Introduction

Introduction

L’immunité inné initie une défense rapide et efficace contre les micro-organismes (Bekkering
et al. 2016). Les monocytes sont l’un des acteurs centraux de ce type d’immunité qui
assurant plusieurs fonctions, notamment l’inflammation, la phagocytose et la réparation
tissulaire (Fani Maleki et Rivest 2019). Ces cellules produisent une grande variété de
médiateurs moléculaires. Ces médiateurs incluent les cytokines tels que e TNF- α, l’IL-1β, le
IL-6 et aussi monoxyde d’azote (Elner et al. 1991). Ce dernier est produit à partir de la
conversion de la L-arginine par l’enzyme nitrique oxyde synthase inductible (iNOS) et
contribue à la destruction et l’élimination des pathogènes (Kirkebøen et Strand 1999).

Le Sars-Cov-2 (syndrome de détresse respiratoire aiguë sévère) est un agent hautement

pathogène apparu en fin décembre 2019 qui a infecté 170 millions de personnes en causant
la mort de plus de 3 millions d’entre eux. Se réplique dans les voies respiratoires supérieures
et inférieures. Elle est principalement transmise par des gouttelettes et des aérosols
provenant de sujets infectés asymptomatiques et symptomatiques (Salzberger et al.
2021).Le profilage exacte de la réponse immunitaire induite par le Sars-Cov-2 n’est pas
encore déterminé (Grigoryan et Pulendran 2020). Néanmoins des niveaux accrus de
cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF- α et la cytokine antivirale IFN-α ont été
signaler (Karki et al. 2021).

Dans cet ordre d’idées, l’objectif de la présente étude est d’évaluer les taux du monoxyde
d’azote monocytaire suite à une infection au Sars-Cov-2.

1.1 Monocytes

1.1.1. Généralités

Les monocytes se sont des leucocytes qui circulent dans le sang dotés d’une plasticité et
d’un rôle dans de nombreux processus biologiques (Hamers et al. 2019). Se sont des
cellules immunitaires effectrices appartenant au système phagocytaire mononucléaire qui
migrent dans les tissus inflammés (Sunderkötter et al. 2004) à l’aide des récepteurs aux
chimiokines et à des molécules d’adhésion (Imhof et Aurrand-Lions 2004), issues de moelle
osseuse et la rate et ne se différencient pas en l’absence d’inflammation (Wolf et al. 2019).

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Chapitre 1. Revue de la littérature

Ils forment 5 à 10 % des leucocytes circulants chez l’homme (Dutta et Nahrendorf 2015). Ils
sont définis par une divergence de récepteurs, Ils possèdent un large répertoire de
récepteurs « scavengers » qui reconnaissent des lipides aussi bien que des
microorganismes. Lorsqu’ils sont actionnés, ils peuvent afficher de forts taux de ROS
(Reactive Oxygen Species), de prostaglandines, de facteurs du complément, et monoxyde
d’azote (NO) (Taylor et Gordon 2003), cytokines, des enzymes protéolytiques et des
molécules d’adhésions (Tsubota et al. 2013; Leuschner et al. 2010) capter des débris
cellulaires ou des molécules toxiques. En plus de jouer de jouer un rôle dans la défense
contre les pathogènes , les monocytes ont un rôle dans les inflammations stériles (par
exemple dans les régimes strict) (Napoli et al. 1997). Les monocytes ont pareillement la
propriété de se différencier en macrophages (Rivollier et al. 2012) et en cellules dendritiques
dans les tissus agressés (Germic et al. 2019).

1.1.2. Historique

Les premiers récits de monocyte sont étroitement liés à l'introduction du microscope au

milieu du XIXe siècle. En utilisant de l'aniline et des colorants neutres et en fonction de la
morphologie nucléaire, Paul Ehrlich a classé les globules blancs en leucocytes
mononuclées, dont certains ont été appelés gros mononuclées avec des noyaux en forme de
rein ou Übergangszelle (cellules transitionnelles) (Z.-L. Chang 2009). En 1908, Metchnikoff
et Paul Ehrlich ont établit la théorie de la phagocytose et ont donnés naissance au concept
d'immunité cellulaire innée. Cette théorie fut le prix Nobel de physiologie ou
médecine (Cavaillon 2011).

Le terme «monocyte» a été inventé par, Artur Pappenheim en 1910 et surtout par Schilling
en 1912 pour les cellules mononuclées phagocytaires dépourvues de granules grossiers
dans le sang (Kawamura et Ohteki 2018).

1.1.3. Caractéristiques

Les monocytes sont des cellules immunitaires innées de la lignée myéloïde ,qui sont
produites tout au long de la vie et possèdent divers rôles, y compris dans le développement
des tissus et l’homéostasie (Wolf et al. 2019). Chez les adultes et les enfants en bonne
santé, les monocytes représentent 10 % des leucocytes du sang (Dutta et Nahrendorf 2015).

Les monocytes ont une taille qui varie entre 12 et 20 µm. Ils ont un noyau allongé ,irrégulier
avec des lobes et des étranglements mais ne montre pas de véritable segmentation
(van Furth et Beekhuizen 1998). Ils présentent un cytoplasme abondant, de couleur grisâtre,

2
Chapitre 1. Revue de la littérature

riche en ribosomes et semé de fines granulations pourpre à peine distinctes. Ils possèdent
également des granules plus ou moins dense mesurant de 0,05 à 0,2 µm dispersées dans le
cytosol et contenant des myéloperoxydase (MPO) (Najman 1994) (Figure 1.1).

