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UNIVERSITE DE KINSHASA
FACULTE DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES
Laboratoire de Chimie Analytique Pharmaceutique

COURS DE TOXICOLOGIE ANALYTIQUE

destiné aux étudiants de
2è Doctorat Sciences Biomédicales
1ère Pharmacie Sciences Pharmaceutiques

Professeur Patient CIZA HAMULI, UNIKIN, UOM

Aout 2023

I. NOTIONS GÉNÉRALES EN TOXICOLOGIE

«Tout est poison, rien n'est poison, c’est la dose qui fait le poison». Paracelse

1.1 Généralités
La toxicologie est depuis longtemps reconnue comme étant la science des poisons.
Elle étudie les effets nocifs des substances chimiques sur les organismes vivants.
Elle fait appel à une multitude de connaissances scientifiques :
Biologiques : Pour mettre en évidence les désordres et les modifications de
chimisme de l’organisme.
Pharmacodynamiques : pour expliquer les processus intimes des modes d’action
des différents toxiques.
Chimiques analytiques et physiques : pour la mise en évidence des toxiques.

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I. NOTIONS GÉNÉRALES EN TOXICOLOGIE

«Tout est poison, rien n'est poison, c’est la dose qui fait le poison». Paracelse

1.1. Généralités
La toxicologie est depuis longtemps reconnue comme étant la science des poisons.
Elle étudie les effets nocifs des substances chimiques sur les organismes vivants.
Elle fait appel à une multitude de connaissances scientifiques :
Biologiques : Pour mettre en évidence les désordres et les modifications de
chimisme de l’organisme.
Pharmacodynamiques : pour expliquer les processus intimes des modes d’action
des différents toxiques.
Chimiques analytiques et physiques : pour la mise en évidence des toxiques.

Facteurs influençant la santé

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L’exposition est nécessaire mais pas suffisante.

- Si la concentration est suffisante, l’absorption peut
avoir lieu
- Il est aussi nécessaire que la quantité qui se
retrouve dans l’organisme soit importante pour qu’il
y’ait effet toxique
- Bien d’autres facteurs interviennent dans
l’apparition de cet effet toxique notamment la
biotransformation et les facteurs de traversée de
membranes biologiques sur lesquels nous
reviendrons plus tard.

Un produit qui pénètre dans l'organisme peut avoir des effets bénéfiques
(médicaments) ou néfastes (toxiques).

Inversement, l'organisme peut agir sur ce produit : c'est ce qu'on appelle le

métabolisme.
La réponse de l'organisme à un toxique dépend, entre autres, de la quantité du
produit présent dans un tissu ou un organe.
Plusieurs facteurs interviennent dans les processus d'action toxique, notamment les
phases toxicodynamiques et toxicocinétiques.

La toxicodynamie s'intéresse à l' influence qu'exerce un toxique sur l'organisme et

aux facteurs qui interviennent dans la réponse toxique.
La toxicocinétique s'intéresse à l' influence qu'exerce l'organisme sur un toxique.
Cette influence découle des processus (l'absorption, la distribution, le métabolisme,
l'élimination) qui gouvernent le cheminement du toxique dans l'organisme.

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L'entrée (ou l'absorption)

On appelle absorption le processus de pénétration d'un produit dans l'organisme. Il
s'agit d'une étape importante, car, tant qu'il n'a pas pénétré dans la circulation
sanguine, un produit ne peut causer d'action toxique systémique, c'est-à-dire à des
endroits éloignés du point de contact initial.

Divers facteurs peuvent influencer le processus d'absorption d'un produit : sa nature,

sa solubilité, la perméabilité des tissus biologiques au point de contact, la durée et la
fréquence de l'exposition, etc.

Le transport et la distribution (ou la répartition)

Après avoir atteint la circulation sanguine, le produit peut être transporté dans tout
l'organisme. C'est ce qu'on appelle la distribution.

En plus de l'oxygène, de divers éléments nutritifs essentiels au fonctionnement de

l'organisme et des déchets, le sang transporte aussi des toxiques. Ceux-ci peuvent
alors entrer en contact avec des cellules et se fixer dans certains tissus.

La nature, l'intensité et la localisation de ces perturbations dans l'organisme diffèrent

d'un produit à l'autre et dépendent souvent de la dose.

La biotransformation (ou le métabolisme)

Pendant ou après son transport dans le sang, le toxique peut entrer en contact avec
différentes cellules de l'organisme qui ont la capacité de le transformer.

L'ensemble des réactions de la transformation métabolique est appelée

biotransformation, tandis que les produits de la biotransformation sont appelés
métabolites. Il peut en résulter un produit moins toxique (détoxification) ou plus
toxique (activation), l'accumulation ou l'élimination du produit et de ses métabolites.

La transformation des toxiques est surtout effectuée par le foie, véritable laboratoire
chimique de l'organisme, qui contient une multitude d'enzymes (substance protéique
qui catalyse une réaction chimique dans l'organisme). Il enrichit le sang d'éléments
nutritifs et le purifie en concentrant et en éliminant beaucoup de substances. D'autres
organes tels que les poumons et les reins peuvent aussi transformer des toxiques.

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L'excrétion
Ce processus consiste à rejeter le produit inchangé ou ses métabolites à l'extérieur
de l'organisme. L'excrétion peut se faire par voie rénale (l'urine), gastro-intestinale
(les selles), pulmonaire (l'air expiré), cutanée (la sueur) ou lactée (le lait).

Par exemple, le sang transporte de nombreux produits vers les reins, dont plusieurs
déchets provenant du métabolisme.

Les reins filtrent le sang, remplissant ainsi une fonction essentielle au maintien de
l'équilibre des éléments sanguins et assurent l'élimination de nombreux produits.

