Souches, milieu et conditions de culture

Les micro-organismes et les plasmides recombinants utilisés dans cette étude sont présentés dans le
Tableau 1. E. coli DH5α a été utilisé comme hôte pour la construction du plasmide recombinant.
Corynebacterium glutamicum S9114 a été utilisé comme souche d'origine pour le développement de
mutants. Le milieu Luria-Bertani (LB) a été utilisé pour la propagation d'E. coli et de C. glutamicum.
Pour le test de fermentation de l'ornithine, une souche unique des mutants a été activée sur une
plaque d'agar LB pendant deux cycles de 12 heures. Ensuite, un anneau de bactéries a été inoculé
dans 10 mL de milieu de culture dans un flacon agité de 100 mL. Le milieu de culture était composé
de (par litre) 25 g de glucose, 10 g d'extrait de levure, 10 g de drêche de maïs, 15 g de (NH4)2SO4, 2,5
g de MgSO4·7H2O, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de Na2HPO4 et 10 g de CaCO3. Après 11
heures de culture à 32 °C et 220 rpm, la quantité appropriée de culture a été transférée dans 24 mL
de milieu de fermentation dans un flacon agité de 250 mL. La densité optique initiale (OD600) de la
culture de fermentation a été ajustée à 1. Le milieu de fermentation était composé de (par litre)
100,0 g de glucose, 20,0 g de drêche de maïs, 50,0 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de MgSO4·7H2O, 1,0 g de
KH2PO4, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de Na2HPO4, 0,02 g de FeSO4·7H2O, 0,02 g de MnSO4·4H2O et 10 g
de CaCO3. Le pH initial a été ajusté à 7,0. Toutes les cultures ont été cultivées à 32 °C et 250 rpm, et
des échantillons de 200 μL ont été prélevés toutes les 12 heures pour mesurer la concentration
d'ornithine, la densité cellulaire et la concentration de glucose résiduel. Si nécessaire, 50 mg/L de
kanamycine ont été utilisés pour cultiver E. coli et 12,5 mg/L de kanamycine ont été utilisés pour
cultiver C. glutamicum. Explications des étapes et des objectifs avec plus de détails :Les souches
utilisées sont E. coli DH5α et C. glutamicum S9114. E. coli DH5α a été utilisé pour la construction du
plasmide recombinant tandis que C. glutamicum S9114 a été utilisé comme souche d'origine pour le
développement de mutants.Le milieu de culture utilisé pour la propagation d'E. coli et de C.
glutamicum est le milieu Luria-Bertani (LB). Ce milieu est composé de différents nutriments qui
fournissent Après la préparation du milieu de culture LB, les microorganismes E. coli DH5α et C.
glutamicum S9114 ont été cultivés dans ce milieu pour leur croissance et leur propagation. Pour
l'analyse de la fermentation de l-ornithine, une seule souche des mutants de C. glutamicum a été
activée sur une plaque d'agar LB pendant deux cycles de 12 heures. Ensuite, un anneau de bactéries a
été inoculé dans 10 mL de milieu de culture de départ dans un flacon agité de 100 mL. Le milieu de
culture de départ était composé de glucose, d'extrait de levure, de liquide de maïs, de sulfate
d'ammonium, de sulfate de magnésium, de phosphate de potassium, de phosphate de sodium et de
carbonate de calcium. Après 11 heures de culture à 32 °C et 220 tr/min, une quantité appropriée de
culture a été transférée dans 24 mL de milieu de fermentation dans un flacon agité de 250 mL avec
baffles. La densité optique initiale (OD600) de la culture de fermentation a été ajustée à un. Le milieu
de fermentation contenait du glucose, du liquide de maïs, du sulfate d'ammonium, du sulfate de
magnésium, du phosphate de potassium, du phosphate de sodium, du sulfate ferreux et du sulfate
manganeux. Le pH initial a été ajusté à 7,0. Toutes les cultures ont été cultivées à 32 °C et 250 tr/min,
et des échantillons de 200 μL ont été prélevés toutes les 12 heures pour mesurer la concentration en
l-ornithine, la densité cellulaire et la concentration en glucose résiduel. Si nécessaire, de la
kanamycine a été ajoutée à une concentration de 50 mg/L pour la culture d'E. coli et de 12,5 mg/L
pour la culture de C. glutamicum.
Les microorganismes et les plasmides recombinants utilisés dans cette étude sont présentés dans le
tableau1.E. coliDH5a a été utilisé comme hôte clone pour la construction du plasmide
recombinant.Corynebacterium glutamicumS9114 a été utilisé comme souche originale pour le
développement de mutants. Le milieu Luria-Bertani (LB) a été utilisé pour propagerE. colietC.
glutamique. Pour le test de fermentation de l-ornithine, un seul clone des mutants a été activé sur
une plaque de gélose LB pendant deux cycles de 12 h. Par la suite, un anneau de bactéries a été
inoculé dans 10 ml de milieu d'ensemencement dans un flacon agité normal de 100 ml. Le milieu
d'ensemencement consistait en (par litre) 25 g de glucose, 10 g d'extrait de levure, 10 g de corn steep
liquor, 15 g (NH4)2DONC4, 2,5 g de MgSO4·7H2O, 1gKH2Bon de commande4, 0,5 gK2HPO4, 0,5
gNa2HPO4, et 10 g de CaCO3. Après 11 h de culture à 32 ° C et 220 tr/min, la quantité appropriée de
culture a été transférée dans 24 ml de milieu de fermentation dans un flacon à chicane de 250 ml. DO
initiale600de la culture de fermentation a été ajustée à un. Le milieu de fermentation consistait en
(par litre) 100,0 g de glucose, 20,0 g de corn steep liquor, 50,0 g (NH4)2DONC4, 2,5 g de
MgSO4·7H2O, 1,0 g KH2Bon de commande4, 0,5 gK2HPO4, 0,5g N / A2HPO4, 0,02 g FeSO4·7H2O,
0,02 g MnSO4·4H2O et 10 g de CaCO3. Le pH initial a été ajusté à 7,0. Toutes les cultures ont été
cultivées à 32 ° C et 250 tr/min, et des échantillons de 200 µL ont été prélevés toutes les 12 h pour
mesurer la concentration de lornithine, la densité cellulaire et la concentration de glucose résiduel. Si
nécessaire, 50 mg/L de kanamycine ont été utilisés pour cultiverE. coliet 12,5 mg/L de kanamycine
ont été utilisés pour cultiverC. Glutamique

