Cours de Chimie Analytique

Jean-Luc Vialle
jluc.vialle@gmail.com 2009-2010
 Objectifs
• Maitriser les techniques utilisées dans les
domaines:
- De l’agroalimentaire (lipides, glucides,
protides)
- Connexes à la production
(environnement, culture, élevage)
• Approfondir quelques techniques majeures et
discriminatives
 Sommaire

• Panorama des techniques

• La Quantification et l’Echantillonnage
• La Chromatographie
• L’HPLC et La CPG
• L’ Absorption Atomique et L’ Absorption Moléculaire
 Déroulement - Contrôle
• 5 Interventions: Cours
• 1,5 TD + 0,5 TD Projet
• 1 Projet (TP)
• 1 contrôle

• Claroline: Chimie Analytique

– Documents (cours + Power-Point)
– Forum (Questions)
 Chapitre N°1

Panorama des techniques

analytiques
 Sommaire
• Introduction
Les environnements Recherche, R&D,
Production
• Contraintes des analyses
Personnel, Matériel, Normatives,
Economiques
• Classifications des techniques
Propriétés, Etat, Seuil, Cibles
 I°) Introduction
• Objectifs: Adéquation entre
un‘produit’ et un cahier des charges et/ou
une législation.
• Moyens: Quantifications +/- précises
de différents paramètres
• Paramètres: Sensoriels, Physiques,
Chimiques µ biologiques
liés à la matrice, à la
molécule
• Représentativité: Analyse, Echantillonage,
Extraction, Conservation.
• Adaptation de la méthode au résultat
attendu
• Ciblage des paramètres en fonction des
objectifs et de l’environnement
- Recherche
- Recherche et Développement
- Production
 11 L’environnement Recherche
• Objectifs: Structurale / Evolution
• Mots Clefs: Liés au produit
Nature, Origine, Matrice,
Etat, Pureté
• Moyens: Techniques Lourdes
disponibles en Centre de Recherche ou en
externalisation

• Obligations de moyens: Pas / peu de

contraintes économiques et temporelle
 12 L’environnement R&D

• Objectifs: Quantification 2 phases:

a) Centrée sur le produit
+ Niveau de détection

b) Transposition en production :
Contraintes normatives
• Moyens plus softs
• Techniques globales / discriminatives
 13 L’environnement Production

• 3 mots clefs: Simplicité - Durée - Coût

• Nouvelles contraintes: Obligations -
Références - Externalisation - Qualification
• Techniques mises en œuvre :
Liées à la valeur ajoutée du produit:
Faible  Globale
Elevée  Discriminative
 II°) Contraintes des analyses

• Liées au personnel
• Liées au matériel
• Liées aux méthodes
• Liées à l’aspect économique et à l’aspect
délai
 21 Personnel compétent
• Production : Faibles compétences 
Analyses simples (globales)
 Automatisation
• Laboratoire d’analyse: Niveau de
compétence + élevé  Analyses
discriminatives  Automatisation
• Laboratoire de recherche: Niveau de
compétence très élevé  Interprétation
des analyses
 22 Contraintes matérielles
• Coût d’investissement:
- Routine (Production) : 15.000 Euros
- Analyse discriminative: 15.000 Euros
par ligne d’analyse

- Analyse structurale:
Quelques centaines de milliers d’Euros
par technique.
• Coût de fonctionnement et de maintenance
 23 Contraintes Normatives et Légales
• Normes ISO, Afnor, Din, Asae…
font références et sont incontournables
si obligations légales
• Méthodes officielles: AOAC
pallient l’absence de normes
• Méthodes interprofessionnelles
Ex: Test de sédimentation de
Zélény, saccharimétrique dans
l’industrie sucrière, MS chez la
pomme de terre.
• Méthodes internes (propres à l’entreprise)
 24 Contraintes économiques et temporelles
• Liées à l’aspect légal ou marketting de
l’analyse.
• Liées à l’impact sur la production
(Immobilisation)
• Internalisation / Externalisation de l’analyse
 Impact sur le délai et sur le coût
• Liées au volume d’activité de l’entreprise et
à la valeur ajoutée de la production
• C < 15 Euros , D < 3 jours
MS, pH, Gravimétrie, Brix, tests simples
• 15 < C < 50 Euros, D < 3 jours
Titrimétrie, Complexiométrie, AA,
Absorption moléculaire
• 100 > C > 50 Euros, D < 3 jours
Techniques chromatographiques
internalisées, simples
• C > 100 Euros, D > 1 semaine
Analyse thermiques, structurales, analyses
chromatographiques externalisées
 III°) Classifications des techniques
• Selon les propriétés du soluté (matrice).
• Selon le caractère ‘destructif’.
• Selon l”état de la matière.
• Selon le seuil de détection
• Selon le caractère discriminant de l’analyse
• Selon la ‘cible’ visée dans la molécule
• Propriétés du soluté (matrice)
Chimiques et µbiologiques - Physiques - Mécaniques -
Thermiques - Optiques - Electriques - Magnétiques -
Physico chimiques - Energétiques - Fragmentation
• Caractère destructif / non destructif
MEB, RX, RMN du solide, Near FTIR
• Etat de la matière: S, L G
• Seuil de détection:
– 0,1% (1000 ppm)
Titrimétrie - Thermiques - IR - RMN - Gravimétrie
- 1 ppm:
AA, AM , Chromatographie…