Figure 1.1. Mise en évidence par coloration MGG des monocytes du sang et aspect
ultrastructural (Najman 1994). G : Appareil de golgi ; M : mitochondrie ; E : microfilaments ;
L : granules

1.1.4. Monocytopoïése et cycle de vie des monocytes

Les monocytes se forment et ils acquièrent une maturité dans la moelle osseuse lors de
l’hématopoïèse à partir des cellules souches hématopoïétiques (CSH) possédant le pouvoir
d’auto-renouvellement. (Ceredig, Rolink, et Brown 2009). Le monocyte se différencie à partir
d’un précurseur commun aux cellules myéloïdes (CFU-M), ensuite en progéniteur CFU-
GEMM (unité formant colonie des séries granulocytaire, érythrocytaire, monocytaire et
mégacaryocytaire) (figure1.2), puis plus tard en CFU-GM (granulocytaire et monocytaire)
(Payne et Crooks 2002), sous l’action de cytokine IL-3 et de facteurs de transcriptions GM-
CSF puis M-CSF , le monoblaste subit deux mitoses successives donnant naissance à
deux promonocytes ensuite 4 monocytes (van Furth et Cohn 1968).

Le temps de transit médullaire à partir des monoblaste est d’environ 2 à 3 jours avec un
temps de génération de 30 heures. Après leur génération, les monocytes matures sont
libérés dans la circulation périphérique où ils patrouillent (Guilliams, Mildner, et Yona 2018)
pendant quelques jours (1-2 jours). Enfin, ces cellules n’ont pas été recrutés dans un tissu
pour faire face à un danger, ils meurent (W.-N. Liu et al. 2020).

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Chapitre 1. Revue de la littérature

Figure1.2.processus de production des monocytes dans la moelle osseuse.

Présentation schématique du processus de production des monocytes dans la moelle osseuse via les cellules
souche hématopoïétique , qui se diviseront en deux progéniteur lymphoïde (donnant les LB , LT et NK) et en
progéniteur myéloïde (précurseur de la lignée granulocytaire) à partir de la quelle se forment les monoblaste qui
sous l’action de M-CSF et IL-3 produisent les monocytes .

En plus de la moelle osseuse, il a été démontré que la rate contient un énorme réservoir de
monocytes dans des conditions homéostatiques normales. Lors d'une blessure ou d'une
inflammation, les monocytes spléniques augmentent leur motilité, sortent de la rate et
migrent vers le site de la blessure ou de l'inflammation (Swirski et al. 2009) où ils se
transforment en macrophage ou en cellules dendritiques(DC) . La capacité des monocytes à
se différencier en de nombreux autres types cellulaires montrent d'une part la plasticité de
ces cellules mais aussi qu’ils jouent un rôle important dans nombre de processus
biologiques.

1.1.5. Hétérogénéité des monocytes

Initialement, les monocytes du sans périphériques ont été définis par leur morphologie ainsi
que par leur capacité à adhérer, et ont été caractérisés par leurs fonctions principales telles
que la phagocytose et la production de cytokines(van Furth et Cohn 1968).L’essor de la
cytométrie en flux et des anticorps monoclonaux pour le marquage des cellules a rendu
possible une meilleure définition des monocytes (Todd, Nadler, et Schlossman 1981).

Ainsi actuellement, les monocytes sont divisés en trois sous-ensembles (Tableau 1.1)
(Ziegler-Heitbrock et al. 2010) qui se distinguent par leurs fonctions (Varol, Yona, et Jung
2009), l'expression des marqueurs de surface, notamment le CD14 et le CD16 (figure1.3)
(Passlick, Flieger, et Ziegler-Heitbrock 1989), et leurs cinétiques de maturation (Tak et al.
2017). Le marqueur principal des monocytes humains, CD14, est une glycoprotéine et un
antigène de différenciation myélomonocytaire qui fonctionne comme une protéine accessoire
au récepteur toll-like (TLR)-4 (Cordula Weber et al. 2012), tandis que le CD16 (ou récepteur

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Chapitre 1. Revue de la littérature

FcγR III) est une molécule de la superfamille des Ig qui est impliquée dans la cytotoxicité des
lymphocytes T dépendante des anticorps (ADCC) (Randolph et al. 2002).

Figure1.3Les sous-populations monocytaire en fonction de l’expression du CD14 et du

CD16 (Ziegler-Heitbrock 2015).

1.1.5.1. Monocytes classiques

Les monocytes classiques constituent le principal sous-ensemble de monocytes et

constituent 80% à 90% des monocytes sanguins humains. Ces cellules expriment des
niveaux élevés de CD14 et aucun CD16 (CD14 ++ CD16 −) (Wong et al. 2011) et présentent
une plasticité fonctionnelle considérable. Ils sont impliqués dans le processus de la
réparation des tissus et dotés d’une activité phagocytaire élevée (figure1.4) (Grage-
Griebenow, Flad, et Ernst 2001) , et ils présentent également un haut niveau de production
de dérivés réactifs de l’oxygène (reactive oxygen species ou ROS) et exprime la
myélopéroxidase et le lysozyme (Cros et al. 2010).Leur recrutement lors d’une inflammation
repose fortement sur le CCR2 et ses ligands, CCL2 et CCL7 (Serbina et Pamer 2006) , ainsi
que d’autres signaux. Des marqueurs de surface, tels que le CD64 (Fc gamma RI) et les
récepteurs de chimiokines CXCR1 et CXCR2 (Wong et al. 2011) semblent être exprimés que
sur ce type de monocytes. Les monocytes classiques produisent plusieurs cytokines, y
compris le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), l’interleukine1-beta (IL-1β) et l’IL-6, ainsi
de des chimiokines CCL5 , CCL2 , CCL3 en réponse aux lipopolysaccharides (LPS) (Figure
1.). Ils expriment des protéines pro-inflammatoires S-100, ce qui leur donne la capacité de
soutenir l'inflammation(Berthier et al. 2012).

L’analyse génomique et transcriptomique des monocytes classiques a mis en évidence une

expression accrus de gènes impliqués dans la réparation tissulaire, la coagulation, la
cicatrisation, et les gènes répondant à divers stimuli tels que les toxines , les hormones , les
médicaments pro-inflammatoire et l’hypoxie(Y. Liu et al. 2017) .L’analyse épigénétique quant
à elle , a mis en évidence des sites de méthylation CpG variables selon les individus qui

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Chapitre 1. Revue de la littérature

seraient associé à certaines maladies (tels que le diabète de type 1, l’arthrite rhumatoïde , le
cancer ) et à l’exposition au tabac (Krieg 2002).

