Etude expérimentale de

la phosphatase alcaline
Enzymologie 2

Cabaret Laurine
Martin Laetitia
Groupe C2
01/10/2010
 I. Introduction

Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzym
d’étudier l’influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur su
vitesse de réaction.

Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline d
veau. Il s’agit d’une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d’hydrolyser les monoesters
phosphoriques selon la réaction suivante :

R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2-

II. Principe

Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotomét

des produits apparus dans le milieu, lorsque l’enzyme est en présence de son substrat.
faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP
qui, après action de l’enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP)
directement dosable à 410nm.

2-
+ 2O
H 4 HPO
+

PNPP incolore

Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l’absorbance d’une subst

colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d’enregistrem
(ordinateur), qui nous permet de visualiser l’évolution de l’absorbance dans un interval
temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâc
pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (ΔDO/min).

De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gam
étalon de tubes contenant différente concentration (connues) de produit. On trace la dr
 DO = f ([PNP]). En reportant l’absorbance d’une solution de concentration inconnue, on
peut en déduire sa concentration.

III. Manipulations préliminaires

Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d’incubation, nous devons préalablemen
préparer les solutions de substrats de concentrations différentes.

1) Solution de PNPP :
Nous voulons préparer 6 tubes de solution de PNPP à 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM,
0,167mM, 0,125mM, à partir d’une solution mère de 5mM. Pour cela, nous effectuons u
dilution en cascade.

10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL

5mM 2,5 mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM

[PNPP] 5mM 2,5mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM0,125mM
(umol /L)
Solution 20 10 8 10 10 13,4 5
mère
(mL)
H20 (mL)0 10 12 10 10 6,6 15

Calcul pour la première dilution :

C1 V1 = C
2 V2

V1 = 20mL

Donc V
1 = (C
2 V2 )/ C1 V= (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL

Il faut donc prélever 10mL de la solution mère, et ajouter 10mL d’eau pour la diluer 2 fo

2) Solution de glycérophosphate :
Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphat
2,5mM et 1mM, à partir d’une solution mère à 5mM.

7mL 4mL

5mM 2,5 mM 1mM

[GRO-P] 5mM 2,5mM 1mM

Solution mère (mL)
10 7 4
H20 (mL) 0 7 6
Calcul pour la première dilution :

C 1 V1 = C
2V2

Vf1 = 10mL

Donc V
1= ( 2
CV2)/ C1 V= (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL

Il faut donc prélever 7mL de la solution mère et ajouter 7mL d’eau pour la diluer 2 fois.

IV. Etude cinétique de la libération du produit

1) Gamme étalon n°1 :

Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à 410 nm
longueur d’onde à laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traçons, ensuite, la droite éta
DO corrigée = f (quantité de PNP)

CF tableau 1 et figure 1a

Calcul de la quantité de produit dans les tubes :

n = CV

Tube 1:=n 0 µmole

-3 -3
Tube 2: n= (0,5.10
. 0,025.10
)= 0,0125 µmole (C= 6, 25 µmole/ L)
-3 -3
Tube 3: n= (0,5.10
. 0,05.10) = 0,025
µmole (C=12,5 µmole/ L)
-3 -3
Tube 4: n= (0,5.10
. 0,1.10) =0,05 µmole
(C=25 µmole/ L)
-3 -3
Tube 5: n = (0,5.10
. 0,15.10) = 0,075µmole
(C=37,5 µmole/ L)
-3 -3
Tube 6: n = (0,5.10
. 0,2.10) = 0,1
µmole (C=50 µmole/ L)

2) Milieux d’incubation :
Cf tableau 2

Calcul de [PNPP] dans chaque tube (A à G) :

On effectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 mL dans 3,5 mL de m

réactionnel, puis on prélève 1,75 mL de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL d’enzy
Première dilution (milieu A) :

[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total

[PNPP] = (0,125.0,5) / 3,5 = 17,85 µM

Deuxième dilution (cuve A):

[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total

-3
[PNPP] = (17,85.10
. 1,75)/2 = 15,6 µM

On procède de la même manière pour les autres milieux et on obtient:

 [PNPP]B = 20,90 µM
 [PNPP]C = 31,25 µM
 [PNPP]D = 62,5 µM
 [PNPP]E = 124,95 µM
 [PNPP]F = 324,71 µM
 [PNPP]G= 625,0 µM

Calcul de la concentration de l’enzyme dans les milieux réactionnels:

Cenz Venz = C
tubeVtube

Ctube= (0,1 . 0,25)/ 2 = 0,0125 mg/mL = 12,5 µg/mL

Maintenant, nous mesurons les variations de la DO dans chaque milieu d’incubation, au

cours du temps (3minutes), à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un système
d’enregistrement. Nous obtenons différentes droites ΔDO = f (t). La pente de chaque d
ΔDO/min, représente la vitesse de la réaction, aux temps initiaux, pour une concentrati
substrat donnée.

