06/09/2022

GÉNÉTIQUE, BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

ET BIOINFORMATIQUE

Cours #1 : Lésions, Mutations, Polymorphismes & Réparation de l’ADN

Sébastien Bloyer
Fabrice Confalonieri

Licence 2
2022-2023

V1_20141118

Essayons de définir les termes suivants

Lésions
Mutations
Polymorphisme

et notion de référence

1
 06/09/2022

Lés
e ion
èn sp
utag on
tan
M ée

Lésions de l’ADN

Persistance du
Réparation
dommage

La nature des dommages à l’ADN est très variée

- Perte et modifications de bases

- Modification de la structure des nucléotides
- Mésappariements
- Ajout /délétion de quelques nucléotides
- Pontage inter-brins
- Cassures simple- et double-brins

A plus grande échelle:

Translocations de fragments d’ADN ou de
chromosomes…

2
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1- Dommages spontanés sur les bases

• Désamination (A =>hypoxanthine, C=>U)

=>changement d'appariement si pas réparé

C>T

A>
G

1- Dommages spontanés sur les bases

• Dépurination, (perte de la base, en général purine G ou A)

=> site abasique, si non réparé, la polymérase peut introduire n'importe quel
nucléotide en face à la réplication

3
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1- Dommages à l’ADN induits= MUTAGENES

Mutagènes chimiques

Agents modifiant les bases:

• Acide nitreux =>Désamination des A et des C, appariements aberrants si pas

réparés

• Ethyl Methyl Sulfonate (EMS), Ethyl Ethyl Sulfonate (EES) =>Methylation ou

Ethylation de G, qui s'apparie alors avec T si pas réparé

• Gaz moutarde=> Alkylation des bases, appariements aberrants si pas réparés

• Aflatoxines=>site abasique à la place d'un G (dans les noix ou graines moisies)

Augmente la fréquence de certains évènements

qui se produisent spontanément

Réparation des bases endommagées

4
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3- Dommages à l’ADN induits= MUTAGENES

Mutagènes physiques
Rayonnement Ultra-violet:

dimères de thymine, parfois de cytosine

3- Réparation par NER

Mécanisme du « Nucleotide Excision Repair »
Reconnaissance spécifique

Dommages qui entraînent une

distorsion, dimères de T

Système UvrABC de E. coli

Complexe de pré-excision

Complexe d'excision uvrD= hélicase II

Coupure -4/5, +8
(chez eucaryotes, excision de 28 nucléotides)

10

5
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3-Xeroderma pigmentosum : NER déficient

11

3-Réparation des nucléotides endommagés

Différents mécanismes spécifiques de chaque lésion:

12

6
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4- Dommages multiples à l’ADN induits

Mutagènes physiques

Rayonnements X et gamma: "radiations ionisantes"

• Très énergétiques, pénètrent profondément les tissus

• Effets mutagènes indirects (80% des dommages): formation de

radicaux libres qui peuvent altérer les bases de l'ADN.

• Effets mutagènes directs: cassure des liaisons phosphodiester:

cassure simple-brin, cassure double-brin.

13

Réparation des cassures double brins

Différents mécanismes spécifiques de chaque lésion:

14

7
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5- Dommages dus à des mutagènes "biologiques"

Transposons classe I: rétrotransposons "copier-coller"
Transposons classe II: transposons ADN "couper-coller"

15

5- Dommages dus à des mutagènes "biologiques"

Chez la drosophile, le transposon "élément P" envahit les

populations naturelles et cause de nombreuses mutations par
insertion

16

8
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5- Dommages dus à des mutagènes "biologiques"

Retrotransposons dans le génome humain

Alu

17

Il existe trois types de dommages à l’ADN :

• Dommages spontanés

• Dommages induits (physique et chimique)

• Dommages dus à des mutagènes biologiques

18

9
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Lés
e ion
èn sp
utag on
tan
M ée

Lésions de l’ADN

Persistance du
Réparation
dommage

Tolérance
Mutation Mutation
silencieuse

Evolution Maladie (Cancer)

19

QU'EST-CE QU'UNE MUTATION?

Modification de l’ADN affectant la séquence nucléotidique de

référence, l’arrangement des gènes ou la quantité de matériel
génétique.