1.2. Historique
La toxicologie est une science aussi austère que passionnante ; En effet la
connaissance des poisons est très ancienne car il semble que les premiers toxiques
utilisés aient servi à empoisonner des flèches destinées à la chasse ou à la guerre.

Le terme de toxique dérive d'ailleurs du mot grec « toxon,» qui signifie arc et
«logos» discours
Autrefois l’administration des remèdes était donnée par voie buccale et le mot «Poto
»veut dire boire va être transformé en potion ou remède et plus tard sera changé en
poison.
La toxicologie a eu des débuts, dans la plus haute antiquité. En effet les poisons
organiques, puis les poisons minéraux, ont été connus et employés par les
Egyptiens, les Grecs, les Romains et les Barbares.

L’emploi de ces poisons à des fins criminelles se poursuivra au cours du moyen âge
et de la renaissance, ce n’est qu’au début du XVIIIème siècle et notamment au
XIXème siècle que la toxicologie devient réellement une discipline scientifique.

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1.3. Définitions
Toxicologie
C’est ensemble des connaissances concernant les poisons, leurs effets sur
l'organisme, les moyens de les déceler et les procédés thérapeutiques destinés à les
combattre.
Poison
Toute substance qui est susceptible, après introduction dans l'organisme et selon la
dose, le mode de pénétration, l'état du sujet, de perturber certaines fonctions vitales,
de léser gravement des structures organiques ou d'entraîner la mort.

Toxique
Produit d’origine animale végétale ou minérale qui provoque l’intoxication, la
destruction d’un organisme vivant.
Xénobiotique
Toute substance étrangère au consommateur qui peut causer des troubles plus ou
moins importants. Ce sont par exemple des polluants, des contaminants et des
résidus de produits agrochimiques et vétérinaires.

Empoisonnement
Troubles occasionnés par les poisons lorsque ceux-ci sont administrés dans un but
de nuire

Toxémie
Troubles dus à la production des toxines, c'est à dire des substances toxiques
produites par des bactéries ou des parasites et véhiculées par le sang.

Toxine
Substance toxique élaborée par un organisme vivant auquel elle confère son pouvoir
pathogène.

intoxication
est l’effet nocif qui intervient lorsque l’on avale ou inhale une substance toxique, ou
lorsque cette dernière entre en contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses,
telles que la bouche ou le nez.

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Intoxication accidentelle
L’intoxication est la cause la plus fréquente d’accidents domestiques non mortels.
Les jeunes enfants sont particulièrement exposés à l’intoxication accidentelle à
domicile du fait de leur curiosité et de leurs explorations, de même que les
personnes âgées, qui confondent souvent les médicaments à prendre.

Intoxication intentionnelle
L’intoxication peut être intentionnelle, dans le cas d’homicide ou de suicide. La
plupart des adultes qui tentent de se suicider en s’empoisonnant utilisent plusieurs
médicaments associés à de l’alcool.

L'intoxination désigne un état pathologique résultant de l'accumulation excessive

de substances toxiques dans le corps. Ces toxines peuvent provenir de sources
externes, comme la pollution ou des produits chimiques, ou internes, comme les
déchets métaboliques.

1.4. Empoisonnement et toxique

Le terme empoisonnement désigne les troubles occasionnés par les poisons lorsque
ceux-ci sont administrés dans un but de nuire (acte de malveillance).

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1.5. Classification des toxiques

Parmi les nombreuses classifications proposées, les plus importantes sont celles qui
se basent sur : la nature chimique du composé, le mécanisme d'action toxique,
l’usage ou enfin la nature du danger.

 Selon la nature chimique

On distingue :
 Les toxiques gazeux : Oxyde de carbone,ammoniac, anhydride sulfureux.
 Les toxiques minéraux : Métalloïdes (arsenic, phosphore), métaux (mercure,
plomb, cadmium).
 Les toxiques organiques : Alcools, phénols, composés hétérocycliques,
alcaloïdes, hétérosides.

 Selon le mécanisme d’action toxique

Le mécanisme d'action de tous les toxiques n'est malheureusement pas connu. Les
mécanismes d'action suivants sont intéressants à considérer.

 Toxiques caustiques
Les acides et les bases concentrés, les phénols, les halogènes, certains sels de
métaux lourds dénaturent les protéines et causent des dommages irréversibles à
toutes les cellules avec lesquelles ils sont en contact.

Ils entraînent des brûlures chimiques, très voisines des brûlures thermiques.
La peau et les muqueuses sont les tissus les plus exposés.
Les dérivés minéraux de l’arsenic, surtout les dérivés trivalents (arsénites) exercent
une action caustique nécrotique sur les muqueuses digestives, entrainant des
lésions d’ulcération et de nécrose au niveau l’estomac et de l’intestin.
Le plomb après ingestion unique de quantités élevées, entraine une action caustique
sur le tube digestif.
A doses plus faibles et répétées, il entraine une atteinte des tubes proximaux rénaux.

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 Toxiques thioloprives
Ces toxiques (As, Pb, Hg) se fixent sur les groupements thiols - SH des acides
aminés soufrés ou des enzymes, inhibant ainsi leurs activités.
Cette inhibition enzymatique peut être levée par administration de composés riches
en groupements - SH (dimercaprol, D pénicillamine) pour lesquels ces métaux
présentent une plus grande affinité (chélateurs).
Le complexe ainsi formé est hydrosoluble et donc facilement éliminable par le rein.

 Toxiques méthémoglobinisants
Nitrates et nitrites, chlorates, paracétamol chez le chat. Ils oxydent le fer ferreux
(Fe++) de l'hémoglobine en fer ferrique (Fe+++), inapte au transport de l'oxygène,
entraînent la mort par anoxie cellulaire.

 Toxiques convulsivants
C'est le cas de la strychnine, du métaldéhyde, de la crimidine.

