cest dire addition dun ou de plusieurs nuclotides.
Les substitutions de purine purine ou de pyrimidine pyrimidine (transitions) sont les plus
frquentes :
A G, C T, G A et T C
Les autres substitutions sont des transversions :
A C, A T, C A, C G, G C, G T, T A et T G

150/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Substitutions

8.2 Somatique, germinale

BM 63/1

Leffet dune mutation est diffrent selon que cette mutation affecte le DNA dune cellule so
matique ou dune cellule de la ligne germinale.
Lorsque le DNA dune cellule somatique est modifi et quil en rsulte une mutation, les cel
lules issues de cette cellule mute forment un clone de cellules mutes qui prsente des carac
tres diffrents de ceux du tissu dorigine. De tels clones constituent souvent des tumeurs
cancreuses. Les mutations somatiques ne sont pas transmises la descendance.
Lorsque le DNA dune cellule germinale est modifi et quil en rsulte une mutation, celle-ci
sera transmise par les gamtes et apparatra dans la descendance : la mutation est alors hr
ditaire.

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Substitutions

8.3 Faux-sens, non-sens

BM 63/2

Une substitution peut aboutir des rsultats trs diffrents aprs la traduction. Cela dpend de
sa position par rapport au cadre de lecture. Les transversions font plus de mutations que les
transitions.
Une substitution dans un codon peut se traduire par le mme acide amin : on dit quelle est
synonyme. Il ny aura pas de modification de lacide amin traduit.
Une substitution dans un codon peut se traduire par un acide amin diffrent : on dit quelle
est faux-sens. Elle sera dautant plus dltre pour les fonctions de la protine que le nouvel
acide amin sera diffrent de celui qui aurait du tre traduit.
Une substitution dans un codon peut se traduire par un codon de terminaison : on dit quelle
est non-sens. La protine traduite sera tronque cet endroit.

152/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Substitutions

8.4 Polymorphisme Xba I de lapoB

BM 64

Le polymorphisme de restriction Xba I de lapolipoprotine B rsulte dune substitution


T C, synonyme, qui fait disparatre un site de restriction Xba I (TCTAGA) sur le DNA de
certains sujets.
Cette substitution nentrane pas de mutation dans lapoB et na donc aucune consquence di
recte sur la sant des sujets. Toutefois les sujets porteurs du gnotype X2 sur leurs deux gnes
dapoB (homozygotes), ont un taux dapoB et des lipides sanguins moins levs que les sujets
de gnotype X1, et par consquent un risque plus faible de souffrir dathrome et de maladies
cardio-vasculaires. Le lien entre ce polymorphisme et les lipides sanguins est encore inconnu.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 153/204


Substitutions

8.5 Marqueur gntique

BM 64/1

La recherche diagnostique dun tel marqueur : polymorphisme de fragments de restriction,


amplification dune squence rptitive, etc... permet de conclure la probabilit de lexisten
ce dun caractre li statistiquement ce marqueur : mutation inconnue ou pathologie dont
lorigine gntique nest pas explique.
Le diagnostic de la prsence dun marqueur gntique chez un sujet nest habituellement pas
une certitude 100 % de la survenue de la pathologie lie ce marqueur : on parle alors de
facteur de risque.

154/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mutations

Chapitre 9

Mutations

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 155/204


9.1 Mutation

Mutation
changement permanent de la structure de l'acide
dsoxyribonuclique qui sera copi dans toutes les
gnrations cellulaires futures (Gnotype)

BM 65

Les substitutions de base nucliques dans le DNA conduisent :


soit lincorporation dun acide amin diffrent dans la protine (substitution non-syno-
nyme),
soit lincorporation du mme acide amin dans la protine (substitution synonyme). Les
substitutions synonymes rsultent de la dgnrescence du code gntique.
Lorsquune substitution non-synonyme se produit dans le DNA dun sujet (gnotype) et aboutit
lincorporation dun acide amin fonctionnellement diffrent dans la structure primaire dune protine, il
en rsulte lapparition dun caractre diffrent (mutation) dans le phnotype de lindividu.
Toute autre modification entranant une protine traduite plus longue ou plus courte, ou encore
un dcalage de la lecture des codons, se traduit par une squence primaire diffrente et donc la plupart du
temps une mutation dans le phnotype de lindividu.
Mutations

9.2 Mutation Arg3500Gln de lapoB-100

BM 66

La mutation 3500 de lapolipoprotine B-100 rsulte dune substitution GA non synonyme,


qui la traduction code pour le 3500e acide amin de lapoB-100, Glutamine au lieu dArgi
nine.
La prsence de cette mutation nentrane pas de modification de sites de restriction et on ne
peut pas la dtecter directement par un polymorphisme de longueur des fragments de restric
tion.
La prsence de cette mutation, retrouve en France chez une personne sur 500, est un facteur
de risque vis--vis de lathrome et des maladies cardio-vasculaires, parce quelle perturbe la
liaison de lapolipoprotine B-100 avec le rcepteur cellulaire des lipoprotines de basse den
sit (LDL).

