Université Ahmed DRAYA -ADRAR Faculté des Sciences et de la technologie

Département des SNV 1 er master biochimie (Génie enzymatique)

Mr Hireche A

Chapitre 5 : les enzymes immobilisés :

1. Introduction :

Dans la nature, les enzymes sont fortement liés à des supports tels que les membranes cellulaires
ou d’autres supports biologiques. Cette fixation permet la préservation des enzymes dans les
cellules conduisant à la possibilité de leurs réutilisations par l’organisme sans le besoin de
synthèse de l’enzyme à chaque fois que la cellule doit l’utilisé.

Dans la pratique, les applications industrielles des enzymes en solution se trouvent parfois
considérablement limitées par leur prix de revient et leur relative instabilité du fait de leur nature
protéique (sensibles à la température, au pH, aux ions). En solution, même si l’activité de
l’enzyme est suffisante, sa récupération après utilisation nécessite un processus long et coûteux
de purification. Par conséquent, ces enzymes sont perdues une fois la réaction effectuée : elles
ne sont pas utilisables pour d’autres cycles de production. L’immobilisation des enzymes sur
des supports solides, en augmentant leur stabilité opérationnelle et en permettant l’utilisation
de réacteurs en flux continu permet de contourner cette difficulté.

2. Les enzymes immobilisés :

C’est une enzyme liée par des moyens physiques ou chimiques (ou les deux en même temps)
en surface ou à l’intérieure d’une matrice. Autrement dit c’est une enzyme fixé sur un support
ou entouré par un enveloppe par l’utilisation de plusieurs méthodes possibles.

 Choix de la matrice :
Afin de choisir la matrice la plus appropriée pour une enzyme donnée il faut prendre en
considération plusieurs points comme :

 Résistance physique à la compression ;

 Inertie vis-à-vis des enzymes ;
 La facilité de production ;
 Biocompatibilité (sa capacité de liaison) ;
 La résistance aux attaques microbiennes ;
 La stabilité contre la dégradation chimique et thermique ;
 La rigidité structurelle ;
 La durabilité lors de diverses applications ;
 La disponibilité.

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 Avantage des enzymes immobilisées :

L’utilisation des enzymes immobilisés dans le secteur industriel et biotechnologique
représente des avantages très importants sur le plan pratique. Parmi ces avantages nous
citons :
 Une amélioration générale de la stabilité des enzymes ;
 Une durée plus longue pour les enzymes utilisées grâce au manque des pertes ;
 La récupération d’un produit sans enzyme (pure) donc une étape de la purification est
évité ;
 Utilisation répétés de la même enzyme ;
 Possibilité de mettre fin al réaction à tout moment par l’élimination de l’enzyme
insoluble.
3. Les méthodes d’immobilisation des enzymes :
L’immobilisation artificielle des enzymes est possible grâce à plusieurs techniques. Ces
techniques peuvent permettre la formation d’une liaison qui peut être aussi bien chimiques que
physiques sur des matériaux ou supports insolubles. Les enzymes immobilisées peuvent être
seulement confinés dans des matériaux de soutien sans aucune liaison (figure 1).

Figure 1 : classification des méthodes d’immobilisation des enzymes.

3.1.Immobilisation des enzymes par fixation sur un support :
3.1.1. Fixation par liaisons physiques :
 Adsorption :
L’adsorption constitue la méthode la plus économique d’immobilisation des enzymes, c’est la
plus simple et la plus rentable.
L’adsorption repose sur la capacité de certains corps minéraux ou organiques à fixer une
molécule donnée à leur surface. L’immobilisation est alors due à des interactions faibles de type
Van der Waals, liaisons hydrogène, transfert de charges (liaisons ioniques), échanges d’ions ou
encore à des interactions homophiles (hydrophobes et/ou hydrophiles).

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Les supports adsorbants utilisés sont très variés, tant du point de vue de leur structure chimique
que du point de vue de leurs propriétés physiques, nous citions dans ce cas :
 Les supports organiques : comprennent les polyosides comme l’acétate de cellulose,
nitrate de cellulose, dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène,
le polyéthylène…
 Les supports inorganiques (support minéraux) : comme la kaolinite, le verre poreux,
des oxydes et des sels minéraux. Ce sont généralement plus stables, résistent l’usure,
aux agents chimiques et aux bactéries. Les sels de métaux les plus utilisés sont les
chlorures de titane (TiCl4), de zinc ou de fer.
Les avantages de la technique :
C’est une méthode très simple à mettre en œuvre nécessitant seulement de mettre en
contact l’enzyme et le support dans des conditions de pH, température et de force
ionique données.
De plus elle est facilement réversible, économique et ne requiert aucun réactif chimique
pouvant dénaturer l’enzyme.
Les inconvénients de la technique :
Elle présente un inconvénient majeur puisque, du fait des interactions faibles liant l’enzyme au
support, ces systèmes sont peu stables, l’enzyme se désorbant au cours du temps.
3.1.2. Fixation par liaisons chimiques :
L’immobilisation des enzymes par liaisons chimiques impliquent deux méthodes
principalement, soit la fixation sur un support grâce à des liaisons covalentes ou bien par
réticulation.
 Immobilisation par liaisons covalentes sur support (le greffage covalent) :
Le principe de cette méthode d’immobilisation est de faire réagir un groupement fonctionnel
libre de l’enzyme avec un groupement fonctionnel du réactif (du support). Les groupements
fonctionnels du support fréquemment utilisés sont le groupement carboxyle (COOH), thiols
(SH), hydroxyle (OH) et amine (NH2).
L’immobilisation de l’enzyme peut être directement sur le support (le groupement fonctionnel
du support) sans avoir recoure à d’autres molécules. Dans ce cas en parle d’une immobilisation
directe.
Dans la plupart de temps les groupements fonctionnel sont insuffisamment réactifs, donc ils
nécessitent une activation préalable. A priori, il faut activer soit l’enzyme, soit le support.
L’activation des groupes du support est la plus utilisé car activation des groupes fonctionnels
de l’enzyme peut conduire à la dénaturation de l’enzyme.

