Technique microscopique de mesure et de contrôle

Introduction
Première publication d’une observation de la fluorescence 1565 « Emission de lumière par
une infusion de bois Lignum Nephriticum », Monardes N ; Stokes Georges.Gabriel. Emission
de lumière par des solutions de sulfate de quinine sous excitation UV en 1852 et 1853 il a
introduit le terme fluorescence. La microscopie en fluorescence (ou en épifluorescence) est
une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence
et de phosphorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation classique par Réflexion
(physique) ou absorption de la lumière visible naturelle ou artificielle. Elle fait désormais
partie des méthodes de recherche classiques et de la biologie et continue à se développer avec
l'imagerie moléculaire. On peut ainsi observer divers objets, substances (organiques ou
inorganiques) ou échantillons d'organismes morts ou vivants.
I. Principes
La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après
avoir absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie en fluorescence repose sur la
formation d'une image par détection de cette lumière émise. Le déplacement de Stokes décrit
la différence entre la longueur d'onde absorbée par l'objet (émise par la source lumineuse du
microscope) et émise par l'objet. Plus la différence entre les deux longueurs d'onde est grande
plus il est facile d'observer la fluorescence.
I.1 Fluorescences primaire et secondaire
En fluorescence on distingue deux types d'objets :
Les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes, on parle de « fluorescence
primaire » ou autofluorescence (chlorophylle) , les autres doivent être combinés à une
substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de « fluorescence
secondaire ». En microscopie de fluorescence, on peut donc visualiser directement des
substances fluorescentes. Pour des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes,
il est nécessaire de les marquer par des substances appelées fluorochromes, comme le DAPI
qui marque l'ADN et fluoresce en bleu. Certains marqueurs génétiques comme la protéine
fluorescente verte, (en anglais Green Fluorescent Protein ou GFP) sont aussi très utilisés en
biologie dans des organismes génétiquement modifiés pour en produire de manière endogène.
Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et
ne nécessite pas l'ajout de substrat. La fluorescence peut alors être visualisée directement dans
les cellules vivantes, c'est un des domaines développés par l'imagerie moléculaire.
II. Caractéristiques de la fluorescence
 Longueur d’onde d’émission (maximum du spectre): λ em
 Rendement quantique de fluorescence: 
 Coefficient d’extinction ou absorbance spécifique: ε
 L’intensité de fluorescence ou brillance: If
 Temps de vie de fluorescence: τ
II.1 Excitation et Emission

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 L’excitation d’un fluorophore à 3 longueurs d’ondes ne change pas le profil

d’émission correspondant
 Par contre, l’intensité d’émission est proportionnelle à l’intensité de
l’excitation
II.2 Rendement quantique
- L’efficacité de fluorescence pour une molécule donnée est déterminée par le
rendement quantique .
- Défini par le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons
absorbés par la molécule. = If / Ia

Valeur comprise entre 0,05 et 1. Le rendement quantique peut varier en fonction de

l’environnement des fluorochromes: concentration, polarité, PH…Exemple: = 0,85 pour
la fluorescéine.
II.3 Coefficient d’extinction ε ou absorbance spécifique
Reflète la probabilité d’absorption d’une molécule. Sa valeur peut constituer un critère
pour le choix des colorants. Plus ε est grand, Plus intense sera la fluorescence à intensité
lumineuse incidente égale. Valeur comprise entre 5000 et 250 000 cm-1.M-1.
Exemple: pour la fluorescéine à 488 nm, ε = 80 000 cm-1.M-1

II.4 Rappel : Loi de Beer-Lambert (Absorption)

L’efficacité avec laquelle la lumière est absorbée à la longueur d’onde λ par un milieu
absorbant est caractérisée par l’absorbance. L’absorbance d’un échantillon suit la loi de Beer-
Lambert:

Ia = Io - It = Io ( 1 - 10-ε.C.l ) qui se simplifie à : If ≈ 2,3 f . Io . ε. C. l

Soit une relation linéaire entre C, la concentration du fluorophore, et If, l’intensité d’émission
Io : intensité lumineuse incidente
It : intensité lumineuse transmise
C : concentration de la molécule absorbante, en mol.l-1 (M)
l : trajet optique, en cm

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If : intensité d’émission
II.5 Temps de vie de fluorescence τf

Durée pendant laquelle un fluorophore demeure dans un état excité.