1.1.5.2. Monocytes intermédiaires

Ce type de monocyte expriment des niveaux relativement élevés de CD14 et certains CD16
(CD14 +(+) CD16 +) (Zawada et al. 2011), représentent 10% des monocytes circulant
.contrairement aux monocytes classiques, les monocytes intermédiaires expriment
faiblement CCR2 et fortement CX3CR1(récepteur de fractalkine). Dans ce sous-ensemble,
HLA-DR , CCR1,CXC3R1 et TNFR1 sont exprimés des niveaux significativement plus élevés
(Smedman et al. 2012; Wong et al. 2011). Ces monocytes seraient les plus grands
producteurs de IL-10 lors d’une stimulation de leur TLR4 aux LPS et aux zymosans
(Skrzeczyńska-Moncznik et al. 2008), ainsi que le TNF- α, l’IL-1β de manière similaire à la
population classique (figure1.4) (Cros et al. 2010).

Les analyses transcriptomiques de cette population révèlent un enrichissement de

l’expression de certains gènes responsables de l’apprêtement et de la présentation des
antigènes par le CMH de classe II, incluant les 6 gènes codant les chaînes α et β du CMH de
classe II ainsi que le gène codant la molécule co-stimulatrice CD40 , ce qu’il leur permet de
présenter l’antigène aux cellules TCD4+ induisant la prolifération et de la stimulation des
cellues Th1 (Ziegler-Heitbrock 2007). Certaines études suggèrent que les monocytes
intermédiaires peuvent activer les cellules T CD8.

Les monocytes intermédiaire sont également les meilleurs inducteurs de la prolifération des
cellules T médiée par l'entérotoxine B staphylococcique(SEB). De plus, les monocytes
CD14+CD16+ possèdent un rôle dans l'angiogenèse grâce à la présence du récepteurs
Tie-2 (tableau1.1) (Murdoch et al. 2007), le récepteur au facteur de croissance vasculaire
endothéliale 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2 ou VEGFR-2) et l’endogline
(ENG) (Zawada et al. 2011).

1.1.5.3. Monocytes non-classiques

Les monocytes non classiques expriment de faibles niveaux de CD14 et des niveaux élevés
de CD16 (CD14 + CD16 ++ ) (Boyette et al. 2017).Ils représentent 5% à 10% des monocytes
sanguins .En plus des CD16 , ils peuvent être caractérisées par différents niveaux d'antigène

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Chapitre 1. Revue de la littérature

leucocytaire humain D lié (HLA-DR) (Smedman et al. 2012), de CX3CR1(Ancuta et al. 2003)
et de CD195 (également connu sous le nom de CCR5) (figure1.4), de même que les
récepteurs TNFR1 (CD120a) et TNFR2 (CD120b) (Hijdra et al. 2012).Des molécules comme
CCR1, CCR2, CCR5, CXCR1, CXCR2, CD62L sont absentes du sous-ensemble non
classique (tableau1.1) (Christian Weber et al. 2000). Cette population analysée
conjointement avec la population intermédiaire est amplifiée en situation infectieus e et
inflammatoire (Saionji et Ohsaka 2001).Ils produisent également TNF-α, l’IL-1β et très peu de
IL-10 en réponse aux LPS (Serbina et al. 2008). Leurs autres capacités incluent la
«patrouille» de l’endothélium (Thomas et al. 2015),La détéction des virus, des complexes
immuns et des acides nucléiques et leur action par la voie des TLR7 et TLR8 ce qui en fait
des acteurs clés de la réponse immunitaire innée (Cormican et Griffin 2020).

Les analyses transcriptomiques de cette population révèlent un enrichissement de

l’expression de certains gènes impliqués dans le réarrangement du cytosquelette ainsi que
des gènes jouant un rôle dans le mouvement cellulaire des gènes impliqués dans le
remodelage du cytosquelette qui interviennent dans la phagocytose ainsi que des
composants du complément, (Saionji et Ohsaka 2001; Belge et al. 2002).Enfin une
surexpression des gènes impliqués dans la phosphorylation oxydative et le métabolisme
protéique a été observé (Schmidl et al. 2014).

Tableau1.1. Propriétés phénotypiques des sous-ensembles de monocyte

Monocytes Monocytes Monocytes
Récepteurs Classiques Intermédiaires non-classiques Références
CD14+++CD16- CD14+CD16+ CD14+CD16+++
HLA-DR + +++ + (Smedman et al. 2012)

CD64 + - - (Ożańska, Szymczak,

(FcγRI) et Rybka 2020)

RCC1 +++ + - (Ożańska, Szymczak,

et Rybka 2020)
RCC2 ++ - - (Wong et al. 2011)
(CD192)

RCC5 + ++ - (Wong et al. 2011)

(CD195)

CXCR1 ++ - - (Christian Weber et al.

2000)

CXCR2 ++ - - (Christian Weber et al.

2000; Wong et al.
CX3CR1 - ++ ++ 2011)
(Wong et al. 2011)

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Chapitre 1. Revue de la littérature

TNFR1 + ++ - ((Ożańska, Szymczak,

et Rybka 2020; Hijdra
TNFR2 - + ++ et al. 2012)
(Hijdra et al. 2012)

CD40 PD + PD (Ożańska, Szymczak,

et Rybka 2020)

Tie-2 PD + PD (Murdoch et al. 2007)

PD : pas de données; Niveaux d'expression : ++, élevé ; +, moyen ; −, faible ; CD :cluster de

différenciation; CCR : récepteur de chimiokine CC; CXCR : récepteur de chimiokine CXC; HLA : antigène
leucocytaire humain; TNFR : récepteur du facteur de nécrose tumoral

Figure 1.4. La fonction des sous-populations des monocytes

1.1.7. Le NO comme agent antimicrobien chez les monocytes

Lors d’une infection bactérienne ou virale comme le Sars-Cov-2, le monocyte produit des
radicaux libres tel que le monoxyde d’azote (NO)(Akaberi et al. 2020). Il est décrit sous trois
formes : la NOS endothéliale (eNOS ou NOS1), la NOS neuronale (nNOS ou NOS3) et la
NOS inductible (iNOS ou NOS2) (Mattila et Thomas 2014). La production du NO est
catalysée par une enzyme : la NO synthase (NOS) via une série de réaction redox par
conversion de la L-arginine en L-citrulline en présence d’oxygène et du NADPH
(nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate) (figure1.6)(Nouari 2016).

