Master 2 Chimie analytique

Module: FAC 300

Intitulé du module: Analyse d’échantillons complexes.
Préparation et traitement d’échantillons.
Cours proposé par: DAHMANE Mohamed
Master 2 Chimie analytique
Module: FAC 300
Partie SPE
Méthodologie SPE
Qu'est-ce que SPE?

Introduction:

L’extraction liquide-liquide a plusieurs limites.

Dans le cas de solutions aqueuses, le solvant d’extraction doit être non miscible à l'eau et ne doit pas
former d'émulsions.

Une deuxième difficulté est que la LLE utilise des volumes relativement importants de solvant.

De plus, généralement, la LLE est effectuée manuellement, ce qui la rend quelque peu lente et
fastidieuse.

L'extraction en phase solide, ou extraction liquide-solide, peut résoudre plusieurs de ces problèmes.
Méthodologie SPE
Qu'est-ce que SPE?

L'extraction en phase solide (SPE) est la technique la plus puissante

actuellement disponible pour la préparation rapide et sélective des
échantillons.
Méthodologie SPE
Introduction

La SPE est une technique de préparation d'échantillons largement

utilisée avec des principes similaires à ceux de la chromatographie
liquide haute performance (HPLC).
Méthodologie SPE
Principe de la SPE

la SPE est basée sur la distribution des composés d’interet (analytes)

entre une phase solide (adsorbant) et une phase liquide (échantillon).
 Méthodologie SPE
Utilisation de la SPE

changement de de solvants
(les analytes sont transférés d'un environnement matriciel particulier
dans un autre, par exemple aqueux à organique),

la dérivatisation
l'enrichissement
(les analytes sont conservés sur
des traces, un sorbant, dérivatisés, puis élués)
03
02 04
fractionnement par
la purification, 01 Utilisation 05 classes chimiques
de la SPE
 Méthodologie SPE
Utilisation de la SPE

changement de de solvants
(les analytes sont transférés d'un environnement matriciel particulier
dans un autre, par exemple aqueux à organique),

la dérivatisation
l'enrichissement
(les analytes sont conservés sur
des traces un sorbant, dérivatisés, puis élués)
03
02 04
la purification fractionnement par
01 Utilisation 05 classes chimiques
de la SPE
Méthodologie SPE
Applications

L'application de la SPE couvre une grande variété de types d'échantillons et dans

plusieurs et divers domaines. Elle est souvent utilisée dans l'étude :

des médicaments dans les fluides biologiques 1

des traces de substances organiques dans les échantillons

environnementaux 2

des toxines dans les denrées alimentaires 3

Méthodologie SPE
SPE / LLE
Extraction en Phase Solide (SPE)
SPE / LLE

extraction plus une collecte plus

01 05
efficace de l'analyte facile des analytes

SPE / LLE
SPE / LLE

élimination plus Concentration des

02 06
efficace des interférents analytes

réduction de la plus
03 consommation de 07
solvants organiques pratiques

Plus de facilité
04 08
sélectivité d'automatisation
Méthodologie SPE
SPE / LLE

Les procédures LLE qui nécessitent plusieurs extractions successives pour récupérer
+ 99% de l'analyte peuvent souvent être remplacées par des méthodes SPE en une
seule étape. Parce que SPE est un processus de séparation plus efficace que LLE.
Méthodologie SPE
SPE / LLE

Comme avantage secondaire, les particules plus grosses sont piégées par la
cartouche SPE et ne passent pas dans la fraction d'analyte. Ainsi, SPE sert également
d'étape de filtration.
Méthodologie SPE
SPE / LLE

D'autre part, il existe certains inconvénients de la SPE par rapport à LLE.

Celles-ci incluent:
• l'adsorption irréversible de certains analytes sur phase SPE, le fritté ou les
matériaux de la cartouche.
• Le développement de méthodes dans SPE implique quatre étapes distinctes,
tandis que pour la LLE, la sélection des deux solvants non miscibles, leurs volumes
relatifs et le pH tamponné approprié (pour les analytes ionisables) est effectuée
assez facilement.
Méthodologie SPE
SPE / HPLC

Le mécanisme de la SPE est similaire à celui de la HPLC, qui est basée sur l'affinité ou
l'interaction entre les solutés (analyte d'intérêt) dissous dans un liquide (phase
mobile) et les matériaux adsorbants (phase stationnaire).
Méthodologie SPE
Cartouche SPE

SPE utilise une petite cartouche en plastique, souvent une seringue médicale en
polypropylène contenant 0,1 à 1,0 g. d’adsorbant, contenu entre deux frittés de
polyéthylène.
Méthodologie SPE
Cartouche SPE
Méthodologie SPE
Appareillage

Emplacements des cartouche.

