CHAP ITRE II :

SPECTROSCOPIE A FLUORESCENCE
Méthodes spectrales Spectroscopie à fluorescence

1- Introduction :

Certains composés organiques ou minéraux, liquides ou solides (cristaux moléculaires ou

ioniques), qu’ils soient purs ou en solution, émettent de la lumière lorsqu’ils sont excités par des
photons du domaine du visible ou du proche ultraviolet. Parmi les applications en analyse de ce
phénomène, baptisé photoluminescence, se trouve la fluorimétrie, une méthode à la fois sélective
et très sensible permettant de très nombreux dosages. L’intensité de fluorescence étant en rapport
avec la concentration de l’analyte, les dosages sont faits à l’aide de fluorimètres ou de
spectrofluorimètres. L’extinction extrêmement rapide de l’intensité lumineuse lorsque l’excitation
cesse, fait également l’objet de mesures à des fins analytiques. Par opposition, la phosphorescence
se caractérise par une décroissance dans le temps beaucoup plus lente. La fluorescence est
également mise à profit dans la conception de détecteurs utilisés en chromatographie liquide. Bien
que l’origine en soit différente, la chimiluminescence, qui consiste en émission de lumière au cours
de certaines réactions chimiques, a reçu quelques applications en chimie analytique.

2- Fluoresce nce et phos phorescence

Beaucoup de composés, lorsqu’ils sont excités par une source lumineuse du domaine du visible ou
du proche ultraviolet, absorbent de l’énergie pour la restituer par la suite sous forme d’un
rayonnement. Certains présentent la faculté plus ou moins prononcée de réémettre quasi-
instantanément à une longueur d’onde plus grande que celle de la lumière d’origine. Ils sont dits
fluorescents (Fig 01 et 02). Lorsqu’on éteint la source, l’intensité lumineuse diminue extrêmement
rapidement en suivant une loi exponentielle.

L’expression 1 relie l’intensité de fluorescence If (t) et le temps écoulé t après l’excitation :

If (t) = If (0) · exp [−kt ] (1)

Cette loi de décroissance s’applique aussi à la phosphorescence. La différence tient à la valeur de

la constante k qui est beaucoup plus grande pour la fluorescence que pour la phosphorescence car
celle-ci décroît beaucoup plus lentement. La durée de vie defluorescence t0 est définie à partir de k
par t0 = 1/k. À l’instant t0 , l’intensité I f(t ) vaut, d’après l’équation 1, 36,8 % de l’intensité de
départ I f(0 ). Autrement dit, un composé fluorescent correspond à l’échelle microscopique à une
population d’espèces individuelles dont 63,2 % sont revenues à un état non émissif après ce temps.
t0 est de l’ordre de quelques nanosecondes. Pour faciliter les mesures de fluorescence, les
instruments courants opèrent en régime stationnaire, c’est-à-dire en maintenant la source
d’excitation allumée, avec, en contrepartie l’obligation évidente de différentier la lumière de la
source et celle de fluorescence.

La figure 1 illustre par un exemple l’apparente symétrie en miroir des spectres d’absorbance et de
fluorescence de nombreux composés. Pour obtenir cette représentation on réunit sur le même graphe
avec une double échelle, le spectre en absorbance et celui en émittance.

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émittance
absorbance
H2 C HC CH CH2
C C

H2 C CH2

Absorption Fluorescence

Longueurs d'onde (nm)

235 285 335

FIGURE 1 : Représentation sur un même graphe des spectres d’absorption et de fluorescence

d’un composé éthylénique.

Le spectre de fluorescence qui ressemble à l’image dans un miroir du spectre d’absorption, ainsi que
le « Stokes shift » peuvent s’interpréter en considérant les diagrammes énergétiques (fig. 1).

Fluorescence résolue dans le temps. L’avènement de sources lumineuses à impulsions ultra-

brèves (lasers picoseconde et diodes laser) permet d’accéder aux courbes de décroissance de la
fluorescence en fonction du temps. De nouvelles applications basées sur la connaissance des durées
de vie en découlent, mais elles sont encore peu nombreuses en analyse chimique.