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Chapitre 1. Revue de la littérature

C’est une molécule extrêmement importante du système immunitaire .Il est connu pour son
effet microbiostatique et microbicide contre les agents pathogènes et son action anti-tumoral
(Bogdan 2015).Lors de l’homéostasie, il agit également lors de la bronchodilatation
(Ricciardolo 2003), la vasodilatation (Simmonds, Detterich, et Connes 2014), la modulation
de la pression intraoculaire (J. Y. H. Chang et al. 2015), la neurotransmission (Garthwaite
2008).En outre un niveau élevé du NO peut conduire au dommage sur les cellules et les
tissus sains, en induisant la dégradation de la matrice extracellulaire, le recrutement accrus
de cellules inflammatoires en augmentant l’expression des chimiokine, ce qui peut entraîner
une inflammation chronique et l’apoptose des lymphocyte T (Hall et Garthwaite 2009).

Figure 1.6. Réaction chimique de production du NO (Nouari 2016)

Le NO agit a plusieurs niveau lors d’une infection notamment le Sars-Cov-1 (Akerström et

al. 2005). Il inhibe directement la réplication de l’ARN virale du Sars-Cov-1 en affectant une
ou deux protéases à cystéine liées à la réplication du virus (Lisi, Zelikin, et Chandrawati
2021) ou il diminue le niveau de palmitoylation de la protéine structural S et inhibe la fusion
membranaire de la protéine S du virus (Fang et al. 2021). Etant donné que le Sars-Cov-1 et
le Sars-Cov-2 partagent plusieurs caractéristiques l'inhibition du SARS-CoV-2 par le NO peut
être similaire à celle du SARS-CoV-1. Cependant, le mécanisme du NO dans le SRAS-CoV-
2 reste incertain. Les chercheurs ont recommandé le NO avec les médicaments antiviraux
cliniquement recommandés comme stratégie efficace pour le traitement du COVID-19.

1.2. Sars-Cov-2

1.2.1. Généralités
Depuis décembre 2019, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a éclaté, le virus a été
zoonotiquement dérivé de la région de Wuhan, dans la province du Hubei, en Chine. Il se
propageait rapidement, affectant en dix mois les pays du monde entier en faisant jusqu’à
maintenant plus de 170 millions de cas identifiés dans plus de 216 pays et territoires, faisant
3541324 de décès. Hautement transmissible (Draganić 2020), cette nouvelle maladie à
coronavirus, également connue sous le nom de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), Il

9
Chapitre 1. Revue de la littérature

a largement dépassé le SRAS et le MERS en termes de nombre de personnes infectées et

d’étendue spatiale des zones épidémiques (Figure 1.1) (Hu et al. 2021).
Le Comité international de taxonomie des virus (ICTV) a déclaré que le nouveau virus est
nommé SARS-CoV-2 (11 février, 2020). Dans le même temps, l’Organisation mondiale de la
santé (OMS) a annoncé que le nom de la nouvelle maladie causée par le SARS-CoV-2 est la
maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), puis, le 11 mars, 2020, l’OMS a déclaré une
pandémie de SARS-CoV-2 https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-
2019/situation-reports/

Figure 1.7. Carte du monde illustrant le scénario actuel de la COVID-19 (Selon OMS,
2020). https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200513-
covid-19-sitrep-114.pdf?sfvrsn=17ebbbe_4

1.2.2. Modes de transmission et facteurs de risque

Le nouveau coronavirus a été identifié dans les 1 mois (28 jours) suivant l’éclosion. C’est
d’une rapidité impressionnante par rapport au temps nécessaire pour identifier le Sars-cov.
Les particules respiratoires se propagent en respirant, en parlant, en toussant ou en
éternuant (Cook 2020). Selon une étude publiée dans le New England Journal of Medicine,
la transmission peut s’effectuer également par aérosols (figure1.8). D’autres études montrent
que la demi-vie du virus est d’environ 1,1 à 1,2 h et qu’il est resté viable pendant 3 h dans
les aérosols. Pendant ce temps, le virus sur le plastique, l’acier inoxydable, le cuivre et le
carton est resté stable pendant 4 à 72 h(van Doremalen et al. 2020). Xiao et ses collègues
ont aussi montré qu’une transmission fécale-orale peut également jouer un rôle important
dans la propagation du SARS-CoV-2 (J.-Y. Li et al. 2020).
La plus part des cas positifs ont touché des personnes âgées de 30 à 85 ans . Le risque de
contamination est considérablement accrue par une exposition prolongée ou répétée (Zhao

10
Chapitre 1. Revue de la littérature

et al. 2020), une raison pour laquelle les enfants sont moins infectés que les adultes car ils
sont plus susceptibles d’avoir des horaires réglementés et moins susceptibles d’être à des
rassemblements sociaux (Dowd et al. 2020). De plus, d’autre facteurs permettent
d’augmenter le risque de mortalité tels que l’hypertension, l’obésité (Sattar, McInnes, et
McMurray 2020), les maladies cardiovasculaires ou cérébrovasculaires concomitantes
préexistantes et d’hyperglycémie (F. Zhou et al. 2020).