• Global / Discriminant: Titrimétrie / Séparatives

 Classification selon la ‘cible’
• Molécule =  atomes et ou de groupes
fonctionnels liés entres eux par des électrons.
• Atome =  noyau + électrons
• Propriétés physiques , chimiques +/-
spécifiques et des Propriétés physico-
chimiques spécifiques  Techniques
Séparatives
• Possibilité de la casser par apport d’énergie
mécanique (chimique)  analyse
élémentaire , Spectrométrie de masse.
• Possibilité de modification de la molécule
par apport d’énergie sous forme thermique
 ATD, ATG, DSC, Fusion…
• Possibilté d’action sur les molécules et ses
atomes constitutifs par apport d’énergie
sous forme lumineuse E = h = hc / 
En fonction de l’énergie apportée, on agit sur
des cibles différentes: SAA, IR, Absorption
moléculaire
• µ onde et ondes radio 3 106 nm
Modification de la matrice
• Infra-Rouge de 2500 à 1000 nm
Vibration des atomes constitutifs des
liaisons
• Visible de 800 à 400 nm
Excitation des electrons constitutifs des liaisons
(les plus mobiles). Excitation des electrons atomiques
• UV de 350 à 200 nm
Excitation des électrons constitutifs des liaisons (les
moins mobiles)
• RX et rayons  < 3 nm
Arrachage des electrons constitutifs
 Propriétés moléculaires et ioniques
+ / - Spécifiques

Propriétés Chimiques

Réactivité pH métrie Potentiométrie

Chimique

Argentimétrie Periodimétrie
Réaction spécifiques Complexiométrie

Manganimétrie Chromimétrie

Cérimétrie Chlométrie
Iodométrie
Bromométrie
 Propriétés moléculaires et ioniques
+ / - spécifiques

Propriétés Physiques

Constitutives Physiques Thermiques Optiques Electriques

P, V, m...

Analyse élémentaire Gravimétrie Calorimétrie Analyse Thermique Réfractométrie Conductimétrie

Densimétrie Polarimétrie Ampérométrie

Ebullioscopie A.T.D

Volumétrie Cryoscopie A.T.G Voltamétrie

D.S.C
Tonométrie Coulométrie

Polarographie

Electrodes
spécifiques
 Propriétés Moléculaires et Ioniques
Sélectives

Intéractions Physicochimiques

Chromatographie Electrophorèse

Surface Volume Surface Volume

C.P C.C.M HPLC CPG Papier Gel Electrophorèse

HP CCM Phase liquide Phase gazuese capillaire
 Propriétés Energétiques des molécules
Spécifiques

Cible utilisée
(E croissante)

Molécule Atome

Vibration des atomes Excitation des Excitation des

e- de covalence e- atomiques

Spectroscopie Spectroscopie Absorption Fluorimétrie

Infra-rouge Raman moléculaire Emission Absorption
UV - Visible atomique Atomique

Flamme Flamme
Froide

Torche à Four
Plasma
 Propriétés du
Noyau Atomique

Propriétés du noyau
et de l'atome

Magnétiques Radioactives Physiques

R.M.N Scintigraphie Microscopie Diffraction X

Electronique
à balayage
Chapitre N° 2

La quantification
 Sommaire
• Introduction
Les calculs d’incertitudes
• Les méthodes ‘Absolues’
Methodes directes
Dosages chimiques
• Les méthodes comparatives
Etalonnage interne et externe
Les ajouts dosés
• Conclusion
 I°) Introduction
• Analyse = Quantification
• Structurale = Identification
• Rappels sur les incertitudes
Incertitudes absolues  n x
Incertitudes relatives  x /x
 II°) Les méthodes ‘absolues’
• Mesure de paramètre physiques
Exemple Taux de cendres NF V 18-101
• Méthodes basées sur l’application d’une loi
simple
Exemple ; L’amidon (3ème directive du JO
du 23/11 1980)
• Méthodes basées sur des réactions chimiques
• Acido-basique
• Rédox
• Complexiométrie - Précipitation

• Conservation du nombre d’équivalents

échangés
• Méthodes à point final
• Méthode directe: (NF T 60-204)
• Méthode en retour (NF V 18-100)
 III°) Méthodes comparatives
• Etalonnage externe

• Etalonnage interne

• Méthode des ajouts dosés

 31 Etalonnage externe
• Pas de dépendance d’un facteur extérieur

• Application au dosage du phosphore soluble

dans les terres (NF X 31-161)
– Etalonnage
– Exploitation des résultats
– Avantages et inconvénients
 32 Méthode de l’étalonnage interne
• Domaine d’utilisation
• Principes
• Application à l’analyse des FAME (NF T 60-234)
• Avantages et inconvénients
• Choix de l’étalon interne
 33 Méthode des ajouts dosés
• Analyse de traces