De l’ordre de la nanoseconde pour la plupart des fluorochromes.
Plus ce temps sera court, meilleure sera la sensibilité du fluorochrome.
Varie en fonction de l’environnement: milieu, PH…
Durée de vie du singulet excité le plus bas = tau, la constante de temps de déclin de fluo, τf

τf = f . τN

où τN , constante de temps intrinsèque de l’état excité

Quelques exemples

III. Fluorescence et phosphorescence

III.1 Définition : La fluorescence
Une molécule fluorescente possède la propriété d'absorber un rayonnement lumineux incident
(excitation) et de restituer rapidement (quelques nanosecondes) l'énergie absorbée sous forme
d'émission de lumière (fluorescence) dans le domaine du visible ou proche UV. Elles émettent
à une longueur d’onde supérieure à celle du faisceau incident.
La phosphorescence et la fluorescence ont de nombreuses applications dont la fluorimétrie
qui est une méthode de dosage utilisant cette propriété.
Tous ces phénomènes se regroupent sous la dénomination de Luminescence. Elle se compose
comme suit :

LUMINESCENCE

PHOTOLUMINESCENCE -CHIMILUMINESCENCE
-BIOLUMINESCENCE
-THERMOLUMINESCENCE
-ELECTROLUMINESCENCE
etc.
FLUORESCENCE PHOSPHORESCENCE

 La photoluminescence est un phénomène radiatif suite à une excitation lumineuse

(photons de lumière visible ou ultraviolette).
 La chimiluminescence est un phénomène radiatif suite à une réaction chimique
(chimiluminescence vraie) ou enzymatique (bioluminescence).

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III.2 Différence entre Fluorescence et Phosphorescence

La fluorescence et la phosphorescence ne suivent le même processus d’émission photonique.

La principale différence est par rapport au temps d’émission :
- La fluorescence est caractérisée par retour à l’état fondamental rapide de l’ordre de 10 -12s.
(la multiplicité de spin est conservé).
- La phosphorescence est caractérisée par un retour à l’état fondamental plus lent avec
émission de photons de l’ordre 10-6s. L'émission lumineuse dure donc beaucoup plus
longtemps même après arrêt de la lumière incidente. (retournement de spin avec passage à un
état triplet).
III.3 Comprendre le phénomène ?
Il est utile d'étudier le diagramme de Jablonski. C'est un diagramme énergétique comparant
les phénomènes de retour à l’équilibre par fluorescence et phosphorescence.
II.3.1 Diagramme de Jablonski (simplifié)
Il montre les transitions radiatives et non radiatives entre états électroniques
Principe de la fluorescence

III.3.2 Etat singulet et état triplet: Distinction entre fluorescence et phosphorescence

L’émission de lumière se produit entre deux

L’émission de lumière se produit entre états de multiplicité différente (Triplet T1-
deux états de même multiplicité singulet fondamental S0). Processus plus long
(singulet excité singulet fondamental). que la fluorescence.

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III.3.3 Spectre d’émission de fluorescence

Le spectre d’émission de fluorescence est un histogramme des énergies libérées par la
concentration de fluorophores lors de la transition radiative vers les différents niveaux de
résonances de l’état fondamental S0.

II.4 Spectres et déplacement de Stokes

II.4.1 Loi de Stokes
L’énergie emmagasinée par un photon est inversement
proportionnelle à sa longueur d’onde,
alors E= hc/λ

h = constante de planck

C = vitesse de la lumière

λ = longueur d’onde

Remarque: du fait de la dissipation d’énergie, l’énergie émise est plus faible que l’énergie
excitatrice et donc la longueur d’onde est plus élevée.
hνexcitation > hvémission  λ excitation < λ émission
II.4.2 Spectres et déplacement de Stokes
Une partie seulement de l’énergie absorbée peut être émise sous forme de rayonnement.
Longueur d’onde λ du maximum d’excitation < λ du maximum d’émission
Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission.

