REPUBLIQUE DEMOCRATIQUE DU CONGO

UNIVERSITE EVANGELIQUE
EN AFRIQUE
U.E.A /BUKAVU

B.P:3323et 266BUKAVU
E-mail : ueabukavu@yahoo.fr
FACULTE DE MEDECINE ET SANTE COMMUNAUTAIRE

Rapport de travail pratique de Biochimie

CINETIQUE ENZYMATIQUE DE LA BÊTA-GALACTOSIDASE

Présenté par :

Présenté par ;
o Kwizera Honoré
o Kwokwo Charhala Benjamin
o Kyamas Malutami Chris
o Li’aba Mulala Annette
o Linda Maray
Dirigée par;
C.T KASHOSI ET ASS.BIENFAIT

Promotion : G2 Biomédicale

Année academique 2019-2020

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 I. INTRODUCTION

La B-galactosidase (β-D galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23, lactase) catalyse l'I'hydrolyse

du lactose en "glucose et galactose. Le lactose est un glucide se trouvant quas autorisé dans le lait des
mammifères. Il est degradé dans le tube digestif par lactase. Elle est présente chez tout le monde
durant l'enfance, mais chez quelques adultes la galactosidase n'est plus exprimée. Le lactose reste ainsi
dans le tube digestif et est métabolisé par certaines bactéries produisant des substances osmotiques qui
entrainent l'accumulation de l'eau et de certains composants expliquant les symptômes de diarrhée

Ayant une spècificité de substrat large, β-galactosidase hydrolyse aussi, galactosides, substrats
synthétiques comme Porthoritrophényl β-D galactoside ( ONPG) .La réaction catalysée en présence
d'ONPG
L'orthonitrophénol (ONP) formé au cours de la réaction d'hydrolyse est jaune en milieu alcalin et
présente un maximum d'absorption à 420 nm.

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 I. PRINCIPE DE LA TECHNIQUE

Technique utilisé est celui du β-galactosidase qui est une enzyme qui intervient dans le
métabolisme du lactose.l’utilisation du galactose par la bactéirie requiert deux enymes;le lactose
perméase qui permet au lactose en pénétrer dans la bactérie et le b-galactosidase qui catalyse
l’hydrolise du lactose en glucose et galactose.

II. MATELIELS UTILIZES

Tout pratique de laboratoire nécessite l’usage des matériels. C’est pourquoi lors de notre séance,
nous avons utilisés les matériels suivants :
 Microplaque contenant 12 puits sur une ligne (de 1à12) et 8 puits sur une colonne (A à H)
 Micropipette avec embout de 0,5 à 10µl
 Micropipette avec embout de 20 à 200µl
 Boite contenant les embouts
 Plaque contenant certaines solutions
 Poubelle
 Cuvette contenant les solutions glacées

III. RÉACTIF UTILISÉS ET SOLUTIONS

 Bicarbonate de sodium à 1mol.dm3

 Solution d’ONPG

 Solution de lactose[200Nm]

 Sorution de β-galactosidase
 Tampon de phosphate Ph 7

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 IV. MODE OPERATOIRE

Prepare deux colonnes d’une micoplaque avec 8 puits en respectant le protocole experimental ci-
dessous;

colonne 2
colonne 1 colonne 2 colonne 1+2
solution de colonne 1+2 sotion
puits tampon de tampon de solution
lactose de β-galactosidase
phosphate phosphate d'ONPG
[200mM]

A 50 0 50 50 50
B 60 10 505 40 50
C 70 20 50 30 50
D 80 30 50 20 50
E 85 35 50 15 50
F 90 40 50 10 50
G 95 45 50 5 50
H 100 50 50 0 50

 Incuber à temperature ambiente pendant 10 min

 Ajoueter dans chaque puits 50µL solution de bicarbonate de sodium

 Lire les absorbances à 420nm

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 V. RESUTANTS

COMPLETER LE TABLEAU CI-DESSOUS

[S]=[ONPG] [S]=[ONPG] 1/[S]/[ONPG] 1/[S]/[ONPG]

D.O D.O 1/D.O 1/D.O
mmol/L Mmol/L L/mmol/l] [L/mmol]
Col 1 Col 2 COL1 Col 2
Col 1 Col 2 Col 1 Col 2
A 0.144 0.066 6.94 15.15 2 2 0.5 0.5
B 0.129 0.06 7.75 16.66 1.6 1.6 0.625 0.625
C 0.125 0.057 8 17.54 1.2 1.2 0.83 0.83
D 0.119 0.052 8.4 19.23 0.8 0.8 1.25 1.25
E 0.1 0.049 10 20.4 0.6 0.6 1.66 1.66
F 0.096 0.046 10.41 21.73 0.4 0.4 2.5 2.5
G 0.08 0.042 12.5 23.25 0.2 0.2 5 5
H 0.052 0.043 19.23 23.8 0 0 ∞ ∞

1. Tracer la courbe 1 / D.O = f (1 / [S]) selon Lineweaver-Burke en présence et absence de lactose (voir ci-
dessous; explication sera être donné dans 1´introduction). Parce que l'absorbance (= densité optique,
D.O.) est proportionnelle à la concentration du produit ONP, on peut utiliser comme mesure de la
vélocité V de la réaction (en unités arbitraire).
2. Déterminer graphiquement KM et VMax en présence et absence de lactose.
3. Expliquer pourquo. sur utiliser la représentation selon Lineweaver - Burke et pas selon Michaelis-Menten
pour la détermination de Vmax et Km?
4. Quelle est la conséquence de la déficience en lactase chez un individu surtout chez les nourissons? A quoi
est dů cela?

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 REPONSE A LA QUESTION
1. SUR PAPIER MILLIMETRE

2. SUR PAPIER MILLIMETRE

3. represantation selon lineweaver-burke est representation entre l’inverse de la vitesse d’une

reaction enzymatique(ordonnées) et l’inverse de la concentration en substrat (abscisses).
Permet la linearization de l’éqaution de Michaelis-menten et le calcul des paramètre V max et Km
4.conséquence de la déficince en lactose chez un indivudu surtout chez nourissons,
L’intolérance au lactose est un problème de digestion du sucre contenu dans le lait et ses produits
dérivés. Elle provient d'un déficit dei
L'intolérance au lactose est l'inconfort digestif dû à une consommation de lactose dépassant la capacité
propre de la personne à digérer ce sucre présent dans le lait et ses produits dérivés.
Les personnes, qui ne produisent plus assez de lactase pour digérer correctement le lactose, souffrent
d'intolérance au lactose.
Le lactose est digéré par la lactase intestinale
Le lactose est le principal sucre du lait. On ne le trouve d’ailleurs que dans le lait et ses produits
dérivés.
Le lactose nécessite une enzyme, la lactase, pour être digéré. La lactase, normalement produite par
l'intestin, décompose le lactose provenant de l'alimentation en deux autres sucres (glucose et
galactose), qui peuvent être facilement absorbés par l’intestin.

VI. CONLUSION
En bref, cette expérience nous permet de mettre en évidence les paramètres cinétiques de

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l’enzyme, Km et Vmax , en présence et en absence de l’inhibiteur lactose par l’usage du graphique de
Lineweaver-burke et d’en connaître l’importance.
La réaction d’hydrolyse de l’ONPG va donner un produit de couleur jaune, l’ONP, sous l’action de
l’enzyme ß-galactase.

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