• Application en absorption atomique

• Application en chromatographie

• Avantages et inconvénients
Chapitre N° 3

Introduction à la
Chromatographie
 Sommaire
• Introduction
• Aspect thermodynamique
• Aspect cinétique
• Facteurs liés à la chromatographie
 I°) Introduction
• Technique séparative
• Dualité Analytique / Préparative
Lié à la valeur ajoutée
• Les différents états de la matière
solide – liquide – gaz – critique
• Classification des techniques séparatives
- Suivant les forces mises en jeu
- Suivant l’état de la matière
 Forces

Barrières
Gravitationnnelles Electriques Thermiques Magnétiques Semi-perméables Physico-chimiques

Diffusion Spectrométrie
Centrifugation Electrolyse Filtration Extraction Chromatographie
thermique De Masse

Décantation Diffusion
Electrophorèse Osmose
Gazeuse

Dialyse

µ, nano filtration
 Nature des phases

Gaz - Gaz Gaz - Liquide Gaz - Solide Liquide - Liquide Liquide - Solide Solide - Solide

Diffusion Distillation µ filtration Chromatographie Chromatographie Tri

Chromatographie Sonification Chromatographie Extraction Distillation Filtration Recristallisation

Chromatographie Chromatographie
 Un peu d’histoire…
• Khrômatos = Couleur Graphikos = Tracé
• 1903 Tswett: CaCO3 Colonne ouverte
• 1940 Martin et Synge : Théorie de la
partition
• 1950 Snyder: Théorie de l’adsorption
• 1950 Martin et James CPG
• 1960 CCM
• 1970 HPLC et phase inverse
• 1975 CPG Capillaire
• 1985 HPLC en phase supercritique
 Glossaire
• Soluté: Espèce à séparer / à doser
• Solvant: Solubilise le soluté
• Eluant: Phase mobile
• Eluat: Phase mobile (+ soluté)
• Phase stationnaire:
Phase immobilisée dans le
système chromatographique
 Schéma d’un chromatographe
Réserve Système de Injecteur
Eluant Mobilité
Passeur

Gradient Séparateur

Micro
Proesseur
Détecteur

Traitement
du signal
Collecteur
 Classification des techniques
chromatographiques
• Suivant la technologie: Surface / Volume
• Suivant la nature des phases:

Phase mobile: Liquide ou Gazeuse

(Critique)

Phase stationnaire: Solide ou Liquide

immobilisé
 Récapitulatif
Phase Phase Technologie Application Principe
Mobile Stationnaire

Liquide CPG Partage

Gaz Volume G/L
Solide CPG Adsorption
G/S Exclusion
Surface CCM Partage
Liquide L/L
Volume HPLC Partage
Liquide L/L
Surface CP Adsorption
Solide L/S Exclusion
Volume LC, HPLC Adsorption
L/S Exclusion
 II°) Aspect Thermodynamique
Théorie des plateaux
• Un soluté P qui se distribue entre les deux phases stationnaire
et mobile = Equilibre K = [P]stat / [P]mob
• K varie avec la force des interactions
• Objectif: Multiplication du nombre d’équilibre : n
• Ecoulement discontinu ; 1 plateau = 1 équilibre
• y = fraction de P (stat) et x = fraction de P (mob) k’ =
y/x = cste x + y = qo = 1

0 1 2 3 ….. p … n-2 n-1 n

 Evolution du soluté P
Injection
n 0 1 2 n-1 n
Stat. 1 0 0
Mob. 0 0 0

Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Stat. y
Mob. x
 Transfert
n 0 1 2 n-1 n
Mob 0 x 0
Stat y 0 0

Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy x²
stat y² xy
 Transfert
n 0 1 2 n-1 n
Mob 0 xy x²
Stat y² xy 0

Equilibre
n 0 1 2 n -1 n
Mob xy² 2x²y x3
Stat y3 2xy² x²y
 Généralisation
• Après n transferts:
Le soluté se disperse suivant une
loi du type (x + y)n
• Facteur de capacité:k’ = y / x Grandeur
caractéristique d’un soluté dans un système
chromatographique donné
• Qnp = f(n,p, q0)
Equation
d’une Gaussienne Courbe à
maximum
• Après n transferts, la phase mobile a
parcourue une distance ln et l’extrémum se
situe à une distance lp tel que

lp / ln = 1 / (1+k’)

• Soit en terme de vitesse

vp / vn = 1 / (1+k’)
• Soit t = Cste On mesure l Surface

• Soit l = Cste On mesure t Volume

 Quelques grandeurs fondamentales
• Temps de rétention:Apparition de l’extrémum
Tr = T0 (1+k’)
• Temps de rétention nulle:Soluté non retenu
T0
• Rf Rf = lp / l0

• Efficacité : N = Nb de plateaux théoriques

• HEPT: H=L/N
 Séparation de plusieurs solutés
• Sélectivité = k’2 / k’1 Traduit la différence
d’affinité pour 1 et 2

• Résolution Rs Traduit la séparation entre

deux pics chromatogaphiques
 III°) Aspect Cinétique
• Ecoulement Continu : Déformation des pics:
• Transfert de système chromatographique et
Transposition: Notion de grandeurs réduites (l,
h et vitesse réduite)

