Mailys Durand

Yossra El bachir

TP techniques et instrumentations

compte rendu

partie I : spectrophotométrie UV/Visible

Question 1 :

La caféine est une molécule soluble dans l’eau. De ce fait , nous la retrouvons dans
les urines , qui seront rejetées dans les eaux usées ainsi que dans la nature et donc
dans les eaux fluviales.

De plus , dans les traitements des déchets de transformation de café , il y a utilisation

d’eau . Ce qui participe à la présence de caféine dans les eaux naturelles.

Question 2 :

La longueur d’onde d’absorbance maximal est 281 nm pour une absorbance

maximale d’une valeur de A = 0,345

nous savons par la loi de beer lambert que l’absorbance ( sans unités ) se note :

A= ε × l × C

ainsi , l’absorptivité se note de la façon suivante:

𝐴
ε = 𝑙×𝐶
La concentration nous est donnée en mg/L . Or , les unités de l’absorptivité sont les
L.cm^-1.mol^-1. Nous devons donc procéder à la conversion de cette concentration
massique en concentration molaire afin d’obtenir l’absorptivité aux bonnes unités
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑐𝑎𝑓é𝑖𝑛𝑒
ainsi , CM = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 𝑐𝑎𝑓é𝑖𝑛𝑒

10×𝐸−3
soit CM = = 5.14x10^-5 mol/L
194,19

Donc, avec les données dont nous disposons nous pouvons calculer ε de la manière
suivante :
 0,345
ε = 5.14𝐸−5 ×1
= 6.7*E3 L/ cm /mol

Question 3 :

afin de réaliser les dilutions en série de la solution mère , nous avons effectués les
calculs suivants dressé un tableau récapitulatifs de nos résultats :

calcul :

nous disposons des données suivantes :

𝐶𝑖 = 100 mg/L

𝐶𝑓 = compris entre 1 et 20 ( pour nos calculs , nous avons sélectionné des

concentrations de volumes filles de 1; 5; 10; 15 et 20)

𝑉𝑓 = 10 mL

nous cherchons Vi pour la première solutions diluée

sachant que 𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓
𝐶𝑓 × 𝑉𝑓
alors , 𝑉𝑖 = 𝐶𝑖

- pour Cf = 20 mg/L le volume de solution mère à prélever est :

20×10
𝑉𝑖 = 100
= 2 𝑚𝐿

Nous avons donc prélever 2 mL de la solution mère initial afin de réaliser la première
solution fille diluée de concentration 20 mg/L

Nous avons réalisé ce calcul pour l’ensemble des solutions que nous souhaitions
obtenir .

Sachant que nous réalisons des dilutions en cascade , nous prendrons en

concentration initial , la concentration de la solution diluée au préalable et ceux , pour
l’ensemble de nos dilutions.

ainsi , nous obtenons les données suivantes :

- pour Cf= 15 mg/L ,

Ci = 20mg/L , Vf = 10ml et Vi= inconnue

15×10
𝑉𝑖 = 20
= 7. 5 𝑚𝐿
 - pour Cf= 10 mg/L ,

Ci = 15 mg/L , Vf = 10ml et Vi= inconnue

10×10
𝑉𝑖 = 15
= 6. 66 𝑚𝐿

- pour Cf= 5 mg/L ,

Ci = 10 mg/L , Vf = 10ml et Vi= inconnue

5×10
𝑉𝑖 = 10
= 5 𝑚𝐿

- pour Cf= 1 mg/L ,

Ci = 5 mg/L , Vf = 10ml et Vi= inconnue

1×10
𝑉𝑖 = 5
= 2 𝑚𝐿

Résultats sous forme de tableau :

Ci (mg/L) Vi (mL) Cf (mg/L) Vf ( mL )

1 100 2 20 10
2 20 7,5 15 10
3 10 6,66 10 10
4 15 5 5 10
5 5 2 1 10

Question 4 :
Question 5 :

Protocole de préparation :

- Prélever un volume Vi= 1 mL de la solution mère de concentration initial 100

mg/L
- Insérer ce volume dans un tube à essai
- Prélever un d’eau de 9 mL et l’insérer dans le tube à essai de manière à
obtenir un volume final de 10ml

Sachant que nous réalisons une dilution en cascade , nous prélevons un volume (V)
de la solution n°1 afin de réaliser la solution n°2