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 157/204


Insertions - dltions

Chapitre 10

Insertions - dltions

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 159/204


Insertions - dltions

10.1 Dltion

BM 67

Au cours de lvolution, la transmission du message gntique de cellule cellule, dindividu


individu, despce espce se fait avec des modifications ponctuelles de la structure primai
re du DNA, qui sont transmises hrditairement si elles sont compatibles avec la reproduction.
Ces modifications sont de trois sortes :
substitution, cest dire remplacement dun nuclotide par un autre
dltion, cest dire suppression dun ou de plusieurs nuclotides
insertion, cest dire addition dun ou de plusieurs nuclotides.
Les dltions sont dimportance variable selon leur longueur :
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre de lecture (codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent la suppression dun acide amin dans la protine ex
prime
de grande longueur, elles peuvent supprimer lexpression dun ou de plusieurs exons,
voire dun gne entier.

160/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Insertions - dltions

10.2 Dcalage du cadre de lecture

BM 67/2

Le cadre de lecture, dtermin une fois pour toute la traduction, est essentiel la synthse
exacte dune protine de 77 acides amins (apoA-II).
Une dltion *, emportant le premier nuclotide du codon 59 dcale dune lettre le cadre de
lecture et aboutit la synthse de cinq acides amins faux, suivis dun codon Stop. La protine
produite est inexacte et tronque (63 aa).
De mme si on retire les deux premiers nuclotides ** du codon 59 on aboutit encore une
protine fausse et tronque (60 aa). Dans les deux cas, on dit quil y a dcalage du cadre de
lecture .
Si on retirait trois nuclotides, il y aurait un ou deux acides amins inexacts mais le cadre de
lecture resterait le mme et la traduction se poursuivrait normalement avec un acide amin de
moins (76 aa).

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Insertions - dltions

10.3 Dltion Phe 508 de CFTR

BM 67/3

La mutation Phe508 du gne CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)


rsulte dune dltion qui fait disparatre les nuclotides 1653 1655 du messager (CUU).
Le gne CFTR code pour un transporteur danions (chlore) qui rgule les transsudations tra
vers les pithliums et la peau.
La dltion nentrane pas de dcalage du cadre de lecture et le changement du troisime nu
clotide du codon 507 ne change pas lacide amin (isoleucine) ; mais la seule consquence
est labsence de lacide amin 508 (phnylalanine). Cette absence suffit inhiber lactivit du
transporteur.
La prsence de cette dltion, retrouve en France chez une personne sur 500, est une des cau
ses les plus frquentes de la mucoviscidose (cystic fibrosis).

162/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Insertions - dltions

10.4 Dltion de lexon 9 de la lipoprotine-


lipase

BM 68

Une dltion large (dans lexemple reprsent ici 2136 nuclotides) entrane souvent linacti
vation du gne. Dans le cas prsent la dltion stend depuis lintron 8 jusqu lintron 9 du
gne de la lipoprotine lipase, et par consquent supprime la totalit de lexon 9 de ce gne.
Il est probable que lexcision pissage de lintron coup ne peut pas se faire avec le site rece
veur de lintron 9 et donc que la maturation du transcrit nest pas possible.
On constate chez un sujet porteur de cette dltion sur ses deux chromosomes 8 (homozygo
te), une absence dexpression du gne et par consquent, labsence de la lipoprotine lipase
en tant que protine, ainsi que de son activit enzymatique dans le plasma sanguin.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 163/204


Insertions - dltions

10.5 Mutation dun site dpissage

BM 69/1

Une substitution peut altrer un site dpissage. Ainsi le site donneur de lintron 3 de lapoA-
II est-il transform de GT en AT dans une famille de malades, ce qui le rend inactif pour lex
cision de cet intron.
Il existe au milieu de lexon 3 une squence qui peut servir de site donneur alternatif mais qui
est normalement inactive (site donneur cryptique). En labsence du site donneur normal, cest
ce site cryptique qui va servir exciser lintron 3.
Mais comme ce site cryptique est situ 65 nuclotides en amont du site normal il y aura 22
acides amins de lexon 3 qui ne seront pas traduits. En outre, le nombre de nuclotides perdus
ntant pas un multiple de 3 il y aura dcalage du cadre de lecture, ce qui entrane une traduc
tion fausse des 10 premiers acides amins de lexon 4 et la rencontre dun codon Stop prma
tur.
La protine tronque ne sexprime pas et lapolipoprotine A-II est absente du plasma de ces
malades.