• Si l, h et la vitesse réduite sont constant, N

est constant
 Mécanismes de Dispersion
• Knox (HPLC) et Van Dempter (CPG)

• H=A+B/u+Cu
• A = Anisotropie d’écoulement
• B = Diffusion longitudinale
• C = Résistance aux transferts de masse
• U = vitesse linéaire de la phase mobile
• Optimisation
IV°) Facteurs liés à la chromatographie
• La température: Fondamental
k’ est fonction de T
Si T augmente k’ diminue
• La composition de la phase mobile (HPLC -
CCM)
• Le débit de la phase mobile (u)
• Loi de Darcy: Perte de charge dans un
écoulement à travers un tube rempli
 Chap N°4 La CPG
Sommaire
• Introduction
• Les phases stationnaires en colonne remplie
• Transposition colonne remplie / colonne
capillaire
• L’injection
• La détection
• La dérivatisation
 I°) Introduction
• 1ère technique développée dès 1950
• Simplicité de mise en œuvre
• Rapidité des analyses complexes
• Matériel disponible et peu onéreux
• Nombreuses applications :
• NF T60-234 FAME Carbowax 20
M DB 20 F.I.D NF T60-237 BHA
et BHT DC 200 CP Sil 5F.I.D
 NF T90-120 PcB et Organo-chlorés OV17
DB5 ECD
NF T90-121 Atrazine et Simazine DB5
Thermo ionique
NF T90-125 COV halogénés
Carbowax 1500 CPSil 5 ECD

Nombreuses autres applications - Gaz

Permanents Porapak
Catharomètre
- Solvants résiduels – Composés volatils -
Résidus d’incendies – Arômes – Huiles
essentielles….
 II°) Les phases stationnaires en colonne
remplie
• Colonne remplie = Tube + Support +
Phase Liquide Imprégnée (Solide)

• Tube: 2 m 1/8ème ‘’ Inox

• Support: Diatomées P, W, G Granulométrie 80-
100 mesh (175-150µm) Pertes de charge
faibles (1-2 bars) Taux d’imprégnation
10 - 30%
Traitements: Tamisage, AW, TMCS
 21 Les phases stationnaires
• Les hydrocarbures ramifiés
référence : Polarité nulle
• Les Polysiloxanes et polysiloxanes substitués:
R = CH3,
Phényl, Cyanopropyl… Polarité très
faible (DB1, 100% de CH3) à très forte (CP
Sil 88, 100% de cyanoéthyl)
Référence en capillaire
• Les polyéthylènes glycols (carbowax 20M,
FFAP..) équivalence CP Wax, DB 20
• Les Polyesters: Polarités intermédiaires et
fortes (DEGS, EGA….)

• Les Adsorbants Tenax, Carbopack, Tamis

moléculaires
• Classification selon la polarité
• Equivalence entre remplie et capillaire
 22 Les indices de Kovat’s
• Série homologue: log10 Tr’ = an + b

• Notion de droite de similitude: -

Prédiction de la rétention -
Approche d’identification

• Application à la série des n alcanes -

Notion d’indice de rétention
 23 Classification suivant la polarité
• Constantes de Mac Reynolds – Rohrschneider

– 1 phase de référence : Squalane P = 0

– 5 solutés de référence:
Benzène X’ n Butanol Y’ MeCOPr Z’
Nitropropane U’ Pyridine S’
Cste de Mac Reynods = Différence d’indice de rétention du
soluté entre la phase et la référence
Polarité = Somme des cstes de Mac Reynolds des cinq solutés
(Existence de 3+2 autres solutés références)
 Exemples
Phase X’ Y’ Z’ U’ V’ Somme

Squalane 0 0 0 0 0 0
SE 30 15 53 44 54 41 217
OV 17 119 158 162 243 202 884
FFAP 340 590 397 602 627 2546
OV 275 666 1001 895 1177 1099 4838
 24 Choix raisonné des phases
stationnaires
• Classification des solutés en 5 catégories
Liées à la polarité

• Classification des phases en 4 catégories

Liées à la polarité

• Associations par catégories: -

Apolaire – Apolaire - Polaire –
Polaire -
Moyennement polaire – Moyennement polaire
 III°) Transposition
Colonne Remplie / Colonne Capillaire
Remplie Capillaire

Phases Variées Variées

(mais +
restreint)
Longueur 2m 10 - 100 m
Perte de charge 1 bar / m 1 bar / 50 m
Diamètre 1/8 ‘’ 0.32 et 0.25 mm
1/4 ‘’ 0.53 et 0.1 mm
 Classification
• Colonnes de Golay:
-
COT et WCOT : Wall Coated Open Tubular - SCOT :
Support Coated Open Tubular - PLOT : Porous
Layer Open Tubular - Micropacked
Columns
• Perméabilité k importante : Efficacité importante et
vitesses linéaires importantes soit tr faibles
• B = VG/VL 2 à 10 x supérieur / remplie
• B= dc / 4ef et tr = t0 (1 + K / B)
• Si B augmente : tr diminue ; possibilité de
diminuer la température
B
élevé: Analyses rapides : substances
lourdes B faible:
Substances volatiles