Figure 1.8. Voies de transmission potentielles du SARS-CoV-2 (Dhama et al. 2020). Bien
que le Sars-Cov-2 provient d’une hôte zoonotique (origine animale), sa propagation est plus poussée par
transmission interhumaine, par voie respiratoire ou par contacte directe ; serrer une main par exemple ou encore
par contact direct avec des surfaces contaminées. Néanmoins, d’autres pistes de transmissions restent à étudier
telles que la transmission sanguine, la transplantation d’organe ou même les voies transplacentaire et
périnatales.
1.2.3. Manifestations cliniques

Chez les patients atteints de SARS-COV-2, on observe une large liste de manifestations qui
vont de symptôme asymptomatique bénin à grave (Mizumoto et al. 2020). L’incidence des
cas asymptomatiques varie de 1,6 % à 51,7 % (Kimball et al. 2020). Pour les cas
symptomatiques, les symptôme évoluent rapidement et ne sont pas spécifiques. Les
symptômes les plus signalés sont la fièvre ou les frissons, les maux de tête, les douleurs
musculaires ou corporelles, la toux sèche, les myalgies ou la fatigue, la pneumonie et la
dyspnée compliquée. Les patients peuvent également avoir l’insipuciance, la diarrhée,
l’hémoptysie, l’écoulement nasal, les dommages au foie, les lésions rénales, les nausées et
les vomissements (Huang et al. 2020). De plus, la perte de l’odorat (hyposmie) ou du goût
(hypogéusie) peuvent être considérés comme des symptôme de la COVID-19 (Lao, Imam, et
Nguyen 2020).

11
Chapitre 1. Revue de la littérature

1.2.4. Caractéristiques morphologiques, biologiques et physicochimiques

Le SARS-CoV-2 est un virus, de l’ordre des Nidovirales (Chen, Liu, et Guo 2020), de la
famille des Coronavirinae (Rehman et al. 2020), de la sous-famille des Orthocoronavirinae,
qui est subdivisé en quatre genres, à savoir Alphacoronavirus, Betacoronavirus,
Gammacoronavirus et Deltacoronavirus (Chen, Liu, et Guo 2020). Il s’agit d’un virus
sphérique, enveloppé de 60-220 nm de diamètre. Il possède une glycoprotéine Spike (S)
(donne l’aspect en couronne au virus en microscopie électronique), une enveloppe (E), une
membrane (M) et une nucléocapside (Nsp). La nucléocapside est icosaédrique à symétrie et
cubique renfermant le génome viral qui est un acide ribonucléique (ARN) monocaténaire,
non segmenté et positif (29 881 paires de bases) (Cui, Li, et Shi 2019) (le plus grand
génome parmi les virus à ARN) (Woo et al. 2010). L’ARN génomique est 5′-coiffé et 3′-
polyadénylé et contient plusieurs cadres de lecture ouverts (ORF) (Fung et Liu 2019). 67%
du génome code par l’ORF1a/b et il code pour 16 polyprotéines non structurelles
(Mousavizadeh et Ghasemi 2021) alors que l’autre partie du génome codent les quatre
protéines structurelles majeures qui sont responsables du maintien et de la réplication
virales (Cui, Li, et Shi 2019) (figure1.9). Cet ARN génomique possède trois principales
capacités au cours du cycle de vie viral : (1) en tant qu’ARN initial du cycle infectieux ; (2)
comme modèle pour la reproduction et la transcription; et (3) comme substrat pour
l’emballage dans le virus de la descendance.
La protéine E est exprimée pendant la réplication et la protéine N est importante pour
l’emballage de l’ARN et la libération virale suite à une infection des cellules hôtes (Anderson
et Wong 1993). La glycoprotéine M est la protéine structurelle la plus abondante, hautement
hydrophobe qui couvre la bicouche membranaire trois fois et laissant un domaine NH2-
terminal à l’extérieur du virus ainsi qu’un long COOH‐terminal à l’intérieur (Bond, Leibowitz,
et Robb 1979). La protéine S du coronavirus est une grande protéine transmembranaire
virale multifonctionnelle avec une taille qui varie entre 1160 à 1400 acides aminés (Perlman
et Netland 2009). Elle est trimérique avec deux domaines : un domaine lobulaire supérieur
qui contient une caractéristique de liaison au récepteur de l’angiotensine 2 (ACE-2) (qui
engage la cellule hôte pour initier l’entrée dans cellule et un domaine d’encrage
transmembranaire (W. Li et al. 2005) (Figure1.9).
Jusqu’à présent les caractéristiques physicochimique du virus ne sont pas toutes
connues, mais il a été rapporté que le SARSCOV2 est sensible aux rayons ultraviolets et à la
chaleur à 56 °C pendant 30 minutes. L’éther, l’éthanol à 75 %, le désinfectant contenant du
chlore, l’acide peracétique, le chloroforme et d’autres solvants gras, mais pas la
chlorhexidine, peuvent inactiver efficacement le virus (Rabenau et al. 2005).

12
Chapitre 1. Revue de la littérature

Figure 1.9. Structure et organisation génomique du SARS-CoV-2 (Chilamakuri et

Agarwal 2021). (A) : structure du virus SARS-CoV-2 et des positions de la glycoprotéine Spike, de
l’hémagglutinine-estérase, de l’enveloppe E, de la membrane M, de la nucléopside N et du génome viral de
l’ARN. (B) : Organisation génomique du SARS-CoV-2 représentant l’ORF1a, l’ORF1B qui codent pour des
protéines non structurales telles que l’ARN polymérase ARN-dépendante, l’hélicase et l’endoribonucléase et les
gènes codant pour les protéines Spike (S), enveloppe (E), membrane (M) et nucléocopside (N) sont également
affichés. Les positions génomiques sont représentées par des lignes pointillées suivies du nombre de positions
nucléotidiques dans le génome viral de l’ARN. La boîte met en évidence l’organisation génomiqu e du gène spike
(S) montrant des sous -unités S1 et S2 distinctes codant des segments. (C): Représentation agrandie
schématique de la glycoprotéine Spike du SARS-CoV-2 montrant les sous -unités S1 et S2. D : Le domaine de
liaison des récepteurs (RBD) représ entant le site de liaison des récepteurs ACE2 dans les cellules humaines, le
domaine N-terminal (NTD), la protéine de fusion (FP), l’ancrage transmembranaire (T.A.) et les domaines de
protéines intracellulaires de la queue (I.T.) sont affichés.
1.2.5. Cycle virale
1.2.5.1. Entrée et fusion du virus
L’entrée du virus se fait par endocytose par l’intermédiaire de la protéine Spike. La fusion
commence par la liaison de cette protéine (F. Li 2016) au récepteur ACE-2 de la cellule hôte,
coenzyme exprimé dans presque tous les tissus, y les poumons, les reins, le tronc cérébral,
le tissu adipeux, le cœur, la vascularisation, l’estomac, le foie, ainsi que dans les muqueuses
nasale et buccale(W. Li et al. 2003). La pénétration de virus dans la cellule hôte se fait par
voie endosomal qui dépend du clivage du site S1/S2 par la sérine transmembranaire de
surface protéase 2(TMPRSS2) (Bugge, Antalis, et Wu 2009). La sous-unité S1 se lie aux
récepteurs ACE-2, tandis que la sous-unité S2 subit un changement de conformation
conduisant à la fusion de la membranes cellulaire de l’hôte et l’enveloppe virale et à la
libération de la nucléopside dans le cytoplasme (F. Li 2016) (Figure1.10).