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La détection d’une espèce fluorescente est d’autant plus

facile que le déplacement de stokes est grand.
Ex: pour la fluorescéine, respectivement λa=495 nm
et λb=521 nm, le déplacement de Stokes = 26 nm.

III.5 Propriété
III.5.1. Intensité de fluorescence ou brillance

La brillance est proportionnelle à ε et 

ε : Coefficient d’extinction e ou absorbance spécifique.
 : Rendement quantique défini par le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre
de photons absorbés par la molécule.= If / Ia

Fluorophore ε  Brillance
Fluorescéine 80 000 0,9 72 000
Cyanine 5 200 000 0,35 70 000
EYFP 84 000 0,61 51 000
B-phycoérythrine 2 410 000 0,98 2 360 000
Tryptophan 6 000 0,1 600

IV. La Microscopie à fluorescence (classique)

IV.1 Principe
La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de la
lumière de fluorescence émise. Suivant les cas la fluorescence peut être :
primaire ou auto fluorescence ou directe (chlorophylles, paroi de kystes de parasites)
secondaire à un marquage plus ou moins spécifique, immunologique (direct ou
indirect) voir génétique (ex. protéine recombinante fluorescente avec la Green
Fluorescent Protéine ou GFP) permettant alors d’observer la fluorescence directement
dans les cellules vivantes.

IV.2 Eléments optique spécifiques

En sciences biologiques le microscope à fluorescence « classique » le plus courant permet

une épi-illumination de l’échantillon (épiscopie).

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1/ La source lumineuse est une lampe à mercure qui produit un rayonnement intense (dont la
« chaleur » est limitée par un filtre anticalorique) qui traverse un filtre d’excitation (de type
passe bande) ne transmettant que la longueur d’onde désirée.
2/ La fluorescence émise est collectée par l’objectif pour former une image réelle grandie,
débarrassée des rayons excitateurs réfléchis par le filtre d’arrêt du tube (de type passe-haut),
au niveau du plan image tube optique.
3/Les différents types de filtres de fluorescence

 Passe bas: laisse passer les λ< à une valeur et bloque les autres. Un filtre SP500: laisse
passer les λ<500

 Passe haut: laisse passer les λ > à une valeur et bloque les autres Un filtre LP500:
laisse passer les λ >500

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 Passe bande: laisse passer les λ comprise entre 2 valeurs et bloque les autres.Un filtre
AF500/30: laisse passer les λ comprises dans une gamme de 30 nm centrée sur 500nm
soit de 485 à 515nm. 500+/- (30/2).

 Inverse du passe bande laissent tout passer sous un bande de longueur d’onde
 Le miroir dichroïque
Le miroir dichroïque fonctionne un peu comme un passe haut SAUF qu’il réfléchit à 45° les
longueurs d’onde qu’il ne laisse pas passer au lieu de les bloquer. Un dichroïque de 500
réfléchi les λ<500nm et est transparent (laisse passer) les λ>500nm.

Bien choisir les filtres d’excitation, d’émission et miroir dichroïque selon les fluorochromes à
observer. Il existe des blocs filtres multi band (double, triple, quadruple) qui ont plusieurs
bandes passantes en excitation, émission et dichroïque. Vérifier les % de transmission pour
comparer l’efficacité de 2 filtres
V. Microscopie par fluorescence un Photon
V.1 Processus de luminescence
Tout atome ou toute molécule présente en réaction à une excitation. Une probabilité non nulle
de passer de son état d'énergie le plus stable (équilibre thermodynamique) vers un état
d'énergie excité. En contrepartie, les entités atomiques ou moléculaires auront tendance à
retourner dans leur état d'énergie fondamental par un processus de désexcitation qui pourra se
traduire par un échauffement, une émission de photon...
V.2 Fluorescence, phosphorescence et désexcitation non-radiative
La fluorescence est un processus appartenant à la classe des processus de luminescence,
consistant à l'émission d'un photon d'énergie E=hγ (où h=6,62.10 -34 J.s est la constante de
Planck et γ = [c/(λ)] la fréquence du photon dans le vide où c=3.10 8 m.s-1 et λ est sa longueur
d'onde) correspondant à la différence entre deux niveaux d'énergie de spin singulet d'un atome
ou d'une molécule, l'atome ou la molécule passant alors de son état d'énergie le plus élevé