• Epaisseur du film: De l’ordre du micron

• Tr augmente en f(Log e) e x 2 = Tr (-15°)
• Films minces et films épais
• Films Minces: 0,15 < e < 0,5 µm Avantages:
Meilleures performances Réduction du temps
d’analyse Possibilité d’analyse de composés ‘lourds’
Inconvénients:Charges + faibles : restreint
la possibilité d’analyse de traces - Interactions avec la
surface
• Films Epais: e > 1 µm
Avantages: Analyses de traces Analyses de
volatils
Inconvénients Pb de Bleeding (e > 5µm)
• Diamètre: Wide Bore = Remplie
Narrow bore: Analyses courtes : Couplage GC /
MS
 IV°) L’injection
• Colonne remplie: Injecteur à Septum
Volume injecté: 0,5 à 1 µl Gaz :
100 µl à 500 µl Head-
Space (Statique et dynamique)
• Colonne capillaires: Charges + faibles Utilisation
de diviseurs - Split /
Splitless - On
column - Injecteur
de verre
 V°) La détection
• 2 classes de détecteurs: I:
Réponse proportionnelle à la concentration
Catharomètre, E.C.D
II : Réponse proportionnelle au débit
massique: F.I.D , N.P.D
• Sélectivité : Universels / Spécifiques
• Quantité minimale détectable : variable de (1-
10 ng) TCD à 0,1 pg ECD
(30-100 pg) FID
• Catharomètre: Pont de Wheastone (I)
Universel Gaz permanents

• F.I.D: Combustion (II)

Universel (sauf incombustibles) Notion de
Make-up

• E.C.D Capture d’électrons (I)

Spécifique: Dérivés Halogénés

• N.P.D Thermoionique (II)

Spécifique: Dérivés N et P
 VI°) La dérivatisation
• Objectifs: Volatilisation des espèces
Amélioration des analyses
(trainées de pic)
Amélioraion des résolutions
• Méthodes:
Estérification :
Diazométhane, BF3/CH3OH
Silylation : TMCS / HMDS
obtention d’éthers, d’esters
silylés volatils: Pb H2O
 Chapitre N°5
La chromatographie Liquide
L’adsorption
Le Partage
 Sommaire
• La chromatographie d’adsorption
Théorie de Snyder
Facteurs liés à la phase stationnaire, la
phase mobile et le soluté
• Le Greffage
• La chromatographie en phase inverse
• La chaîne chromatographique
 I°) Introduction
• Le dosage de l’aflatoxine B1 dans les aliments pour
animaux (NF V 18-200)

Extraction Liquide / solide au CHCl3

Purification Colonne ouverte de gel de silice (50-200
µm) conditionnée dans CHCl3 – Lavage à l’éther
Désorption avec CHCl3 / CH3OH (97/ 3)
Chromatographie Monodimensionnelle sur silice:
Phase mobile: CHCl3 / Acétone (90/10) Ether /
méthanol/ eau (96/3/1)
Lecture visuelle / Fluorodensitométrique
 II°) La chromatographie d’Adsorption
• Supports solides polaires:
Silice Caractère acide
Alumine Caractère basique

Utilisables en CCM, HPLC, colonne ouverte

Principe: Formation de liaisons H entre le

support et le soluté. (interactions)
• Phases mobiles : peu polaires

• Applications analytiques:
– Fonctionnalités Différentes
– Isomères
– Solutés peu et moyennement polaire
• Applications en extraction (purification)
Fixation des espèces plus polaires
• Ordre d’élution: suivant l’ordre de polarité
• Faible coût – Pb de la phase mobile
 21 Mécanismes d’adsorption
• Adsorption / désorption en surface
• Equation de Snyder
• log k’ = log Va + B*(E° - As °) + log (Wa/Vm)
• k’ = facteur de capacité

– Phase stationnaire: Va, Wa et Vm , B*

– Phase mobile: B* , °
– Soluté: As et E°
 Facteurs liés à la phase stationnaire
• Va, Wa et Vm Liés à la taille des particules et
au remplissage
Peu
d’actions Influence
la transposition Surface /
volume
• B* Etat d’activité de l’adsorbant (0<B*<1)
Séchage des plaques et conservation au
dessicateur
 Facteurs liés à la phase mobile
• ° et B*
• B* liée à la teneur en eau de la phase mobile
Solvant isohydrique utilisation
d’acide et de base pour réduire l’activité
• °: Force éluante Série éluotropique si °
Augmente, alors Rf augmente
 (k’ diminue)
Développement isocratique et en gradient de
concentration.
Utilisation de mélanges binaires et ternaires
 Facteurs liés au soluté
• As et E°
• As: surface spécifique : Pas d’action si ce n’est
une dérivatisation
Changement de la nature du soluté et des
interactions
• E°: même remarque
 III°) Le greffage
• Adsorption
Contraintes
Activité du support
Isohydrie de la phase mobile
Limites
2 types de phase : Silice (alumine)
échelle de polarité limitée
problèmes de traînées de pics
• 1970 Le greffage
 II°) Le Greffage
• Modification du support siliceux par greffage
chimique d’espèces liquides: Si-OH
Si-O-Si-R R=
Alkyl (C18, C8, C3, C2)
Phényl
Amino alkyl
Nitro alkyl
Diols , Cyano….
• Notion de chromatographie de partage
• Echelle de polarité inversée / Adsorption
• End-Capping
Soluté Polaire Moyennement Moyennement Non
Polaire Polaire Polaire