13
Chapitre 1. Revue de la littérature

Le clivage protéolytique se fait également avec l’aide de la cathepsine L qui négocie la fusion
membrane de l’hôte et le virus dans le compartiment endosomal (l’augmentation d’afflux de
proton H+ dans l’endosome active la cathepsine L qui active la protéine virale S et facilite la
fusion)(Hu et al. 2021).

1.2.5.2. Réplication du virion

Une fois libéré dans le cytosol, la réplication du génome du SARS-COV-2 commence par la
transcription des ORF1a et ORF1b en polyprotéines pp1a et pp1b, respectivement. L’ORF1b
est traduit en aval par un mécanisme de déphasage ribosomique où un ribosome de
traduction déplace un nucléotide dans la direction −1, du cadre de lecture ORF1a au cadre
de lecture ORF1b. Ceux-ci forment l’ARN polymérase ARN-dépendante (nsp12 dérivé
d’ORF1b).
Le brin positif d’ARN sera transcrit en brin ARN négatif et ARNm sous-génomique. Le
premier sera alors synthétisé en plusieurs copies d’ARN génomique et le second sera requis
pour exprimer les gènes de protéines structurelles, non-structurelles et accessoires (Siu et
al. 2008). Certaines recherches suggèrent que ce processus se produit avec la participation
de ribonucléoprotéides nucléaire hétérologue (ARNn) et des protéines de liaison aux ARN
telles que m-aconitase (Fung et Liu 2019) (Figure1.10).

1.2.5.3. Assemblage et sortie du virion

Une fois les copies du génome d’ARN sont transcrites et les protéines d’accessoire et
structurelles sont formées, l’assemblage s’ensuit très rapidement. Les protéines structurelles
virales S, E et M sont traduites et insérées dans le réticulum endoplasmique (RE). Ces
protéines se déplacent le long de la voie sécrétoire dans le compartiment intermédiaire
réticulum endoplasmique - Golgi (ERGIC) (Maier, Bickerton, et Britton 2015) (Figure1.10).
L’ARN du génome se complexe avec la protéine N par bourgeonnement de la membrane de
l’ERGIC contenant des protéines structurelles virale et forme le virions mature (Cao et Li
2020, 19). La protéine M dirige la plupart des interactions protéine-protéine nécessaires à
l’assemblage des coronavirus. Elle sélectionne et organise les composants de l’enveloppe
virale sur les sites d’assemblage et conspire les interactions avec la nucléopside pour
permettre le bourgeonnement des virions (figure1.10). La protéine M interagit également
avec différentes protéines structurelles virales, telles que la protéine E, pour s’attrouper en
un virus mature, générant ainsi l’échafaudage de l’enveloppe virion et incite le
bourgeonnement et la libération de la membrane commutée par la protéine M. L’interaction
avec la protéine S pour assembler les pointes dans l’enveloppe virale (Siu et al. 2008).
Plusieurs facteurs de l’hôte sont impliqués dans l’assemblage et la libération du coronavirus.

14
Chapitre 1. Revue de la littérature

Essentiellement , les interactions entre le cytosquelette et les protéines structurelles ,telles

que la tubuline et la protéine S ; ou encore la filamine A , la protéine M et la β-actine et la
protéine N la vimentine (une protéine filamenteuse intermédiaire). Après assemble et
bourgeonnement le virus et libéré par exocytose (Fung et Liu 2019) .

Figure 1.10. Cycle virale du Sars-Cov-2 (Chilamakuri et Agarwal 2021).

1.2.6. Sars-Cov-2 et système immunitaire

Les réponses immunitaires normales contre la majorité des virus impliquent une phase
médiée par des composants d’immunité innés et si nécessaire une phase d’immunité
adaptative retardée (Tseng et al. 2005). La réponse immunitaire de l'hôte efficace contre le
Covid-19 est essentielle pour contrôler et éliminer l'infection. Plusieurs études ont montré
que la Covid-19 dérègle les réponses immunitaires normales et entraînent des réponses
inflammatoires incontrôlées chez les patients sévères et critiques atteints de COVID-19
(Brodin 2021).
1.2.6.1. Réponse immunitaire innée antivirale
Les déterminants de la réponse immunitaire immédiate au Covid19 ne sont pas encore
connus, mais peuvent être extrapolés à partir des modèles d’infection virale. Les infections à
Sars-Cov-2 sont détectées grâce aux motifs de reconnaissances des pathogène PRR liant
un ARN Toll-like receptors 7 (TLR-7), TLR-3, RIG-1 et MDA-5 ou les molécules de surface
TLR-2 et TLR-4 (figure1.11). Ces récepteurs activent les adaptateurs TRIF(TIR domain-
containing adaptor inducing IFN) et MyD88 (Myeloid Differentiation primary-response gene
88) pour les TLR et la voie MAVS et TBK1 sont activées par RIG-1 et MDA5 en commençant
par la voie de production des interférons (Finlay et McFadden 2006). L'activation d'IRF3,
d'IRF7, AP1, NFκB entraîne leur translocation nucléaire et l'activation transcriptionnelle de