164/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Insertions - dltions

10.6 Insertion

BM 70

Au cours de lvolution, la transmission du message gntique de cellule cellule, dindividu


individu, despce espce se fait avec des modifications ponctuelles de la structure primai
re du DNA, qui sont transmises hrditairement si elles sont compatibles avec la reproduction.
Ces modifications sont de trois sortes :
substitution, cest dire remplacement dun nuclotide par un autre
dltion, cest dire suppression dun ou de plusieurs nuclotides
insertion, cest dire addition dun ou de plusieurs nuclotides.
Les insertions sont dimportance variable selon leur longueur :
de 1 ou 2 nuclotides, elles dcalent le cadre de lecture (codons)
de 3 nuclotides, elles aboutissent laddition dun acide amin dans la protine expri
me
de grande longueur, elles peuvent modifier compltement la traduction des exons
dans les introns ou dans les exons non-traduits, on rencontre souvent de longues inser
tions de structure variable qui sont sans effet apparent sur lexpression du gne.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 165/204


Transpositions

Chapitre 11

Transpositions

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 167/204


Transpositions

11.1 Transposition

BM 71

Au cours de lvolution des espces, le gnome sagrandit continuellement par suite de dupli
cations de gnes et de transpositions.
Les duplications se produisent en tandem, une squence se trouvant rpte deux fois dans le
gnome la suite de la duplication. Cette duplication permet chacune des copies de la s
quence dvoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de produire des carac
tres nouveaux.
Les transpositions rsultent de lincorporation dacides nucliques synthtiss hors du
gnome :
soit par incorporation du DNA dun virus,
soit par transcription rverse dun RNA de la cellule ou dun virus, au moyen dune r-
verse-transcriptase qui produit un DNA complmentaire (cDNA) et dune transposase
qui lincorpore au gnome de la cellule.

168/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Transpositions

11.2 Squence Alu

BM 72

A peu de distance en aval du gne de lapoA-II, on rencontre une squence transpose de la


famille Alu.
Cest un pseudogne, entour de deux squences rptes (GAAAATGAGGGTACCCT) qui
sont caractristiques des squences transposes. Entre ces deux squences on trouve deux s
quences homologues spares par une courte squence de liaison (TACTAAAAATA
CAAAAATTA). Plusieurs sites caractrisent encore cette squence Alu : site dinitiation de
la RNA-polymrase III, site de restriction de lenzyme Alu I (do le nom de squence Alu),
queue poly-A. La squence Alu rsulte dune transposition de la squence du RNA 7 S, RNA
de structure de la SRP (Signal Recognition Particle).
Il y a prs dun million de squences Alu de ce type dans le DNA humain, soit une tous les
4 kb. Il en est de mme chez la plupart des Primates et des Rongeurs. Dautres squences
transposes sont connues chez lHomme ou dautres Mammifres.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 169/204


Transpositions

11.3 Virus

BM 72/5

Lacide ribonuclique du virus HIV lorsquil pntre dans le sang est reconnu par le rcepteur
CD4 des lymphocytes T4. La formation du complexe rcepteur CD4 - virus entrane la fusion
de lenveloppe du virus et de la membrane du lymphocyte, et par consquent lentre du virus
dans le cytoplasme.
Ce noyau contient une enzyme la rverse transcriptase et un RNA viral porteur de linforma
tion gntique. Lenzyme catalyse la rtrotranscription de le RNA viral en DNA et lincorpo
ration de ce DNA (provirus) dans le DNA du lymphocyte.
Le provirus engendre de nouvelles particules virales par transcription et traduction et la mort
de la cellule par destruction de son DNA. Les particules virales nouvelles sont libres pour
transmettre le signal dautres lymphocytes T4.
Le nombre de lymphocytes T4 diminue jusqu ce que les dfenses immunitaires du sujet de
viennent insuffisantes (SIDA) ce qui entrane le dveloppement dinfections opportunistes et
terme la mort du sujet atteint.