Eluant Moyennement Très Fortement Moyennement

Faiblement
Polaire Polaire Polaire
Polaire
CH2Cl2 / CH2Cl2 / CH30H / H20 CH30H / H20
Exemples Hexane Hexane 40 / 60 90 / 10
80/20 5/95

Partage Partage Partage Partage

HPLC Phase Phase Phase Phase
Normale Normale Inverse Inverse
NH2, CN, NH2, CN, C18, Phényl C18, Phényl
 IV°) La Phase Inverse

• Application : Dosage de 6 PAH (µ polluants) en phase aqueuse

NFT 90-115 : Fluoranthène, Benzofluoranthène b et k; Benzopyrène a; (10
ppb) Benzopérylène, Indénopyrène (50 ppb)
• Extraction au cyclohexane - Concentration à 1ml sous vide
• Purification sur colonne d’alumine
• Concentration à sec et reprise dans 1ml de solvant:
• Phase stationnaire: RP 18, Lichrosorb C18 L = 250 mm Diam:
¼ ‘’
• Phase mobile: CH3-CN / H2O (85/15 ; 90/10) Débit: 1ml mn-1
• Injection 20 µl
• Fluorimétrie: Excitation 360 nm Emission > 420 nm
 La phase stationnaire
• Apolaire Lipophile = Hydrophobe
• Nature du greffon: CH3-(CH2)n-CH2-
si n augmente: La rétention augmente
• Nombre de greffon: Plus le taux de greffage
est élevé, plus la rétention est importante
• Généralisation à la surface hydrocarbonée
• Pratique: Entre 8 et 15 % de Carbone
 La phase mobile
• Base: H20 + CH3OH ou H20 + CH3CN
Attention à la perte de charge (Darcy)
• Utilisation éventuelle de modificateurs:
THF, Acétone, CHCl3… Attention
à la détection
• Influence de la teneur en eau : La rétention
augmente avec la teneur en eau
• Elution en mode isocratique : Composition de
la phase mobile constante
• Elution en mode gradient de concentration
 Le soluté
• Rétention Inverse à la polarité Plus
le soluté est polaire, plus la rétention est faible.
• Liée à l’hydrophobie: Cste de partage dans le
système octanol / eau P
• Rekker:
log P = Somme fi + CM (somme kj)
fi = Incréments CM = Cste = 0,268 kj =
effets de proximité
log k’ = a log P + b
 IV°) La chaîne chromatographique

L’Injection

• Couramment : 20 µl(1 à 50 µl)

• Injection en boucle Etalonnage
externe
• Vanne d’injection Six Voies
• Automatisation Passeurs automatiques
 La détection - Généralités
• Notion de dérive (1 heure)
bruit à long terme (10 mn)
bruit à court terme (1 mn)
• Sensibilité: Pente de la courbe:
Réponse = f (Concentration initiale)
• Concentration minimale détectable: n
fois le bruit à court terme
• Détection directe et différentielle
 Les différents Détecteurs
Détecteurs Détecteurs Détecteurs
Simples semi Informatifs intelligents

Ultra violet UV multi lambda Spectométrie de

Fluorimétrie Fluorimètre Masse
Réfractométrie programmable FT IR
Diffusion de Barrette de diodes
lumière RMN

Electrochimique Multi électrodes

Conductimétrique
 Dérivatisation pré et post colonne
Dérivatisation Pré Colonne

Simplicité Réactions reproductibles

Modification des conditions Possibilité de réactions
chromatographiques secondaires
Ex: Acides aminés (OPA)
Dérivatisation Post Colonne

Sélectif Matériel plus sophistiqué

Multi détection Modification du pic
Exemple:Vitamine C chromatographique
 VI°) Les autres techniques HPLC
Technique Phase Phase mobile Solutés
stationnaire
Paire d’ions C8, C18 CH3CN, Espèces
CH3OH, H2O ionisables

Echange Résines Tampons Ions minéraux

d’ions échangeuses aqueux cations et
anions
Exclusion Polymères THF, Tampons Polymères
poreux aqueux hydrophiles et
organiques
Chirale Chirale Aqueuses et Enantiomères
cyclodextrines, organiques
Pirkle
 Chapitre N°6

L’absorption Moléculaire UV-Visible

Et
L’absorption atomique
 L’absorption moléculaire
Sommaire
Introduction
Détermination de l’indice Phénol NF T 90-109
Détermination de As3+ NF T 20-054
Détermination du Fer total et du Fe2+ NF T 90-017
Détermination du Phosphore soluble NF X 31-161
Le spectrophotomètre d’absorption moléculaire
 Introduction
• Absorption Atomique: Concerne les électrons
atomiques (absorption et émission)
• Absorption et Émission Moléculaire: Concerne les
électrons des liaisons moléculaires, les électrons
délocalisables ().
• Mêmes concepts: Dualité Onde / Énergie
E=h=hc/
• Spectre de la lumière
Domaine UV: 200-350 nm
Domaine Visible: 350 – 800 nm
• Complémentarité Absorption / Couleur
Triangle des couleurs
• Utilisation des propriétés d’absorptions pour une
quantification
• Nombreuses applications :
Cations , Anions, Molécules Organiques