Attention faire la différence:

- Soit la mutation est dite somatique (cellules des différents
tissus constituants l’organisme hors cellules sexuelles).
Cette mutation ne touche que l’organisme ou l’individu
concerné.
- Soit, elle touche un gamète ou une cellule qui le produit,
alors la mutation peut être transmise à la descendance

20

10
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Le polymorphisme et la notion de référence

21

MUTANTS ? NON ! POLYMORPHISME !

• homme / femme : dimorphisme sexuel

• Couleur des yeux, des cheveux, de la peau, ...
• Grand, petit, ...

22

11
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23

Une double étude génétique et phénotypique

L'équipe d’Andréa Manica a réalisé une étude permettant de départager les tenants des trois
théories en utilisant deux méthodes totalement différentes mais complémentaires. Ils ont
combiné une étude génétique sur les populations humaines du globe avec une étude des
caractéristiques physiques de plus de 6000 squelettes fossiles provenant également de
plusieurs régions de la planète.

Les études confirment l'origine africaine d'Homo sapiens

Les résultats montrent que plus les populations sont éloignées géographiquement de
l'Afrique, plus la diversité génétique et la variété phénotypique diminuent.
"... certains ont utilisé des données morphologiques pour argumenter que les hommes
modernes avaient des origines multiples. Nous avons combiné nos enregistrements
génétiques avec de nouvelles mesures d'un large échantillon de squelettes pour démontrer
définitivement que les hommes modernes sont originaires d'une seule région au sud du
Sahara en Afrique."

Francois Balloux : "Pour tester une théorie alternative aux origine de l'homme, nous avons
essayé de trouver une origine non-africaine. Nous avons simplement trouvé que cela ne
fonctionne pas. Notre étude montre que les humains sont bien originaires de l'Afrique sub-
saharienne."

Out of Africa confirmée

La théorie de l'Out of Africa est donc confirmée. Il y a 150 000 ans les Homo sapiens, partis
d'Afrique, ont colonisé les autres continents, supplantant au fur et à mesure les populations
d'hominidés qu'ils rencontraient.
Juillet 2007

24

12
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Depuis juillet 2007….

25

XXXX

Un seul scénario

Depuis juillet 2007….

26

13
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Essayons de définir les termes ….

• Qu’entend t-on par un individu dit

« sauvage » ?
Type sauvage ou forme de référence (en anglais wild type) :

Forme d'un organisme le plus représenté dans la nature.

Lorsqu'il s'agit d'un gène présentant du polymorphisme, c'est la forme la

plus répandue qui sert de référence.

27

GÉNÉTIQUE, BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

ET BIOINFORMATIQUE
Cours #2: Génome: structure, réplication

Sébastien Bloyer
Fabrice Confalonieri

Licence 2
2022-2023

V1_20141118

28

14
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1-1 Cycles cellulaires et cycles de vie

Procaryotes

29

Procaryotes

30

15
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1-1 Cycles cellulaires et cycles de vie

Cycle cellulaire eucaryote et mitose

Duplication de l’ADN

Division

31

1-1 Cycles cellulaires et cycles de vie

Modèles eucaryotes
Reproduction sexuée
cycle de vie: alternance phase haploïde (1n) et diploïde (2n)
F= fécondation
M= méiose

Cycle haplobiontique: phase haploïde dominante

champignons (S. pombe, N. crassa, C. reinhardtii)

Cycle diplobiontique: phase diploïde dominante,

animaux, plantes

Cycle haplodiplobiontique: phases de même durée ou bien croissance possible dans les deux états (S.
cerevisiae)

32

16
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L'ADN support de l'information génétique

Procaryotes :

Bactéries : ADN double brin circulaire (Nucléoïde, plasmides)

Eucaryotes :

Noyau : ADN double brin linéaire sous forme de chromosomes

Mitochondrie : ADN double brin circulaire

Chloroplaste : ADN double brin circulaire

Virus, bactériophages :

M13 : ADN simple brin circulaire

SV40 : ADN double brin circulaire
Parvovirus : ADN simple brin linéaire
Adénovirus: ADN double brin linéaire

33

• 1-2 Organisation des génomes procaryotes et

eucaryotes

Procaryotes (Bactéries, Archées) Eucaryotes

Généralement un chromosome circulaire Plusieurs chromosomes linéaires

mais parfois
- linéaire (Streptomyces) En une ou plusieurs copies (dépend
du cycle de vie et de la ploïdie)

- plusieurs réplicons (ex Deinococcus

radiodurans : 4 réplicons )

Plusieurs copies du chromosome et des

réplicons dans chaque cellule

34

17
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Les plasmides

- Molécule d’ADN double brins circulaire, ne possédant pas de capside et

existant naturellement dans la bactérie.