170/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Transpositions

11.4 Cycle dun rtrovirus

BM 72/6

La particule du rtrovirus est compose dune enveloppe protinique, entourant une


capside galement protinique qui contient le patrimoine gntique du rtrovirus sous for
me dun RNA simple brin contenant la transcription du gne de la rverse transcriptase et des
gnes des protines des enveloppes.
Lors de linfestation dune cellule, seule la capside pntre travers la membrane plasmique
puis libre le RNA dans le cytoplasme o il sexprime comme un messager. La rverse trans
criptase ainsi synthtise est une enzyme capable de :
1. transcrire ( lenvers) le RNA du virus en DNA complmentaire (hybride RNA:DNA)
puis
2. dtruire le RNA pour le remplacer par un deuxime brin de DNA.
Le DNA double-brin se transpose alors dans le DNA nuclaire de la cellule-hte do il peut
nouveau tre transcrit en multiples copies de RNA du virus. La traduction de ces RNA abou
tit la synthse de protines qui sassemblent autour des RNA pour constituer de nouvelles
particules virales en trs grand nombre (amplification du virus).
Enfin la cellule-hte meurt en librant les particules virales et le cycle recommence.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 171/204


Transpositions

11.5 Duplication de gne

BM 72/7

De nombreuses situations peuvent conduire la duplication dun fragment de DNA. Ces du


plications sont facilites par lexistence de squences rptitives directes (squences identi
ques dans le mme sens faible distance sur le mme brin de DNA.
Dans la bulle de rplication, des squences rptitives directes peuvent conduire un apparie
ment ingal des deux brins de DNA rpliqus et aboutir aprs change des deux brins la r
ptition dun fragment de DNA.
Lorsque lchange de brins se fait dans la mme chromatide aprs la rplication ; la rptition
en tandem du mme fragment se retrouve sur un seul des deux brins.
Au cours de la miose des changes peuvent encore se produire entre chromatides, comme
dans le crossing-over normal, mais en rpartissant de faon ingales les brins la suite
dun change de brins au niveau des squences rptitives. Dans ce cas les squences dorigi
ne paternelle et maternelle se retrouvent la suite sur le mme brin de DNA, aboutissant
deux gnes presque identiques (appels paralogues).
Dans chacun de ces cas, le DNA porteur de rptitions bnficie souvent de deux gnes iden
tiques codant pour la mme protine. Cette disposition confre aux individus qui reoivent ce
patrimoine gntique une meilleure rsistance aux mutations qui peuvent survenir sur un g
ne, donc un avantage slectif en faveur des gnes dupliqus.

172/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Transpositions

11.6 Pseudogne

BM 73

Certains gnes apparus par duplication au cours de lvolution ont subi des vnements gn
tiques (substitutions, insertions, dltions, etc...) qui empchent la transcription ou la traduc
tion de se faire.
A titre dexemple, une duplication du gne de lapolipoprotine C-I a produit un gne apoC-
I, il y a 40 millions dannes dans le gnome des Primates. Mais, une mutation rcente a
transform le dernier acide amin du signal-peptide de la protine exprime par ce gne en
codon Stop ! Il en rsulte que mme si la transcription conduit un RNA messager, celui-ci
ne peut tre traduit que par un signal-peptide sans protine sa suite.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 173/204


Transpositions

11.7 Conversion de gne

BM 74

Les squences de gnes peuvent tre transformes par change dexons complets par une
transposition partir dun autre gne.
La transposition dun exon peut ajouter un domaine nouveau dans la structure dune protine
ou restaurer un domaine devenu non fonctionnel au cours de lvolution.

174/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Lvolution

Partie IV

Lvolution

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 175/204


Divergence

Chapitre 12

Divergence

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 177/204


Divergence

12.1 Divergence

BM 75

Lorsque deux squences primaires dacides nucliques se ressemblent on tente de les aligner
au mieux pour obtenir un nombre minimum de diffrences entre les deux squences : substi
tutions, insertions ou dltions.
La divergence entre les deux squences est alors le pourcentage de nuclotides diffrents par
rapport au nombre total de nuclotides aligns.
La divergence est habituellement trs faible entre les squences dun mme gne lintrieur
dune espce (< 1 %). De mme elle reste faible mme pour des espces trs loignes pour
des protines ayant une importance mtabolique primordiale.
La divergence peut-tre grande, mme dun individu lautre, pour des segments de DNA en
tre les gnes ou dans les introns sans fonctions gntiques (squences hypervariables).

178/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Familles de gnes

Chapitre 13

Familles de gnes

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 179/204


Familles de gnes

13.1 Famille de gnes

BM 76

Une forme particulire dinsertion a jou un rle majeur dans lvolution des espces
deucaryotes : la duplication des gnes. Lorsque la squence dun gne a t rpte deux fois
dans le mme DNA et que les deux gnes continuent sexprimer, ils voluent diffremment
pour aboutir au bout de nombreux millions dannes exprimer des protines diffrentes, ce
qui peut apporter un avantage slectif lespce.
Dans les gnes ou dans les protines qui sont issus dun gne ancestral unique, on retrouve
toujours une homologie de structure (exons, introns) de squences primaires (DNA, proti
nes) et de fonctions (activits des protines). Ces gnes constituent ensemble une famille de
gnes dont on peut reconstruire larbre phylogntique en suivant lvolution du gne ances
tral et de ceux qui en sont issus travers le temps et lvolution des espces.