• Sélectivité plus ou moins importante

• Loi de Beer-Lambert: log10 I0/It = .l.C

 : Coefficient d’extinction molaire
. Quantification par étalonnage externe
 Détermination de l’indice phénol
Eaux NF T 90-109
• Principe
Distillation des phénols en milieu acide
(H3PO4) en présence de CuSO4(action
bactérienne) (Entraînement à la vapeur)
Enregistrement du spectre UV à 254
et 270 nm ( # 6000 et 1500)
cuve quartz 1cm
Comparaison à un étalonnage externe
• Applications: 0,025 – 0,5 mg/l
 Dosage de l’arsenic
Corps gras NF T 20-054
• Principe
Réduction de l’arsenic sous forme d’arsine AsH3
par Zn en milieu HCl Absorption de l’arsine
par le diéthyldithiocarbamate d’argent: Ag(DDTC) AsH3 + 6
Ag(DDTC)…. 6 Ag + 3H(DDTC) + As(DDTC)3
• Formation d’Argent colloïdal dispersé: Rouge – Violet
• Mesure de la DO à 540 nm cuve 1cm
• Comparaison à un étalonnage externe
• Application: masses de 1 à 20 µg d’Arsenic
 Dosage du fer
Eaux NF T 90-017
• Fet = Fe dissous + Fe suspension
• Formation d’un complexe coloré entre Fe2+ et l’ortho
phénanthroline (1-10) Rouge –Orangé (510nm)
• Fer total: Oxydation par le peroxodisulfate Fe3+
Réduction par le chlorydrate
d’hydroxylamine pH # 4,5 Fe2+
Complexation (15mn à l’obscurité)
• Fer dissous: Réduction du Fe3+ dissous
Complexation
• Fe2+ dissous Complexation directe
• Applications 10 µg/l – 10mg/l
 Le phosphore soluble
Sols NF X 31-161
• Principe: Méthode de Joret-Hébert Extraction
du phosphore soluble (sous toutes ses formes) par
l’oxalate d’ammonium (pH = 7)
• Complexation du phosphore sous forme de complexe
phosphomolybdique réduit avec le réactif
sulfomolybdique (heptamolybdate d’ammonium, Acide ascorbique,
thiosulfate de sodium, formol)
• Développement chaud (100°C, 5mn) d’une
coloration violette
• Mesure de la DO à 825 nm
• Domaine d’application: 1 – 10 mg/l de P sols:
Expression du résultat en P2O5
 Le spectrophotomètre
• Source
• Monochromateur
• Fentes (Slit)
• Cuve
• Photomultiplicateur
• Amplificateur
• Calculateur
 Sources et rayonnement incident
• Lampes à décharge (lumière blanche)
• Multi longueurs d’onde
- Deutérium (Domaine UV)
- Vapeur de mercure (Domaine visible)
• Simple et double faisceaux
• Sélecteur: Monochromateur
• Fente (Slit): Permet de réguler l’énergie du
rayon incident
 Cuves
• Cuves:
- Plastique (jetables)Attention aux solvants organiques
- Verre (domaine du visible)
- Quartz (domaine UV)
• A remplissage et à circulation
(Cinétique – Passeurs automatiques)
• Trajets optiques: 0,1 à 5 cm
fonction de la concentration et du coefficient d’extinction
molaire 
• Zéro optique: Sur Blanc (0 d’absorbance)
 Rayonnement transmis
• Photomultiplicateur : Comptage des photons
transmis: Travail en Absorbance (A) ou en
Transmitance (T)
• Amplificateur
• Calculateur: Io, It, A (T), log10(A), C
• Restitution du spectre, des concentrations…
• Gamme de linéarité de Beer-Lambert
(Étalonnage externe)
 L’absorption atomique
Sommaire
• Introduction
• Principe de l’absorption et de l’émission
• Schéma général d’un spectromètre d’AA
• Les différentes parties du spectromètre
• La quantification
• Applications
• Analyse de traces
 Introduction
• Analyse de cations minéraux
• Actuellement: Environ 60 éléments du tableau de
Mendeleiev
• Nombreuses applications: Métallurgie, Géologie,
Environnement, Agriculture, Agro alimentaire…
• Impératif: Mise en solution de l’échantillon
Eaux NF T90-112 Flamme Eaux
NF T90-119 Four Eaux NF
T90-131 Flamme Froide Sols NF X31-
151Flamme
 Principe
• Atome = Noyau + électrons
• Électrons: Gravitent autour du noyau (Champs
électrostatique): Notion d’orbitales: Niveaux
d’énergie quantifiés

• État fondamental + Énergie électromagnétique: État

excité (Passage de l’e- d’un niveau fondamental à un
niveau supérieur) : Instable : Retour à l’état
fondamental

