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Fondamentaux de la culture virale :

méthodes et stratégies de
propagation virale

Adria Allen, MS
Biologiste principal, ATCC

Alexander Piccirillo, biologiste

principal MS, ATCC

Megan Yockey, BS
Biologiste principal, ATCC

CrédibleMène àIncroyable™
 À propos de l'ATCC

▪
Fondée en 1925, ATCC est une organisation à but non lucratif
dont le siège social est à Manassas, en Virginie, et un centre de
R&D et de services à Gaithersburg, dans le Maryland.
▪ Le matériel biologique et la ressource d'information la plus vaste et
la plus diversifiée au monde pour la culture cellulaire – le
"étalon-or»
-
Collaborer avec le gouvernement, l’industrie et le monde
universitaire
- Premier fournisseur mondial de lignées cellulaires
authentifiées et de standards viraux et microbiens
- Ventes et distribution dans 150 pays, 19
distributeurs internationaux

▪ Entreprise de R&D innovante proposant l'édition génétique, le - Équipe talentueuse de plus de 450 employés, dont plus d'un tiers
microbiome, le NGS et les modèles avancés sont diplômés d'études supérieures

▪ Biodépôt cGMP

2
 Ordre du jour

▪ Fondamentaux des virus

− Présenté par Adria Allen

▪ Authentification et contrôle qualité

− Présenté par Megan Yockey

▪ Stratégies de dépannage
− Présenté par Alex Piccirillo

Norovirus, gracieuseté du Dr Charles D. Humphrey, CDC

3
 Les fondamentaux
Crédible mène à InCredible™

4
 Aperçu

▪ Bases des virus

− Structure
− Cycle de vie

▪ Propagation du virus

▪ Hôtes communs

▪ Stratégies de propagation

Virus de la grippe, avec l'aimable autorisation du Dr Erskine L Palmer et

ML Martini, CDC

5
 Virus : les bases

▪ Génome
− ADN ou ARN
− Double brin ou simple brin
− Segmenté ou non segmenté

▪ Structure
− Enveloppé ou non enveloppé

Norovirus, gracieuseté du Dr Charles D. Humphrey, CDC

6
 Cycle de vie des virus

▪ Pièce jointe
− serrure et clé
Pièce jointe
− Hôte susceptible

▪ Pénétration

Libérer Pénétration
− Le virus pénètre dans la cellule

▪ Réplication/Assemblage
− Hôte permissif
− Le virus réquisitionne les fonctions cellulaires pour produire
davantage de virus

Assemblée Réplication ▪ Libérer*

7
 Cycle de vie du virus : version

▪ Lyse cellulaire

− Destruction de la cellule hôte

− Particules virales libérées en même temps
− Virus généralement non enveloppés

▪ Excrétion virale
− Exocytose
− Bourgeonnant

▪ Associé aux cellules

− Le virus ne se libère pas complètement de l'hôte

− La cellule hôte aide à infecter un nouvel hôte

VIH (vert) bourgeonnant à partir d'un lymphocyte, gracieuseté de la bibliothèque

d'images de santé publique

8
 Propagation du virus

▪ Passage viral
− La réalisation d’un cycle de :
Inoculation
oInoculation

oIncubation

oRécolte

▪ Historique des passages

Incubation
− Une histoire chronologique quantitative des hôtes utilisés pour
propager un produit viral spécifique

− Indique si différents hôtes ont été utilisés

− Indique combien de fois une souche virale a été transmise
Récolte

9
 Hôtes du virus : œufs embryonnés

▪ Oeufs embryonnés
− Avantages
oEnvironnement stérile
oPlusieurs tissus
oPlusieurs enzymes
oCapable d’augmenter facilement la production
oInoculation simple
− Limites
oNe convient pas à tous les virus
oAllergènes possibles
▪ Culture de cellules

dix
 Hôtes viraux : culture cellulaire

▪ Culture cellulaire : croissance de tissus ou de cellules dans un milieu

artificiel distinct de l'organisme parent

▪ Lignée cellulaire : culture cellulaire développée à partir d’une seule cellule et donc
constituée de cellules présentant une constitution génétique uniforme.