 Toxiques anti-cholinestérasiques
Les insecticides organophosphorés et les carbamates ont une grande affinité pour
les cholinestérases et entrent en compétition avec l'acétylcholine qui est leur substrat
naturel.
Les organophosphorés sont hydrolysés : mais une partie de leur molécule reste fixée
sur les cholinestérases qui sont ainsi progressivement inhibées.

L'acétylcholine n'est plus détruite immédiatement après la libération dans le système

nerveux s'accumule dans l'organisme provoquant des manifestations toxiques.

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 Toxiques provoquant des biosynthèses anormales

Le plomb agit sur la biosynthèse de l'hème, à partir du succinyl coenzyme A. Le
plomb perturbe la biosynthèse des porphyrines en s'opposant à la condensation de
deux molécules d'acide delta amino-lévulinique pour former le porphobilinogène, puis
en ralentissant la transformation des coproporphyrines en protoporphyrines et des
protoporphyrines en hème.

 En fonction de leur usage

On distingue les intoxications provoquées par les insecticides, les herbicides, les
fongicides et les raticides (rodenticides).

En fonction de la nature du danger

En fonction de divers critères (propriétés physiques et chimiques, nature et intensité
des effets toxiques, conditions d'exposition).

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1.6. Relation dose- effet

 Sur plan individuel: méfaits augmentent avec dose
 Sur plan communautaire: nombre individus atteints augmente avec dose
 Si dose faible, effet réversible. Si dose importante, effet plus grave voire décès

 NOEL: seuil d’activité; la dose la plus élevée d’une substance qui ne provoque pas
de modifications distinctes de celles observées chez les animaux témoins
(contrôle).

 NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect Level) est la dose la plus élevée d’une

substance pour laquelle aucun effet toxique (adverse) n’est observé.

 LOEL (Lowest-Observed-Effect Level) est la plus faible dose d’une substance qui
provoque des modifications distinctes de celles observées chez des animaux
témoins (contrôle).

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1.7. Prélèvements toxicologiques

 Prélèvements Sur le Vivant

• Contenu stomacal: 250 ml
• Sang veineux: 15 à 20 ml
• Urines: 300 ml

Toxicologie d’urgence
- Course contre la montre pour sauver le patient.
- Contenu stomacal : 1er siphonage du lavage gastrique
- Sang veineux: sang total collecté sur anticoagulant

 Prélèvements post-mortem  Prélèvements après Exhumation

• Estomac et son contenu • Si corps entier, procéder comme
• Foie et vésicule biliaire pour Post Mortem
• Reins • Si décomposition, puiser magma au
• Sang de cavité cardiaque niveau abdominal et prendre la
• Cerveau terre sous le cercueil.
• Phanères
• Vessie ligaturée + urines

Toxicologie medico-legale
• Réquisition du Parquet
• Médecin légiste ou Equivalent
• Foie: prélèvement capital
• Phanères: pour métaux lourds
• Pas fermer hermétiquement (laisser échapper gaz)

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 Informations pouvant être obtenues à partir d’une analyse toxicologique en fonction de

l’échantillon

 Le sang représente probablement l’échantillon de référence en toxicologie

forensique, car il permet d’obtenir la meilleure corrélation entre les
concentrations mesurées et les effets pharmacologiques au moment du
prélèvement.
 Les substances et leurs métabolites étant concentrés dans l’urine, cet
échantillon constitue un élément complémentaire très utile et nécessaire pour
les analyses de dépistage et de screening.

 D’autres échantillons peuvent être très utiles au toxicologue, en particulier en

cas d’absence d’urine et de sang. Ainsi, dans les cas post mortem, la
détermination de l’éthanol dans le muscle squelettique donne une bonne
évaluation de l’éthanolémie en l’absence de sang.

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1.8. Notions de Toxicité

1.8.1. Types de toxicité

 Toxicité aiguë: méfaits d’une dose administrée une seule fois

 Toxicité a court terme: méfaits dose plus faible administrée pdt un certain
temps.
 Toxicité chronique: méfaits dose encore plus faible administrée tte la vie et
même à la descendance
 Effet mutagène: initiation mutations génétiques
 Cancérogénèse: initiation cancers
 Effet tératogène: méfaits toxiques sur fœtus.

Evaluation toxicité
- toxicité aiguë: dl 50
- toxicité à court terme: dose répétée pdt 10 % de la durée de vie de l’animal
- toxicité chronique: dose répétée toute la vie de l’animal et sur sa descendance.
- Effet mutagène: test de Ames.

Dose létale 50 (dl 50)

- deux espèces d’animaux au moins
- pour chaque espèce, meme portée, âge , sexe
- acclimatation au moins une semaine
- mise à jeun la veille
- répartition, identification et pesée souris
- administration dose par gavage
- essai d’orientation puis proprement dit
- suivi souris pendant 15 jours: poids et comportement
- évaluation dl50 par graphique ou autre

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Le test d'Ames est un test biologique permettant de déterminer le potentiel

mutagène d'un composé chimique.

• Le principe de ce test repose sur

différentes souches bactériennes de
Salmonella typhimurium portant des
mutations dans les gènes nécessaires à
la synthèse de l'histidine
• Le test permet donc d'évaluer la facilité
que possède une substance à induire
une réversion de la souche auxotrophe
• Dans le cas d'une substance mutagène,
on observe ainsi l'apparition de souche
prototrophes, ne nécessitant plus
d'histidine pour croître mais d'un milieu
minimum seulement.

Toxicité orale aiguë : Détermination de la dl50

Le concept DL50 ( dose de substance causant la mort d’une population animale

donnée dans des conditions d’expérimentation précises) a été inventé par J.W.
Trevan en 1927.

• La DL50 est souvent exprimée pour une

ingestion orale chez le rat.
• Finney(1947;1950;1953) a démontré que la
mortalité suivait fréquemment une relation
sigmoïdale en fonction des doses et a établit
une abaque destinée à transformer la sigmoïde
en une droite, de manière à en déduire la valeur
de la DL50 par interpolation.
Il a utilisé la fonction de distribution normale.