Ainsi ;

- Prélever un volume Vi= 7,5 mL a partir de la solution n°1

- Insérer dans un tube à essai
- Prélever un volume d’eau de manière à ce que le volume final soit égal à 10
mL ( soit ici , Veau = 2,5 mL )
- Réaliser ce protocole pour l’ensemble des concentrations voulue

Ajouter les calculs et les gammes étalons choisies

Résultat gamme 1 :

exemple de calcul :
10×10
𝑉𝑖 = 100
= 1 𝑚𝐿

Cf Ci Vf Vi
(mg/L) (mg/L) (mL) (mL )
(compris en 1 et 10)

10 100 10 1

7,5 10 10 7,5

5 7,5 10 6,7

2,5 5 10 5
 1 2,5 10 4

résultat gamme 2 :

exemple de calcul :
2×10
𝑉𝑖 = 100
= 0. 2 𝑚𝐿

Cf Ci Vf Vi
(mg/L) (mg/L) (mL) (mL )
(compris entre 0.4 et 2)

2 100 10 0.2

1.5 2 10 7.5

1 1.5 10 6.6

0.7 1 10 7

0.4 0.7 10 5.7

Question 6 :

L’intérêt de réaliser les 2 gammes est de déterminer quelle gamme est la plus large
afin d’analyser le spectre de façon plus précise . En effet , si une gamme étalon n’est
pas assez large , les résultats seront de ce fait condensés , l'étude du spectre ne
sera donc pas réaliser de façon précise .

Ainsi , nous remarquons que la gamme 0,4 – 2 est très restreinte et les résultats sont
condensés en comparaison à la gamme 1-10 qui est plus étendue . De ce fait , afin
d’analyser le spectre de façon optimale et de manière plus précise , nous utiliserons
la gamme 1-10 qui nous permet une visibilité sur l’ensemble du spectre

Question 7 :

Nous disposons d’une solution inconnue , pour laquelle l’absorbance est

A = 0.764 (S.U)

Afin de déterminer la concentration de cet échantillon , nous nous reportons à la

courbe obtenue a la question 4.
Nous réalisons des calculs à partir de la pente de la courbe à l’aide du logiciel
“EXCEL” qui nous permettent de déterminer que la concentration inconnue est de
34,2 mg/L .

Partie II : Purification de protéines

I. séparation sur colonne

Lors de cette partie , nous avons procédé à la séparation de protéines. Nous

disposons d’un mélange contenant du bleu dextran , de la myoglobine, de la BSA et
de la GFP et d’une colonne DEAE-cellulose .

Nous réalisons ensuite le protocole donné .

Question 1 :

Lors de notre séparation de protéines, certaines sont descendues dans la colonne

plus ou moins rapidement que les autres étant donné que celles ayant un pI plus
acides sont plus retenues, permettant une séparation des protéines en fonction de
leurs pI et donc d’obtenir des protéines dans plusieurs tubes afin de pouvoir
ultérieurement les détecter.

Question 2 :

Comme énoncé dans la question précédente, l’ordre est établie en fonction pI des
protéines.
La formule chimique du bleu dextran ayant été changée par le fournisseur induisant
une vitesse de descente de la colonne largement diminuée, nous n’avons pas
attendu qu’il soit descendu pour effectuer nos mesures.

D'après les données de l'énoncé:

-Le pI de la BSA est 4,7 dans l’eau à 25°C

-Le pI de la myoglobine est 7,2 dans l’eau à 25°C

-Le pI de la GFP est 5,58 dans l’eau à 25°C

On s’attend donc à obtenir de la myoglobine dans les premiers tubes étant donné
que c'est la protéine qui a le pi le plus élevé, puis la GFP ayant un pI inférieur à 7,2
mais supérieur à celui de BSA, qui sera donc la dernière protéine à descendre de la
colonne.

il est possible d’obtenir plusieurs types de protéines dans le même tube puisque l’on
utilisait 3 solvants différents, le premier permettant aux prot de descendre dans
l’ordre, le solvant 2 et 3 permettant aux protéines plus lentes de descendre plus
,rapidement, il est donc possible de retrouver de la BSA et de la GFP dans le même
tube.

Question 3 :

Ces tests permettent d’identifier les protéines présentes dans les différents tubes de
solvant inconnu, et d’ainsi répertorier dans quels tubes les protéines sont présentes,
permettant d’avoir un ordre d’idée de l’ordre dans lequel les protéines sont
descendues à travers la colonne.