3- Origine de la fluoresce nce

Soumise à l’excitation lumineuse, la molécule du composé (le soluté, dans l’état électronique
fondamental S0 ), est portée dans son premier état électronique excité S1 . Ses électrons et ceux des
molécules environnantes de solvant se rééquilibrent quasiment instantanément ; mais les positions
des noyaux des atomes en revanche restent identiques à ce qu’elles sont dans l’état fondamental
(c’est le principe de Franck-Condon). Le système soluté/cage de solvant étant ainsi hors-équilibre,
il va évoluer vers une conformation plus stable de l’état électronique excité S1 (Fig. 2). Très
rapidement, (10−12 s), par des processus dits de conversion interne, les molécules rejoignent, sans
émettre de photons, l’état V0 du niveau S1 . Si ce niveau est compatible avec le niveau fondamental
le système peut y redescendre par une étape de fluorescence (10−11 à 10−8 s) au cours de laquelle les
molécules retournent dans un des états vibrationnels de l’état S0 initial en émettant des photons. Au
cours de la fluorescence qui accompagne le retour à l’état initial, la molécule peut conserver une
partie de l’énergie reçue sous forme d’énergie vibrationnelle. Cet excès d’énergie de vibration est
dissipé par collisions ou autres processus non radiatifs baptisés mécanismes de relaxation
vibrationnelle. Il peut se produire également une émission de photons beaucoup moins énergétiques,
à l’origine d’une fluorescence située dans le moyen infrarouge.

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Désacti vati on
non radi ati ve

Absorption Fluorescence Phos phorescence

FIGURE 2 : Diagramme énergétique comparatif de la fluorescence et de la phosphorescence.

Les flèches courtes correspondent à des mécanismes de conversion interne sans émission de
photons. La fluorescence résulte de transferts entre états de même multiplicité (même état de spin),
et la phosphorescence entre états de multiplicités différentes.

L’état T1 produit un retard dans le retour à l’état fondamental pouvant atteindre plusieurs heures.
Le « stokes shift » correspond à l’énergie dissipée sous forme de chaleur (relaxation
vibrationnelle) pendant la durée de vie de l’état excité, donc avant que les photons soient émis.
La situation réelle est plus complexe que ce diagramme un peu trop simplifié, dit de Jablonski,
peut le laisser supposer. À notre échelle, un composé peut être à la fois fluorescent et
phosphorescent car à l’échelle moléculaire les espèces individuelles qui le composent n’ont pas le
même comportement.

 La phosphorescence correspond à un mode de désexcitation plus complexe. Après la phase

d’absorption correspondant au transfert d’un électron dans un niveau S1 (état singulet), on
assiste, si la relaxation vibrationnelle est assez lente, au retournement de spin de l’électron
pour conduire à un état T1 un peu plus stable (état triplet). De ce fait, le retour ultérieur au
niveau fondamental est ralenti puisqu’il implique un nouveau retournement du spin de cet
électron. Les durées de vies peuvent dépasser plusieurs minutes (Fig.2).

 La sensibilité en fluorimétrie est souvent 1 000 fois supérieure à celle que l’on connaît en
absorption UV/visible. Cependant l’usage correct de ces techniques exige une bonne
connaissance du phénomène afin d’éviter de nombreuses sources d’erreurs.

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 La fluorescence est souvent le privilège des molécules cycliques, rigides et possédant des
liaisons p. Elle est augmentée par la présence de groupes électro-donneurs et diminuée avec les
groupes électro-attracteurs (Fig. 3). Elle dépend également du pH et du solvant. Les molécules
non rigides par contre, perdent facilement la totalité de l’énergie absorbée par dégradation et
relaxation vibrationnelle. Par analogie, on peut comparer ce phénomène à l’effet que produit
un coup de marteau soit sur un bloc mou, caoutchouc par exemple, soit sur quelque chose de
dur, comme une enclume. Sur le caoutchouc, l’énergie se disperse dans la masse (échauffement)
et aucun bruit n’est émis, en revanche, sur l’enclume, une partie de l’énergie mécanique est
retransmise vers l’extérieur (rayonnement sonore), phénomène comparable à la fluorescence.

FIGURE 3 : Composés fluorescents aromatiques.

Le nom est suivi du rendement de fluorescence Ff (voir Fig .3) dont la valeur est obtenue de
proche en proche par comparaison avec des composés de fluorescence connue. Les mesures sont
faites à 77 K. La 8-hydroxyquinoléine est représentative de diverses molécules formant des
complexes de chélation fluorescents avec certains ions métalliques.

