Question N°1

Comment réalise t-on la coloration de gram et ziehl Nelson

A. La coloration de Gram

Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de coloration de Gram.
Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans Christian Gram, un bactériologiste danois.
Après coloration, les bactéries Gram+ deviennent violettes alors que les bactéries Gram-
apparaissent en rose. La répartition des bactéries en Gram+ ou Gram- est un critère
systématique important pour la classification des bactéries. En outre, la coloration de Gram
reste une étape essentielle dans l’analyse médicale pour la détermination des pathogènes. Elle
permet de visualiser facilement les bactéries et de donner des indications sur leurs formes et
leurs tailles.

Qu'est-ce qui fait que certaines bactéries retiennent le violet gentiane (Gram positif) tandis que d'autres
libèrent facilement le colorant lorsqu'on ajoute de l'alcool (Gram négatif) ?

Les parois des bactéries à Gram négatif ont un taux élevé de lipides (à cause de la membrane externe) et
une fine couche de peptidoglycane. L'alcool contenu dans le décolorant extrait le lipide, ce qui rend la
paroi des bactéries à Gram négatif plus poreuse, et incapable de retenir le complexe violet-lugol,
décolorant ainsi la bactérie.

Le peptidoglycane plus épais et le degré de réticulation plus élevé piège le complexe violet-lugol plus
efficacement, ce qui rend la paroi Gram positif moins sensible à la décoloration.
Composition et préparation des colorants

- Violet de gentiane phéniqué :

• violet de gentiane : ..........10 g

• phénol : ......................20 g

• éthanol (95 °GL) :.......... 100 ml

• eau distillée : ...............01 l

- Solution iodée de Gram ou lugol : iodure de potassium : 20 g ; iode métalloïde I2 : 10 g ; eau Ezoic

- Solution de safranine : safranine O :25 g ; éthanol à 95 °GL : 100 ml ; solution aqueuse d'oxalate
d'ammonium à 25 g/l : 800 ml ;

- ou fuchsine pour Gram : fuchsine de Ziehl = fuchsine basique : 10 g ; phénol : 50 g ; éthanol : 100 ml ;
eau distillée : 1 l. Diluer au 1/10° pour la fuchsine pour GRAM ;

- Décolorant alcool acétone : éthanol (alcool) "absolu" 5 volumes ; acétone : 1 volume ;

- En flacon hermétique, à l'abri de la lumière, de préférence au frais : plus de 3 ans sauf pour la fuchsine
diluée.

- Attention : filtrer lorsque l'on rempli les flacons pour l'utilisation quotidienne à partir des flacon de
réserve.

Les étapes de la coloration de Gram

• Quelle que soit le colorant utilisé la technique reste sensiblement la même comme suite:

1. Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute avec le réactif de coloration
au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis (concentration cellulaire trop lourde ou
trop légère) affectera les résultats de la coloration.
2. Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes
3. Inondation avec le mordant : iode ou lugol. Attendez 1 minute
 4. Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes.
5. Inondation la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte à goutte
pour faire sortir l'agent de décoloration

6. Inondation la lame avec contre-colorant,'safranine'. Patienter 30 secondes à 1 minute.

7. Laver la lame dans un jet d'eau douce et indirecte de l'eau du robinet jusqu'à ce qu'aucune
couleur n'apparaisse dans l'effluent, puis sécher avec du papier absorbant.
8. Observez les résultats de la procédure de coloration sous immersion dans l'huile.Examiner au
microscope, objectif x100

À la fin , les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à
Gram positif tacheront le bleu / violet.

Il faut cependant savoir que la coloration de Gram peut être variable pour une même espèce
(par exemple, le pneumocoque se décolore facilement, de même, certaines bactéries Gram
positif quand les colonies sont âgées).

- Certaines bactéries sont même dites « Gram faible » ou « Gram variable » (ex:
corynébactéries.)
B. Coloration de Ziehl Nelson

La coloration de Ziehl-Neelsen (coloration ZN) est une technique de coloration

microbiologique inventée à la fin du XIXème siècle pour visualiser les Mycobactéries au
microscope optique. Elle repose sur le fait que les Mycobactéries sont des bacilles acido-
alcoolorésistants (BAAR) à la paroi épaisse et cireuse : une coloration énergique à chaud
franchit cette paroi et colore aussi toutes les autres bactéries éventuellement présentes,
puis une décoloration avec un mélange d'acide et d'alcool décolore toutes les bactéries
sauf les Mycobactéries, et enfin une contre-coloration permet de visualiser les éléments
décolorés à l'étape précédente.
1. Principe de coloration de ziehl neelsen
La présence d'acides mycoliques dans les parois cellulaires des bactéries acido-alcoolo-
résistantes est la base cytologique de cette coloration. L'acide mycolique donne à ces bactéries
une plus grande affinité pour le colorant primaire et une résistance à la décoloration par une
solution d'acide-alcool.
La fuchsine est utilisé comme colorant primaire parce qu'elle est liposoluble et pénètre la paroi
cellulaire cireuse. La coloration est encore améliorée en chauffant jusqu'à émission de vapeur la
préparation pour faire fondre la cire et permettre au colorant de se déplacer dans la cellule.
Le mélange acide-alcool est utilisé pour décolorer les cellules non acido-alcoolo-résistantes. Une
contre-coloration, telle que le bleu de méthylène, est ensuite appliquée. Une fois terminées, les
bactéries acido-alcoolo-résistantes sont colorées en rouge-violet sur un fond bleu.