- Molécule indépendante du chromosome bactérien (extra chromosomique).

- Se réplique dans la bactérie de manière autonome à partir de sa propre

origine de réplication et en nombre de copies variable en fonction du type de
plasmides.

- Est porteur de gènes non essentiels à la bactérie hôte mais lui conférant une
propriété particulière (exemple : la résistance à un antibiotique).

- Est modifiable par des techniques de génie génétique. Les plasmides utilisés
comme vecteurs ne sont pas «naturellement » transmissibles d’une bactérie à
une autre.

- Présente une structure tertiaire superenroulée.

35

• 1-3 La réplication de l’ADN et ses conséquences

36

18
 06/09/2022

Contexte: forme, taille, structure des génomes

Différentes formes d’ADN Taille

Microscopie électronique de plasmides

37

Comment répliquer l’ADN ?

Phase 1- Initiation

Ori
Ori

région définie ou région aléatoire ?

38

19
 06/09/2022

Origine de réplication bactérie et plasmides

Incorporation in vivo d’un nucléotide radioactif et autoradiographie à différents temps

Enzyme capable de reconnaître la séquence

GATTC et couper l’ADN sur les deux brins générant
ainsi un ADN linéaire

Observation de l’origine de réplication au

cours du temps

39

Comment répliquer l’ADN ?

Phase 1- Initiation

Ori
Ori

région définie ou région aléatoire ?

40

20
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La réplication débute à une position définie: origine de réplication

Structure d’Ori C, origine de réplication unique du chromosome bactérien

245 pb

L M R 1 2 3 4

13-mers, riches en A/T

9-mers ou « itérons »

Mécanisme conservé
Séquences divergentes

41

Le concept de protéine initiatrice (ou initiateur)

et son application à DnaA chez les bactéries

Fixation de la protéine DnaA

Ouverture de la double hélice

par une hélicase DnaB aidée de la protéine
DnaC

Protection et stabilisation de l’ADN simple brin par la protéine SSB (single-standed binding protein)

42

21
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Multiplicité des origines de réplication chez les eucaryotes

Bactéries Mammifères

Taille de l’ADN génomique 106 pb 3.109 pb

Un par chromosome ou plusieurs milliers

Nombre d’origines de réplication
plasmide

Notion de « Réplicon »
= portion d’ADN dont la réplication dépend d’une origine de
réplication donnée

à un seul réplicon par chromosome ou plasmide chez les bactéries

à plusieurs centaines à plusieurs milliers de réplicons chez les

eucaryotes.

43

Modalités du contrôle temporel des origines de réplication

Chaque origine de réplication fonctionne au plus une fois par cycle cellulaire
(phase S)

Toutes les origines de réplication potentielles ne sont pas forcément

activées

Origine de réplication potentielle

Origine de réplication effectivement

active

Origine de réplication répliquée passivement

L’activation des origines de réplication est contrôlée de manière

stochastique.

44

22
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Etape 2
Synthèse d’ADN

45

La réplication est semi-conservative (Meselson et Stahl, 1958)

H: Heavy (lourd)
L: Light (léger)

46

23
 06/09/2022

La réplication est semi-conservative (Meselson et Stahl, 1958)

H: Heavy (lourd)
L: Light (léger)

47

Principales propriétés de l’ADN polymérase III bactérienne

Une enzyme « multifonctionnelle »

ADN Pol III

Molécules par cellule 10

Activité polymérase 5’à3’ oui

1000 nt.sec-1
Vitesse de polymérisation

Processivité 50 nt

Activité exonucléase 3’à5’ oui

Un complexe « multienzymatique »

a « core-enzyme »

q
e
Pol III

48

24
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ADN polymérases III : du « core-enzyme » à « l’holoenzyme ».