Resultats

Le glutamate est le précurseur de la synthèse de l-ornithine et, par conséquent, la sécrétion

extracellulaire de glutamate est un attribut défavorable aux problèmes de séparation en aval et de
gaspillage de matériaux. Selon un précédent rapport, la suppressionncgl1221, qui code pour un
glutamate a provoqué une accumulation intracellulaire de l-glutamate en endommageant le système
de transport et n'a montré aucune influence sur la croissance

Glutamate is the precursor of l-ornithine synthesis and therefore, extracellular secretion of glutamate
is unfavorable attribute to the problems of downstream separation and wastage of materials.
According to a previous report, deleting ncgl1221, which encodes a glutamate transport protein,
caused intracellular accumulation of l-glutamate by damaging the transportation system and showed
no infuence on growth [26]. Tus, ncgl1221 was disrupted to reduce glutamate secretion and provide
more precursors for l-ornithine production in strain Sorn1, thus generating the strain Sorn2. Te results
from the shake fask test shown in Fig. 4 suggest that 9.8 g/L of l-ornithine was produced by stain
Sorn2 after 72 h of cultivation, which was 22.7% higher than that obtained with strain Sorn1. Te
growth, glucose consumption, and lactate production of Sorn2 were consistent with those of Sorn1
(Fig. 3). Tese preliminary results demonstrate an efcient strategy to improve l-ornithine production by
deleting ncgl1221. In addition, the glutamate concentration in the fermentation supernatant of Sorn2
was decreased to 0.5  g/L, which was just about 7.6% of that in the control strain Sorn1.
Consequently, glutamate production was reduced by a titer of 6 g/L whereas l-ornithine production
was only increased by a titer of 1.83 g/L, which illustrated that further enhancement of l-ornithine
production was limited by the conversion efciency of glutamate to ornithine in strain Sorn2