15
Chapitre 1. Revue de la littérature

gènes immunitaires notamment les cytokines inflammatoires TNF-α, IL-1, IL-6 et les
chimokines entraînant une hyperperméabilité capillaire et l’attraction de cellules
inflammatoires et l'IFN (Figure1.11). Ensuite, la transition vers la signalisation IFN-I
commençant par la liaison IFN-I à IFNAR pour initier la signalisation JAK/STAT et la
formation du complexe ISGF3 STAT1/STAT2/IRF9, qui se translocation dans le noyau pour
activer la transcription ISRE (Figure1.6) (de Veer et al. 2001). La voie des interférons de type
I est centrale dans la réponse antivirale initiale, et permet notamment d’inhiber la réplication
virale, de protéger les cellules non-infectées et de stimuler l’immunité lymphocytaire
antivirale (lymphocytes T CD8, NK) conduisant à la lyse des cellules infectées.
Les antigènes viraux sont internalisés par les cellules présentatrices d’antigène, apprêtés
puis présentés via les complexes majeurs d’histocompatibilité de type 1 (pour l’ARN viral) et
de type 2 (pour les protéines de surface) aux lymphocytes T CD4, CD8 et lymphocytes B,
polarisés par la sécrétion cytokinique initiale, assurant l’instauration d’une immunité durable
(Pedersen et Ho 2020) .

La signalisation d’IFN-I dans l’infection Covid-19 semble être dérégulée à la baisse par de
nombreux mécanismes d’échappements du virus (figure1.11).

16
Chapitre 1. Revue de la littérature

Figure 1.11.Réponse immunitaire innée et antagonisme de la voie IFN dans la COVID-

19 (Lowery, Sariol, et Perlman 2021). La reconnaissance du Sars -coV-2se fait par les PRR tels que
TLR3, TLR7, RIG-I et MDA5. Ces PRR activent les adaptateurs TRIF et MyD88 en aval des TLR, et MAVS et
TBK1 en aval de RIG-I et MDA5 en commençant par la voie de production d'interféron. Activation d'IRF3, d'IRF7
ou de NFκB entraînant leur translocation vers le noyau et l'activation transcriptionnelle de gènes immunitaires, en
particulier les cytokines inflammatoires et l'IFN. La ligne pointillée représente la transition vers la signalisation IFN
commençant par la liaison IFN-I à IFNAR pour initier la signalisation JAK/STAT et la formation du complexe
ISGF3 STAT1/STAT2/IRF9, qui se translocation dans le noyau pour activer la transcription ISRE. Les protéines
codées par le SRAS-CoV-2 (rouge) inhibent de multiples aspects de ces voies, entraînant une diminution de l'IFN
et une altération de l'expression des cytokines pro-inflammatoires. De nombreux antagonistes de l'IFN du SRAS-
CoV-2 ont été identifiés par des tests de surexpression in vitro, et donc attendre la confirmation in vivo de leur
rôle dans la réplication et la pathogenèse du virus (noir).

1.2.6.2. La tempête cytokinique due à Sars-CoV-2

En plus des IFNs, plusieurs autres cytokines et chimiokines sont produites lors de l'activation
de cascades de signalisation, telles que la voie NF-kB. De plus, la formation de
l’inflammasome par activation du domaine pyrine du récepteur de type NOD contenant 3
(NLRP3), permet le clivage et l'activation de cytokines telles que l'IL-1β et l'IL-18 et bien
d’autres médiateurs. En raison de la variabilité du profile inflammatoire d’un patient à un
autre un ensemble exacte n’a pas pu être établi vue la progression clinique de la maladie.
Un phénotype général d'IL-6, IL-8, IL- 10, et du TNF, ainsi qu'un mélange de chimiokines

17
Chapitre 1. Revue de la littérature

élevées, dont CCL4,CCLCCL2, CCL3 et CXCL8, ont été observés (Lowery, Sariol, et
Perlman 2021).

1.2.6.3. Le rôle des monocytes dans la réponse immunitaire du Sars-Cov-2

Les analyses par cytométrie de flux des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)
de patients symptomatiques COVID-19, indiquent que les sous-ensembles de monocytes
seraient à l’origine de cette tempête cytokinique (Martinez et al. 2020) ainsi qu’a une grande
production du NO (Akaberi et al. 2020). Des différences transcriptionnelle entre les sous-
types de monocytes ont été détectées sur la base d'une comparaison de l'expression
génique aux stades sévère et en rémission et des comparaisons respectives avec des
individus témoins sains. Un grand nombre de gènes exprimés ayant des fonctions liées à
l'inflammation ont été observés chez les monocytes tels que TNF, IL10, CCL3 et IL6; gènes
de chimiokine liés à l’inflammation CCL4, CCL20 , CCL2, CCL3, CCL4, CXCL8 , CXCL9
(Guo et al. 2020).

La même étude à montré que les monocytes interagissent avec les cellules CD4 + T et les
cellules B plasmatiques dans les cas graves (figure1.12) (Vabret et al. 2020). Au stage
sévère les monocytes présentaient une expression élevée de cytokine et leurs récepteurs
qui peuvent contribuer à un large spectre d'interactions des cellules immunitaires, telles que
le IL-6/IL-6R et le TNF-α et ses récepteurs, à travers lesquels les monocytes peuvent
interagir avec CD4 + T, CD8 +Cellules T et B (Guo et al. 2020). De même, les monocytes
avaient des niveaux élevés d'IL-1β et de son récepteur, suggérant l'interaction fonctionnelle
potentielle de ces monocytes avec les cellules CD8 + T (Ong et al. 2020). Au même stade
une augmentation de monocytes classiques à été constaté avec un pourcentage de 98%
alors qu’elle n'était que de 12,1 % au stade de rémission et de 0 % chez les témoins
sains accompagner d’un enrichissement des chimiokines telles que CCL4L2, CCL3 et CCL4
et leurs récepteurs respectifs (Chevrier et al. 2021).