« core-enzyme » « holo-enzyme »
(dimère asymétrique)

anneau b

a
a b
q g
q y
e t d
e b

e t dy
q g

àprocessivité : 50 nt àprocessivité : 5. 105 nt

à synthèse d’un brin à synthèse simultanée de deux brins

49

L’ADN polymérase ne peut pas répliquer l’ADN sans amorce

Expérience 1
Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+)

Aucune synthèse
5’
3’

Expérience 2
Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+)+ Amorce ADN ou ARN

5’ 3’ 5’ 3’
Synthèse d’ADN
5’
3’

50

25
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L’ADN polymérase ne peut pas répliquer l’ADN sans amorce

Expérience 1
Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+)

Aucune synthèse
5’
3’

Expérience 2
Polymérase III + 4 dNTP + tampon (Mg2+)+ Amorce ADN ou ARN

5’ 3’ 5’ 3’
Synthèse d’ADN
5’
3’

In vivo la protéine DnaG (primase) synthétise de courtes séquences d’ARN

51

Les ADN polymérases

1 : les ADN polymérases nécessitent une extrémité 3'OH pour commencer

2 : le sens de la polymérisation (de déplacement) est toujours 5' vers 3'

quelque soit l'enzyme

3 : les nucléotides sont ajoutés par complémentarité

5 -ATGCTGCCCTGCAAGCTTCGATGTCGTTGA-3 OH

3 -TACGACGGGACGTTCGAAGCTACAGCAACT-5

52

26
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53

54

27
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Polymérisation toujours dans le sens 5’ 3’

55

Le magnésium aide a positionner dans l’enzyme le nucléotide afin

que la coupure ait lieu entre le phosphate a et le phosphate b

aa
aa

aa

56

28
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La réplication chez les bactéries et les eucaryotes est bi-directionnelle

Incorporation in vivo d’un nucléotide radioactif et autoradiographie

EcoRI enzyme capable de reconnaître la séquence

GATTC et couper l’ADN sur les deux brins générant
ainsi un ADN linéaire

Réplication dans les deux sens à partir de l’origine

57

Comment concilier les différents paramètres ?

- Sens de polymérisation 5’ 3’
- Réplication bidirectionnelle
- Les deux brins d’une même fourche sont répliqués
en même temps

MAIS

Les deux brins sont antiparallèles et doivent le rester !

58

29
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Rappel de la structure de l’ADN double brins

59

La réplication est semi-discontinue

Brin parental 5’
Brin néosynthétisé
3’ 5’
A B C 3’
t1 5’
5’ 3’
Sens de progression de la fourche
3’
A
5’
discontinue
3’ 5 3’ 5
’ ’ B C 3
t2>t1 ’5’
5 3’
continue 3’ ’
A B
discontinue 5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
C 3’
t3>t2
fragments d’Okasaki 5’
3’
continue 5’
3’

60

30
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L’autre fourche: même principe

3’
3 5 Brin parental
5’ F E D ’ ’ Brin néosynthétisé
3’ t1
Sens de progression de la fourche
5 3
3’ D ’ ’ 5’
3’
5 continue
3
5’ F E ’
’

3’ t2>t1
5 3 5 3 discontinue
’ ’ ’ ’ 5’
E D 3’ continue
5
3’ ’
5’ F
t3>t2
3’
5 3 5 3 5 3
’ ’ ’ ’ ’ ’ 5’ discontinue
fragments d’Okasaki

61

Réplication bi-directionnelle

continue OriC discontinue

E D A B
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’ F C 3’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

discontinue continue

Amorce ARN

62

31
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Les holoenzymes ADN polymérases III : permettant de coordonner la synthèse

du brin précoce et du brin retardé

Holo Pol III SSB

brin retardé
amorce
ARN

brin précoce

63

Voir
https://www.youtube.com/watch?v=D91QfkZEN_M

Plus compliqué
https://www.youtube.com/watch?v=4jtmOZaIvS0

64

32
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Fidélité post-réplicative

65

Principales propriétés de l’ADN polymérase III bactérienne

Une enzyme « multifonctionnelle »

ADN Pol III

Molécules par cellule 10

Activité polymérase 5’à3’ oui

1000 nt.sec-1
Vitesse de polymérisation

Processivité 50 nt

Activité exonucléase 3’à5’ oui

Un complexe « multienzymatique »

a « core-enzyme »

q
e
Pol III

66

33
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Erreurs lors de la réplication dues au taux

intrinsèque d'erreurs d’incorporation des
nucléotides par les polymérases au moment de
la réplication

