Annales du contrle national de qualit des analyses de biologie mdicale

Bactriologie 11BAC2 octobre 2011

Identification bactrienne Identification et antibiogramme : Enterococcus faecium

Juin 2012

Bactriologie
Guillaume ARLET (Hpital Tenon, Paris) Christophe de CHAMPS (CHU Robert Debr, Reims) Muriel FROMAGE (Ansm) Expdition : 05 octobre 2011 Clture : 02 novembre 2011 Edition des compte-rendus individuels : 20 dcembre 2011 Paramtres contrls : Identification bactrienne : Moraxella (Branhamella) catarrhalis, Haemophilus influenzae Identification bactrienne et antibiogramme : E. faecium, E. faecium vanB Nombre de laboratoires concerns* : 2259 Nombre de laboratoires participants** : 2160

11BAC2

* Laboratoires ayant dclar lAfssaps pratiquer au moins une des analyses concernes par lenvoi ** Laboratoires ayant retourn un bordereau-rponse correctement identifi par le code laboratoire, avant la date de clture de lopration

Rsum de lopration
Cette opration de contrle comportait deux souches bactriennes lyophilises identifier : Moraxella catarrhalis et Haemophilus influenzae, prcisment identifies par respectivement 88,1% et 89,7% des laboratoires participants. A ce jour, cest le meilleur score obtenu pour ces deux espces bactriennes. Chacun des 2259 laboratoires inscrits a galement reu un entrocoque pour identification et antibiogramme. Lidentification prcise de lespce est un lment indispensable pour la surveillance pidmiologique des souches dentrocoques dont la multirsistance aux antibiotiques reprsente le principal problme en pratique clinique. Deux souches diffrentes de lespce Enterococcus faecium ont t proposes. Elles ont t correctement identifies par respectivement 74 et 81% des participants ; ce qui reprsente un progrs considrable par rapport lenvoi prcdent en 2007, pour lequel on notait 64% didentifications exactes. On observe, en particulier, une baisse du nombre de diagnostics incomplets tels que Enterococcus sp. ou streptocoque du groupe D . Il tait galement demand aux laboratoires de tester la sensibilit de la souche isole vis--vis de 15 antibiotiques. Une attention particulire tait porte sur le niveau de rsistance aux aminoglycosides (gentamicine et kanamycine) ainsi que sur les glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) : les CMI de ces derniers pouvaient tre prcises par les participants lorsquils le jugeaient ncessaire. En effet, les laboratoires doivent tre mme de dtecter les ERG (entrocoques rsistants aux glycopeptides) partir des prlvements cliniques ou des prlvements de dpistage sachant quune ventuelle rsistance la vancomycine est plus ou moins facilement mise en vidence selon son niveau dexpression par la souche teste. La rsistance de bas niveau la vancomycine (CMI = 8-16 mg/l) de la souche de E. faecium vanB propose na pas t mise en vidence par environ 32% des participants qui lont catgorise tort sensible . Seul lautomate Vitek bioMrieux a permis sa dtection. En revanche, les autres techniques, en particulier la diffusion en glose ont t mises en dfaut quel que soit le fournisseur de disques.

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Identification bactrienne
Dfinition des chantillons
Bactrie Moraxella catarrhalis N des chantillons 199, 473, 511, 614, 713, 721, 879, 938. 142, 206, 222, 354, 387, 556, 645, 763. Renseignements cliniques La bactrie identifier a t isole dune hmoculture chez un patient de 62 ans atteint de broncho-pneumopathie chronique obstructive et prsentant une bronchite trainante et rcidivante depuis plusieurs mois. Il est hospitalis depuis 5 jours en ranimation pour dtresse respiratoire. Il prsente une leucopnie.

Haemophilus influenzae

Rsultats des participants

Le bilan des identifications bactriennes transmises par les laboratoires participants ainsi que les pourcentages de diagnostics corrects obtenus selon le systme didentification utilis sont prsents dans les tableaux I et II. Les rsultats obtenus lors des cinq envois prcdents dune souche de Moraxella catarrhalis et des six envois prcdents dun Haemophilus influenzae sont rapports respectivement dans les tableaux III et IV.
tableau I - identification des souches bactriennes : frquence des rsultats Genre exact Rponse attendue M. catarrhalis H. influenzae (a) : (b) : espce exacte 856 (88,1%) 880 (89,7%) espce fausse 6 (0,6%) 19 (1,9%) espce non prcise 30 (3,1%) 28 (2,9%) Total 892 (91,8%) 927 (94,5%) Genre faux 80 (8,2%) (a) 54 (5,5%) (b) Total identifications 972 981

dont 28 Micrococcus ou Kocuria, 16 staphylocoques, 11 Neisseria, 8 Haemophilus et 8 enterocoques ou streptocoques. dont 14 entrocoques ou streptocoques, 13 Moraxella, 8 Pasteurella.

tableau II - pourcentage didentification correcte (genre et espce exactes) selon la technique utilise Mthode utilise (effectif > 5) Galeries : API NH bioMrieux API non prcise Neisseria 4H Biorad Rapid id NH Remel Automates : Vitek 2 Compact bioMrieux Vitek 2 bioMrieux Microscan Siemens Phoenix Becton Dickinson Autres : Mthode conventionnelle * Spectromtrie de masse 18/42 (42,9%) 9/9 (100%) 37/73 (50,7%) 7/9 (77,8%) 180/204 (88,2%) 122/143 (85,3%) 5/6 (83,3%) 4/6 (66,7%) 184/195 (94,4%) 137/146 (93,8%) 9/11(81,8%) 430/443 (97,1%) 34/44 (77,3%) 23/23 (100 %) 17/18 (94,4%) 441/460 (95,9%) 37/44 (84,1%) 16/16 (100%) M. catarrhalis H. influenzae

* : identification traditionnelle dichotomique avec choix personnel des caractres tudis (pas de galerie, ni dautomate).