Cf tableau 2 figure 2

Commentaire :

D’après les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et
façon linéaire pendant environ 1min. Ce qui signifie que la quantité de produit dans le
milieu augmente.
De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A
plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse
d’apparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat.

Ensuite, pour un temps > 1minute, Il n’y a plus de relation linéaire (pour les milieux A,
D, E). En effet, la quantité de substrat dans le milieu, diminue au fur et à mesure de la
réaction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit formé donc l’absorbance n’augmen
plus de façon linéaire.

Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linéaire. Effectivem
la quantité de substrat est encore suffisante pour que la réaction s’effectue à une vitess
initiale, maximale.

Nous voulons déterminer [PNP]/min, c'est-à-dire la vitesse d’apparition du produit à pa

de la pente ΔDO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur
gamme étalon n°1, et on regarde à quelle quantité de produit cela correspond.

On obtient :

ΔDO/min 0,0126 0,108 0,2646 0,3762 0,3792 0,4128 0,4295

[PNP]/min 0,62 5,62 17,2 23,12 23,74 25,0 26,25
µmole/L/min

V. Influence de la concentration en substrat su

la vitesse de la réaction

1) Etude graphique de la vitesse de réaction en fonction de [PNPP] :

Grâce aux vitesses initiales déterminées précédemment, on trace la courbe de Mickaeli
Menten : Vi = f([PNPP]).

Représentation graphique :
On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km :

 Vmax = 0,411 ΔDO/min

Si on reporte cette valeur sur la gamme étalon n°1, on trouve Vmax = 24,9 µmole/min

 Km = 23,4 µmole/L

Ces valeurs ne sont que des estimations, la représentation de Mickaelis-Menten étant u

courbe, il y a une importante marge d’erreur lors de la détermination de Vmax.

De plus, le Km est lié à la valeur de Vmax, donc la marge d’erreur se rapporte égaleme
valeur du Km.

Ainsi, il est nécessaire de linéariser cette représentation, afin de diminuer ces incertitud
et obtenir des valeurs beaucoup plus précises. Nous allons donc utiliser les représentat
de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf.

2) Détermination de la vitesse maximale et de la constante de Mickae

La cinétique de la réaction suit l’équation de Mickaelis- Menten : la vitesse initiale pour
certaine concentration en substrat (PNPP) est de la forme :

Vi =

Et d’après cette équation, on peut en déduire la représentation de Lineweaver – Burke :

= = +

= . +

Représentation graphique :
A partir de la représentation de Lineweaver-Burke, on peut en déduire celle de Hanes-
Woolf :

= . + = . +

=[PNPP]. +

Représentation graphique :

Les représentations graphiques de ces deux relations, sont préférables à celle de Micka
Menten, car elles sont linéaires et donc plus précises pour la détermination des constan
cinétiques Vmax et Km, d’une réaction enzymatique.

On obtient donc les résultats suivant :

 Lineweaver-Burke :
- Vmax =
- Km =

 Hanes-Woolf :
- Vmax = 27,2 µmole/L/min
- Km = 34,42 µmole/L

Pour la représentation de Hanes-Woolf, nous avons enlevé le premier point de la courbe

il ne correspondait pas au résultat attendu, il faussait la droite.

Cf figure 4b et 4b’

3) Ordre de la réaction :
D’après la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de
0,3 µM), on a une courbe linéaire.
  [PNPP] >> Km donc
, V = Vm/Km)
( . [PNPP]

Or Vm/Km = constante, donc V = K[PNPP]

 La vitesse est proportionnelle à la concentration en substrat dans le milieu, donc

réaction est d’ordre 1.

Pour des concentrations en substrats importantes (de 200 à 500 µM), on a un plateau.