Nous effectuons un test au spectrophotomètre à différentes absorbances pour

détecter les différentes protéines ainsi qu’aux UV pour détecter les protéines non
détectées par le spectrophotomètre.

On utilise donc:

- l’absorbance à 260 nm pour détecter la BSA

- l’absorbance à 390 nm pour détecter la myoglobine

- l’exposition aux UV pour la GFP

Question 4:

Voici nos résultats obtenus à partir du spectromètre et à partir de l’exposition aux UV

pour la GFP:
A partir de ces résultats, on peut donc déduire la présence d’une protéine visible à
260 nm dès le tube 1, d’une seconde visible dans le tube 17, visible à 390 nm et
d’une 3eme visible seulement aux UV dans les tubes à partir du numéro 65.

Étant donné que la myoglobine est visible à 390 nm, il n’est donc pas normal de
retrouver, même en faible quantité en vue de la faible absorbance répertoriée, de la
BSA dès les premiers tubes, cela est peut être dû aux solutions rajoutées lors de
l‘expérience.

L’ordre est donc: 1) la myoglobine 2) la GFP 3) la BSA

Question 5 :

Afin de réaliser l'extraction des protéines , nous disposions de la colonne DEAE.

Il s'agit d’une colonne de séparation par échange d’ions. Le fonctionnement de cette

colonne repose sur l'échange d’ion se réalisant entre la phase mobile et la phase
stationnaire . La résine constituant la phase stationnaire permet de retenir les ions.
Le support DEAE-cellulose retient donc plus les protéines de charge globale
négative que les protéines de charge moins négative(point isoélectrique (pI) inférieur
au pH du milieu qui est 8,5), de ce fait, lors de notre séparation, les 3 protéines
étudiées ayant un point isoélectrique différent et plus ou moins bas, elles sont plus
ou moins étaient retenues. Nous permettant d’établir un ordre en fonction de leurs
points isoélectriques.
 II. dosage des protéines

Pratique :

Préparation des dilutions de la solution de BSA :

Nous souhaitons obtenir une gamme étalon comprise entre 0 et 1 mg/mL (

concentration de : 0,1 ; 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ;1 )

Nous avons :

Ci= 100 mg/L

Vi = inconnue

Cf= compris entre 0 et 1

VF= compris entre 0 et 1

Nous réalisons les calculs suivants :

Question 2:

Schéma de l’expérience:
question 3 :

Afin de d’établir la droite d’étalonnage, nous devons d’abord obtenir la concentration

molaire du BSA à partir de la concentration massique.

nous réalisons le calcul suivant afin d’obtenir ces valeurs :

𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑖𝑞𝑢𝑒 𝐵𝑆𝐴

CM = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 𝐵𝑆𝐴

Exemple pour une concentration massique de 1 mg/L :

1 𝐸−3
CM = 430,3 𝑔/𝑚𝑜𝑙
= 2.3 E-6

Nous effectuons ces calculs à l’ensemble des concentrations massiques et obtenons

les valeurs suivantes.

pour une concentration massique de 0.8mg/L ; CM = 1.8 E-6

pour une concentration massique de 0.6 mg/L ; CM = 1.39 E-6

pour une concentration massique de 0.4 mg/L ; CM = 9.29 E-7

pour une concentration massique de 0.2 mg/L ; CM = 4.64 E-7

pour une concentration massique de 0.1 mg/L ; CM = 2.32 E-7

Suite à une erreur de manipulation , les cuves de spectrophotomètre ont été

inversées . Nous obtenons dans un premier lieu les résultats qui montrent une
incohérence entre les concentrations et les valeurs d’absorbance.

C (Mol/L) A

2,30E-06 0,0002

1,80E-06 0,0347

1,39E-06 0,0436

9,29E-07 0,0361

4,64E-07 0,0438
 2,32E-07 0,0492

ainsi ; après avoir remis nos valeurs dans le bon ordre , nous obtenons les résultats
suivants :

C ( Mol/L) A

2,30E-06 0,0492

1,80E-06 0,0438

1,39E-06 0,0361

9,29E-07 0,0436

4,64E-07 0,0347

2,32E-07 0,0002

nous réalisons par la suite une droite d’étalonnage :