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tableau III - bilan des six oprations de contrle Moraxella catarrhalis . Anne 2011 2008 1998 1994 1993 1987 Prsentation * M M P P P P Effectif 972 1632 923 961 954 609 Espce exacte (%) 88,1 83,2 72,4 53,5 53,6 28,7 Genre exact (%) 91,8 88,6 75,4 59,4 61,0 30,1

* : chantillon monomicrobien (M) ou plurimicrobien (P) tableau IV - bilan des sept oprations de contrle Haemophilus influenzae . Anne 2011 2005 1998 (lot 1) 1998 (lot 3) 1994 1993 1992 1988 Prsentation * M M P P P P M M Effectif 981 865 906 986 953 954 604 747 Espce exacte (%) 89,7 77,2 55,0 67,0 59,0 59,0 54,5 56,4 Genre exact (%) 94,5 86,5 67,0 80,0 73,0 77,0 79,8 74,7

* : chantillon monomicrobien (M) ou plurimicrobien (P)

Commentaires
1 - Moraxella catarrhalis
Pour une description complte de cette espce, on pourra se reporter aux Annales du CNQ correspondant lopration de contrle en bactriologie 08BAC1. Moraxella catarrhalis est un germe strictement humain commensal des voies ariennes suprieures. Il peut tre lorigine dinfections de la sphre ORL (otite moyenne, sinusite, laryngite, rhinopharyngite) ou dinfections des voies respiratoires (bronchites, pneumonies). On peut galement le retrouver, plus rarement, dans les conjonctivites et de faon exceptionnelle, les mningites ou les septicmies ( partir dun foyer pulmonaire). Enfin, M. catarrhalis est reconnu comme un agent possible dinfections nosocomiales. Le pouvoir pathogne de cette espce tant relativement faible, le statut immunitaire joue un rle important dans la rsistance linfection. Les facteurs favorisant une infection M. catarrhalis sont les maladies pulmonaires (BPCO, silicose, emphysme), le tabagisme, une infection virale (VRS++), linsuffisance cardiaque. Lidentification de M. catarrhalis na pas pos de problme puisque prs de 92% des laboratoires ont fait un diagnostic correct du genre Moraxella et que la majorit dentre eux a rendu M. catarrhalis. On note, par rapport lenvoi prcdent de cette mme souche en 2008, une amlioration du pourcentage didentifications correctes de 5%. En rsum, les caractres culturaux, morphologiques et biochimiques retenir sont les suivants : - croissance sur glose au sang ou glose chocolat mais aussi sur milieux ordinaires, - colonies rondes, blanc gristre, opaques, non hmolytiques, de 1 3 mm de diamtre, - diplocoques Gram ngatif, - catalase et oxydase positives, - les sucres ne sont pas acidifis, - hydrolyse la tributyrine, - produit une DNAse. Annales Bactriologie 11BAC2 3 / 15

2 - Haemophilus influenzae
Les bactries du genre Haemophilus sont de petits bacilles Gram ngatif, immobiles, aro-anarobies facultatifs, parasites obligatoires des muqueuses et exigeant pour leur croissance les facteurs X (hmine) et/ ou V (NAD). Haemophilus influenzae, espce type du genre Haemophilus, est X + V dpendant. Lhomme est lhte naturel de H. influenzae qui colonise loro- et le naso-pharynx et plus rarement le tractus gnital. Cette espce est lorigine dinfections localises : sphre ORL (otites, sinusites, laryngites, pharyngites), conjonctivites, bronchites chroniques, pneumopathies de surinfection, mucoviscidose et dinfections invasives : piglottites, cellulites (cou, joue), pneumonies primitives, arthrites septiques, mningites, septicmies. Les pathologies invasives touchent surtout les enfants de moins de 5 ans et sont dues essentiellement des souches capsules. On peut galement retrouver H. influenzae dans les infections gnito-urinaires et nonatales. Lidentification de H. influenzae na pas pos de problme. En effet, 94,5% des laboratoires ont fait un diagnostic correct du genre Haemophilus et la majorit dentre eux a rendu H. influenzae. On note, par rapport lenvoi prcdent de cette mme souche en 2005, une amlioration du pourcentage didentifications correctes de 8,6%. En rsum, les caractres culturaux, morphologiques et biochimiques retenir sont les suivants : - croissance sur glose chocolat supplmente (isovitalex, polyvitex, etc...), en arobiose ou sous 5% de CO 2 , - colonies grises, muqueuses, luisantes, de 0,5 2 mm de diamtre pour les souches capsules ou daspect rugueux pour les souches non capsules, - exigence en facteur X et V (disques imprgns de X, V, X+V sur glose TS ou MH), - petits bacilles Gram ngatif, - catalase et oxydase positives, - nitrate rductase positive, - phosphatase alcaline positive. Les souches peuvent tre classes en 8 biotypes (de I VIII) en fonction de trois caractres biochimiques : indole, urase, ODC. La souche de cette opration de contrle tait de biotype III (indole -, urase +, ODC -). Les souches qui possdent une capsule polysaccharidique peuvent tre srotypes. On distingue 6 types antigniques ou srotypes (de a f). La souche de cette opration de contrle ntait pas capsule.

Bibliographie
Franois Denis, Marie-Ccile Ploy, Christian Martin, Edouard Bingen, Roland Quentin. Bactriologie Mdicale, techniques usuelles chez Elsevier - Masson (2007)

Identification et antibiogramme : Enterococcus faecium

Dfinition des chantillons
Deux chantillons contenant chacun une souche dE. faecium lyophilise ont t proposs. Il tait demand aux laboratoires participants didentifier la souche isole et de tester sa sensibilit vis--vis de 15 antibiotiques dfinis. En complment de lantibiogramme standard, les laboratoires devaient rpondre un questionnaire concernant les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) et le niveau de rsistance aux aminoglycosides (gentamicine et kanamycine). Les numros des chantillons ainsi que les rsultats des experts - Pr G. ARLET, Paris, Pr C. de CHAMPS, Reims - obtenus pour chacune de ces deux souches par la mthode de diffusion en milieu glos sont prsents dans le tableau V. La dtermination des CMI lorsquelle tait ncessaire a t ralise par la mthode du E-Test et/ou par la mthode de rfrence (dilution en glose). Les renseignements cliniques qui accompagnaient les chantillons sont les suivants : Bactrie isole dune infection urinaire chez une femme de 65 ans. Cette patiente fait depuis plusieurs annes des infections urinaires rptition, le plus souvent Escherichia coli et parfois Staphylococcus aureus. Ces pisodes ont t traits par plusieurs antibiotiques : amoxicilline/ac.clavulanique, fosfomycine, trimthoprime/sulfamthoxazole. Lexamen cytobactriologique actuel a t motiv pour des symptmes de dysurie. A la coloration de Gram, vous observez des cocci Gram positif.