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(état excité) à un état d'énergie plus faible, généralement l'état fondamental. On parle alors de
transition radiative ou émission spontanée dont la probabilité de transition est inversement
proportionnelle à la durée de vie l'état excité. Dans les cas qui nous intéressent, nous
considèrerons que l'excitation des molécules se fait par absorption d'un photon d'énergie
E1=hγ1. La molécule est alors amenée de son état fondamental S 0 vers un état excité S1 dont
l'écart en énergie est caractérisé par S 1-S0=E1, l'énergie du photon incident. Au sein du niveau
S1 ont lieu une série de conversion interne non-radiative amenant à l'état vibrationnel le plus
bas. La molécule se désexcite alors vers son état S0 en émettant un photon d'énergie
E2=S1-S0=hγ2

Passage à l’état 1 1
vibrationnel hγ›hγ2 γ› γ2 > λ2 > λ
λ λ2

La fluorescence se produit entre des états de spin singulet et a des durées de vie allant de la
picoseconde à la dizaine nanosecondes.
Il existe une probabilité qu'une fois dans le niveau S1 la molécule se désexcite non pas vers S 0
mais vers un niveau d'énergie de spin triplet, état généralement métastable et possédant une
durée de vie très longue pouvant atteindre plusieurs dizaines de millisecondes. Ce niveau a
une probabilité de désexcitation radiative vers S0 très faible en émettant un photon d'énergie
E3=T1-S0 (transition d'un état triplet vers un état singulet : processus de phosophorescence). La
nature des états triplets des molécules fait qu'elles auront également une probabilité
importante de se désexciter vers une autre entité chimique (génération d'oxygènes singulets et
base du photoblanchiment) ou de retourner vers le niveau S0 par une transition non-radiative.

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D'une manière générale, dans le cadre de la

microscopie de fluorescence, les effets liés
aux états triplets n'interviennent que lors des
transferts d'excitations ou de photodestruction
des molécules fluorescentes. Si l'on ne tient
pas compte des effets liés aux états triplets et
aux dégénérescences des niveaux d'énergie
(effets rotationnels, vibrationnels et
rovibrationnels), on peut décrire

photon avec une probabilité ( taux) de transition W01 en s-1 du niveau S0 vers un niveau S1 puis
l'action de deux processus en concurrence : une désexcitation non-radiative vers S0 présentant
un taux de transition Wnrad et l'émission spontannée d'un photon ramenant la molécule vers
son état le plus stable avec un taux de transition Wrad.
En réaction à une excitation par une impulsion de photons unique, la population du niveau
excité S1 s'écrit :

dN* dN∗¿
dt
= - (Wrad+Wnrad) N* =−(W rad +W nrad )¿
N¿
dt

Cette équation différentielle conduit donc à une décroissance exponentielle de l'intensité de

fluorescence telle que :

If(t)=I0.e-[t/(τ)] où τ= [1/(Wrad+Wnrad)] est la durée de vie de fluorescence

En intégrant l'expression de l'intensité, on détermine alors le nombre total de photons émis Ne

∞

Ne=∫ I f (t) If(t)= τ I0

0

Comme à t0, le nombre de molécules dans l'état excité est égal au nombre de photons absorbés
Na, l'intensité de fluorescence est à cet instant :
I0=WradNa
Le rapport du nombre de photons émis par le nombre de photons absorbés donne le rendement
quantique de fluorescence :

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Ne W rad
D’où : η= =
N a W rad +W nrad