180/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Familles de gnes

13.2 Gnes des -globines

BM 78

Plusieurs gnes existent pour exprimer les chanes dacides amins qui constituent
lhmoglobine : -globines sur le chromosome 16 et -globines sur le chromosome 11. Sur
ce dernier chromosome il existe cinq gnes exprims successivement au cours du dveloppe
ment de lindividu dans les hmoglobines embryonnaires, ftales et adultes.
Lensemble des cinq gnes constitue un groupe de gnes (cluster). Les cinq gnes sont drivs
dans lvolution partir dun gne ancestral unique (chez les Invertbrs) par duplications
successives.
Le gne -globine est lextrmit 5 du groupe de gnes. Aprs un long intergne, on ren
contre les deux gnes des -globines (-Gly et -Ala). Dans lintergne suivant se trouve un
pseudogne -globine, qui nest plus exprim. Enfin vers lextrmit 3 se rencontrent suc
cessivement les deux gnes exprims chez les adultes -globine et surtout -globine.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 181/204


Le DNA au laboratoire

Partie V

Le DNA au laboratoire

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Mthodes dtude

Chapitre 14

Mthodes dtude

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 185/204


Mthodes dtude

14.1 Extraction et purification du DNA

BM 15

Lacide dsoxyribonuclique est extrait partir des lymphocytes dune prise de sang sur
EDTA (anticoagulant chlateur du Calcium).
On spare les lymphocytes des autres cellules sanguinbes par un gradient de densit, puis on
les lave avant de les centrifuger en un culot de lymphocytes.
On redissous ce culot dans un tampon et on pratique une extraction par le phnol, qui dissous
les lipides et prcipite les protines en laissant les acides nucliques en solution.
On reprcipite enfin le DNA par lalcool en prsence de sel.
Le DNA prcipite en un nuage cotonneux blanchtre (la mduse ) quon recentrifuge et
quon lave avant de redissoudre le DNA purifi dans de leau distille.

186/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.2 Synthse dun cDNA

BM 15/1

La manipulation et ltude des RNA est difficile cause de leur grande sensibilit aux ribo
nuclases qui les dtruisent.
Il est ncessaire de recopier la squence en DNA pour quelle soit plus stable et quon puisse
lamplifier en fonction des besoins.
Le mRNA purifi (chromatographie daffinit sur une colonne doligo-d(T)) est li dans un
premier temps avec des oligonuclotides poly(T) qui sattachent la queue poly(A).
A partir de lextrmit 3 de cette amorce poly(T) la transcriptase rverse, qui est une DNA
polymrase, synthtise un brin de DNA complmentaire du messager de dpart.
Une fois cette synthse acheve on dgrade le RNA par une base forte ou par une ribonuclase
spcifique.
Le brin de DNA fabriqu forme spontanment son extrmit 3 une boucle en pingle che
veux en shybridant sur lui-mme.
Lextrmit 3 de cette boucle va servir de site de dmarrage pour la DNA polymrase qui va
synthtiser un brin de DNA complmentaire du premier.
Une nuclase spcifique du DNA simple brin supprimera la boucle de lextrmit. Le cDNA
double brin est prt.
On peut ainsi constituer autant de cDNA quil existe de messagers dans une cellule : lensem
ble de ces cDNA forme une banque de cDNA .

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Mthodes dtude

14.3 Electrophorse de DNA

BM 16

Les fragments dun DNA digr par une enzyme de restriction comme Hha I, sont des anions
et si on les soumet dans un gel un champ lectrique, ils migrent vers le ple positif (anode)
une vitesse dautant plus grande quils sont de taille plus petite.
On place dans un des puits de dpt des fragments de DNA de tailles connues pour servir de
marqueurs de taille.
On ajoute dans les dpts deux colorants : un bien visible sur le gel qui va migrer trs rapide
ment avant les fragments de DNA pour limiter la distance parcourue au bord de lanode ;
un autre, le bromure dthidium qui se fixe spcifiquement au DNA quelle que soit la squen
ce et qui met une fluorescence mauve lorsquon lclaire avec des rayons ultra-violets.
On examine le gel sous lumire ultra-violette 254 nm et on photographie les fragments de
DNA digr.

188/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.4 Hae III (enzyme de restriction)

BM 16/1

Hae III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus.
Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides :

5 GGCC 3
3 CCGG 5

Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur
les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons
phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides
restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs .
La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyse inhibe la reconnais
sance du site par Hae III. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que
lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Mthodes dtude

14.5 EcoR I

BM 16/11

EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.
Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5

Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur
les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons
phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nucloti
des restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .
La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance
du site par EcoR I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN
parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

190/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.6 Polymorphisme de restriction

BM 16/2

Le profil lectrophortique obtenu avec une enzyme de restriction donne montre des diff
rences individuelles dans la taille des fragments de restriction (RFLP, Restriction Fragment
Length Polymorphism).
Chaque systme alllique de restriction dfinit un locus polymorphe.