▪ Types de lignées cellulaires

− Adhérent
− Suspension

▪ Avantages

− Reproductibilité : Cultivé dans un environnement hautement contrôlé

− Capacité à augmenter la production

▪ Limites
− Environnement hautement contrôlé
Cellules hôtes, Vero (ATCC®CCL-81™)
oDoit ajouter tout le nécessaire pour le cycle de vie du virus
11
 Inoculer la culture cellulaire

▪ Préparation
− Retirer le milieu de croissance cellulaire des cellules
Préparation
− Inoculum
oQuantité de virus portée à un volume spécifique
▪ Adsorption
− Ajouter l'inoculum à la culture cellulaire Adsorption
− Faible volume pour augmenter l’interaction du virus hôte
− 1 à 3 heures

▪ Alimentation

− Ajouter un milieu de croissance virale Alimentation

− Garder les cellules en vie suffisamment longtemps pour répliquer le virus

12
 Quand récolter ?

▪ Durée d'incubation
− Basé sur le temps
oAucun CPE visible
− Basé sur l'effet cytopathique

▪ CPE commun
− Arrondi des cellules
− Agglomération cellulaire
− Syncytie
− L'élargissement des cellules

Virus de l'hépatite murine, formation de syncytia (ATCC® Adénovirus humain 41, arrondissement et agglomération
VR-261™) cellulaire (ATCC® VR-930™)

13
 Récolte

▪ Rayer
− Virus qui ne sont pas associés aux cellules

▪ Dissociation
− Cellules adhérentes doucement détachées de la paroi vasculaire
− Des cellules encore vivantes

14
 Stratégie d'infection 1

▪ Plusieurs cycles de réplication en un seul passage

▪ Je ne veux pas que les cellules hôtes soient infectées en même temps

− Inoculer avec moins de virus

▪ Accumulation de particules virales dans les milieux de croissance virale

▪ Caractéristiques du virus

− Virus non enveloppés

− Virus qui survivent hors de leur hôte pendant de longues périodes

Norovirus murin (ATCC®VR-1937™)

15
 Stratégie d'infection 2

▪ Peu de cycles de réplication par passage viral

▪ Les cellules hôtes doivent être au même stade d’infection au même

moment

▪ Infecter avec plus de particules virales que de cellules hôtes

▪ Caractéristiques du virus

− Le virus perd sa viabilité rapidement après sa libération de la cellule

− Cellule associée
− par exemple, Varicelle-zona (VZV ; ATCC®VR-1433™)

Infection par le VZV des cellules BSC-1 (ATCC®CCL-26™)

16
 Stratégie d'infection 3

▪ Infecter les cellules hôtes une fois

− Les cellules hôtes infectées se diviseront en deux cellules filles

infectées

− Les cellules non infectées seront infectées par des particules virales provenant
de cellules infectées.

▪ Passage du virus défini en divisant les cellules infectées

− Identique au passage en culture cellulaire

▪ Caractéristiques du virus

− Le virus intègre le génome dans la cellule hôte

− Infection persistante
− par exemple,rétrovirus
Virus de la leucémie féline (ATCC®VR-1889™)

17
 Authentification, contrôle qualité et conservation
Crédible mène à InCredible™

18
 Contour

▪ Quantification virale et viabilité

− Dosages de plaques
− TCID50
oSpécifications du titre
oIFA, RT-PCR/PCR
− CEID50
oTest HA

▪ Méthodes d'authentification

− NGS
− Séquençage de Sanger
▪ Méthodes de contrôle qualité

− Tests de mycoplasmes
− Tests de stérilité
▪ Conditions de stockage des virus pour garantir leur intégrité

19
 Quantification et viabilité des virus

- La quantification virale consiste à compter le nombre de particules

virales dans un volume connu pour déterminer la concertation.

−Il existe trois méthodes différentes pour la quantification virale

oInoculer des cellules ou des œufs pour mesurer le pouvoir infectieux :

• Test sur plaque, test immunoflurocescent (IFA) et test de

dilution au point final (TCID)50/CEID50)
oAnalyser les niveaux d’expression des protéines virales ou des gènes :

• ELISA, qPCR
oCompter les particules virales :

• Microscopie électronique à transmission (TEM) et compteurs

viraux

Image du norovirus

20
 Quantification et viabilité des virus

- Dosages de plaques

− S'appuie sur des séries de dilutions de point final

− Les plaques virales sont de petites zones de

mort cellulaire.