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On administre généralement le produit à des rats ou à des souris répartis en

plusieurs groupes, et ce, à des doses croissantes suffisantes pour obtenir un
pourcentage de mortalité s’échelonnant entre 0 % et 100 %

• La transformation des taux de mortalités conduit à des nouvelles valeurs = « Probits

», du fait du caractère probabiliste de la fonction de répartition qui lui sert de
référence de transformation.

•Miller et Tainter,1944 ont mis à la disposition des toxicologues des abaques sur
papier
• Berkson,1944: la transformation empirique des courbes de mortalités en droites au
moyen de fonctions logistiques, donnant lieu à la transformation dite en « logits ».
• Litchfield et Wilcoxon, 1949 ont fait usage des tables à la place des « papiers
probits ».

• L’OCDE(Organisation de Coopération et de Développement Economique) a fait de

la DL50 un test officiel (ligne directrice pour les essais 401) en 1981 et abrogée le
17/12/2002.
• En 1987, l’OCDE réduit de 20 au lieu de 30 le nombre minimal d’animaux que doit
contenir l’échantillon testé.
• En 2001, elle a approuvé des nouvelles lignes directrices qui, non seulement
utilisent moins d’animaux mais aussi, allègent la souffrance animale:
Ligne directrice 420 (Méthode de la dose prédéterminée: un total de 5 animaux
à chaque niveau de dose)
Ligne directrice 423 ( Méthode par classe de toxicité aigue: un total de 3
animaux à chaque niveau de dose)

• En Octobre 2008 sera adopté la ligne directrice 425 (Méthode de l’ajustement des
doses) qui permet d’estimer la DL50 avec un intervalle de confiance.( 5 animaux au
maximum et les calculs se font animal-par-animal par ordinateur avec des logiciels
appropriés.

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Toxicité orale aiguë: Méthode de l'ajustement des doses

 Avant de procéder à l'essai, le laboratoire doit rassembler toutes les informations

disponibles sur la substance d'essai, à savoir:
• son identité et sa structure chimiques,
• ses propriétés physico-chimiques,
• les résultats de tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo,
• les données toxicologiques sur des analogues de structure ou des mélanges
semblables,
• les usages prévus de la substance.
 Il ne faut pas administrer les substances d'essai à des doses dont on sait qu'elles
provoquent des douleurs ou souffrances très pénibles en raison de leurs propriétés
corrosives ou très irritantes.
 Un essai limite est parfois nécessaire avant l’essai principal. 3

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Sélection des espèces animales

•Le rongeur préféré est le rat, mais d'autres espèces de rongeurs peuvent être
utilisées.
•L'essai se pratique normalement sur des rats femelles car elles sont généralement
un peu plus sensibles.
•On emploie de jeunes adultes sains appartenant à des souches couramment
utilisées en laboratoire.
• Les femelles doivent être nullipares et non gravides.
• Au début du traitement, chaque animal est âgé de 8 à 12 semaines et son poids est
compris dans un intervalle de ± 20% du poids initial moyen des animaux
éventuellement traités avant lui.

Conditions d'hébergement et d'alimentation

• La température du local expérimental est maintenue à 22 °C (± 3 °C).

• Taux d'humidité relative devrait se situer entre 50 et 60%, mais il doit atteindre au
moins 30% et, de préférence, ne pas dépasser 70%, sauf pendant le nettoyage du
local.
• Disposer d’un éclairage artificiel faisant alterner des séquences de 12 heures de
lumière et de 12 heures d'obscurité.
• Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles.
•Nourriture: préparations classiques pour rongeurs de laboratoire et de l'eau potable
en quantité disponible.

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Préparation des animaux

•Marquer les individuellement à dessein d’identification et les garder dans les cages
au moins cinq jours avant l'administration de la substance, afin qu'ils s'acclimatent
aux conditions du laboratoire.

Préparation des doses

•Administrer les substances d'essai dans un volume constant pour toute la gamme
des doses à tester, en variant la concentration de la préparation administrée.
•Le volume maximal de liquide administrable en une fois dépend de la taille de
l'animal d'expérience.
•Chez les rongeurs, le volume ne dépasse normalement pas 1 ml/100 g de poids
corporel ; cependant, pour les solutions aqueuses, un volume de 2 ml/100 g de poids
corporel est envisageable.

Préparation des doses

•Si le véhicule n'est pas aqueux, il faut connaître ses caractéristiques toxicologiques.
•Les doses doivent être préparées peu de temps avant l'administration, à moins que
la stabilité de la préparation, sur la période précédant son utilisation, soit connue et
acceptable.

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Administration des doses

 Administrer la substance d'essai par gavage en une seule dose à l'aide d'une
sonde gastrique ou d'une canule d’intubation appropriée.
 Dans les rares cas où il est impossible d'administrer la dose en une seule fois,
celle-ci peut être fractionnée et administrée sur une période ne dépassant pas 24
heures.
 Les animaux doivent être à jeun avant l'administration de la substance :
• pour les rats, on supprime la nourriture, mais pas l'eau, à partir de la veille du
jour de l'administration
• pour les souris, on supprime la nourriture, mais pas l'eau, 3 à 4 heures avant
l'administration.
 Après cette période de jeûne, les animaux sont pesés, puis la substance leur est
administrée.

Administration des doses

 La dose est calculée en fonction du poids corporel à jeun de chaque animal.

 Après l'administration de la substance, les animaux peuvent continuer à être privés
de nourriture:
• durant 3 à 4 heures pour les rats
• 1 à 2 heures pour les souris.
 Si la dose est administrée par fractions sur un certain laps de temps, il peut
s'avérer nécessaire, selon la durée du traitement, d'alimenter les animaux et de
leur donner à boire.