La fréquence des erreurs de réplication est d’environ 10-9

activité exonucléase 3’
vers 5’ de la DNA Pol

67

Fidélité de la réplication : la correction sur épreuve (proofreading)

introduction d’un mauvais désoxynucléotide

mésappariement

pause de l’ADN polymérase

changement de conformation de l’ADN pol III

l’extrémité 3’ de la chaîne en élongation est transférée au site

actif de la sous-unité e de l’ADN polymérase

la sous-unité e clive la chaîne en élongation

en amont du mésappariement

changement de conformation de l’ADN pol III

a l’extrémité 3’ de la chaîne en élongation est

re-transférée au site actif de la sous-unité a
q
e
DNA Pol III
la polymérisation reprend

68

34
 06/09/2022

Que se passe t-il si l’activité

proofreading n’a pas pris le relais ?

69

Réparation des
mésappariements
chez E. coli

Chez les eucaryotes: systèmes similaires

70

35
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Fixation des mutations ponctuelles

Lorsque la mutation est due à une forme rare qui viole les règles d'appariement,
il faut deux réplications d'ADN pour que la mutation soit fixée.

71

Comment éliminer les ARN et combler

les brèches dans l’ADN néosynthétisé ?

72

36
 06/09/2022

Réplication bi-directionnelle

continue OriC discontinue

E D A B
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
5’ F C 3’
3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

discontinue continue

Amorce ARN

73

Principales propriétés des ADN polymérase I et III

Des enzymes « multifonctionnelle »

ADN Pol I ADN Pol III

Molécules par cellule 300 10

Activité polymérase 5’à3’ oui oui

A
C Vitesse de polymérisation 600 nt.sec -1 1000 nt.sec-1
T
I
V
I
T
E
S Activité exonucléase 3’à5’ oui oui RELECTURE

Activité exonucléase 5’à3’ oui non

74

37
 06/09/2022

L’ADN Pol I est responsable chez les bactéries du remplacement des amorces

5’ 3’ Pol III
3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ Pol I

5’ 3’
Fixation de l’ADN Pol I Ligase
3’ 5’3’ 5’

Dégradation de l’amorce 5’ 3’
3’ 5’3’ 5’

Synthèse d’ADN 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’

Fermeture de la brèche 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’

75

Bilan

Chez les bactéries

DnaA : protéine de reconnaissance de ORiC.

DnaB: ADN-hélicase ,ouverture de la double-hélice. DnaC stimule DnaB

protéines de liaison de l’ADN monocaténaire (SSB /RPA) pour maintenir l’ADN
sous forme simple brin.
DnaG Primase : ARN polymérase ADN-dépendante responsable de la
synthèse des amorces, sur le brin précoce comme sur le brin tardif
Polymérase III: ADN polymérase ADN dépendante responsable de la synthèse
d’ADN
Polymérase I: ADN polymérase ADN dépendante responsable de la suppression
des amorces ARN et du remplissage des brèches
ADN-ligase : ATPase, rétablissement de la continuité des brins

Topoisomérases : gestion des contraintes topologiques générées par la

progression de la fourche de réplication sur l’ADN.

76

38
 06/09/2022

Comment ont été découvertes ces protéines ?

1- Purification de protéines par chromatographie à partir d’extraits bruts

et test d’activité
- Fixation à l’ADN
- Synthèse d’ADN
- Activité de ligation
- Activité exonucléase…

2- Approches génétiques
-mutants thermosensibles

77

Mutants conditionnels

78

39
 06/09/2022

Pourquoi les chats siamois naissent-ils blancs et

pourquoi les adultes ont-ils ce pelage

• le chaton siamois naît blanc

• en milieu chaud, le siamois a une robe claire,
• en milieu froid, le siamois a une robe foncée,
• avec l'âge, la robe du siamois devient de plus en plus foncée,

79

Parce que le gène codant la tyrosinase, enzyme intervenant dans la

voie de biosynthèse de la mélanine, est touché par une mutation
thermosensible

Chez le chat, les extrémités ont une température

inférieure à 35°C , alors que celle du corps est de 38°C.

80

40
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Les mutants thermosensibles

Gène sauvage Gène muté

Condition 1 Condition 2
30°C 37°C

Protéine active à • Conformation • Conformation

toutes les conditions normale erronée
• Protéine active • Protéine inactive

Fonction assurée Fonction nulle

81

82

41