− Les plaques sont comptées pour déterminer

PFU/mL

− La formation de plaque peut prendre 3 à 14

jours

− PFU/mL représente le nombre de

particules infectées dans
l'échantillon
oHypothèse : chaque plaque Herpèsvirus équidé 1 (ATCC®VR-2248™) dans
Vero (ATCC®CCL-81™)
formé est une particule virale
schéma baculoQUANT publié dansBiotechnologie12
février 2019 infectieuse

21
 Quantification et viabilité des virus
Échantillon viral

▪ Dose infectieuse pour culture tissulaire (TCID)

100µL 100µL
− Le titre viral peut être déterminé in vitro en
calculant la dose infectieuse
oConcentration à laquelle 50% des cellules sont 900µL 900µL 900µL
A continué
infecté/le puits sur lequel les cellules ont été cultivées
est inoculé
− Réalisé à l'aide d'un test de dilution au point final
0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml
oLe titre peut prendre 3 à 14 jours
− Titre généralement déterminé par la présence de CPE
NC NC NC 1E-4 1E-4 1E-4
oLa précision est basée sur le nombre de répétitions
1E-7 1E-7 1E-7
à chaque dilution
oCalculé selon la méthode Reed-Muench
(Burleson et al. 1992, Reed et Muench 1938)
1E-1 1E-1 1E-1
− Exigence de titre minimum pour les éléments ATCC - 5 x
103TCID50/mL Exemple de TCID50Essai

22
 Quantification et viabilité des virus

▪ Test immunoflurocescent (IFA)

− Observé à l'aide d'un microscope équipé pour
détecter la fluorescence

− Les tests d'immunofluorescence directe (DFA)

utilisent un anticorps
Shawn Kelvin, Day Web Chronique
− Les tests d'immunofluorescence indirecte (IFA)
utilisent un anticorps primaire et secondaire
− Utilisé pour interpréter le TCID50soit pour confirmer la
présence de CPE, pour augmenter la spécificité, soit
pour les virus qui ne produisent pas de CPE

Adénovirus humain 19 (ATCC®VR-1979™) dans MRC-5 (ATCC®CCL-171)

23
 Quantification et viabilité des virus

▪ Vérification du titre RT-PCR/PCR

− Utilisé lorsque les éléments viraux ne produisent pas de CPE
et que les anticorps ne sont pas disponibles pour l'IFA

− Concevoir des amorces spécifiquement pour les

produits viraux

− TCID50les puits sont récoltés individuellement

− Chaque puits est extrait pour l'ARN ou l'ADN en
fonction du type viral.

− Exécutez la RT-PCR pour les éléments d'ARN

− Exécuter la PCR pour les éléments d'ADN
Polyomavirus BK (ATCC®VR-837™) dans HEL 299 (ATCC®CCL-137™)
− TCID50est déterminé en fonction de la présence
ou de l'absence d'une bande visible sur l'E-gel

24
 Quantification et viabilité des virus

▪ Dose infectieuse d'embryon de poulet

(CEID50) :

▪ Les dilutions en série du point final sont inoculées

dans des œufs de poule embryonnés.

− Les œufs de poule embryonnés sont

couramment utilisés pour produire des virus de
la grippe

− Les résultats sont mesurés à l'aide

Récolte des œufs
d'un test d'hémagglutination

oBouton que Lattice indique positif

échantillon

one coule pas indique un résultat négatif

échantillon

oTitre calculé avec Reed-Muench

méthode (Burleson et al 1992, Reed
et Muench 1938)
Exemple de CEID50Test HA - Virus de la
grippe B (ATCC®VR-295™)
25
 Authentification des virus

- Séquençage de nouvelle génération (NGS) -

technologie utilisée pour les éléments d'ADN et
d'ARN.

- Séquençage complet du génome en quelques

heures

- L'ATCC nécessite une correspondance à 98 %

supérieure ou égale à 1 000 pb à la séquence
de référence.