4- Relation entre fluorescence et concentration

En chaque point de la solution l’intensité de fluorescence est différente parce qu’une partie de
l’intensité de la radiation excitatrice est absorbée avant d’atteindre le point considéré et parce
qu’une partie de la lumière de fluorescence se trouve piégée avant de sortir de la cellule.
Globalement la fluorescence reçue par le capteur du détecteur correspond donc à la résultante des
fluorescences de chacun des petits volumes individuels constituant l’espace délimité par les
fenêtres d’entrée et de sortie. C’est pourquoi le calcul a priori de l’intensité de fluorescence
(émittance If ) de l’échantillon est difficile. Le phénomène d’affaiblissement lumineux appelé «
filtre interne », dû au recouvrement partiel des spectres d’absorption et d’émission (quenching
couleur) est augmenté des transferts d’énergie d’espèces excitées avec d’autres molécules ou ions
étrangers par collisions ou formation de complexes (quenching chimique). Ainsi l’oxygène entraîne
une sous-estimation de la fluorescence.

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Pour les solutions, on définit le rendement quantique de fluorescence Φf (compris entre 0 et 1) par le
rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés, ce dernier étant équivalent au
rapport de l’intensité de fluorescence If sur l’intensité absorbée Ia (relation 2).

(2)

5- Diffusion Rayleigh et diffusion Raman

Si les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont voisines, il peut y avoir risque de confusion
entre la fluorescence de l’échantillon et deux émissions parasites dues au solvant :

5-1- Diffusion Rayleigh

La diffusion Rayleigh est la réémission, à la même longueur d’onde, d’une petite fraction de la
lumière excitatrice dans toutes les directions par le solvant dans lequel se trouve le composé
(Fig .4). Son intensité dépend de la polarisabilité des molécules de ce solvant.

5-2- Diffusion Raman

La diffusion Raman, de 100 à 1 000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient du transfert
d’une partie de l’énergie de la lumière excitatrice aux molécules de solvant sous forme d’énergie de
vibration. Les molécules de solvant réémettent donc des photons de moindre énergie que ceux ayant
servi à les exciter. Par rapport à la diffusion Rayleigh, le pic de diffusion Raman est déplacé vers les
grandes longueurs d’onde. Pour chaque solvant la différence d’énergie entre les photons absorbés et
les photons réémis est constante, si bien qu’en modifiant la longueur d’onde d’excitation, on déplace
la position du pic Raman (Tab. 1 et Fig. 4).

Tableau 1 : Positions des pics Raman, calculées pour quatre solvants usuels et cinq longueurs
d’onde excitatrices d’une lampe à mercure

Excitation 254 313 365 405 436 écart

(nm) (cm −1 )
eau 278 350 416 469 511 3 380

ethanol 274 344 405 459 500 2 920

cyclohexane 274 344 408 458 499 2 880

chloroforme 275 346 410 461 502 3 020

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La diffusion Raman de l’eau sert de test de sensibilité des fluorimètres. Celui-ci consiste à
mesurer le rapport signal/bruit du pic Raman avec une cellule remplie d’eau, par exemple à 397 nm
(25 191 cm−1 ) si l’excitation est réglée à 350 nm (28 571 cm−1 ), par suite du décalage de 3380cm −1
propre à ce solvant.

FIGURE 4 : Les diverses composantes d’un spectre de fluorescence.

La position de la raie Raman dépend de la longueur d’onde de la raie excitatrice et du solvant.

À droite, test de sensibilité d’un fluorimètre.

La fluorescence n’est pas seulement mise à profit à des fins d’analyse. C’est ainsi qu’on ajoute
aux poudres à laver le linge un additif fluorescent destiné à s’accrocher aux fibres textiles. Ce
composé absorbe les radiations solaires invisibles pour l’œil et restitue l’énergie captée sous forme
de radiations de plus grande longueur d’onde, dans la partie bleue du spectre visible.