 [PNPP] << Km donc, V = Vmax

 La réaction est d’ordre 0

4) Détermination de l’activité spécifique de l’enzyme :

L’activité spécifique As est la quantité de substrat convertie en produit par unité de tem
au cours d’une réaction enzymatique. Elle est exprimée en µmole/min.

 Activité Enzymatique AE = Vmax

cuve . V
 +
ASZn2 = (Vmax cuve
. V) / (menz)

+
ASZn2 = (27,2. 0,002) / (0,1 . 0,25) = 2,2 µmol/min/mg
2+
Or l’activité spécifique obtenue en présencedansde Mgles conditions optimales est cinq
2+
fois plus forte que l’activité spécifique en présence
. de Zn

ASMg2+= AS
Zn2+. 5 = 2,2 . 5 = 11,0 U/mg

L’activité spécifique que nous trouvons est légèrement plus élevée que celle donnée pa
fabriquant.

VI. Etude d’un phénomène de compétition entr

deux substrats

1) Gamme étalon n°2

Nous réalisons une deuxième gamme étalon de tube, puis nous mesurons la DO à 410n

Cf tableau 4 et figure 1b

Calcul de la quantité de PNP dans chaque tube :

 Tube 1: n= 0 µmol
 Tube 2: n=PNP
(C. VPNP) = (0,5 . 0,2) = 0,10 µmole
De la même manière, on obtient :

 Tube 3: n= 0,20 µmole

 Tube 4: n= 0,30 µmole
 Tube 5: n= 0,40 µmole
 Tube 6: n= 0,50 µmole

Calcul de la concentration de PNP dans chaque tube :

 Tube 1: C= 0 µmol/L
 Tube 2: C=PNP
(C. VPNP) / Vtot = (0,5 . 0,2) / 5 = 20 µmol/L

De la même façon, on obtient :

 Tube 3: C= 40 µmol/L
 Tube 4: C= 60 µmol/L
 Tube 5: C= 80 µmol/L
 Tube 6: C= 100 µmol/L

2) Compétition entre le glycérophosphate et le PNPP

Cf tableau 5

Dans cette partie, nous allons étudier l’influence d’un inhibiteur : le glycérophosphate (GRO-P)
vitesse de la réaction enzymatique. Pour cela, nous allons préparer des séries de tubes de
concentration en inhibiteur et en substrat (PNPP) différente. Nous allons ensuite, lancer la réac
enzymatique dans chaque tube, pendant 3min exactement, afin de pouvoir comparer les vitess
avec celles obtenues précédemment.
Enfin, nous mesurons la DO à 410nm.

Calcul des concentrations en Glycérophosphate dans les tubes :

2V2  C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1

 Série A : C = (0,001 . 0,001)/0,004 = 0,25mM

 Série B : C = 0,625mM
 Série C : C = 1,25mM

Calcul des concentrations en PNPP dans les tubes :

2V2  C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1

 Série 1 : C = (0,0005 . 0,000125)/0,004 = 15,6 µmol/L

 Série 2 : C= 20,90 µmol/L
 Série 3 : C =31,25 µmol/L
  Série 4 : C= 62,5 µmol/L
 Série 5 : C= 124,95 µmol/L
 Série 6 : C= 312,5 µmol/L
 Série 7 : C= 625 µmol/L

Détermination de la vitesse de réaction :

Après l’arrêt de la réaction, nous mesurons l’absorbance de chaque tube à 410nm.

Afin de déterminer la quantité de produit libéré (en µmole/L), on reporte les valeurs de
DO sur la gamme étalon n°2. Pour obtenir la vitesse de la réaction, on divise ces valeur
le temps d’incubation (3min). On a alors, une vitesse en µmole/L/min.

Cependant, il faut d’abord calculer la concentration de PNP libéré, avant

2HPO
l’ajout
4, de NA
qui a permis de stopper la réaction enzymatique. On multiplie alors cette concentration
le coefficient de dilution d = 5/4.

d = volume total/volume sans

2HPONA
4

CPNP = C . 5/4
PNP (NA2HPO4)

CPNP (A1)= 7,5 . 5/4 = 9,4 µmole/L

C’est la valeur de la concentration non diluée, que l’on divise par le temps d’incubation.