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tableau V - antibiogramme des deux souches dE.faecium : rsultats des experts E. faecium (Lot 1) N des chantillons 175, 307, 418, 441, 520, 535, 862, 926 E. faecium (Lot 2) 101, 285, 392, 429, 650, 737, 810, 951

Antibiotiques Ampicilline Amoxicilline Ttracycline Erythromycine Lincomycine Clindamycine Pristinamycine Quinupristine - dalfopristine Vancomycine Teicoplanine Cotrimoxazole Linzolide Chloramphnicol Nitrofurantone Rifampicine

Rsultat lu S S R R R R I I S S S S I R S

Rsultat transmis S S R R R R I
(a)

Rsultat lu R R S R R R S S I/R S R S S S S

Rsultat transmis R R S R R R S S I / R (a) S (a) (b) R S S S (c) S (d)

I S S S (b) S I R S

(a) : souche de sensibilit diminue (b) : rsistance naturelle aux sulfamides mais sensible au trimthoprime

(a) : CMI vancomycine = 8 - 16 mg/l et CMI teicoplanine = 0,5- 1 mg/l (phnotype VanB) (b) : ne pas utiliser seule (c) : CMI = 64 mg/l (gale la concentration critique) (d) : souche de sensibilit diminue. Les souches rsistantes la rifampicine ont des CMI> 256 mg/l et une rsistance contact en diffusion sur milieu glos ; ce qui nest pas le cas ici.

Rsultats des participants

1 - Identification
Le bilan des identifications bactriennes transmises par les laboratoires participants ainsi que les pourcentages de diagnostics corrects obtenus selon le systme didentification utilis sont prsents dans les tableaux VI et VII. Les rsultats obtenus lors des deux envois prcdents dune souche dE.faecium pour identification sont rapports dans le tableau VIII.
tableau VI - identification des deux souches dE.faecium : rsultats des participants Genre exact Rponse attendue E. faecium (lot 1) E. faecium (lot 2)
a b

espce exacte 804 (81,0%) 748 (74,1%)

espce fausse 20 a (2,0%) 75 (7,5%)

b

espce non prcise 67 (6,7%) 74 (7,3%)

streptocoque du groupe D 82 (8,3%) 88 (8,7%)

Autres 20 (2,0%) 25 (2,4%)

Total identifications 993 1010

: 16 E. faecalis et 4 E. gallinarum : dont 34 E. gallinarum, 27 E. casseliflavus et 11 E. faecalis

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tableau VII - pourcentage didentification correcte (genre et espce exactes) selon la technique utilise Mthode utilise (effectif > 5) Galeries : API 32 strep bioMrieux API 20 strep bioMrieux API strepto (32 ou 20 strep) API non prcise Automates : Vitek 2Compact bioMrieux Vitek 2 bioMrieux Microscan Dade Phoenix Becton Dickinson Autres : Mthode conventionnelle * Spectromtrie de masse 30/143 (21%) 8/8 (100%) 33/164 (20,1%) 5/6 (83,3%) 224/226 (99,1%) 181/183 (98,9%) 19/20 (95%) 22/23 (95,7%) 219/225 (97,3%) 195/196 (99,5%) 17/19 (89,5%) 24/25 (96%) 120/129 (93,0%) 99/103 (96,1%) 61/69 (88,4%) 27/39 (69,2%) 88/125 (70,4%) 82/99 (82,8%) 44/54 (81,5%) 28/46 (60,9%) E. faecium (Lot 1) E. faecium (Lot 2)

* : identification traditionnelle dichotomique avec choix personnel des caractres tudis (pas de galerie, ni dautomate). tableau VIII - bilan des trois oprations de contrle E. faecium Anne 2011 (lot 1) 2011 (lot 2) 2007 1999 Effectif 993 1010 1117 1797 Espce exacte (%) 81 74 64 35 Espce fausse (%) 2 8 7 10 Espce non prcise * (%) 15 16 23 45 Total (%) 98 98 94 90

* : Enterococcus sp. ou streptocoque du groupe D

2 - Antibiogramme
Les ractifs utiliss par les participants pour raliser lantibiogramme des entrocoques sont dtaills dans le tableau IX, tandis que les rsultats obtenus pour chaque antibiotique, tous ractifs confondus, sont regroups pour chacune des deux souches dans les tableaux X et XI (la rponse attendue pour chaque antibiotique apparat en gras). De plus, afin dvaluer la pertinence des mcanismes de rsistance dtects et leur implication thrapeutique, diffrentes questions concernant dune part les glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) : La dtermination des CMI de la vancomycine et de la teicoplanine est-elle recommande pour cette souche ? et dautre part les aminosides (gentamicine et kanamycine) : Rsistance acquise de haut niveau ? , Synergie bactricide possible avec les glycopeptides ? ont t poses. Les rponses obtenues pour chaque souche sont rapportes dans les tableaux XII et XIII. Dans un troisime temps, les laboratoires qui effectuent en routine la dtermination des CMI des glycopeptides lorsquils le jugent ncessaire, pouvaient reporter leurs rsultats sur le bordereau de rponse. Pour chacun des deux antibiotiques, le ractif utilis et linterprtation de la CMI trouve en termes de catgorisation clinique (S, I ou R) de la souche devaient tre prciss. Environ 29% des laboratoires ont dtermin les CMI de la vancomycine et/ou de la teicoplanine sur la souche de E. faecium phnotype VanB, la seule des deux souches proposes ncessiter ce type danalyse. Les rsultats globaux, tous ractifs confondus sont prsents dans le tableau XIV. En ce qui concerne les CMI de la vancomycine, leurs distributions en fonction du ractif utilis sont reprsentes figure 1 tandis que leurs interprtations par les participants sont rapportes dans le tableau XV. Les rsultats lus en fonctions du ractif utilis (automate, galerie, disque) sont dtaills dans le tableau XVI.

