TECHNIQUES EN BIOLOGIE

GENERALE 8

Vanessa Arfi

1
 Les virus :
Généralités

 Un virus :
• ne se voit pas,
• ne se cultive pas,
• n’est pas retenu par le filtre Chamberland.

 Organisme acellulaire simple.

 Parasite intracellulaire obligatoire.

 C’est donc une entité biologique qui nécessite une cellule hôte
(animale, végétale, bactérienne), dont il utilise les constituants
pour se multiplier (ribosomes, mitochondries…).
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 Les virus :
Généralités

 Les virus existent sous une forme :

• intracellulaire : ce sont des éléments génétiques qui se

répliquent en utilisant le matériel génétique de la cellule hôte
(chromosome).

• extracellulaire : ce sont des objets particulaires, infectieux,

constitués au minimum d'un acide nucléique et de protéines.

3
 Les virus :
Généralités

 non visible au microscope optique

==> microscopie électronique

 10 à 400 nm

 Eléments obligatoires :
• nucléocapside = acide
nucléique (ADN ou ARN) +
capside

 Eléments facultatifs :
• enveloppe
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 Les virus :
Généralités

enveloppés

complexes

hélicoïdales 5
icosaédriques
 Les virus :
Généralités
 Rôle des différents éléments composant un virus :

• Capside : protège le génome viral et porte les déterminants

nécessaires à la fixation du virus aux récepteurs cellulaires
dans le cas de virus nus

• Enveloppe : double couche lipidique qui supportent les

déterminants qui reconnaissent les récepteurs cellulaires

• Génome : code pour toutes les protéines virales qui vont

participer à la réplication du virus dans la cellule hôte

• Déterminants : protéine virale qui reconnaît un récepteur

cellulaire spécifique 6
 Les virus :
Généralités

 La multiplication des virus :

• Principales étapes utilisées lors de

la multiplication des virus dans une
cellules hôte

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 Production de virus

 Soit sur des cellules en culture in vitro

 Soit sur des cellules d’œufs embryonnés de 5 à 10 jours (œufs

fécondés)

 Soit sur des cellules d’un animal entier et vivant

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 Production de virus

 Sur cellules en culture :

• Infecter in vitro des cellules permissives au virus à une

certaine MOI (titre) calculée préalablement (variable)

• Récolter le surnageant après un temps d’infection (variable en

fonction des virus)

• Purifier les particules virales

• Congeler

• Titrer le virus

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 Production de virus

 Formation de plages de lyse (zones localisées de lyse cellulaire) ou

effets cytopathiques (anomalies cellulaires).

 Intérêt :
• Aucun recours à l’animal
• Facilité de mise en œuvre 10
 Production de virus

 Sur des cellules d’œufs :

• Infecter des œufs contenant des embryons de poulet

Des œufs fécondés de dix jours sont 11

inoculés avec des virus.
 Production de virus

 Sur des cellules d’un animal vivant :

• Utilisé si virus incultivables par les deux autres méthodes

 Animaux utilisés :
• Chimpanzé
• Lapin
• Génisse (virus de la vaccine)

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 Production de virus Influenza
En cellules En œufs

Cellules MDCK

Infection : Utilisation d’un milieu dépourvu de

sérum + ajout de trypsine (favorise
l’attachement des particules virales)

Incubation des cellules pendant 1h sous

agitation (utilisation d’un milieu minimal,
recouvre seulement les cellules)

Ajouter du milieu frais dépourvu en sérum

Incuber à 37°C sous 5% d’O2 pendant le temps

nécessaire (variable selon les virus)

Récupération des surnageants et congélation

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Titration
 Purification de virus

 Il existe cinq méthodologies principales :

• Centrifugation différentielle
• Centrifugation en gradient de densité
• Précipitation des virus
• Dénaturation des contaminants
• Digestion enzymatique des contaminants

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 Purification de virus
Centrifugation différentielle
 Méthode la plus simple : une
suspension contenant des particules
virales est soumise par rotation à
une force centrifuge.

 Suivant la force et le temps de

centrifugation, on peut clarifier une
suspension virale de ses débris
cellulaires laissant le virus en
suspension (10 000 x g, 15 min) ou
encore déposer au culot le virus
(100 000 x g, 60 min).

 Obtention d’un virus semi-purifié

 Toutefois, la sédimentation au culot des virus peut entraîner leur

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inactivation, spécialement les virus enveloppés.
 Purification de virus
Ultracentrifugation

 Il est alors recommandé d'utiliser un coussin d'une solution plus

dense que le virus (chlorure de césium, saccharose, tartrate de
potassium… ) => gradient de densité à l’équilibre

 La particule virale va flotter sur le coussin, l'empêchant d'être

écrasée et inactivée au fond du tube

 Quand les virus n’atteignent pas la densité de flottaison :

centrifugation zonale.