Les étapes de la coloration de ziehl neelsen

Etaler l'expectoration régulièrement sur la zone centrale de la lame grâce à un mouvement
continu de rotation ; on recommande un étalement d'environ 20 mm sur 10mm .
Placer les lames sur le séchoir avec la surface d'étalement vers le haut et laisser sécher à l'air
durant environ 30 minutes
Procéder à la fixation des lames séchées en les tenant avec une pince et en les passant sur la
flamme 5 fois pendant environ 4 secondes, la face d'étalement tournée vers le haut. Ne pas fixer
par la chaleur les lames humides et éviter un échauffement excessif.

Coloration :
1. Placer les lames fixées sur le support de coloration selon leur numéro d'ordre, la face
d'étalement vers le haut. Les lames devraient être séparées par un intervalle d'1 cm et ne
jamais se toucher l'une l'autre.

2. Recouvrir les lames l'une après l'autre au moyen de la solution de travail de fuchsine
phéniquée de Ziehl à 0,3 % filtrée
 3. En plaçant une bande de papier absorbant comme un papier filtre ou même du papier
journal, on retiendra la solution de coloration et on évitera le dépôt de cristaux de fuchsine
sur le frottis.
4. Chauffer les lames par le dessous au moyen de la flamme d'un bec Bunsen, d'une lampe à
alcool ou d'un tampon d'ouate imbibé d'alcool, jusqu'à émission de vapeur. Il ne faut jamais
aller jusqu'à l'ébullition de la solution de colorant. Ne pas laisser le colorant se dessécher
5. Laisser les lames recouvertes d'une solution chaude et fumante de fuchsine phéniquée
pendant 5 minutes en repassant la flamme si c'est nécessaire
6. Rincer les lames délicatement à l'eau pour écarter l'excès de fuchsine phéniquée
7. Evacuer l'excès d'eau de rinçage des lames . Les frottis d'expectoration ont une couleur
rouge.

Décoloration :
1. Recouvrir les lames au moyen d'acide sulfurique à 25 % ou d'une solution d'alcoolacide et
laisser agir pendant 3 minutes, après cela la coloration rouge devrait avoir presque
disparu .En cas de nécessité, répéter cette séquence durant deux minutes supplémentaires.
2. Laver délicatement l'acide sulfurique ou l'alcool-acide et l'excès de colorant à l'eau .
Evacuer des lames l'excès d'eau de rinçage.

Contre-coloration :

1. Recouvrir les lames l'une après l'autre avec la solution de contre-coloration (bleu de
méthylène à 0,3 %) et laisser agir pendant 1 minute
2. Rincer les lames à l'eau individuellement
3. Evacuer l'eau des lames et les laisser sécher à l'air

Qualité de l'étalement et de la coloration "Ziehl-Neelsen

L'aspect d'un frottis coloré correctement est bleu clair sous l'effet du bleu de méthylène. Si la couleur
est bleu foncé, le frottis est trop épais, dans ces conditions il n'est pas possible de lire un texte au travers
de la lame.

Conclusion

En conclusion, la coloration de Ziehl-Neelsen demeure une méthode importante dans le domaine de la

microbiologie, en particulier pour la détection des bacilles acido-alcoolo-résistants tels que
Mycobacterium tuberculosis.

Bien que d'autres méthodes aient émergé, la Ziehl-Neelsen conserve sa place prédominante en raison
de sa simplicité, de sa fiabilité et de son coût relativement bas
Question N°2

Schématiser le crossing-over

le Double Strand Break Repair entraîne soit la production de conversions soit de crossing over. Lorsqu’un ADN subit une cassure
double brin, il peut être réparé en utilisant une molécule d’ADN homologue, c’est à dire possédant la même séquence. Cela
peut être le cas dans une cellule diploïde et dans ce cas la deuxième copie peut servir de matrice. Mais c’est aussi le cas après
réplication chez les bactéries et les eucaryotes haploïde (en phase G2). Éventuellement, une séquence homologue/homéologue
située ailleurs dans le génome peut être utilisée, ce qui conduira à un réarrangement (voir figure 60). La réparation commence
par la résection simple brin au niveau de la cassure par une nucléase spécifique et la reconnaissance et l’appariement des deux
séquences. Puis, l’ADN du brin intact est ouvert et la portion simple brin d’une des deux extrémités libre du brin à réparer vient
s’hybrider avec le brin intact. Le remplissage des “trous” par une polymérase et la fermeture des simples-brins par une ligase
conduit à une structure possédant deux jonctions de Holliday. Cette double jonction est résolue par une résolvase et conduit en
fonction de l’action de la résolvase au niveau de chaque jonction soit à une conversion soit à un crossing-over (voir figure 79).
Les enzymes impliqués dans ce mécanismes sont très conservés au cours de l’évolution: système RecA,B,C,D chez les bactéries
et gènes rad/XP/ERCC chez les eucaryotes.