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Mthodes dtude

14.7 Polymorphisme Msp I de lapoA-II

BM 16/3

Le Southern blot permet la dtection des polymorphismes de longueur des fragments de res
triction (RFLP ou restriction fragments length polymorphism).
Il existe un polymorphisme dans le gne de lapolipoprotine A-II. Ce polymorphisme altre
la squence du site reconnu par lenzyme de restriction Msp I situ en aval du gne, de telle
sorte que 19 % des sujets (anglais) ne prsentent pas de site de restriction cet endroit.
Lorsquon digre le DNA gnomique de plusieurs individus choisis au hasard on obtient des
fragments de taille diffrentes entre chaque point de coupure par lenzyme. Aprs lectropho
rse pour sparer ces fragments en fonction de leur taille et transfert sur une membrane, on
hybride les fragments sur la membrane avec une sonde complmentaire des exons de lapoA-
II puis on fait lautoradiograhie de la membrane pour rvler ces fragments.
La plupart de ces sujets (81 %) qui possdent trois sites de coupure autour du gne donnent
un fragment de 3000 paires de nuclotides (3,0 kb).
Dautres sujets, plus rares (19 %) qui ne possdent pas le site de restriction ont un fragment
plus grand = 3700 paires de nuclotides (3,7 kb). Le sujet dont le DNA a t dpos dans
llectrophorse au n3 est dans ce cas.
Il arrive quun sujet porte un allle du type frquent sur un chromosome et lautre allle sur
lautre chromosome. Il est alors htrozygote pour le polymorphisme et llectrophorse
(n4) on voit les deux fragments rvls par la sonde.

192/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.8 Cartes de restriction

BM 16/4

Les marqueurs gntiques peuvent aussi caractriser les DNA responsables des maladies h
rditaires grce aux cartes de restriction.
Le DNA du malade est digr par de nombreuses enzymes de restriction isolment ou asso
cies entre elles. Les fragments de restriction sont reconnus par une sonde spcifique du gne
responsable de la maladie. Il en rsulte un grand nombre de fragments possibles dont les lon
gueurs (en kilobases) sont mesures par lectrophorse cot dun marqueur de masse mol
culaire.
Ainsi, le DNA dun malade atteint dune dyslipoprotinmie et celui dun tmoin sain ont t
digrs par BamH I : le sujet sain montre un seul fragment long de 11,65 kb reconnaissable
par la sonde du gne de lapoA-I, alors que le DNA du malade en montre deux de 7,5 et
10,25 kb. Le fragment BamH I du sujet tmoin peut encore tre digr par dautres enzymes
donnant chaque fois deux fragments (Dde I) ou trois (Hind III) ou quatre (Pst I).
Les fragments peuvent tre compars comme les morceaux dun puzzle pour obtenir une carte
des emplacements des sites de restriction sur le DNA. La mme carte, chez le sujet malade,
montre les mmes sites de restriction aux deux extrmits du fragment BamH I, mais il appa
rat une insertion de 6 kb au milieu du gne de lapoA-I avec des sites nouveaux : BamH I,
EcoR I, Pst I non retrouvs chez le tmoin. Cette insertion est responsable dune absence
dexpression de lapoA-I ce qui se traduit par une dyslipoprotinmie.

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Mthodes dtude

14.9 Hybridation dune sonde

BM 17

Un fragment de DNA double brin affecte normalement une structure secondaire en double h
lice.
En levant la temprature jusqu la Tm, on disjoint 50 % environ des liaisons hydrogne qui
unissent les brins de DNA, ce qui dnature partiellement la double hlice.
Lorsque la temprature atteint 95C. toutes les liaisons hydrogne sont rompues et la dnatu
ration du DNA est complte : DNA simple brin, qualifi de dnatur . Au cours de la d
naturation, le coefficient dextinction du DNA 260 nm augmente (hyperchromicit).
En refroidissant brutalement (glace) les structures secondaires ne se reforment pas et le DNA
reste dnatur. Si on refroidit doucement, la double hlice se reforme progressivement. Un
oligonuclotide (sonde) ajout ce moment peut shybrider avec un fragment complmentai
re du DNA, ds que la temprature descend en-dessous de la Tm.
Lhybridation dune sonde marque (atomes radioactifs, radicaux fluorescents ou ligands sp
cifiques) sur un DNA dnatur permet de marquer spcifiquement tous les fragments de ce
DNA dont la squence est complmentaire de la sonde.