• Restitution calorifique: Absorption atomique

• Restitution lumineuse: Émission atomique
• E = f (h, c et longueur d’onde)
• Notion de transitions spectrales
• Spectres de raies spécifiques à chaque élément
• Possibilité de dosage spécifique par éléments
(Interférences)
• Équation de Boltzman: Ne = Cste x N0e-(E/kT)
• Emission: Ne élevé
• Absorption: N0 élevé
• Loi # Beer-Lambert A = I0/It
• Log10 A = K.l.C K = Coef. d’absorption
monochromatique
 Schéma général d’un spectromètre
d’Absorption Atomique (Emission)
• Une source de photons: Source d’émission
• Une source d’atomes: Source d’atomisation
• Un monochromateur: Sélecteur de radiations
• Un détecteur: Photomultiplicateur +
amplificateur
 Source de photons
• Tube à décharge à cathode creuse
– Cathode : Élément à doser (sel)
– Anode: Lame de Zirconium
– Tube ‘rempli’ de gaz inerte (Ne, Ar)
– Décharge : Tension 500 - 800 volts
– Intensité = qqes mA (suivant élément)
• Obtention du spectre d’émission de l’élément
à doser
• Lampes mono élément et multi éléments
 Générateurs d’atomes
• Fonction de la nature des éléments à doser
• Flamme: Cas général
• Atomisation thermique: Détection plus
basse
• Flamme froide et générateurs d’hydrures:
spécifique à certains éléments (Hg,As..)
• Torche à plasma
 Atomisation en flamme
• Objectif: Transformer des espèces de la forme
ionique à la forme atomique
• Analyse d’échantillons liquides exempts de particules
solides.
• Capillaire: Transfert de l’échantillon vers la
chambre de nébulisation
• Nébuliseur: Formation d’un brouillard dans le
comburant: Fines gouttelettes
• Brûleur: Transformation des espèces à
l’état atomique
 Principales Flammes
Combustible Comburant Température

Hydrogène Argon 1000 K

Air 2200 K
Propane
Butane Oxygène 3200 K
Air 2500 K
Acétylène Oxygène 3400 K
Protoxyde 3200 K
d’azote
 Autres Générateurs d’atomes
• Atomisation électrothermique: Four -
Séchage (# 100°C)
- Décomposition thermique (100 à1800°C)
- Atomisation (1800-2600°C)
- Nettoyage Four (2800°C)
• Générateur de mercure
HgCl2 + SnCl2….Hg° + SnCl4
• Générateurs d’hydrures As, Sb…
Formations d’hydrures (AsH3) + Flamme
froide (1000°C)
 Sélecteur de radiations et PM
• Monochromateur: Sélection d’une longueur
d’onde
• Bande passante: 0,05 à 0,1 nm si spectre
complexe sinon 0,5 à 2 nm
• Photomultiplicateur: Permet de compter les
photons transmis
• Amplificateur + calculateur
 La quantification
• Étalonnage externe (ajouts dosés)
• Flamme: Mesure en continu à flux
constant…..Permet de minimiser les fluctuations de
la flamme
• Pb des interférences (chimiques, spectrales…)
• Utilisation de modificateurs LaCl3, HNO3..
• Réalisation de dilutions
• Sensibilités: Flamme # ppm
Four # ppb
 Exemples d’Applications
• Sols, Sédiments NF X 31-151
- Calcination à 450°C -
Solubilisation (HF,HCLO4) -
Evaporation et mise à sec - Reprise
eau régal(HCl/HNO3)
• Dosage par absorption atomique (Cd,
Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn)
 Eaux : Dosage du Hg par SAA sans
flamme NF T 90-113
• Minéralisation de l’échantillon par KMnO4 et
K2S2O8 à 95°C
• Réduction par SnCl2 Obtention de Hg°
• Entraînement sous argon
• Mesure à 253,7 nm Cuve à fenêtre
• Limite de dosage 0,5 µg/l
 Eaux: Dosage de dix éléments
métalliques (directe et indirecte)
• NF T90-112 (Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag,
Cd et Pb)
• Flammes air / acétylène -
Oxydantes Fe, Ni, Cu, Mn -
Réductrices Cr -
Normales Co, Zn, Ar, Cd et Pb
• Ex du plomb: 283,3 nm et/ou 217 nm
• Dosage direct
Elément Longueur d’onde Détection (ppm)
Cr 357,9 0,1-10
Mn 279,5 0,05 - 4
Fe 248,3 0,1 - 10
Co 240,7 0,1 - 10
Ni 232 0,1 - 10
Cu 324,7 0,05 - 6
Zn 213,8 0,05 - 2
Ag 328,1 0,05 - 4
Cd 228,8 0,05 - 2
Pb 217 0,2 - 10
 Dosage indirect
• Complexation(APDC) et Cr 1-200 ppb
extraction du complexe Mn 1-200 ppb
par la MIBC
Fe 1-200 ppb
• Dosage dans le phase
Co 1-200 ppb
organique
Ni 1-200 ppb
Cu 1 -200ppb
Zn 0,5 - 50ppb
Ag 0,5 - 25ppb
Cd 0,5 - 50ppb
Pb 1- 200 ppb