Le rendement quantique de fluorescence décrit l'efficacité de fluorescence des molécules

après absorption de photons. Il illustre la concurrence entre les processus radiatifs et non-
radiatifs. Si Wnrad > Wrad, η sera faible et la molécule peu fluorescente.
Remarque : En conditions expérimentales, les molécules fluorescentes sont rarement pures
en solution et la présence de certaines entités chimiques peut précipiter les désexcitations non-
radiatives et éteindre la fluorescence ("quenching"). En présence de fortes concentrations en
molécules fluorescentes, la probabilité de collision entre molécules dans l'état excité sera
importante, introduisant un taux supplémentaire de désexcitations non-radiatives.
On peut aussi quantifier l'efficacité d'absorption d'un photon par une molécule en considérant
la probabilité d'interaction se produisant lors de la collision de particules.
V.1. Imagerie d'épi-fluorescence
Le banc d'imagerie d'épi-fluorescence est composé d'un microscope inversé Zeiss Axiovert
installé dans un incubateur contrôlé en température.

Le maintien des échantillons est assuré par un support permettant de contrôler localement le
taux de CO2, l'humidité et la température, essentiels à la viabilité de cultures cellulaires. Ce
support est monté sur une platine motorisée XY à vitesse variable autorisant des déplacements
fins à une résolution de 0,1 µm. Le microscope est équipé de trois objectifs : x20 et x40 à
contraste de phase ; x100 à immersion (huile).
L'éclairement de transmission est réalisé par une lampe hallogène focalisée à l'aide d'un
condenseur contenant un diaphragme réglable pour l'imagerie de transmission classique et les
anneaux de contraste de phase correspondant aux objectifs employés.
L'épifluorescence consiste à venir exciter les molécules fluorescentes contenues dans un
échantillon par un rayonnement dont la longueur d'onde correspond à une transition
d'absorption, amené à travers un objectif du microscope. La fluorescence étant émise dans
toutes les directions de l'espace, les photons peuvent alors être recueillis dans le même cône
d'angle solide que l'excitation

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L'excitation de la fluorescence se fait par une lampe à vapeur de mercure filtrée à 365 nm
(UV-A). La lumière émise entre dans le microscope par sa face arrière et est collimatée par un
système de lentilles (figure 2.9). Un miroir dichroïque permet de diriger les rayons vers
l'objectif tout en autorisant le passage du rayonnement de fluorescence vers les canaux de
détection. Un canal sert pour l'imagerie permettant soit une observation directe par un système
d'oculaire soit une prise d'image par une caméra numérique couleur avec une matrice d'un
Mega-pixel. Sur un second canal, 80 % de la lumière est envoyé sur une fibre optique de 100
µm de coeur reliée à un spectromètre USB2000 d'OceanOptics (350 nm - 1100 nm). Le
troisième canal est inutilisé.
L'ensemble du banc est piloté par un ordinateur avec le logiciel Zeiss Axiovision pour
l'imagerie et avec une interface que nous avons développée sous LabView pour la
spectrométrie.

L'épifluorescence réalise des images en champ large. La totalité des molécules fluorescentes
présentes sur le trajet du rayonnement d'excitation vont émettre des photons, aussi, le signal
détecté sera la contribution des objets contenus à la fois dans le plan d'observation mais
également avant et après.
Il en résulte une image présentant un fond de fluorescence (figure gauche) dont il est difficile
de s'affranchir sans effectuer de traitement d'images (figure droite).
Image d’épifluorescence de cellules CHO (Chinese Hamster Ovaries) incubée avec de la
rhodamine B - A gauche image avant traitement, à droite, image après traitement par le
logiciel ImageJ.
L'imagerie d'épifluorescence classique présente deux inconvénients majeurs liés aux effets
photochimiques induits par l'éclairement UV qui sont la photodégradation des molécules
fluorescentes conduisant à une perte de la qualité de l'image, et la phototoxicité des
rayonnements provoquant la mort de la cellule.

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VI. Fluorescence par excitation à deux photons

En présence d'une concentration très forte de photons, comme au col d'un faisceau laser de
grande intensité focalisé fortement, il existe une certaine probabilité pour une molécule
d'absorber deux photons simultanément .C'est le processus non-linéaire d'absorption à deux
photons proposé en 1931 par M. Göpper-Mayer puis vérifié expérimentalement en 1961 après
l'apparition des premiers lasers par W. Kaiser.