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Essai limite et essai principal

•L'essai limite est surtout utilisé s'il existe des informations indiquant que la substance
d'essai n'est probablement pas toxique, c'est-à-dire que sa toxicité se manifesterait à
des doses supérieures à la dose limite réglementaire.

•Des informations sur la toxicité de la substance d'essai peuvent être tirées d'essais
déjà pratiqués sur des substances, produits ou mélanges similaires, en tenant
compte de l'identité et du pourcentage des substances dont la toxicité est avérée.

•Si l'on manque d'informations sur la toxicité de la substance d'essai, ou si cette

substance risque d'être toxique, il faut procéder à l'essai proprement dit.

Essai limite/ Essai limite à 2 000 mg/kg

 La dose expérimentale est administrée à un animal:

• S'il meurt, on réalise l'essai principal afin de déterminer la DL50.
• Si l'animal survit, on traite quatre animaux supplémentaires suivant une
séquence, de telle sorte qu’un total de cinq animaux soit testé.
 Cependant, si trois animaux meurent, l'essai limite s'achève et on entame l'essai
principal. La DL50 est supérieure à 2 000 mg/kg si au moins trois animaux
survivent.
 Si un animal meurt de façon inattendue à un moment tardif de l'étude, et si d'autres
survivent, il convient d'arrêter le traitement et d'observer tous les animaux afin de
voir si d'autres animaux vont également mourir au cours d'une période
d’observation similaire.
 Les morts tardives sont comptabilisées de la même façon que les autres morts.
Les résultats sont notés comme suit : O = survie ; X = mort).

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Essai limite/ Essai limite à 2 000 mg/kg

 La DL50 est inférieure à la dose d'essai (2 000 mg/kg) si au moins trois animaux
meurent.
O XO XX
O OX XX
O XX OX
O XX X
 Si un troisième animal meurt, conduire l'essai principal.

 Mettre cinq animaux à l'essai. La DL50 est supérieure à la dose d'essai (2 000
mg/kg) si au moins trois animaux survivent.

Essai limite/ Essai limite à 5 000 mg/kg

•Exceptionnellement, et seulement si cela se justifie par des exigences

réglementaires particulières, l'utilisation d'une dose de 5 000 mg/kg peut être
envisagée.

•En raison des souffrances qu'ils infligent aux animaux, les essais dans la catégorie 5
du SGH (2 000-5 000 mg/kg) sont à éviter et ne doivent être envisagés que s'il est
très probable que les résultats d'un tel essai présentent un intérêt direct pour la
protection de la santé humaine ou animale ou de l'environnement.

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Essai limite/ Essai limite à 5 000 mg/kg

•Administrer la dose d'essai à un animal. S'il meurt, mener l'essai principal afin de
déterminer la DL50.

•Si l'animal survit, traiter deux animaux supplémentaires.

•Si les deux animaux survivent, la DL50 est supérieure à la dose limite et l'essai est
terminé (à l'issue d'une période d'observation de 14 jours au cours de laquelle
aucune dose supplémentaire n'a été administrée).

Essai limite/ Essai limite à 5 000 mg/kg

Si un ou deux animaux meurent, traiter deux autres animaux, un à la fois.

•Si un animal meurt de façon inattendue à un moment tardif de l'étude, et si d'autres

survivent, il convient d'arrêter le traitement et d'observer tous les animaux afin de voir
si d'autres animaux vont également mourir au cours d'une période d’observation
similaire.

•Les morts tardives sont comptabilisées de la même façon que les autres morts. Les
résultats sont notés comme suit : O = survie, X = mort et I = inutile).

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Essai limite/ Essai limite à 5 000 mg/kg

•La DL50 est inférieure à la dose d'essai (5 000 mg/kg) si au moins trois animaux
meurent.
O XO XX
O OX XX
O XX OX
O XX X

La DL50 est supérieure à la dose d'essai (5 000 mg/kg) si au moins trois animaux
survivent.
O OO, O XO XO, O XO O, O OX XO, O OX O, O XX OO,

Essai principal

• Traiter les animaux l'un après l'autre, généralement à des intervalles de 48 heures.
Néanmoins, les intervalles entre l'administration des doses sont dictés par le moment
de l'apparition, la durée et la gravité des effets toxiques.

• Le traitement d'un autre animal à la dose suivante devrait être retardé jusqu'au
moment où la survie du dernier animal traité ne fait plus de doute.

• Choisir la dose initiale à la lumière de toutes les informations disponibles

(notamment des données sur les analogues de structure et les résultats de tous les
autres essais de toxicité déjà pratiqués sur la substance d'essai) permettant d'estimer
la DL50 et la pente de la courbe dose/effet.

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Essai principal

• Le premier animal reçoit une dose immédiatement inférieure à la meilleure

estimation préliminaire de la DL50:
Si l'animal survit, le deuxième animal reçoit une dose plus forte.
Si le premier animal meurt ou paraît moribond, le deuxième animal reçoit une
dose plus faible.

• Le facteur de progression entre les doses doit équivaloir à l'antilogarithme de 1/(la

pente estimée de la courbe dose/effet) et demeurer constant tout au long de l'essai
(une progression de 3,2 correspond à une pente de 2).

•À défaut d'informations sur la pente de la courbe de la substance d'essai, on

applique un facteur de progression de 3,2.

Essai principal

Avec ce facteur de progression par défaut, les doses sont choisies dans la séquence
1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 2 000 (ou 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 1 750, 5 000
pour répondre à certaines exigences réglementaires).

•Si aucune estimation de la létalité de la substance n'est disponible, le traitement

débute par une dose de 175 mg/kg. Dans la plupart des cas, cette dose est sublétale
et atténue de ce fait les douleurs et la souffrance des animaux.