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tableau IX - ractifs utiliss pour lantibiogramme des entrocoques Ractifs Automates (44,4%) Phoenix Vitek 2 Compact Vitek 2 Microscan Galeries (37,1%) ATB STREP EU ATB STREP ATB UR EU ATB UR Rapid ATB UR EU Disques (18,5%) Disques Disques NeoSensitabs Disques Disques Multidisk BioMrieux Biorad Eurobio i2a Oxoid Sobioda non prcis Total 9 (0,4) 250 (12,7) 4 (0,2) 49 (2,5) 20 (1,0) 4 (0,2) 30 (1,5) 1973 BioMrieux BioMrieux BioMrieux BioMrieux BioMrieux 602 (30,5) 114 (5,8) 7 (0,4) 4 (0,2) 4 (0,2) Becton Dickinson BioMrieux BioMrieux Siemens 45 (2,3) 551 (27,9) 240 (12,2) 40 (2,0) Fournisseur Effectif (%)

tableau X - antibiogramme E. faecium (Lot 1) : rsultats des participants rsultats lus antibiotiques Ampicilline Amoxicilline Ttracycline Erythromycine Lincomycine Clindamycine Pristinamycine Quinupristine - dalfopristine Vancomycine Teicoplanine Cotrimoxazole Linzolide Chloramphnicol Nitrofurantone Rifampicine effectif 897 326 824 855 247 497 269 769 968 944 885 837 507 916 429 S (%) 81,8 80,7 0,6 0,6 1,2 0,4 32,3 41,6 99,5 99,4 75,4 97,9 11,6 6,2 94,2 I (%) 7,5 7,0 0,0 0,0 0,0 1,6 42,4 53,1 0,3 0,0 1,9 0,8 77,9 1,2 0,4 R (%) 10,7 12,3 99,4 99,4 98,8 98,0 25,3 5,3 0,2 0,6 22,7 1,3 10,5 92,6 5,4 effectif 885 364 794 818 262 483 277 750 941 919 876 812 486 897 410 rsultats transmis S (%) 77,9 77,8 0,6 0,5 1,1 0,4 29,2 40,9 99,0 98,6 30,8 96,2 11,5 6,4 89,5 I (%) 3,7 6,3 0,0 0,0 0,8 1,0 37,9 47,1 0,2 0,2 2,9 0,9 73,7 0,9 0,5 R (%) 18,4 15,9 99,4 99,5 98,1 98,6 32,9 12,0 0,7 1,2 66,3 2,9 14,8 92,7 10,0

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tableau XI - antibiogramme E. faecium VanB (Lot 2) : rsultats des participants rsultats lus antibiotiques Ampicilline Amoxicilline Ttracycline Erythromycine Lincomycine Clindamycine Pristinamycine Quinupristine - dalfopristine Vancomycine Teicoplanine Cotrimoxazole Linzolide Chloramphnicol Nitrofurantone Rifampicine effectif 930 350 852 873 265 524 278 806 964 955 921 872 534 934 439 S (%) 1,7 1,7 96,6 6,5 10,2 8,0 91,7 97,3 35,9 97,2 3,9 96,7 95,7 57,5 27,5 I (%) 0,3 0,6 0,1 0,2 0,0 0,2 1,1 0,7 8,1 0,1 0,4 1,5 1,1 1,8 8,0 R (%) 98,6 97,7 3,3 93,3 89,8 91,8 7,2 2,0 56,0 2,7 96,7 1,8 3,2 40,7 64,5 effectif 916 408 806 836 277 536 277 790 924 906 906 851 535 913 397 rsultats transmis S (%) 1,2 1,5 94,7 6,5 9,0 7,8 87,4 95,3 31,7 92,8 3,1 96,2 95,2 55,7 27,7 I (%) 0,1 0,5 0,6 0,1 0,0 0,2 2,5 0,9 4,9 1,5 0,3 1,1 0,9 1,8 8,6 R (%) 98,7 98,0 4,7 93,4 91,0 92,0 10,1 3,8 63,4 5,6 96,6 2,7 3,9 42,5 63,7

tableau XII - Questionnaire E. faecium (Lot 1) Rponse attendue Glycopeptides : La dtermination des CMI de la vancomycine et de la teicoplanine est-elle recommande pour cette souche ? Aminoglycosides : Rsistance acquise de haut niveau (HNR) ? Gentamicine Kanamycine Synergie bactricide possible avec les glycopeptides ? Rsistance acquise de haut niveau (HNR) ? Synergie bactricide possible avec les glycopeptides ? Non Oui Oui Non * 6,5 6,7 9,2 10,1 7,0 88,3 87,4 3,7 86,5 5,0 3,3 86,2 Non 4,6 25,8 69,6 Rponses des 979 participants (%) Oui Non

* : lacquisition dune rsistance de haut niveau abolit leffet bactricide synergique entre un aminoglycoside et une pnicilline ou un glycopeptide. tableau XIII - Questionnaire E. faecium VanB (Lot 2) Rponse attendue Glycopeptides : La dtermination des CMI de la vancomycine et de la teicoplanine est-elle recommande pour cette souche ? Aminoglycosides : Rsistance acquise de haut niveau (HNR) ? Gentamicine Kanamycine Synergie bactricide possible avec les glycopeptides ? Rsistance acquise de haut niveau (HNR) ? Synergie bactricide possible avec les glycopeptides ? Oui Non * Oui Non * 6,5 8,0 9,2 10,3 91,7 4,5 88,7 2,9 1,8 87,5 2,1 86,8 Oui 4,7 73,6 21,7 Rponses des 1008 participants (%) Oui Non

* : lacquisition dune rsistance de haut niveau abolit leffet bactricide synergique entre un aminoglycoside et une pnicilline ou un glycopeptide.