194/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.10 Calcul de la Tm

BM 17/1

Il est possible de mesurer directement la temprature de fusion (Tm) dun DNA double brin
en mesurant laugmentation de labsorbance de la solution 260 nm en fonction de la temp
rature.
Toutefois, on se contente la plupart du temps dune estimation partir de la composition de
loligonuclotide. Si celui-ci a une longueur gale ou infrieure 20 nt on compte 2C par
couple A:T et 4C par couple G:C. A partir de N = 20, on corrige dun multiplicateur propor
tionnel la longueur au del de ce chiffre : 1 + [(N-20)/20].
Lorsquil existe des msappariements il faut soustraire de la Tm calcule autant de degrs C
que le pourcentage de squence non-apparie de loligonuclotide.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 195/204


Mthodes dtude

14.11 Sonde hybride

BM 17/2

Pour pouvoir reconnatre spcifiquement une squence du DNA, on utilise au laboratoire un


petit morceau de DNA synthtis (sonde) dont la squence correspond au moins en partie
celle dun des brins du DNA.
Parce quelle est complmentaire de lautre brin du DNA, la sonde est capable de se fixer sp
cifiquement sur lautre brin lendroit o se lit la squence complmentaire.
En marquant cette sonde par un atome radioactif ou par une molcule fluorescente lis cova
lentiellement un des nuclotides de la sonde, on peut dtecter la sonde et le morceau de DNA
complmentaire qui lui est hybrid.

196/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.12 Sonde spcifique dallle (ASO)

BM 17/3

La drpanocytose ou anmie falciforme est une maladie des globules rouges qui sont dfor
ms par une cristallisation anormale de lhmoglobine. Cette cristallisation rsulte dune
substitution AT dans le sixime codon.
Cette substitution sexprime par une mutation Glu6Val de la chane de la globine.
Llectrophorse de lADN du gne HBB, qui code pour la chane des globines est rvle
par deux sondes : lune spcifique de la squence normale, lautre de celle de la protine mu
te (ASO = Allele Specific Oligonucleotide).
Le DNA dun sujet est rvl par la seule sonde normale sil possde deux gnes HBB nor
maux (homozygote normal), par la seule sonde de la protine mute sil possde deux gnes
HBB responsables de la mutation (homozygote mut) et par les deux sondes sil possde un
gne normal et un gne de la protine mute (htrozygote).
Les sujets homozygotes muts sont atteints danmie falciforme et sujets des crises graves.
Les sujets htrozygotes sont porteurs du trait drpanocytaire , ils nont que peu de trou
bles mais ils transmettent le gne leurs descendants.

2006 - 2007 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 197/204


Mthodes dtude

14.13 Southern blot

BM 17/4

Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975 pour re
chercher des fragments de DNA sur une lectrophorse en les hybridant avec une sonde com
plmentaire.
1. Aprs avoir digr le DNA par une enzyme de restriction, on obtient un mlange de trs
nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments une lectrophorse pour
les faire migrer dans un gel de haut en bas en fonction inverse de leur taille.
2. On fait un montage pour faire passer les fragments grce une monte de tampon impr
gnant le gel puis une membrane de nylon o le DNA va se fixer par des liaisons stables.
3. La membrane de nylon avec le DNA fix est alors mise incuber dans un sac contenant
une solution dune sonde radioactive complmentaire du fragment de DNA quon re
cherche, une temprature assez basse pour que lhybride se forme mais assez leve
pour que cet hybride soit parfaitement complmentaire.
4. On lave la membrane des molcules de la sonde qui ne sont pas fixes leur DNA com
plmentaire, puis on la met en prsence dun film radiographique vierge dans une encein
te opaque pour que la sonde radioactive fixe sur les fragments de DNA
complmentaires impressionne le film.
5. On rvle le film o des taches noires (sur le ngatif) correspondent aux emplacements
o ont migr les fragments de DNA complmentaires de la sonde. On compare les dis
tances de migration avec des fragments de DNA radioactifs de tailles connues qui servent
de marqueurs de taille.

198/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.14 PCR

BM 18

La PCR (polymerase chain reaction) permet damplifier spcifiquement une rgion de DNA
double brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit dabord tre spar en sim
ples brins (dnaturation 95C).
On ajoute au DNA de dpart une large quantit damorces (oligonuclotides synthtiques
complmentaires des deux extrmits de la rgion amplifier) qui vont shybrider 50-60C
environ avec la squence complmentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre dNTP
qui serviront de substrats.
On soumet le tout lactivit dune DNA polymrase (Taq polymerase) qui synthtise 72C
un brin complmentaire partir du 3OH de lamorce hybride. On obtient quatre brins de
DNA.
On recommence dnaturer ces 4 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (tou
jours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 8 brins de DNA.
On recommence dnaturer ces 8 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (tou
jours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 16 brins de DNA.
Et ainsi de suite 35 fois, ce qui aboutit 34359738368 brins de DNA (34 milliards), ce qui
reprsente une quantit suffisante pour tudier le fragment de DNA amplifi.