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Essai principal

•L'administration des doses se poursuit en fonction des résultats obtenus sur tous
les animaux traités jusqu'à ce moment-là, suivant une séquence d'intervalles fixes
(par exemple 48 heures). L'essai prend fin dès qu'un des critères d’arrêt est rempli :

 Les animaux euthanasiés en raison de leurs souffrances sont pris en compte

de la même façon que les animaux morts au cours de l'essai.
 Si un animal meurt de façon inattendue à un moment tardif de l'étude, et si
d'autres survivent à cette dose ou à une dose supérieure, il convient d'arrêter le
traitement et d'observer tous les animaux afin de voir si d'autres animaux vont
également mourir au cours d'une période d’observation similaire.
 Si les survivants subséquents meurent également et qu'il s'avère que toutes les
doses dépassent la DL50, le mieux serait de recommencer l'étude avec une
dose inférieure d'au moins deux crans à la plus petite dose ayant entraîné la
mort (et d'allonger la période d'observation), étant donné que cette méthode
offre une exactitude optimale lorsque la dose initiale est inférieure à la DL50.

Essai principal

 Si les animaux subséquents survivent à une dose supérieure ou égale à la

dose à laquelle l'animal est mort, il n'est pas nécessaire de modifier la
progression entre les doses, puisque l'information provenant de l'animal mort
sera comptabilisée dans les calculs comme un décès à une dose inférieure à
celle à laquelle ont été traités les survivants subséquents, ce qui aura pour effet
d'abaisser la DL50.

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OBSERVATIONS

Observer individuellement les animaux, au moins une fois au cours des 30

premières minutes suivant l'administration du produit et régulièrement durant les
premières 24 heures (avec une attention particulière pendant les 4 premières
heures), puis quotidiennement par la suite, la période d'observation totalisant 14
jours, à l'exception des animaux qui doivent être euthanasiés en raison de leurs
souffrances et des animaux décédés au cours de l'étude.

Elle sera fonction des effets toxiques, du moment de l'apparition des symptômes et
de la longueur de la période de rétablissement, si bien qu'elle peut être prolongée
suivant les besoins.

Consigner systématiquement toutes les observations de manière individuelle pour

chaque animal.

OBSERVATIONS

Si les animaux continuent à manifester des signes de toxicité, des observations

supplémentaires devront également porter sur:
• des modifications de la peau et de la fourrure,
• les yeux et les muqueuses,
• les systèmes respiratoire et circulatoire,
• les systèmes nerveux central et autonome,
• l'activité somato-motrice et le comportement.

Il faudra être attentif aux tremblements, aux convulsions, à la salivation, aux

diarrhées, à la léthargie, au sommeil et au coma.

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Poids corporel

Les animaux moribonds et les animaux sujets à de fortes douleurs ou à une

souffrance intense et prolongée doivent être euthanasiés.

L'heure du décès des animaux morts spontanément ou euthanasiés en raison de

leurs souffrances, doit être notée avec la plus grande précision possible.

Le poids de chaque animal doit être déterminé peu de temps avant l'administration
de la substance d'essai et ensuite au moins une fois par semaine.

Les changements de poids doivent être calculés et enregistrés.

À la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés, puis sacrifiés.

Pathologie

Faire l’autopsie macroscopique de tous les animaux (y compris ceux qui meurent
au cours de l'essai ou sont retirés de l'étude pour être euthanasiés en raison de leurs
souffrances).

Noter tous les changements pathologiques macroscopiques relevés sur chaque

animal.

En ce qui concerne les animaux ayant survécu au moins 24 heures à

l'administration initiale, l'examen microscopique des organes présentant des signes
pathologiques macroscopiques est également envisageable car il peut livrer des
informations utiles.

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RESULTATS

•Les résultats doivent être fournis pour chaque animal.

•En outre, tous les résultats doivent être récapitulés sous forme de tableaux
indiquant, pour chaque dose d'essai:
le nombre d'animaux utilisés,
le nombre d'animaux manifestant des signes de toxicité,
le nombre d'animaux morts au cours de l'essai ou euthanasiés à cause de leurs
souffrances,
l'heure de la mort de chaque animal,
une description des effets toxiques, de leur évolution au cours du temps et de
leur réversibilité, ainsi que le rapport d'autopsie.
La dose de départ et la progression des doses doivent être justifiées, données
pertinentes à l'appui.

Calcul de la DL50 pour l'essai principal

•La DL50 est calculée selon la méthode de la probabilité maximale (SAS Institute Inc,
1990)(BMDP Statistics Software, Inc 1990).
•Toutes les morts, qu'elles soient immédiates, différées ou résultant d'une euthanasie,
sont prises en compte dans l'analyse de la probabilité maximale.
•D’après Dixon (Dixon W.J,1991), la fonction de probabilité s'écrit en ces termes : L =
L1 L2 ................L
où
L est la probabilité du résultat expérimental, étant donné μ et σ et n, le nombre total d'animaux
soumis à l'essai.
Li = 1 - F(Zi ) si le ième animal a survécu, ou
Li = F(Zi ) si le ième animal est mort
où F = distribution cumulée normale type
Zi = [log(di ) - μ]/σ
di = dose administrée au ième animal, et
σ = écart-type en unités logarithmiques de dose (ce qui n'est pas le logarithme de l'écart-
type).

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Calcul de la DL50 pour l'essai principal

•Une estimation de la valeur réelle de la DL50 est donnée par la valeur de μ qui
maximise la probabilité L.

•On estime que σ vaut 0,5, lorsqu'on ne dispose pas d'une meilleure valeur
générique ou spécifique au cas.

Le calcul de la probabilité maximale peut être effectué avec les progiciels

SAS(par exemple PROC NLIN) ou BMDP (par exemple le programme AR).
D'autres logiciels peuvent également être utilisés.
Les instructions concernant ces progiciels sont fournies dans les annexes à la
norme ASTM E 1163-87 (ASTM, 1987). [Le σ utilisé dans le programme BASIC
devra être adapté de façon à refléter les paramètres de la présente Ligne
directrice 425].
Ces progiciels livrent une estimation du logarithme de la DL50 et de son écart-
type.