6- Instrume ntation

Le composé fluorescent qui fait l’objet du dosage se comporte comme une source qui irradie
dans toutes les directions. Par construction, l’appareil recueille en général la lumière émise suivant
un axe qui est perpendiculaire au faisceau de la lumière en provenance de la source excitatrice.
Pour les solutions fortement absorbantes, l’observation peut se faire dans le prolongement du
faisceau incident et pour les échantillons opaques ou semi-opaques dans une direction frontale sous
un angle variable (Fig. 5). La source excitatrice est souvent constituée par une lampe à arc xénon
de 150 à 800 watts. La mesure de l’intensité lumineuse est faite par un photomultiplicateur ou une
photodiode.
Le solvant, la température, le pH et la concentration sont autant de paramètres qui interviennent
sur les intensités de fluorescence.
Certains gaz à l’état de traces dans l’atmosphère terrestre sont quantifiés à partir de leur
fluorescence rétrodiffusée, induite par excitation d’une très courte impulsion (1 ms) d’un puissant
laser monochromatique qu’il est possible d’accorder sur une longueur d’onde spécifique du
composé recherché (dispositif appelé lidar).

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Source M onoc hrom at eur Éc hantillon

d'excitation

IF

M onoc hrom at eur

Détecteur
d'émission

FIGURE 5 : Agencement des différentes composantes d’un spectrofluorimètre et lampe

à arc xénon.

La fluorescence est mesurée en régime permanent « steady state », en maintenant l’excitation, à la

différence de l’étude de la fluorescence dynamique. Deux géométries, angle droit et angle aigu,
sont utilisées pour l’examen de la lumière émise. Modèle de lampe à arc xénon. La pression de xénon
dans la lampe est d’environ 1 MPa. Ces lampes à arc sans filament, à enveloppe en verre de silice,
sont des sources de « lumière blanche ». La cathode correspond à l’électrode la plus fine.

Deux grandes catégories d’appareils sont proposées par les constructeurs :

➤ les fluorimètres à rapport de fluorescence,
➤ les spectrofluorimètres.

6-1- Fluorimètres à rapport de fluorescence (méthode ratiométrique)

La lumière émise par la source traverse d’abord le monochromateur d’excitation qui permet de
sélectionner la bande étroite de longueurs d’onde (15 nm) qui va servir à exciter l’échantillon. Une
partie de la fluorescence émise par le composé est captée dans une direction perpendiculaire ou
parallèle (selon les modèles) au faisceau incident. Cette lumière traverse le monochromateur
d’émission qui sélectionne la longueur d’onde de mesure avant d’atteindre le détecteur. De
nombreux constructeurs commercialisent des modèles avec filtres (Fig. 6). Ces appareils sont de
type monofaisceau. Ils comportent un compartiment à tourelle dans laquelle sont placées à la fois
les cuves contenant les solutions étalons, l’échantillon ainsi qu’une cuve remplie d’un composé à
usage de standard fluorescent. En alternant sur le trajet optique les solutions étalons et échantillon
et le standard fluorescent on me- sure le rapport de fluorescence qui sert à la fois à construire la
courbe d’étalonnage et, pour l’échantillon, de paramètre de mesure. On élimine ainsi les
fluctuations possibles de la source et bon nombre de paramètres de réglage de l’appareil. Les
standards courants utilisés dans cette méthode ratiométrique sont généralement des solutions de
sulfate de quinine, de rhodamine B ou de 2-aminopyridine.
L’emploi d’une lampe flash xénon comme source permet d’étudier la fluorescence après extinction
de la source. Cette méthode est connue en immunologie où les complexes fluores- cents obtenus
avec les sels de lanthane ont une durée de vie de fluorescence d’environ 1 ms, suffisante pour être à
l’origine de dosages très sensibles (de l’ordre de la picomole).

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FIGURE 6: Schéma optique simplifié d’unfluorimètre à lecteur de micro-puits.

Une fibre optique amène la lumière excitatrice au niveau du puits choisi et une seconde fibre récupère
la fluorescence, ici sous une géométrie frontale. Pour le contrôle des résultats en chimie combinatoire
et autres méthodes de screening en immunologie/enzymologie, ces fluorimètres peuvent recevoir des
microplaques comportantde 6 à 384 puits.

6- 2- Spectrofluorimètres

Les spectrofluorimètres sont dotés de fonctions qui leur permettent l’étude plus complète des
composés fluorescents, notamment par l’enregistrement de leurs spectres d’émission et d’excitation
(Fig. 7). Ils disposent de deux monochromateurs motorisés pouvant balayer chacun une bande
spectrale. On obtient le spectre d’émission en maintenant la longueur d’onde d’excitation fixe, et le
spectre d’excitation en maintenant la longueur d’onde d’émission fixe.