- L'ATCC utilise NGS comme autre méthode

pour déterminer si l'article est contaminé
−Alex passera en revue cela comme l'une
de nos méthodes de dépannage

26
 Authentification des virus

- Séquençage de Sanger
− Capable d'analyser de courts fragments du
génome, un fragment à la fois

− Étalon de haute précision développé il y

a 70 ans
− Utilisé comme méthode d'authentification pour les
produits d'acide nucléique de l'ATCC

− Bonne comparaison pour NGS comme deuxième

méthode d'authentification si nécessaire

− Capacité limitée à détecter la contamination

Image modifiée de "Séquençage de Sanger ," par Estevezj (CC BY-

SA 3.0 ). L'image modifiée est sous licence (CC BY-SA 3.0 ) Licence

27
 Méthodes de contrôle de qualité

- Stérilité
− Les articles ATCC sont cultivés sans antibiotiques
oNécessite une technique aseptique exceptionnelle

oLa contamination bactérienne est facile à repérer

• Médias troubles

• En cas d'acidification, le milieu devient jaune/orange

• Réplication restreinte ou pas de réplication du virus

Compteur de bactéries ATCC
− Les articles ATCC nécessitent une stérilité de 14 jours

oTests du système de compteur bactérien pour les bactéries aérobies et

contamination par des micro-organismes anaérobies

oContaminant identifié

oMALDI-TOFutilisé spécifiquement pour identifier

contamine pour assurer un nettoyage facile de l'article si
nécessaire

28 ATCC MALDI-TOF
 Méthodes de contrôle de qualité

▪ Contamination par les mycoplasmes

− Pas facile à détecter

oPas de turbidité des médias

oPas de changement de pH

oNe peut pas être détecté au microscope

− Que peut provoquer une contamination par les mycoplasmes
oInhibe la croissance cellulaire
Kit universel de détection des mycoplasmes (ATCC® 30-1012K™)
oAffecte la réplication virale
oMort cellulaire inexpliquée

▪ Tests de mycoplasmes

− L'ATCC produit un kit de détection de mycoplasmes par PCR

oTests pour 60 des sérotypes les plus courants

29
 Stockage

▪ Cryoconservation-
− Virus lytiques
oFlash congelé dans le réservoir LN et déplacé à -80°C pour le stockage
oLyophilisation - n'est plus utilisée à l'ATCC, mais largement
utilisé dans le passé

− Virus associés aux cellules

oExiger un gel contrôlé des tarifs
oPeut nécessiter un cryoconservateur tel que le DMSO
• Formation de glace nuisible à la viabilité cellulaire
• Le produit final stocké dans les réservoirs LN garantit l’intégrité des cellules

CoolCell®Récipient de cryoconservation sans alcool LX Dépôt ATCC, réservoirs d'azote liquide

(ATCC®ACS-6000™)

30
 R&D et dépannage
Crédible mène à InCredible™

Grippe, avec l'aimable autorisation du Dr FA Murphy, CDC

31
 Pourquoi la réplication et la propagation virales échouent ?

Problèmes majeurs de croissance

▪ Le MOI (multiplicité d’infection) n’est pas optimisé

▪ Le virus n'est pas adapté à l'hôte le plus approprié

▪ L'environnement in vitro manque de facteurs de croissance cruciaux (par

exemple,formulation des milieux, enzymes, etc.)

▪ Contaminants dans la culture cellulaire et/ou virus

TEM du VIH, gracieuseté des Drs. Harrison et Feorino, bibliothèque

d'images de santé publique

32
 Objectif de la virologie MSAT

Effectuer la R&D si nécessaire pour résoudre les problèmes de croissance et

améliorer la qualité des produits viraux existants

33
 Optimisation du MOI

▪ Le MOI optimal varie en fonction de :

Polyomavirus BK
− Nombre d'agents infectieux, (ATCC®VR-837™)
MOI 0,01
− À quelle vitesse ces agents s’attachent aux cellules 15 jours après l'infection

hôtes

− Combien de temps est accordé pour la

pièce jointe

− Nombre de cellules hôtes

▪ MOI vs dilution
Polyomavirus BK
▪ Un MOI élevé nécessite que chaque cellule de la (ATCC®VR-837™)
culture soit infectée ; un faible MOI est utilisé MMOI 1.0
lorsque plusieurs cycles d’infection sont 15 jours après l'infection

nécessaires

34
 Adaptation aux cellules hôtes

▪ De nombreux virus sont spécifiques à un hôte, ce qui signifie qu’ils n’infectent que certains types de cellules dans les
tissus (tropisme) ; certains peuvent avoir plus d'un hôte

− par exemple, le poliovirus présente un tropisme pour les tissus du cerveau et de la moelle épinière, le virus de la grippe présente un
tropisme primaire pour les voies respiratoires

▪ Adapter les matériaux déposants à partir de : cellules primaires, œufs, modèles in vivo, etc.