Le glutamate est le précurseur de la synthèse de la l-ornithine et, par conséquent, la sécrétion

extracellulaire de glutamate est un attribut indiscutable des problèmes de séparation en aval
et de gaspillage de matériaux. Selon un rapport précédent, la suppression de ncgl1221, qui
code pour une protéine de transport de glutamate, a provoqué une accumulation
intracellulaire de l-glutamate en endommageant le système de transport et n’a montré
aucune infuence sur la croissance [26]. Tus, ncgl1221 a été perturbé pour réduire la sécrétion
de glutamate et fournir plus de précurseurs pour la production de l-ornithine dans la souche
Sorn1, générant ainsi la souche Sorn2. Les résultats de l’essai de secouage en fût illustré à la
Fig. 4 suggèrent que 9,8 g/L de l-ornithine ont été produits par la coloration Sorn2 après 72
heures de culture, soit 22,7 % de plus que celle obtenue avec la souche Sorn1. La croissance
du te, la consommation de glucose et la production de lactate de Sorn2 étaient compatibles
avec celles de Sorn1 (Fig. 3). Les résultats préliminaires démontrent une stratégie efficace
pour améliorer la production de l-ornithine en supprimant ncgl1221. De plus, la
concentration de glutamate dans le surnageant de fermentation de Sorn2 a été réduite à 0,5
g/L, soit environ 7,6 % de celle de la souche témoin Sorn1. Par conséquent, la production de
glutamate a été réduite d’un titre de 6 g/L alors que la production de l-ornith n’a été
augmentée que d’un titre de 1,83 g/L, ce qui a montré que l’amélioration de la production de
l-ornith était limitée par l’efficacité de conversion du glutamate en ornithine dans la souche
Sorne2

Le glutamate est le précurseur de la synthèse de l'ornithine et, par conséquent, la sécrétion

extracellulaire de glutamate est un attribut défavorable pour les problèmes de séparation en
aval et le gaspillage de matériaux. Selon un rapport précédent, la suppression de ncgl1221,
qui code pour une protéine de transport de glutamate, a provoqué une accumulation
intracellulaire de L-glutamate en endommageant le système de transport et n'a montré
aucune influence sur la croissance Ainsi, ncgl1221 a été perturbé pour réduire la sécrétion de
glutamate et fournir plus de précurseurs pour la production d'ornithine dans la souche Sorn1,
générant ainsi la souche Sorn2. Les résultats du test de secouage en fiole présentés dans la
figure 4 suggèrent que 9,8 g/L d'ornithine ont été produits par la souche Sorn2 après 72
heures de culture, soit une augmentation de 22,7 % par rapport à celle obtenue avec la
souche Sorn1. La croissance, la consommation de glucose et la production de lactate de
Sorn2 étaient conformes à celles de Sorn1 (figure 3). Ces résultats préliminaires démontrent
une stratégie efficace pour améliorer la production d'ornithine en supprimant ncgl1221. De
plus, la concentration de glutamate dans le surnageant de fermentation de Sorn2 a été
réduite à 0,5 g/L, soit environ 7,6 % de celle de la souche témoin Sorn1. Par conséquent, la
production de glutamate a été réduite d'un titre de 6 g/L alors que la production d'ornithine
n'a été augmentée que d'un titre de 1,83 g/L, ce qui a montré que l'amélioration ultérieure
de la production d'ornithine était limitée par l'efficacité de conversion du glutamate en
ornithine dans la souche Sorn2.

Sorn1 :C. glutamicum S9114 avec suppression de l’argF

Sorn2: Sorn1 avec la suppression de ncgl1221

Sorn3: Sorn2 avec la suppression de l’argR

Sorn4 Sorn3 with putP deletion