Calcul de l'intervalle de confiance

•À la suite de l'essai principal et du calcul de la valeur estimée de la DL50, il peut être

possible d'estimer des intervalles de confiance pour la DL50.

• Tous ces intervalles de confiance fournissent une des informations précieuses sur la
fiabilité et l'utilité de l'essai principal qui a été conduit:
Un intervalle de confiance large indique que la DL50 estimée comporte une plus
grande incertitude. La fiabilité de la DL50 estimée est faible et son utilité risque
d'être limitée.
Un intervalle de confiance étroit indique que la DL50 estimée comporte une
petite incertitude. La DL50 estimée est fiable et d'une bonne utilité.

• Autrement dit, s'il fallait répéter l'essai principal, la nouvelle DL50 estimée devrait
avoisiner la première DL50 estimée et ces deux estimations devraient avoisiner la
DL50 réelle.

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Calcul de l'intervalle de confiance

•Suivant les résultats de l'essai principal, l'un des deux types d'estimations de
l'intervalle de confiance de la DL50 réelle est calculé:
Si au moins trois doses différentes ont été mises à l'essai et que la dose du
milieu a laissé survivre au moins un animal et entraîné la mort d'un animal, on
utilise une méthode de calcul fondée sur le profil de probabilité pour obtenir un
intervalle de confiance censé contenir la DL50 dans 95% des cas.

Toutefois, compte tenu du petit nombre d'animaux normalement utilisés, le niveau de

confiance réel n'est généralement pas exact (Rosenberger, W.F. et al, 1990).

Rapport d'essai

•Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes :

Substance d'essai :
- état physique, pureté et propriétés physicochimiques pertinentes (y compris
l'isomérisation) ;
- données d'identification, notamment le numéro CAS.
Véhicule, le cas échéant :
- justification du choix du véhicule s'il est autre que l'eau.

Animaux d'expérience :
- espèce/souche utilisée ;
- état microbiologique des animaux lorsqu'il est connu ;
- nombre, âge et sexe des animaux (y compris, le cas échéant, la
justification du remplacement des femelles par des mâles) ;
- source, conditions d’hébergement, régime alimentaire, etc.

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Rapport d'essai

•Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes :

Conditions expérimentales
- justification de la sélection de la dose initiale, du facteur de progression
entre les doses et des doses suivantes ;
- détails relatifs à la préparation de la substance d'essai, y compris l'état
physique du produit administré ;
- détails relatifs à l'administration de la substance d'essai, notamment les
volumes et les heures d'administration ;
- détails concernant la nourriture et la qualité de l'eau (type et source de
nourriture et source de l'eau)

Rapport d'essai

•Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes :

Résultats :
- poids corporel, modifications du poids corporel ;
- pour chaque animal, présentation sous forme de tableau des effets et de la
dose administrée (animaux manifestant des signes de toxicité, y compris la
nature, la gravité et la durée des effets ainsi que la mortalité) ;
- poids individuel des animaux le jour de l'administration, ensuite une fois par
semaine et au moment de la mort ou du sacrifice ;
- moment de l'apparition et évolution dans le temps des signes de toxicité et
réversibilité éventuelle de ces derniers pour chaque animal ;
- résultats de l'autopsie et observations histopathologiques pour chaque
animal, s'ils sont disponibles ;
- données de DL50
- traitement statistique des résultats (description du sous-programme
d'ordinateur et du tableur utilisé pour les calculs).

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Rapport d'essai

•Le rapport d'essai doit comporter les informations suivantes :

Analyse et interprétation des résultats.
Conclusions.

1.8.2. Facteurs influençant toxicité

Facteurs liés à substance Facteurs liés à organisme

- voie d’administration
- rapidité d’administration
- solubilité et ionisation
- concentration substance
- volatilité de substance
- nature véhicule associé
- métabolisme
- espèce: roténone, Atropine, psychotropes
- race: inh et indiens d'Amérique
- variations individuelles
- âge : enfants et vieillards
- sexe: femmes et œstrogène
- nutrition ou jeûne
- maladies : foie, rein, cœur, poumon.

Facteurs environnement Autres facteurs

- climat, altitude, saison, - intolérance: naturel ou acquise
ensoleillement. - tolérance: adaptation org.
- Dépendance: psychique et physique

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Interactions
- synergie: addition action
- antagonisme:opposition chimique,
fonctionnelle ou compétitive
- induction enzymatique: alcool, 3,4-
benzopyrène

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Intoxication aiguë
Exposition accidentelle en milieu
de travail;
Incendie;
Ingestion volontaire
Intoxication chronique
Ingestion de plantes cyanogènes
(ex. le manioc);
Exposition occupationnelle

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En cas d'ingestion, de l'irritation au niveau de la bouche et de la gorge apparaît.

Douleurs épigastriques.

La vitesse d'apparition des symptômes après inhalation, ingestion ou contact cutané

dépend de la présentation physico-chimique du cyanure, de la concentration et de la
durée d'exposition.

Symptômes précoces : anxiété, céphalée, vertiges, confusion, palpitations,

hyperventilation. Ces signes peuvent évoluer rapidement vers l'agitation, le coma,
l'hypotension, la bradycardie, les convulsions, l'arrêt respiratoire et le décès en
quelques minutes s'il s'agit d'une intoxication sévère.

Traitement: hydroxocobalamine

est la forme naturelle de la vitamine B12 (OHB12).

Elle agit dans l'intoxication au cyanure en remplaçant un groupement hydroxyle de
sa molécule par un groupement cyano, produisant ainsi de la cyanocobalamine qui
est éliminée dans l'urine.