(appareil à vide, appareil à pression
positive, seringues).
Méthodologie SPE
Appareillage

Emplacements des cartouche.

(appareil à vide, appareil à pression positive,
seringues).
Méthodologie SPE
Appareillage

Emplacements des cartouche.

(appareil à vide, appareil à pression positive,
seringues).
Extraction en Phase Solide (SPE)
Mécanisme de SPE

Prétraitement de
l’échantillon 1 5 Lavage

Conditionnement 2 6 Séchage

Métodologie
SPE
Equilibration 3 7 Elution

Dépôt de séchage à sec et

l'échantillon 4 8 reconstitution
Méthodologie SPE

• Etapes SPE:
• Pré-traitement de l’échantillon.
• 1. Conditionnement de la cartouche
• équilibration
• 2. Dépôt de l’échantillon
• 3. Lavage de la cartouche (élimination des interférences)
• séchage de la cartouche
• 4. Élution et récupération des analytes
• Concentration des analytes
Chacune de ces étapes doit être optimisée au cours du processus de développement
de la méthode.
Méthodologie SPE

En SPE, un échantillon liquide, après un prétraitement approprié, est déposé sur une
cartouche préconditionnée / équilibrée garnie d’un matériau asorbant approprié; le
ou les analytes d'intérêt sont retenus sur l’asorbant (phase stationnaire) à travers
différents mécanismes d'interaction; les interférents passent directement à travers la
cartouche pendant (1) l'étape de dépôt ou (2) sont éliminés pendant l’étape de
lavage avec un solvant approprié; le ou les analytes d'intérêt sont ensuite élués de la
cartouche avec un solvant d'élution approprié.
L'éluat recueilli est (1) soit directement soumis à une analyse chromatographique ou
spectroscopique, (2) soit soumis à un processus de séchage à sec pour évaporer le
solvant d’élution. Cette étape est suivie par la reconstitution avec un solvant
approprié avant analyse.
Méthodologie SPE

• Pré-traitement de l’échantillon.
• Dissolution
• Dilution
• Précipitation
• Homogéniésation
• Ajustement de pH
Méthodologie SPE

• Pré-traitement de l’échantillon.

Le solvant où ils sont dissouts les analytes (solvant de l’échantillon ou de

chargement) doit être faible par rapport à l’adsorbant. Si le solvant est trop fort, les
substances à analyser ne seront pas retenues et la récupération sera infime.
Méthodologie SPE

1. Conditionnement de la cartouche:

Dans cette étape, la cartouche est «conditionnée» par le passage de quelques mL de

solvant.
Méthodologie SPE

Rôle: Le rôle de l'étape de conditionnement est double:

(a) elle permet d’éliminer les contaminants qui auraient pu être:

• présents dans la cartouche fournie par le fabricant.

• ou collectés au hasard alors que la cartouche est exposée à l'environnement

du laboratoire.
Méthodologie SPE

Rôle: Le rôle de l'étape de conditionnement est double:

(b) elle permet de mouiller l’adsorbant et de solvater les groupements fonctionnels

greffés sur la silice pour réactiver les sites de rétention de la PS (assurer
l’interaction).
Méthodologie SPE

Explication:

La majorité des adsorbants dans les cartouches SPE sont commercialisés à leur état
sec. Les adsorbants doivent être solvatés pour assurer une interaction efficace et de
manière reproductible avec les matrices aqueuses. La solvatation est importante car
les cartouches à base de silice en phase inversée (en particulier C8, C18 ou phényle)
à l’état sec présentent souvent une diminution considérable de la rétention des
échantillons d'analytes hydrophobes.
Méthodologie SPE
Méthodologie SPE

Le solvant utilisé pour le conditionnement doit être aussi fort, voire plus fort que le
solvant d'élution.
mode inversé (hydrophobe): méthanol (MeOH) ou de l'acétonitrile (ACN).
mode normal:
• phass greffées: méthanol (MeOH)
• silice pure: hexane.
Méthodologie SPE

• 1’. équilibration:
Rôle: éliminer le solvant de conditionnement.
Méthodologie SPE

• 1’. équilibration:

Le solvant utilisé lors de cette étape doit avoir la même force (ou une force
aussi proche que possible) que le solvant de l’échantillon (dépôt).

On utilise un solvant dont les caractéristiques ioniques et de pH sont les plus

proches possibles du solvant de l’échantillon.
Méthodologie SPE

• 1’. équilibration:

Rq: S'il subsiste un peu du solvant de conditionnement, on risque une

rétention faible et donc une récupération médiocre des analytes.
Méthodologie SPE

• 2. dépôt de l’échantillon :

Percolation de l’échantillon sur l’adsorbant.