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tableau XIV - E. faecium (Lot 2) : rpartition des CMI de la vancomycine (VAN), de la teicoplanine (TEC) et interprtation. Rponse des experts CMI VAN TEC 8 - 16 0,5 - 1 Interprtation I/R S Rponses des participants (%) tous ractifs confondus CMI (mg/l) effectif 290 274 4 7,6 100 4 et 8 29,7 8 62,7 effectif 290 273 Interprtation S 7,3 98,2 I 14,8 0,3 R 77,9 1,5

figure 1 - E. faecium (Lot 2) / vancomycine : distribution des CMI en fonction du ractif utilis (effectif > 5 utilisateurs)
Vancomycine
80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 <1 1 2 3 4 6 CMI (m g/l) 8 12 16 24 > = 32 %

Vitek 2 bioMrieux (n = 20) Vitek 2C bioMrieux (n = 75) E test bioMrieux (n = 156) M.I.C.E Oxoid (n = 33) Phoenix (n = 6)

tableau XV - E. faecium (Lot 2) / vancomycine : catgorisation clinique en fonction de la CMI CMI (mg/l) 4 6 8 >8 total Interprtation (catgorisation clinique) I 1 (4,5%) 12 (20%) 28 (40,6%) 2 (1,1%) 43 (14,8%) R 2 (9,0%) 5 (78,5%) 40 (58,0%) 180 (98,9%) 227 (77,9%) S 19 (86,4%) 1 (1,4%) 20 (7,3%) total 22 (100%) 17 (100%) 69 (100%) 182 (100%) 290 (100%)

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tableau XVI - E. faecium (Lot 2) / vancomycine : rsultats en fonction du ractif utilis (effectif > 5 utilisateurs) Ractifs effectif Automates : Phoenix Vitek 2 Compact Vitek 2 Microscan Galeries : ATB STREP EU ATB STREP Disques : Disques Disques Disques Biorad i2a Oxoid 110 22 10 65 15 3 4 1 4 41 6 3 103 21 10 43 8 3 12 2 4 48 11 3 BioMrieux BioMrieux 303 59 185 30 7 3 111 26 286 56 165 26 4 2 117 28 BD BioMrieux BioMrieux Siemens 20 268 121 18 16 13 3 3 0 40 13 3 4 215 105 12 20 262 117 18 16 14 3 3 0 8 7 3 4 240 107 12 S rsultats lus I R effectif rsultats transmis S I R

Commentaires
1 - Identification
On pourra se reporter aux Annales du CNQ correspondant lopration de contrle en bactriologie 07BAC1 dont les commentaires sont en grande partie repris ci-dessous. Historiquement, les streptocoques isols des fces ou streptocoques du groupe D taient spars en deux groupes : les entrocoques capables de crotre dans des conditions hostiles et les streptocoques du groupe D non-entrocoques incapables de se multiplier dans des conditions hostiles. En 1984, les streptocoques du groupe des entrocoques sont transfrs dans le genre Enterococcus. Lanalyse des squences des ARNr 16S a confirm lindividualisation du genre Enterococcus et a montr que les entrocoques sont phylogntiquement apparents aux genres Carnobacterium, Tetragenococcus et Vagococcus. Les deux principales espces rencontres en pathologie humaine sont Enterococcus faecalis (85 90%) et Enterococcus faecium (5 10%). Ces deux espces occupent une place importante du fait de leur rsistance naturelle et acquise aux antibiotiques, du caractre le plus souvent nosocomial des infections et de la propension quont certains clones multirsistants dissminer souvent bas bruit. Les sites disolements les plus frquents sont les urines (infections urinaires basses et pylonphrites), les pus dorigine digestive (pritonite, pelvi-pritonite, cholcystite), les hmocultures (endocardites, septicmies chez les patients neutropniques, noplasies coliques). Les entrocoques reprsentent 5 10% des endocardites bactriennes. Les autres espces susceptibles dtre isoles chez lhomme sont Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum, Enterococcus durans et Enterococcus hirae. Les entrocoques se prsentent comme des cocci Gram positif, lgrement ovodes, groups par deux ou en courte chanette de quatre six lments. Leur culture est aise en 24h sur milieux usuels en atmosphre arobie ou enrichie en CO 2 . Sur glose TS au sang de mouton, les colonies sont opaques, blanchtres, - ou non hmolytiques, de 0,5 1 mm de diamtre. Ils sont, comme les streptocoques, catalase ngative et ils fermentent les sucres sans production de gaz. Ils se distinguent des streptocoques par plusieurs caractres slectifs : - croissance 10 et 45C, - croissance en bouillon hypersal (6,5% NaCl), - croissance en prsence de bile (40%) et hydrolyse de lesculine (noircissement du milieu bile-esculine), - production de pyrrolidonyl-arylamidase (PYRase). La plupart des entrocoques (80%) expriment lantigne du groupe D de Lancefield et sont donc agglutinables. Annales Bactriologie 11BAC2 10 / 15

Quand un entrocoque apparat impliqu dans un processus infectieux, deux raisons principales justifient son identification jusqu lespce : - la premire est lexistence de rsistances naturelles particulires certaines espces (E. casseliflavus et E. gallinarum prsentent une rsistance naturelle bas niveau la vancomycine) ; dans ces cas, cest lidentification prcise de lespce qui alerte sur lexistence de rsistances naturelles. - la deuxime est la surveillance pidmiologique des entrocoques multirsistants aux antibiotiques, essentiellement E. faecium qui suppose une identification correcte et prcise des souches. Le tableau XVII reprend les caractres phnotypiques utiliss pour lidentification des principales espces dentrocoques.
tableau XVII - caractres phnotypiques diffrentiels des principales espces E. faecalis Rsistance au tellurite de potassium Fermentation : arabinose mannitol saccharose sorbitol raffinose Pigmentation jaune 1 Mobilit
2

E. faecium -

E. casseliflavus -

E. gallinarum -

E. durans -

E. hirae -

+ + + +

+ + + v

+ + + v v + + +

+ + + + + +

+ v v

Antigne du groupe D
1 2

cette coloration se voit sur un couvillon aprs avoir gratt plusieurs colonies sur milieu type trypticase soja. la mobilit se recherche ltat frais au microscope optique partir dune culture en bouillon glucos tamponn de 3 heures ou en milieu mannitol mobilit (il semble utile de disposer dune souche tmoin pour linterprtation des rsultats).