Une molécule de OHB12 fixe une molécule de cyanure, d'où la nécessité d'utiliser
de fortes doses d'hydroxocobalamine.

L'efficacité thérapeutique du OHB12 lors de l'intoxication au cyanure a été

démontrée dans diverses conditions expérimentales et cliniques :

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2. CONTAMINATION MICROBIOLOGIQUE DES ALIMENTS

2.1.Contamination bactérienne
2.1.1. Intoxination alimentaire
 Intoxination botulique
Germe responsable : Clostridium botillinium
produit une toxine qui agit comme un poison curarisant et est responsable du
Botulisme.
La « toxine botulinique » est un des poisons les plus violents connus ; son pouvoir
toxique est environ 500 000 fois plus élevé que celui de la strychnine et la DL50
(dose qui tue 50 % des sujets qui la reçoivent) est estimée de 10-8à 10-9 g par kg
de poids corporel. C’est pour cette raison que la mortalité est élevée malgré les
thérapeutiques comme les sérums antitoxiques ou les anatoxines.
Le danger dépend des paralysies progressives se terminant par la paralysie du
centre respiratoire entraînant la mort par asphyxie.

 Intoxination staphylococcique

Germe responsable: Staphylococcus aureus

Avec cette entérotoxine, la DE50 (dose émétique qui fait vomir 50 % des individus
qui la reçoivent) est estimée à 0,2 μg par kg de poids corporel.
si un aliment a été contaminé, un traitement thermique du type pasteurisation
(60°C, 30 minutes) permettra de détruire les microorganismes, l’aliment restant alors
très dangereux par la présence éventuelle d’une entérotoxine.

Les cibles des entérotoxines: récepteurs sensoriels gastro-intestinaux

périphériques qui, après interaction, transmettent via le nerf pneumogastrique des
impulsions nerveuses au centre de la motilité intestinale situé dans la région
hypothalamique du cerveau.

Il s’agit donc d’une neurotoxine qui induit des vomissements et une hypermotilité
intestinale.

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2.1.2. Toxi-infection alimentaire

Les germes en cause : Shigelle, Salmonelle, Staphylocoque…

 Salmonella
Les intoxications sont dues à un développement abondant d’endotoxines ou
d’entérotoxines.
Les infections apparaissent après une durée d’incubation assez longue de 3-6
jours pour le Salmonelle typhi et 10-11 jours pour le Salmonella paratyphi après
envahissement de l’organisme.
Les salmonelles peuvent se développer abondamment dans les aliments sans
entraîner des altérations apparentes ou une odeur ou encore un goût désagréable.

2.1.2. Toxi-infection alimentaire

 Shigella
L’intoxication par le Shigella se manifeste par une dysenterie bactérienne suivie de
diarrhée rouge.
Le Shigella produit une entérotoxine qui possède une cytotoxicité responsable
des lésions de l’épithélium intestinal.
Le seul réservoir du Shigella est l’homme ainsi la transmission est donc fécalo-
buccale.

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PRÉVENTIONS
Utilisation des eaux propres
Lavage fréquent des mains au savon
Respect strict de l’hygiène alimentaire
Lutter contre les mouches
Isoler les malades
Utiliser les latrines

2.2. Contamination fongique

Les moisissures secrètent des toxines appelées MYCOTOXINES responsable de
beaucoup de manifestations chez l’homme et l’animal appelées MYCOTOXICOSES.

Les mycotoxines ont selon le cas des effets immunodépresseurs, hémorragiques,

hépatotoxiques, néphrotoxiques, neurotoxiques, oestrogéniques ainsi que, à plus
long terme et pour certaines, des effets mutagènes et cancérigènes.

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REMARQUES
L’aflatoxine B1 est le composé le plus toxique au pouvoir cancérigène plus
redoutable:
Le danger de cancer existe lorsque l’absorption journalière
d’aflatoxine est de l’ordre de 10 ng/kg.
à forte dose, l’aflatoxine tue en quelques jours d’atrophie jaune aigue
du foie ;
à dose faible, elle provoque en quelques semaines de la cirrhose
à dose très faible, elle provoque en quelques mois du cancer primitif
du foie.

Certaines mycotoxines peuvent être converti en produits moins toxiques par

les bactéries. Ex : Aflatoxine B1--------------------- aflatoxicol (10 fois moins
toxique)
L’Ochratoxine A est la plus toxique des mycotoxines, en effet une dose de 2
ppm suffit à arrêter la croissance chez le poulet (contre 5 ppm pour
l’aflatoxine).

3. TOXICOCINETIQUE

Définition:
étude parcours du toxique dans l’organisme depuis son entrée jusqu’à sa sortie

Etapes:
- administration
- résorption
- métabolisme
- liaison aux protéines
- distribution
- liaison au récepteur
- élimination

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.Administration:
per os, cutanée (brûlures acides et bases), sous
cutanée (poisons de flèche), anale (lavement
lumba-lumba), parent

Résorption:
- passive: gradient de concentration, liposolubilité,
degré d’ionisation (pka)
- diffusion facilitée: pompe à Na

Traversée de membranes biologique

- forme ionisée: hydrosoluble
- forme non ionisée: liposoluble
- barrières: digestive (lipophile), he (lipophile),
placentaire (lipophile), rénale (hydrophile).
- Equation de henderson hasselbach.

Liaison aux protéines

- albumines sanguines
- faible ou forte
- seule fraction non liée aux protéines est active 5

Distribution
- dépend nature récepteur et nature toxique:
liposolubilité et degré ionisation.
- DDT très liposoluble se distribue partout, dans
les organes, graisse et sous la peau.
- Il y’a aussi organotropie: organophosphoré, très
liposoluble mais se distribue là où se trouve
acétylcholinestérase

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Liaison aux récepteurs

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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Métabolisme

Métabolisme

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II. TOXICOLOGIE CLINIQUE

Le médecin face a l’intoxique

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