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Figure 2 : Immobilisation par liaison covalente

étap1 : activation du support, étape 2 : fixation de l’enzyme
Les avantages de la technique :
Cette méthode d’immobilisation présente principalement comme avantage de fixer l’enzyme
de façon permanente et augmente la stabilité de celle-ci, lui conférant une durée de vie plus
importante.
Les inconvénients de la technique :
Les réactifs indispensables au greffage risquent de dénaturer l’enzyme et donc de provoquer
une perte d’activité.
 Immobilisation par réticulation (sans support) :
La réticulation repose sur l’utilisation d’agents dit réticulant qui va permettre de lier les
enzymes entre elles par des liaisons chimiques. Il existe deux méthodes de réticulation, soit les
enzymes sont reliées entre elles par des agents réticulant de façon directe, soit en plus de l’agent
réticulant une protéine inerte peut être utilisée afin de faciliter ou améliorer la réticulation, on
parle alors de Co-réticulation (figure 4).

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Figure 3 : principe de la réticulation.

Figure 4 : amélioration de la réticulation par les protéines inerte.

Les avantages de la technique :
Cette méthode d’immobilisation présente l’avantage d’être assez simple à mettre en œuvre
comme elle offre aussi une bonne stabilité au système.
Les inconvénients de la technique :
Elle peut causer une perte de l’activité enzymatique au cours de la préparation. Cette méthode
n’est pas adéquate pour des substrats de haut poids moléculaire.
3.1.3. Immobilisation d’enzyme par inclusion :
 Inclusion dans un gel :
Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un polymère insoluble
dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou emprisonnées dans des microcapsules
délimité par une membrane semi perméable dont les pores sont suffisamment larges pour
permettre le passage des molécules du substrat ou des produits de la réaction. On utilise comme
matrice pour l’inclusion plusieurs polymères :
- Gel à partir des polymères naturels : l’alginate, carraghénane, chitosane,…etc.

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- Gels à partir des polymères synthétiques : le gel de polyacrylamide, fibres de polyacétate

de cellulose.
 Inclusion dans une fibre creuse :
Les enzymes peuvent être piégés dans des microcavités de fibres synthétiques.
Dans ce procédé, les flux de liquides circulent à l’intérieur des fibres, ayant pour avantage une
diminution des phénomènes de polarisation de surface et de colmatages fréquents avec les
membranes. Par contre cette méthode n’est pas adaptable aux enzymes qui pourraient être
désactivés par des solvants non miscibles à l’eau.
 Micro-encapsulation d’enzymes :
Cette technique est couramment utilisée dans les industries pharmaceutiques, cosmétiques et
alimentaires.
L’émulsion d’une solution aqueuse renfermant l’enzyme avec un monomère hydrophile est
réalisée dans un solvant organique chloroforme/cyclohexane non miscible à l’eau. Un agent
tensioactif stabilisant l’émulsion est rajouté afin d’ajuster la taille des capsules aux dimensions
désirées (1 à 100 microns).
L’addition d’un second monomère hydrophobe à la phase organique, provoque la réaction de
copolymérisation à l’interface entraînant ainsi la formation d’une membrane polymère autour
des microgouttes aqueuses.
Les microcapsules emprisonnant l’enzyme sont recueillies par centrifugation.
Les avantages de la technique :
Elle est économique, facile à mettre en œuvre et peut s’appliquer à un nombre élevé d’enzymes.
L’absence d’effet inhibiteur et l’absence de modification chimique des enzymes.
Les inconvénients de la technique :
Limite dans la diffusion du substrat vers le site actif et du produit vers l’extérieur.
Une perte continue des activités enzymatiques, due à la distribution de la taille des mailles.
Elle est peu efficace pour les substrats de haut poids moléculaire.
4. Domaines d'applications des enzymes immobilisées :
Les enzymes immobilisés sont susceptibles d’applications particulièrement nombreuses et
diversifiées :
 L’agroalimentaire :
- Production d’acides aminés de la série L à l’aide d’un amino-acide acylase immobilisée.

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- Production de glucose et de galactose, par hydrolyse du lactose au moyen de lactase

immobilisée.
- Production de fructose en utilisant glucose isomérase immobilisée.
- Amélioration des propriétés de boissons alimentaires : viscosité, clarification, digestibilité,
goût, etc
- Amélioration de procédé de panification.
- Amélioration de la production de produits lactés : désodorisation du lait UHT par la
sulfydryloxydase sur verre poreux.
 La médecine :
- Des papiers imprégnés de solutions enzymatiques sont utilisés dans certains tests cliniques
(dosage du cholestérol, de l'acide urique, des hormones…).
- Les techniques ELISA utilisent également des enzymes fixées (liées à des anticorps eux-
mêmes fixés par adsorption sur les parois de petites cuvettes en plastiques), destinées à des
dosages cliniques.
 La chimie industrielle et pharmaceutique :
- Production d’acides divers (lipase, pénicilline amidase).
- Modification de la structure d’antibiotique : production d’acide 6-aminopénicillanique (6-
APA), au moyen d’une pénicilline acylase immobilisée.
- Synthèse de nucléotides par une ribonucléase immobilisée.
 Autres secteurs :
- Textile, blanchissage, tannerie, etc.