La croissance sur milieu au tellurite de potassium et la fermentation du mannitol, du sorbitol et du saccharose permet didentifier E. faecalis qui reprsente la grande majorit des entrocoques. Pour la recherche de E. gallinarum et E. casseliflavus, il est utile dassocier la recherche de mobilit et dune pigmentation jaune. Ces deux espces sont mobiles et les souches de E. casseliflavus sont pigmentes en jaune citron. Cependant, la mobilit nest pas constamment mise en vidence chez ces espces. Dans ce cas, la fermentation du MGP (mthyl--D-glucopyranoside) positive pour ces espces et ngative pour E. faecium est un bon test diffrentiel. Les espces immobiles E. mundtii et E. sulfureus, rarement isoles chez lhomme sont galement pigmentes. Les deux souches envoyes lors de cette opration de contrle ont t prcisment identifies par respectivement 81% et 74% des laboratoires participants, ce qui reprsente un progrs considrable par rapport lenvoi prcdent en 2007 pour lequel on notait 64% didentifications exactes. On observe notamment une diminution (moins 7%) du nombre didentification incomplte de type Enterococcus sp. ou Streptocoque du groupe D (tableau VIII). Si lon compare les rsultats obtenus avec chacune des deux souches de cette opration de contrle, il semble que les confusions avec une autre espce soient plus frquentes pour la souche E. faecium lot 2 : 7,5% derreur au niveau de lespce (principalement avec E. gallinarum ou E. casseliflavus, confusion galement observe en routine dans les laboratoires et lors des envois prcdents du CNQ). Lidentification lespce peut tre ralise par mthode conventionnelle ou par des galeries didentification (API, BBL Crystal) ou par des automates (Vitek, Phoenix, MicroScan). Les performances de ces derniers sont bonnes avec en moyenne 97% didentifications correctes pour la souche du lot 1 et 96% pour la souche du lot 2. En ce qui concerne les galeries API, on ne note pas de diffrence significative entre les galeries 32 strep et 20 strep pour la souche du lot 1, avec respectivement 93% et 96% didentifications exactes. En revanche, les galeries API sont globalement moins performantes pour lidentification de la souche du lot 2 avec respectivement 70,4 et 82,8% didentifications exactes (tableau VII).

2 - Antibiogramme
Les entrocoques, en particulier E. faecalis et E. faecium prsentent naturellement une sensibilit mdiocre aux pnicillines (CMI de la pnicilline G et de lamoxicilline proches de 1 4 mg/l) ainsi qu limipnme et lertapnme et une rsistance aux cphalosporines (en particulier aux cphalosporines de troisime Annales Bactriologie 11BAC2 11 / 15

gnration). Des souches de E. faecium peuvent prsenter un haut niveau de rsistance toutes les btalactamines par diminution de la PLP5. Les entrocoques sont galement naturellement rsistants aux sulfamides et la fosfomycine ( bas niveau). Enfin, les entrocoques prsentent une rsistance naturelle de bas niveau aux aminosides. Malgr cette rsistance de bas niveau, la synergie bactricide avec les pnicillines est conserve et cette association constitue la base du traitement des infections entrocoques. Certaines souches prsentent une rsistance acquise de haut niveau aux aminosides. Dans ce cas, la synergie avec les pnicillines est abolie. La dtection dune rsistance acquise de haut niveau ncessite lemploi de certaines molcules comme la streptomycine, la gentamicine et la kanamycine fortes doses. Selon le CA-SFM, les antibiotiques tester en premire ligne sur les entrocoques sont lampicilline, la gentamicine, les nitrofuranes et, en milieu hospitalier, la vancomycine et la teicoplanine. La liste complmentaire comprend entre autres le chloramphnicol, la ttracycline, lrythromycine, la lincomycine (rsistance naturelle de E. faecalis), la pristinamycine, le cotrimoxazole. Deux molcules rcentes sont galement intressantes tester : le linzolide et la tigcycline. Alors que les entrocoques sont des bactries considres comme peu pathognes, leur multirsistance aux antibiotiques reprsente le principal problme en pratique clinique. En particulier lors des infections dues E. faecium souvent rsistant toutes les -lactamines, pour lesquels la famille des glycopeptides (vancomycine, teicoplanine) reprsente une option thrapeutique de choix. Les premires souches rsistantes aux glycopeptides (ERG) ont t dcrites la fin des annes 80 en Angleterre et en France. Jusqu ces dernires annes, la proportion de rsistance la vancomycine chez les entrocoques est reste stable et estime moins de 2% (pidmies hospitalires).Toutefois, la vigilance et lexpertise des biologistes dans la dtection de cette rsistance acquise sont indispensables pour enrayer la progression de ce phnomne. Cest pourquoi, une des deux souches adresses aux laboratoires dans le cadre de cette opration de contrle tait porteuse du gne de rsistance vanB et exprimait une rsistance la vancomycine de niveau modr et de dtection difficile.