Les spectrofluorimètres disposent de logiciels qui peuvent déterminer automatiquement le meilleur

couple de longueurs d’onde excitation/émission.

Manuellement le processus peut se faire par la méthode dite « un seul facteur à la fois » :

➤on enregistre le spectre UV du composé avec un spectrophotomètre UV/VIS ;

➤ on règle le monochromateur d’excitation à la valeur correspondant au maximum du spectre
d’absorption ;
➤on enregistre le spectre de fluorescence ;
➤ on règle le monochromateur d’émission à la longueur d’onde du maximum de fluorescence et on
fait varier la longueur d’onde d’excitation. On obtient le spectre d’excitation qui permet un
meilleur choix final de la radiation excitatrice (qui peut être distincte de celle correspondant au
maximum d’absorption du spectre UV).

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FIGURE 7 : Schéma du spectrofluorimètre Shimadzu F-4500.

Une fraction du faisceau incident, réfléchie par un miroir semi-transparent, arrive sur une
photodiode de référence. La comparaison des signaux des deux détecteurs permet d’éliminer la
dérive de la source. Ce procédé à un seul faisceau permet d’obtenir la stabilité propre aux
appareils à double faisceau. Les spectres présentent souvent des petites différences lorsqu’ils
proviennent d’appareils différents (reproduit avec l’autorisation de la société Shimadzu).

Certains instruments permettent la mesure des durées de vie de fluorescence, bien que celles-ci
soient très courtes. Il existe plusieurs méthodes basées soit sur l’enregistrement de la courbe de
décroissance de la lumière émise lorsque l’excitation a cessé, soit sur la comparaison de la
modulation de la fluorescence en fonction d’une modulation rapide de l’excitation. La première
méthode impose d’utiliser une source pulsée (laser) et la seconde une source modulée de fréquence
élevée. En analysant le signal obtenu (modulation et phase) en fonction de la fréquence de la source
excitatrice, il est ainsi possible de calculer la durée de vie de fluorescence.

7 - Que lques applications de la fluoresce nce

En dehors des molécules possédant une fluorescence naturelle (moins de 10 % de l’ensemble des
composés), beaucoup peuvent le devenir par le biais d’une modification ou d’une association avec
une autre molécule fluorescente. On peut greffer par exemple sur l’analyte un réactif fluorophore
par réaction chimique (les 7-hydroxycoumarines peuvent être utilisées à cet effet). C’est la
dérivation de fluorescence, qui rappelle le procédé employé en colorimétrie.

Pour doser les métaux sous forme de cations, on forme des complexes de chélation avec l’oxine
(8-hydroxyquinoléine), l’alizarine ou la benzoïne, extractibles par les solvants organiques.
En biochimie, la fluorescence trouve de nombreuses applications pour quantifier les protéines ou
les acides nucléiques au moyen de réactifs qui se fixent spécifiquement sur ces composés. Cette
approche, quelquefois très élaborée, en association avec l’électrophorèse, constitue une alternative
plus sensible et moins contraignante que la révélation au moyen de substrats radioactifs.

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La chimifluorescence (à ne pas confondre avec la chimiluminescence) est également un moyen

particulièrement sensible de détection de protéines spécifiques. On doit disposer pour cela d’un
anticorps spécifique porteur d’un conjugué enzymatique, tel une phosphatase (Fig. 8). Mis en
présence d’un substrat tel un dérivé phosphaté de la fluorescéine, il y a libération de cette dernière
facile à mettre en évidence par sa fluorescence déclenchée par une source excitatrice.

FIGURE 8: Processus d’un dosage de protéine par chimifluorescence en biochimie.

En analyse par CLHP, on peut ainsi marquer les amines (avec d’autres coumarines), ce qui
permet des seuils de détection extrêmement bas, de l’ordre de l’attomole (10 −18 M). Parmi les
applications classiques actuelles de la fluorescence, figurent les dosages des hydrocarbures
polycycliques aromatiques (« HPA ») dans les eaux de consommation, par CLHP. Dans ce cas, le
détecteur est muni d’une cellule de fluorescence à circulation, installée en aval de la colonne du
chromatographe. Ce mode de détection est particulièrement bien adapté pour atteindre les seuils
très bas imposés par la législation. Ce même procédé permet de doser également les aflatoxines,
ainsi que de nombreux autres composés organiques.

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