▪ Importance d'effectuer plusieurs passages dans l'hôte

Virus coxsackie humain s'adaptant

aux cellules RD (ATCC®CCL-136™)
du passage 2 au passage 3

35
 Facteurs de croissance environnementale

▪ Un milieu approprié est important pour développer et maintenir la lignée

cellulaire hôte et le virus lui-même

− EMEM contre DMEM

− Pourcentage de sérum

▪ La trypsine est-elle nécessaire ?

− Certains virus comme la grippe et les rotavirus

dépendent de la trypsine
− Agit comme un clivage protéolytique pour les protéines virales afin de
permettre une fixation réussie aux cellules hôtes

36
 Contaminants

▪ Les virus peuvent être contaminés par diverses bactéries, champignons et/ou
autres cultures d'ADN/ARN viral, en particulier les éléments beaucoup plus
anciens du catalogue ATCC.

▪ La contamination croisée du virus peut être détectée par NGS et

résolue par purification sur plaque

▪ MRA (agent d'élimination des mycoplasmes) vs éther diéthylique

▪ D'autres bactéries/champignons peuvent être éliminés par filtration ou par utilisation

d'antibiotiques/antimycotiques.

37
 Qu’en est-il des nouveaux éléments d’adhésion ?

▪ Des échantillons viraux sont envoyés à l'ATCC par des chercheurs et des scientifiques du monde entier pour être
déposés en vue d'une éventuelle propagation et authentification.

▪ Avec plus de 2 000 virus, dont des souches types issues de différentes espèces hôtes, l'ATCC veille à ce que
chaque préparation réalisée soit la plus proche possible du dépôt de culture d'origine, tout en prenant
toutes les mesures nécessaires (optimisation du MOI, adaptation à un hôte plus bénéfique, etc.) pour
fournir le meilleur produit disponible aux clients

▪ Vous avez un échantillon à déposer ? Contactez l'Unité centrale des accessions auCAU@atcc.org ou
visitezhttps://www.atcc.org/en/Services/Deposit_Services.aspx

38
 Résumé
▪ Fondamentaux des virus

− Les stratégies de propagation dépendent de la manière dont un virus infecte et est libéré des cellules hôte
− Les cellules hôtes doivent être sensibles et permissives pour que la propagation virale réussisse
− La propagation du virus peut être décomposée en 3 étapes : inoculation, incubation et
récolte

▪ Authentification et contrôle qualité

− L'ATCC utilise diverses méthodes pour garantir la viabilité et l'authentification des produits viraux
− Nous veillons également à ce que nos produits soient soumis à des procédures de contrôle de qualité appropriées.
− L'intégrité des éléments viraux ATCC est préservée grâce à des techniques de stockage appropriées
▪ Stratégies de dépannage
− L'objectif principal de MSAT Virology est d'effectuer de la R&D pour résoudre les problèmes de réplication et de propagation.
oOptimisation du MOI, adaptation à la lignée cellulaire hôte la plus appropriée, ajout idéal
facteurs de croissance environnementaux et élimination des contaminants de la culture virale

− Les échantillons viraux déposés à l'ATCC seront correctement répliqués et authentifiés

− MSAT Virology utilise diverses bonnes pratiques pour garantir une propagation réussie
Norovirus, gracieuseté du Dr Charles D. Humphrey, CDC

39
 Des questions?
Crédible mène à InCredible™

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 De notre laboratoire au vôtre

Conseils de sécurité pour retourner au laboratoire

Pour vous aider à retourner au travail, nous avons élaboré un kit

gratuit contenant les meilleures pratiques pour vous aider à garder
votre laboratoire exempt d'infection :

- Affiche
- Infographie
- Décalcomanies

Commandez le kit ici :

www.atcc.org/backtothelab

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répertoriées dans cette publication sont des marques déposées appartenant à l'American Type Culture Collection, sauf indication
contraire.

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