2-1 Enterococcus faecium / Lot 1

La souche tait sensible in vitro aux aminopnicillines, aux glycopeptides, au cotrimoxazole, au linzolide et la rifampicine. En revanche, elle tait rsistante aux macrolides, lincosamides, streptogramines, ttracyclines ainsi qu la nitrofurantone. De plus, elle prsentait une rsistance de haut niveau la kanamycine. 2-1-1 Aminopnicillines

Pour les -lactamines, le CA-SFM recommande de tester lampicilline avec un disque charg 10 g. Les souches sont considres comme sensibles lorsque le diamtre dinhibition est 19 mm correspondant des CMI 4 mg/l. La souche tait sensible avec un diamtre dinhibition gal 26 mm et une CMI gale 2 mg/l (Etest) ou 4 mg/l (dilution en glose). Cependant, on note parmi les laboratoires participants, un pourcentage non ngligeable de rsultats lus intermdiaire (7%) ou rsistant (11%). La rponse intermdiaire est considre comme une erreur mineure puisque une dilution prs, le rsultat peut tre lu sensible ou intermdiaire . En revanche, rendre cette souche rsistante aux aminopnicillines est considr comme une erreur majeure. Lanalyse des rponses en fonction du ractif utilis montre que la majorit des fausses rponses R provient des utilisateurs du Vitek 2C. 2-1-2 Aminoglycosides

Les entrocoques prsentent une rsistance naturelle de bas niveau aux aminosides lie un transport inefficace de ces antibiotiques dans la bactrie. La souche tait sensible la gentamicine haute concentration et rsistante la kanamycine haute concentration. A la question cette souche prsente-t-elle un haut niveau de rsistance la gentamicine ? , 86,5% des participants ont rpondu non et 88,3% ont indiqu quune synergie bactricide avec les glycopeptides tait possible. En ce qui concerne la kanamycine, 87,4% des participants ont relev le haut niveau de rsistance de la souche et 86,2% ont prcis que cette rsistance abolissait leffet bactricide synergique avec les glycopeptides (tableau XII). Pour mmoire, les molcules agissant sur le peptidoglycane de ces bactries comme les -lactamines ou les glycopeptides permettent une meilleure pntration des aminoglycosides expliquant ainsi le phnomne de synergie. Cependant, un haut niveau de rsistance peut tre observ du fait de lacquisition de gnes codant pour des enzymes inactivant les aminoglycosides. Dans ce cas il y a une perte de la synergie.

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2-1-3

Macrolides, lincosamides, pristinamycine

Le taux de bonnes rponses est trs satisfaisant puisque plus de 98% des laboratoires ont mis en vidence la rsistance de la souche lrythromycine ainsi qu la lincomycine ou la clindamycine. En revanche, les rsultats lus pour la pristinamycine sont discordants (32% S , 43% I et 25% R ). Cet antibiotique nest pas test sur le Vitek ni sur la galerie ATB STREP EU. En diffusion sur glose, les experts ont observ des diamtres dinhibition autour du diamtre critique D (entre 21 et 22 mm) ce qui signifie que la souche prsente une sensibilit diminue par rapport une souche sauvage pour laquelle le diamtre dinhibition est habituellement de 30 mm. Par consquent, ils ont choisi de rendre la souche intermdiaire . On peut rappeler que contrairement E. faecalis, E. faecium ne prsente pas de rsistance naturelle la pristinamycine et il ny a pas lieu de modifier la rponse. 2-1-4 Glycopeptides

Respectivement 99,5 % et 99,4 % des laboratoires ont eu des rsultats concordants avec les rponses attendues sensible pour la vancomycine et la teicoplanine. La souche tant sensible aux glycopeptides, la dtermination des CMI ntait thoriquement pas recommande comme lont indiqu 69,6 % des laboratoires (tableau XII). Nanmoins, 123 laboratoires ont effectu cette analyse. Pour information, la CMI de la vancomycine est 0,5 mg/l avec les automates Vitek et Phoenix et gale 0,38 - 0,5 mg/l avec le E-Test, tandis que la CMI de la teicoplanine est 0,5 mg/l avec le Vitek et le Phoenix et gale 0,125 mg/l avec le E-Test. 2-1-5 Autres antibiotiques

Les autres antibiotiques comme la nitrofurantone, la rifampicine, le linzolide ou la ttracycline nont pas pos de difficults particulires, le pourcentage de bonnes rponses tant compris entre 92,6 et 99,4 % selon la molcule considre. Toutefois, on note pour le chloramphnicol une dispersion des rponses (78% I , 10% R , 12% S ) due au fait que la CMI (16 mg/l) correspond la concentration critique haute. Par consquent, la rponse attendue est intermdiaire . Mais les concentrations critiques basse et haute tant respectivement gales 8 et 16 mg/l, on peut, une dilution prs, obtenir un rsultat S ou R . Comme en 2007, la seule vraie difficult rencontre par un grand nombre de laboratoires a t linterprtation de la rsistance au cotrimoxazole : la souche sensible a t rendue R par les deux tiers des participants. Il existe chez les entrocoques une rsistance naturelle aux sulfamides. Ils sont auxotrophes en dihydrofolate, mais sont sensibles in vitro au trimthoprime et son association aux sulfamides. Cependant, in vivo, les entrocoques seraient capables dchapper laction du trimthoprimesulfamthoxazole inhibiteur de la synthse des folates, en assimilant les folates prsents dans lenvironnement (selles, urines ). Les consquences cliniques sont controverses et il ny a pas de consensus sur la rponse qui doit tre faite au clinicien. Il ny a pas de recommandation du CA-SFM. Nanmoins, il est prudent de dconseiller lusage de cet antibiotique au moins dans les infections svres (mauvaise activit in vivo).

2-2 Enterococcus faecium van B / Lot 2

La souche tait rsistante aux aminopnicillines, lrythromycine, aux lincosamides ainsi quau cotrimoxazole. Elle prsentait galement une rsistance de haut niveau la gentamicine et la kanamycine. En ce qui concerne les glycopeptides, cette souche porteuse de lopron vanB tait rsistante la vancomycine et sensible la teicoplanine. En revanche, la souche tait sensible in vitro la ttracycline, la pristinamycine, la quinupristinedalfopristine, le linzolide et le chloramphnicol. 2-2-1 Aminopnicillines

En ce qui concerne lampicilline ou lamoxicilline, on notait une rsistance contact en diffusion sur glose ainsi quune CMI de lamoxicilline (Etest) gale 128 mg/l. Par consquent, la rponse attendue R a t rendue par plus de 98% des laboratoires. Cette souche tait galement rsistante contact la pipracilline et limipnme. 2-2-2 Aminoglycosides