200/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007


Mthodes dtude

14.15 Didsoxyadnosine triphosphate

BM 04/9

Le didsoxyadnosine triphosphate (ddATP) est un nucloside triphosphate de synthse. Sa


structure est dpourvue de fonction alcool en 3.
Analogue structural de nuclotide, le ddA est utilis comme inhibiteur de la rplication (DNA
polymrase). Labsence de fonction alcool en 3 empche toute condensation avec le nuclo
tide suivant.
Cette inhibition est principalement utilise pour le squenage des DNA.

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Mthodes dtude

14.16 Raction de squence

BM 19

Pour lire la squence dun DNA simple brin on hybride une amorce du ct 3 de ce DNA.
Puis on effectue avec une DNA polymrase la synthse dun brin complmentaire.
Pour cette synthse on apporte comme substrats les quatre dsoxyribonuclosides triphospha
tes (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). En plus une trs petite quantit de didsoxyribonuclosides
triphosphates fluorescents (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA et ddTTP-ROX).
La polymrase choisira le plus souvent un dsoxyribonucloside normal et la synthse se
poursuivra jusqu ce quelle incorpore un didsoxyribonucloside fluorescent.
A ce stade le brin en cours de synthse na plus dextrmit 3-OH et la raction de polycon
densation ne peut plus se poursuivre.
Le didsoxyribonuclotide incorpor en dernier est fluorescent et met sous lexcitation une
lumire verte pour JOE (ddAMP), bleue pour 5-FAM (ddCMP), jaune pour TAMRA (dd-
GMP) et rouge pour ROX (ddTMP).
A chaque lettre de la polycondensation un petit nombre de molcules sont ainsi arrtes et
marques de la fuorescence correspondant au dernier nuclotide incorpor.
En sparant ces molcules par lectrophorse en fonction de leur taille on peut lire les lettres
successives qui apparaissent comme des zones sur llectrophorgramme dont la fluorescence
correspond la base de ce dernier nuclotide.

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Mthodes dtude

14.17 Squenage dADN

BM 19/1

Pour connatre la squence des DNA, on fait synthtiser un brin du DNA par une enzyme sp
cifique.
Lenzyme commence son travail partir de lextrmit 3 dune sonde hybride qui sert
damorce. Elle ajoute des nuclotides complmentaires de ceux du brin de DNA quelle copie.
On lui donne pour substrats des dsoxynuclosides triphosphates normaux mlangs avec des
didsoxynuclotides dont la fonction alcool secondaire en 3 est rduite ce qui empche la
synthse de se poursuivre au del.
Les didsoxynuclotides incorpors en dernier sont marqus spcifiquement par des molcu
les fluorescentes (vert pour didsoxyA, bleu pour didsoxyC, jaune pour didsoxyG et rouge
pour didsoxyT)
On spare ensuite les fragments synthtiss dans un champ lectrique (lectrophorse : les
DNA sont des anions, ils vont donc vers le ple +), en fonction de leur longueur (les plus petits
vont plus vite).
On lit ensuite les taches successives, identifies par leur couleur, ce qui rvle la squence des
fragments synthtiss.

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Mthodes dtude

14.18 Gel de squence

BM 19/2

En utilisant des amorces spcifiques, on fait synthtiser un brin complmentaire du DNA


lire, en prsence dune faible proportion de didsoxyribonuclotides marqus dun radical
fluorescent diffrent pour chaque base.
La DNA polymrase lorsquelle a incorpor un tel didsoxyribonuclotide ne peut plus con
tinuer la synthse faute dextrmit 3OH libre. Il se forme donc une multitude de brin com
plmentaires inachevs, chacun termin par un didsoxyribonuclotide fluorescent
caractristique de la base de ce dernier nuclotide.
En sparant par lectrophorse ces fragments complmentaires on spare dans le gel chacun
des fragments, du plus petit au plus grand et on les dtecte au passage par un faisceau laser
qui excite la fluorescence et une cellule photolectrique qui lit la lumire mise chacune des
longueurs donde des fluorescences caractristiques des quatre bases.
Lordinateur reoit donc une srie de mesure dintensit lumineuses en forme de pics corres
pondant au passage de chacun des fragments : en interprtant la couleur de la fluorescence de
chaque pic lordinateur crit la squence du DNA.

204/204 Biologie Molculaire - Prs C. Housset et A. Raisonnier 2006 - 2007

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