18
Chapitre 1. Revue de la littérature

Figure 1.12. Illustration récapitulative des interactions cytokines/récepteurs

potentielles entre les monocytes et d'autres types de cellules immunitaires
périphériques aux stades sévères et en rémission et chez des individus témoins
sains(Guo et al. 2020).

19
Chapitre 1. Revue de la littérature

Problématique

Le SARS-CoV-2 est un virus à ARN, enveloppé, pathogène, transmissible, capable de

provoquer des maladies qui vont de l'asymptomatique à la sévère avec des signes
respiratoires, entériques, hépatiques et neurologiques. Ce virus peut infecter les cellules de
l’immunité innée, y compris les monocytes, qui exercent plusieurs fonctions effectrices,
notamment l’activité pro-inflammatoire, le remodelage tissulaire, la présentation d'antigène,
et des même des capacités anti-inflammatoires. Le monoxyde d’azote est molécule sécrété
par le monocyte et qui joue un rôle essentiel lors de divers processus immunitaire
notamment la phagocytose. La détermination de son taux pourrait être considérée comme
un marqueur d’évaluation lors d’une infection par SARS-CoV2.

Objectif

L’objectif de cette étude est d’évaluer le taux du NO des monocytes infectés par SARS-CoV-
2.

But

Est de montrer que les monocytes sécrètent le NO suite à une infection au SARS-CoV-2.

20
Chapitre 2. Matériels et méthodes

Chapitre 2. Matériel et méthodes

2.1 Déclaration d’éthique

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique local de l'Université de Tlemcen. Les
donneurs sains volontaires ont fourni leur consentement éclairé conformément à la
Déclaration d'Helsinki.

2.2 Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

Les échantillons de sang ont été dilués au 1:1 avec du PBS et déposés sur l'Histopaque
1077 et centrifugés à 400 x g pendant 30 minutes. La bande d'interface contenant les
PBMCs a été soigneusement récoltée, lavée deux fois avec du PBS. Les culots cellulaires
ont été mis en suspension dans 1 mL de RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FCS et 50
μg/mL de gentamicine pour le comptage cellulaire (figure2.1). La viabilité cellulaire a été
réalisée par TBET en utilisant la microscopie photonique.

Figure 2.1. Isolement des PBMC.

2.3 Isolement des monocytes Mos

Les MOs ont été isolées à partir des PBMCs sur la base d'une adhérence plastique
différentielle (Wahl et al. 2005). En résumé les PBMC ont été cultivées dans du RPMI-1640
complété par 10 % de FCS et 50μg/mL de gentamicine, et ensemencées à 2x10⁶ cellules/mL
dans des plaques à 24 puits. On a laissé les cellules adhérer pendant 2 h à 37˚C avant
l'élimination des cellules non adhérentes et le traitement des MOs adhérentes avec MET (L.
Zhou et al. 2012). Le comptage et la viabilité cellulaire ont été réalisés par le test d'exclusion
au bleu trypan (figure2.2).

22
Chapitre 2. Matériels et méthodes

Figure 2.2. Isolement des Mos.

2.4. Dosage du monoxyde d’azote NO par la méthode de Griess

2.4.1. Principe

Pour déterminer la concentration de NO sérique, il faut d’abord mesurer le taux des nitrates
et nitrites (NOx), considérés comme produits dérivés de NO et marqueurs indirects de sa
formation in vivo. Le sérum collecté est en premier lieu déprotéinisé par une solution saline
de TCA. Le surnageant ainsi récupéré est additionné à du Vanadium III chloride qui a pour
rôle la réduction du nitrate en nitrite (figure2.3).

Figure 2.3. Réaction de transformation du nitrate en nitrite

Cette étape est suivie par l’ajout du réactif de Griess qui absorbe le NO2 en formant une
coloration diazoïque rose. L’absorbance est ensuite mesurée à 520nm et les concentrations
de NOx sont déterminées à partir d’une courbe d’étalonnage établie à l’aide du nitrate
sodique NaNO3.

2.4.2. Technique

1. Déprotéiniser le sérum par addition de 99µL de TCA (5%) à 11µL de sérum. Vortexer, puis
centrifuger (1000xg/10min).

2. Dans un tube Eppendorf, mettre 100µl du surnageant récupéré de l’étape précédente et

100µl de Vanadium III chloride (8mg/ml).

3. Ajouter 50µL du réactif de Griess. Une couleur rose est ainsi formée.
23
Chapitre 2. Matériels et méthodes

4. Incuber à 37°C durant 30min.

5. Lire la densité optique à une longueur d’onde de 520nm.

6. Les concentrations du NOx dans les échantillons de sérums sont ensuite déterminées à
partir d’une courbe d’étalonnage établie par 0-150 µmol/L de nitrate sodique NaNO3

24
Chapitre 3. Résultats

Chapitre 3. Résultats

22
Chapitre 4. Discussion

Chapitre 4. Discussion

25
Chapitre 5. Conclusions et perspectives

Chapitre 5. Conclusions et perspectives

La pandémie de COVID-19 est considérée comme la crise sanitaire mondiale la plus grave
depuis la grippe espagnole de 1918 et probablement la crise mondiale la plus importante
depuis la fin de la Seconde Guerre mondiale. Cette situation sanitaire qui est très difficile
impose une mobilisation rapide non seulement des autorités sanitaires et de la communauté
médicale, mais aussi de toute la force de la communauté des chercheurs afin d’identifier les
meilleures méthodes pour diagnostic, prévention et traitement des patients.

Les monocytes sont les cellules de l’immunité innée qui jouent un rôle crucial dans la lutte
contre les infections, notamment contre ce nouveau virus.

L’objectif de cette étude est d’évaluer le taux du NO monocytaires lors de l’infection à SARS-
CoV2.

Nos travaux sont encore en cours de réalisations, en éspérant avoir des résultats qui vont
permettre de résultats qui pourront nous aider à mieux comprendre cette immunité et
contribuer à réduire la propagation de l'infection de cette pandémie.

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