La souche tait rsistante la gentamicine et la kanamycine haute concentration. Les rsultats sont trs satisfaisants puisque respectivement 91,7% et 88,7% des participants ont dtect cette rsistance acquise de haut niveau. Dans ce cas, la synergie entre les glycopeptides et les aminosides est abolie. Cette consquence a t prcise par respectivement 87,5% et 86,8% des participants qui ont Annales Bactriologie 11BAC2 13 / 15

rpondu non la question une synergie bactricide est-elle possible avec les glycopeptides ? (tableau XIII). 2-2-3 Macrolides, lincosamides, streptogramines

La souche de phnotype MLS B tait rsistante contact lrythromycine, la lincomycine et la clindamycine. Toutefois, on note un pourcentage non ngligeable (de 6,5 10,2% selon la molcule considre) de fausses rponses S dont lorigine na pu tre dtermine. Quant la pristinamycine et la quinupristine-dalfopristine, leur activit ntant pas altre en cas de phnotype MLS B , il ny a pas de raison de modifier la rponse lue S (diamtre dinhibition gal 31 mm) en I ou R . 2-2-4 Glycopeptides

Il sagissait dune souche contenant le gne vanB, rsistante bas niveau la vancomycine et sensible la teicoplanine. Or, 32% des 924 laboratoires ayant test la vancomycine ont transmis un rsultat erron S . Les experts ont test la sensibilit de la souche aux glycopeptides sur six chantillons par diffrentes techniques : diffusion en glose (disques), automate Vitek, glose slective additionne de vancomycine. Puis, ils ont dtermin les CMI de la vancomycine et de la teicoplanine. Les rsultats obtenus sont les suivants : - les diamtres de la zone dinhibition autour des disques de vancomycine et de teicoplanine varient respectivement de 17 19 mm et de 20 21 mm (aucun diamtre < 17 mm). De plus, on nobserve pas de colonies dans les zones dinhibition, ni dcart dau moins 3 mm entre les diamtres des deux glycopeptides, - sur le Vitek, La souche est catgorise R la vancomycine (CMI calcule 32 mg/l cinq fois et CMI calcule = 8 mg/l une fois) et S la teicoplanine (CMI calcule 0,5 mg/l), - la souche cultive sur la glose qui contient de la vancomycine (8 mg/l). Les CMI ralises par la technique du Etest sont gales 8-16 mg/l pour la vancomycine et 0,5-1 mg/l pour la teicoplanine. Le Comit de lAntibiogramme recommande de dterminer les CMI de la vancomycine et de la teicoplanine dans les diffrents cas suivants : - le diamtre de la zone dinhibition autour du disque de lun des deux glycopeptides est < 17 mm, - le diamtre de la zone dinhibition autour du disque de vancomycine est infrieur dau moins 3 mm celui autour du disque de teicoplanine, - quelques colonies sont prsentes dans la zone dinhibition de lun des deux glycopeptides, - la souche est catgorise I ou R au moins lun des deux glycopeptides par un automate, - la souche cultive sur un milieu additionn de vancomycine. La souche teste ne rpondait quaux deux dernires conditions et la question La dtermination des CMI de la vancomycine et de la teicoplanine est-elle recommande pour cette souche ? , seuls 73,6% des laboratoires participants ont rpondu oui (tableau XIII). Selon la technique utilise pour raliser lantibiogramme, les laboratoires pouvaient ne pas dtecter la rsistance faiblement exprime de cette souche la vancomycine et la rendre sensible aux glycopeptides sans chercher aller plus loin (tableau XVI). Cest notamment le cas des utilisateurs : - de la technique de diffusion sur glose quel que soit le fournisseur de disques. Deux fournisseurs (Biorad et i2a) ont par ailleurs confirm avec diffrents lots de disques que les diamtres dinhibition autour de la vancomycine taient de 19 ou 20 mm. - de la galerie ATB Strep EU (61% de faux rsultats S ) qui teste une seule concentration (4 mg/l). BioMrieux rapporte la prsence de quelques petites colonies dans la cupule (absence de trouble homogne) qui ne sont pas vues en lecture optique. - de lautomate Phoenix (80% de faux rsultats S ). En conclusion, seul lautomate Vitek utilis par 40% des participants a permis de dtecter dans plus de 95% des cas la rsistance la vancomycine. Prs de 29% des participants ont rendu un rsultat de CMI et parmi eux, respectivement 92,4% pour la vancomycine et 100% pour la teicoplanine sont en accord avec le rsultat attendu par les experts (tableau XIV). Lanalyse des rsultats obtenus pour la vancomycine en fonction du ractif utilis (figure 1) montre que le pourcentage de CMI sous-estimes ( 4 mg/l) pouvant conduire une catgorisation clinique errone S varie selon le ractif : Vitek 2 et 2C (3%), MICE (6%), Etest (8%) et Phoenix (83%). Enfin, il ny a pas lieu, du fait de la rsistance la vancomycine, dinterprter le rsultat lu S pour la teicoplanine en I ou R ; tout au plus peut-on signaler que dans ce cas la teicoplanine ne doit pas tre utilise seule. Lassociation teicoplanine-aminoside peut tre utilise en cas dinfection par un entrocoque de type VanB ( condition de choisir un aminoside avec un bas niveau de rsistance). Annales Bactriologie 11BAC2 14 / 15

2-2-5

Autres antibiotiques

Les autres antibiotiques comme la ttracycline, le cotrimoxazole, le linzolide ou le chloramphnicol nont pas pos de difficults particulires, le pourcentage de bonnes rponses tant compris entre 95,7 et 96,7 % selon la molcule considre. En revanche, on note pour la nitrofurantone une rpartition quasi identique des rponses entre S (58%) et R (41%) qui sexplique par le fait que la CMI de cet antibiotique (64 mg/l) correspond la concentration critique unique. Par consquent, la rponse attendue est sensible , mais une dilution prs, on peut obtenir un rsultat S ou R . Enfin, prs des deux tiers des participants ont rendu par excs la souche rsistante la rifampicine. En effet, les souches dentrocoques rsistantes la rifampicine ont des CMI > 256 mg/l et une rsistance contact en diffusion sur milieu glos ; ce qui nest pas le cas avec cette souche qui est de sensibilit diminue la rifampicine avec un diamtre dinhibition gal 21 mm.

Bibliographie
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