V(A1) = 9,4/3 = 3,1 µmole/L/min

On procède de la même manière pour les autres essais.

Nous traçons, ensuite, les courbes V= f ([PNPP] (figure 3) pour chaque concentration de
glycérophosphate.

Commentaire :

Sur la figure 3, on observe que la vitesse de réaction sans inhibiteur est supérieure à ce
avec inhibiteur. Effectivement, pour une même concentration en substrat (124,9 µmole
la vitesse est de 23,74 µmole/L/min sans inhibiteur, alors qu’elle est de 12,5 µmole/L/m
avec une concentration en inhibiteur de 0,25mM. Ainsi, on peut dire, que le
glycérophosphate diminue la vitesse d’hydrolyse du substrat.

De plus, on remarque, que plus la concentration en inhibiteur est importante, plus la vit
de réaction est faible. On voit que pour la même concentration de substrat que
précédemment, la vitesse est de 12,5 µmole/L/min pour une concentration de
glycérophosphate de 0,25mM, et de 3,73 µmole/L/min pour une concentration de 1,25m
Pour conclure, la vitesse de réaction est diminuée par la présence d’inhibiteur, et d’auta
plus que sa concentration est importante.

Afin de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax et Km), on linéarise la représentati

Mickaelis-Menten, en utilisant l’équation de Lineweaver-Burke (figure 4a).

[PNPP] 15,6 20,9 31,3 62,5 124,9 312,5 625

En
µmole/L
1/[PNPP] 0,064 0,048 0,032 0,016 0,008 0,0032 0,0016

Commentaire :

Sur la figure 4a, on peut voir que chaque courbe se coupe en un même point sur l’axe des ordo
On a alors une valeur de (1/Vmax) identique pour chacune.

En revanche, la valeur de ( -1/Km) diffère en fonction de la concentration en inhibiteur : On

remarque que plus la concentration en glycérophosphate est grande, plus( -1/Km) est petit don
le Km est grand.

Ainsi, l’inhibiteur a une influence sur le Km de la réaction, mais pas sur la Vitesse maximale. On
donc en déduire, que le glycérophosphate agit comme un inhibiteur compétitif, c’est-à-dire qu’
prend la place du substrat naturel de l’enzyme. Celle-ci présente, alors, une plus faible affinité
son substrat (PNPP) : le Km augmente.

Schéma réactionnel d’une inhibition compétitive :

Km kcat
E+S ES EP= [ES] + [EI] + [E]
[E]totale

Ki

EI

Sans inhibiteur[GRO-P] [GRO-P] [GRO-P]

=0,25mM =0,625mM =1,25mM
Vmax en
µmole/L/min
Km en µmole/L
Détermination des paramètres apparents :

D’après l’équation de Mickaelis-Menten, on cherche l’expression théorique de la fonction

1/V =f ( 1/[PNPP]) :

Vi = = Avec α = +1

= = ( . )+

=( . )+

 Pour 1/[PNPP] = 0, on a 1/V = 1/Vmax

 Ce qui correspond à l’intersection de chaque droite avec l’axe des ordonnées.

 Pour 1/V = 0 on a,

( . )+ =0

 =
 Ce qui correspond à l’intersection des droites avec l’axe des abscisses.

Nous pouvons en déduire le Km apparent, on trouve :

Kmapp = Km . =

Serie -1/Km app Km app en µmole/L

A
B
C
On sait que Km
app =

On veut déterminer le KI, la constante de dissociation de l’enzyme pour l’inhibiteur.

KI =

Pour la série A : KI =

Série [GRO-P] en mmole/L Kmapp en µmole/L K’m en µmole/L

A 0,25
B 0,625
C 1,25

Représentation de Dixon

A partir de la relation en double inverse, on veut trouver la relation de Dixon :

=( . )+

= . +

=( . [GRO-P]+ ( . + 1))

On obtient une équation de droite du type y= ax + b. Il s’agit de la représentation de Dixon.

Nous traçons donc les droites 1/V = f ([GRO-P] (figure 5) pour chaque concentration en PNPP.

Commentaire :

Sur la figure 5, on observe que les droites convergent en un seul et même point de
coordonnées (-Km, 1/Vmax).

Démonstration : Cf annexes
 On peut donc en déduire les paramètres cinétiques Km et Vmax.

 Km =
 Vmax =

VII. Conclusion