1 1
Hγ < hγ3 γ< γ3 < λ3 < λ
λ λ2

La lumière émise à λ plus petite

E3= hγ3

Diagramme de Jablonski de
fluorescence par excitation à 2photons

Le rendement quantique de fluorescence obtenu lors d'une excitation à deux photons est
inchangé car dépendant uniquement des durées de vie radiative et non-radiative des états
excités des molécules fluorescentes.
VI.1. Spectroscopie de fluorescence par excitation à deux photons
En imagerie de fluorescence excitée à deux photons in-vivo, un facteur important est la
puissance d'excitation. Il ne faut pas que le laser d'excitation soit trop puissant de sorte à
préserver l'échantillon de dégâts provoqués par la dissipation de chaleur due à un trop grand
apport de photons. Si dans le cas de l'imagerie en culture cellulaire la destruction d'une cellule
ne pose pas de problème majeure, la culture présentant généralement plusieurs milliers de
cellules, en revanche, les dégâts engendrés par un échauffement laser sur les tissus d'un
animal vivant en imagerie intra-vitale sont critiques, les fonctions vitales étant alors fortement
compromises. Qui plus est, les tissus vivant sont des milieux très turbides et la diffusion des

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photons excitateurs va nécessiter d'augmenter la puissance laser pour disposer d'un plus grand
nombres de photons balistiques au col du faisceau où a lieu l'excitation à deux photons.
Pour pallier à ces problèmes nous avons choisi une stratégie à deux niveaux. La diffusion
évolue proportionnellement à 1/λ4. Il suffit donc dans un premier temps de tenter d'exciter la
fluorescence à deux photons à des longueurs d'onde grandes (proche infra-rouge) et de
concevoir des fluorophores dont les sections efficaces à deux photons sont optimisées pour
une excitation dans le proche infra-rouge.
Dans les deux cas, une bonne connaissance du spectre d'excitation à deux photons est
essentielle pour pouvoir contrôler la présence de résonnances à deux photons dans les
gammes d'excitation recherchées mais également pour vérifier l'efficacité de l'ingénierie
d'optimisation des sections efficaces d'absorption à deux photons.
VI.2. Origine moléculaire de la section efficace d'absorption à deux photons
La section efficace d'absorption caractérise la probabilité d'interaction par absorption entre
des photons et une molécule. Contrairement à ce que suggère la définition que nous en avons
donné, il ne s'agit pas que d'une caractéristique géométrique. On peut relier la section efficace
d'absorption à deux photons d'une molécule directement à ses
propriétés énergétiques. A chaque transition énergétique de la
molécule, on associe un moment dipolaire de transition Mij de
l'état i vers l'état j

VI.3. Imagerie de fluorescence par excitation à deux photons

Utilisant le principe d'excitation à deux photons, W. Denk a développé en 1990 une nouvelle
technique d'imagerie basée sur la microscopie de fluorescence par balayage laser. Comme
l'absorption à deux photons ne se produit qu'au col d'un laser fortement focalisé, il est possible
d'exciter localement des molécules fluorescentes.
En balayant la surface d'un échantillon (comme un tapis de culture cellulaire), on peut réaliser
une image dans un plan dont la résolution dépend du volume d'excitation à deux photons.
En modifiant la position de l'optique de focalisation par rapport à l'échantillon, on déplace la
position du col, ce qui autorise la réalisation d'une série de plan de coupes d'imagerie qui
après reconstruction donneront une image en trois dimensions de l'échantillon et de ses
structures.

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Image par excitation à deux photons d’une cellule vivante CHO marquéeà la rhodamine B à
trois profondeurs différentes