 Lorsque les virus atteignent leur densité de flottaison :

centrifugation isopycnique.

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 Purification de virus
Ultracentrifugation

 Permet la séparation virus-impuretés

par propriétés physiques
Virus

 Obtention d’un virus très purifié

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 Purification de virus
Précipitation

 Par du polyéthylène-glycol et du sulfate d'ammonium

 Utilisation d’une concentration juste inférieure à celle qui

précipitera les virus.

 On enlève alors les contaminants qui sont précipités puis on ajoute

plus de composé précipitant (sulfate d’ammonium par exemple) et
on recueille les virus précipités par centrifugation

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 Purification de virus
Dénaturation des contaminants

 Comme les virus sont généralement moins facilement dénaturés

que beaucoup de constituants cellulaires, on peut également
dénaturer les contaminants à l’aide de :

• chaleur,
• changement de pH,
• utilisation de solvants organiques (chloroforme...).

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 Purification de virus
Digestion enzymatique des
contaminants

 Des enzymes (protéases et nucléases) peuvent être utilisées pour

dégrader les protéines et les acides nucléiques cellulaires car les
virus sont généralement plus résistants à ces enzymes.

 La ribonucléase et la trypsine, par exemple, dégradent les acides

ribonucléiques et les protéines cellulaires tout en laissant souvent
les virions intacts.

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 Titrage des virus

 Utilisé pour déterminer le nombre de virus présents dans un

échantillon.

 Deux approches sont utilisées :

• Comptage direct des particules virales capables d’infecter des

cellules permissives.
• Indirectement par dénombrement des unités infectieuses. On
a apparition d’effets cytopathologiques (formation de syncytia
et lyse cellulaire).

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 Titrage des virus
Comptage direct

 Utilisation d’un microscope électronique

 Les particules virales sont comptées ainsi que des billes en latex
qui servent de référence (concentration connue).

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 Titrage des virus
Méthodes indirectes
 Test d’hémagglutination :
• Détermine la dilution de virus la plus élevée qui entraîne une
hémagglutination de globules rouges du sang.
• Méthode rapide et précise pour déterminer la quantité relative
de certains virus tels que le virus de la grippe.

Ac anti-virus présent Ac anti-virus absent

Ac lie le virus
Liaison du virus au GR Virus lient GR
inhibée

Hémagglutination inhibée Hémagglutination

(culot de GR) (formation d’un réseau)

23
 Titrage des virus
Méthodes indirectes
 Méthode des plages :
• Différentes dilutions de virus sont étalées sur des cellules
hôtes appropriées.
• Dénombrement des plages de lyses.
• Les résultats sont exprimés par nombre de virus infectieux ou
d’unités formatrices de plages (UFP).

UFP/ml = (17UFP/0,1ml)x(106) = 1,7 x 108 24

 Titrage des virus
Méthodes indirectes
 Méthode des plages :

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 Titrage des virus
Méthodes indirectes
 Méthode des dilutions :
• Utilisée quand les 2 autres ne permettent pas d’évaluer les
effets biologiques
• Détermine la dilution limite (plus petite quantité de virus
possible) à laquelle 50% des cellules ou des organismes hôtes
sont infectés ou détruits.
• Les résultats sont exprimés sous forme de dose létale DL50 et
de dose infectieuse DI50.

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 Titrage des virus
Méthodes indirectes
 Méthode des dilutions :
50

Le point d’infectivité à 50% se situe entre 10-5 et 10-6 :

(64-50)/(64-7) = 0,25
Donc DI50 = 10-5,25 27
 Titrage des virus
Méthodes indirectes

 A partir d’un calcul de DI50 on déterminera la multiplicité

d’infection (MOI) en fonction du nombre de cellules utilisées

 MOI : Rapport entre le nombre de particules infectieuses sur le

nombre de cellules soumises à l’infection.

 108 cellules sont exposées à 104 virus

Quelle est la multiplicité d’infection?
104 / 108 = 10-4 Virus/cellule

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 Méthodes de détection de virus

 Western blot avec un Ac dirigé contre une protéine virale :

exemple : Influenza

 ELISA, IF avec un Ac dirigé contre une protéine virale

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 Méthodes de détection de virus

 PCR en temps réel avec une gamme étalon de virus :

 PCR conventionnelle, séquençage 30

 Méthodes de détection de virus

 Séroneutralisation : basée sur la capacité d’un Ac à empêcher le

virus d’infecter un tapis cellulaire
Etape 1 : mélange
du sérum à tester
avec une
suspension virale

Etape 2 : mise en
contact du
mélange avec un
tapis cellulaire
confluent

Etape 3 : lecture
du résultat au
microscope après
coloration
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