Le but de cette étape est de provoquer une rétention quantitative des

analytes d’intérêts sur l’adsorbant tandis que le maximum d’interférents est éliminé
par simple non rétention.
Méthodologie SPE

• 2. dépôt de l’échantillon :

Pour un maximum d’efficacité, il est nécessaire de prévoir un débit modéré pour

assurer l’interaction des analytes et de l’adsorbant.
Méthodologie SPE

2. dépôt de l’échantillon :
Lors de dépôt, on a:
• les interférents n’ayant aucune affinité avec l’adsorbant ne seront pas
retenus : ils seront éliminés lors de dépôt.
• les analytes et éventuellemnt les interférents présentant une grande
affinité avec l’adsorbant seront retenus (fixés).
• des interférents faiblement retenus seront éliminés lors de l’étape de
lavage.
Méthodologie SPE
Méthodologie SPE

• 3. Lavage (élimination des interférents):

cette étape a pour but:
• d'évacuer le reste de l'échantillon qui adhèrent toujours aux parois de la
cartouche vers l’adsorbant.
• d’éliminer des interférents faiblement retenus sans éluer les analytes.
• de garantir que la totalité de l'échantillon entre en contact avec l’adsorbant.
Méthodologie SPE

Remarque: L'étape de lavage n'est pas indispensable mais elle permet néanmoins
d'obtenir des échantillons plus propres.
Méthodologie SPE

Choix du solvant de lavage:

On utilise des solvants de faible force éluante de façon à éliminer les

interférents tout en gardant les analytes fixés sur l’adsorbant.

On utilise comme solvant de lavage:

- un solvant un peu plus fort que le solvant de l’échantillon,

- ou un solvant de force égale (généralement c’est le solvant de l’échantillon).

Méthodologie SPE

Exemple :

mode inversé: eau ou solution méthanol/eau.

Remarque: Il arrive qu'on utilise plusieurs solvants de lavage, notamment dans le cas
des adsorbants ou des composés ioniques.
Méthodologie SPE

• 3’. séchage de la cartouche:

Il est recommandé à la fin de l’étape de lavage d’assécher le support pour

évaporer les traces de solvant de lavage. Cette étape améliore le rendement
d’extraction.

Le séchage se fait sous courant d’azote à 40°C. L’azote va accélérer

l’évaporation du solvant.
Méthodologie SPE

• 4. Élution :

On fait percoler un solvant spécifiquement choisi pour rompre

les interactions mises en jeu entre les analytes et l’adsorbant en
évitant, dans la mesure du possible, d’éluer les interférents fortement
retenus.
Méthodologie SPE

• 4. Élution :
choix du solvant :
• doit être capable d’entraîner la totalité des composés d’intérêts et qui évite
d’éluer des interférents fortement retenus.
• volatil (facilité d’évaporation).
• compatible avec la technique analytique suivante.
• son volume doit être faible de manière à obtenir un facteur de pré-
concentration très important.
Le débit du solvant doit être lent pour favoriser l’élution.
Méthodologie SPE

• 4. Élution :
Un solvant trop fort éluera également les interférents qui sont mieux retenus
que les analytes.
Si le solvant d'élution est inutilement faible, il en faudra des quantités
excessives pour éluer les analytes, ce qui réduira à néant l'avantage que présente la
SPE, qui n'exige qu'une faible quantité de solvants.
Un éluant de force optimale, est capable d’éluer les analytes et les
interférents fortement retenus restent dans la cartouche.
Méthodologie SPE

• 4. Élution :
Remarques:
En mélangeant des solvants miscibles, on peut pratiquement choisir "sur mesures"
la force du solvant désirée.
Chacun des solvants qui passent au travers de l’adsorbant doit être miscible avec le
solvant précédent. Si l'un des solvants n'est pas miscible, il ne pourra y avoir
interaction satisfaisante du solvant suivant avec l’adsorbant.
Le débit du solvant doit être lent pour favoriser l’élution.
Dans la pratique, le volume du solvant d’élution utilisé est généralement de 1,2 ml.
Méthodologie SPE

• Concentration et reconstitution des analytes:

On peut éliminer par évaporation le solvant d’élution pour:
• concentrer encore l’échantillon
• reprise des analytes dans un autre solvant approprié à l’analyse ultérieure.
• reprise dans un volume plus précis.
Méthodologie SPE

Solvant de reconstitution:
spectroscopie: un solvant qui n’absorbe pas à la longueur d’onde d’analyse.
HPLC: généralement c’est la phase mobile.
CPG: un solvant volatil.
Méthodologie SPE

Solvant de reconstitution:
spectroscopie: un solvant qui n’absorbe pas à la longueur d’onde d’analyse.
HPLC: généralement c’est la phase mobile.
CPG: un solvant volatil.