Reconstruction en trois dimensions de la coupe d’images d’une cellule CHO marquée à la

rhodamine B vue sous trois angles différents
Le banc d'imagerie à deux photons se compose de trois parties principales .Un laser Saphire-
Titane permet de disposer de la puissance nécessaire à l'excitation à deux photons en délivrant
des impulsions de l'ordre de 100 fs pour des longueurs d'onde accordables dans le proche
infra-rouge (700 nm à 900 nm). Le faisceau est dirigé vers le microscope Olympus puis
focalisé avec l'objectif à immersion sur l'échantillon à imager. Au point focal, la densité de
photons est suffisante pour exciter les transitions d'absorption à deux photons conduisant à
l'émission de photons de fluorescence. La lumière est recueillie par l'objectif puis dirigée vers
l'interface Bio-Rad par un jeu de miroirs dichroïques.
La détection se fait par deux canaux de photomultiplicateurs (PMs internes ou externes) avec
chacun un dispositif de filtres permettant de séparer les bandes d'émissions de fluorescence
pour détecter deux longueurs d'ondes séparées lorsque plusieurs colorants sont présents dans
l'échantillon.

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Vue schématique du microscope à deux photons

Le module de balayage consiste en un système de miroirs pilotés par le scanner Bio-Rad et la
translation de l'objectif sur l'axe longitudinal se fait par un système motorisé. La résolution du
microscope dépend majoritairement des propriétés optiques du faisceau laser après la
traversée de l'objectif créant le volume d'excitation à deux photons. On sait que l'absorption à
deux photons est proportionnelle au carré de l'intensité du faisceau d'excitation. En fonction
de la façon dont est illuminée la pupille d'entrée de l'objectif, on distingue deux cas : la pupille
entièrement couverte par le faisceau et la pupille d'entrée partiellement couverte.

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L’effet limitant l’efficacité de fluorescence dépend quant à lui de la puissance du laser

excitateur et du nombre de fois qu’un marqueur sera excité.
Dans le cas d’une molécule, l’absorption à deux photons et la réémission d’un photon sont
liées à des réactions photochimiques. A force de réaliser ces réactions, les liaisons concernées
par la photochimie vont se fragiliser puis céder. Le marqueur ne sera plus utilisable pour la
fluorescence. C’est le photoblanchiement de la transition.
VII Problèmes rencontrés lors de l’excitation d’une molécule photo-blanchiment, photo-
dégradation, saturation, effets thermiques
Suite à son irradiation, une molécule à l’état excité a tendance à être plus réactive d’un point
de vue chimique que dans son état fondamental. Des réactions irréversibles (polymérisations,
oxydations, dissociations, isomérisations, liaisons avec d’autres molécules) peuvent se
produire et donner naissance à des photo-produits. Ces nouvelles espèces créées sont souvent
non fluorescentes ou caractérisées par des spectres d’absorption et d’émission de fluorescence
différents de ceux de la molécule initiale. Ces réactions photo-chimiques se traduisent par une
perte progressive de l’intensité de fluorescence émise par un échantillon. Cet effet est appelé
processus de photo-blanchiment. Certaines espèces peuvent par ailleurs avoir une influence
néfaste sur un milieu biologique vivant. On parle alors de photo-toxicité. Un autre problème
rencontré lors de l’excitation d’une molécule par un rayonnement intense est la saturation de
l’état excité. Ce processus n’est pas en lui-même nécessairement destructif pour la molécule
considérée. La variation de l’intensité de fluorescence émise dans des conditions de saturation
ne varie plus linéairement avec l’énergie incidente et peut ainsi conduire à des erreurs
d’interprétations des résultats obtenus. D’autre part, les effets de photoblanchiment et de
photo-dégradation seront d’autant plus importants que l’intensité incidente sera élevée.
Finalement, l’excitation d’une molécule par un rayonnement intense est à l’origine d’effets
thermiques. Ces échauffements sont dépendants des capacités d’absorption des molécules et
sont générés lors des différents processus de conversion interne. Ils ont évidemment un effet
destructif sur la molécule et son environnement. Ces effets pourront être limités par
diminution de l’intensité incidente. L’excitation de la fluorescence d’une molécule par une
radiation lumineuse peut donc conduire à une dégradation progressive plus ou moins rapide
des molécules absorbantes et de leur environnement local. Ces processus de photo-
dégradation dépendent des densités d’énergie incidente mais aussi des fluorophores utilisés et
de la durée de l’irradiation. Les conditions d’excitation de la fluorescence sont donc à
déterminer précisément de manière à s’affranchir le plus possible de ces effets.

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