ECOLE NATIONALE

SUPERIEURE DE
BIOTECHNOLOGIE
CONSTANTINE

Chapitre 3: Ordre chimique des

réactions enzymatique et Site Actif

Dr. ALYANE Mohamed 1

 I. Rappel de cinétique chimique formelle
 La cinétique chimique se propose de déterminer, pour une réaction donnée, la vitesse de disparition

des réactifs ou la vitesse d’apparition des produits.

 Elle mesure les variations des concentrations des réactifs ou produits en fonction du temps.

1. Ecriture d’une réaction chimique

Une réaction chimique s’écrit de la façon la plus générale:

n1 A1  n2 A2  ........  ni Ai  m1 B1  m2 B2  ..........mi Bi

Notre sens d’écriture de gauche vers droite nous fait appeler:

 A1,A2,….Ai  réactifs et B1, B2,…….Bi  produits

 n1, n2,…..,ni et m1, m2,…..,mi  coefficients stœchiométriques

NB
AB  vitesse dépend uniquement de la concentration en A  La concentration en B n'intervient
pas du tout.

A B  les concentrations instantanées de A et B influence la vitesse de la réaction.

2
2. Réactions élémentaires et réactions complexes
2.1. Réaction élémentaire ou simple
 Réaction qui procède en une seul étape  passage des réactifs aux produits sans formation de
constituants intermédiaires.
Ex. Formation du méthanol à partir du chloroforme CH 3Cl  OH   CH 3OH  Cl 
 Les diverses réactions simples se classent suivant leur molécularité i.e. selon le nombre des particules
qui entrent en collision. On distingue
 Réaction monomoléculaire (molécularité =1)  A B
 Réaction dimoléculaire (molécularité =2)  A+ B  C
 Réaction trimoléculaire (molécularité =3)  A+B+C  D
2.2. Réaction complexe
Elle se décompose en plusieurs réactions élémentaires.
Ex. Décomposition du pentoxyde d'azote, comporte 3 étapes élémentaires
Etat initial

Etat final 3
3. Vitesse d’une réaction
A  bP
H2 +I2  2HI
 Vitesse d’une réaction  Mesure de la rapidité avec laquelle la concentration des réactifs et des
produits change au cours du temps
 On peut calculer la vitesse d’une réaction en fonction des produits formés:

var iation de la concentration du produit P 

v 
Temps écoulé t

HI 
v ...1...
t

 On peut calculer la vitesse d’une réaction en fonction des réactifs transformés:

var iation de la concentration du réactif A

v 
Temps écoulé t
H 2 
v ...2... 4
t
 La relation qui existe entre ces deux expressions dépend de l’équation de la réaction.

 La vitesse de formation du produit (l’iodure d’hydrogène) est deux fois plus grande que la vitesse de

disparition de chacun des réactifs

 Dans un même intervalle de temps, pour chaque molécule de réactifs transformée, deux fois plus de

molécules de produits sont formées  la vitesse déterminée en fonction du produit (l’iodure

d’hydrogène) soit deux fois plus grande que celle déterminée en fonction de chacun des réactifs.

H 2   1  HI 
1 A 1 P  v  
v  t  2  t
 t b t

5
3.1. La vitesse générale d’une réaction

Pour que la vitesse d’une réaction soit la même peu importe la substance choisie (réactif ou produit), 

on utilise la vitesse générale de réaction, que l’on calcule de la façon suivante:

Soit la réaction hypothétique suivante:

aA + bB  cC + dD

1 1 1 1
v g  vA  vB  vC  vD
a b c d

Vg  représente la vitesse générale, en mol/L•s

vA, vB, vC et vD  représentent la vitesse en fonction de chacune des substances en jeu dans la
6
réaction
3.2. La vitesse instantanée d’une réaction

Vitesses calculées associées à un certain intervalle de temps  vitesses moyennes

 Vitesse instantanée  correspond à une vitesse mesurée à un instant précis  Plus l’intervalle de

temps est court, plus la vitesse calculée se rapproche de la vitesse instantanée.

La vitesse instantanée est déterminée en calculant le taux de variation de la tangente tracée à partir du

graphique de la concentration en fonction du temps.

 Au temps zéro, la vitesse instantanée correspond à la vitesse initiale de la réaction.,

7
4. Vitesse et ordre d’une réaction chimique
4.1. Loi de Van’t Hoff
 Soit la réaction bilan 
n1 A1  n2 A2  ........  ni Ai  m1B1  m2 B2  .......... mi Bi
 Van’t Hoff a montré que la vitesse de cette réaction est de la forme suivante:

V  k A1  xA2  x........xAi 

n1 n2 ni

k  constante de vitesse  elle est caractéristique de la réaction et dépend de la température.

3.2. Validité de la loi de Van’t Hoff: ordre d’une réaction Van’t Hoff (1852-1911)
 La loi de Van’t Hoff n’est pas toujours vérifiée  expérience montre que la vitesse est liée à la
concentration des réactifs par une relation de la forme:

V  k A1  xA2  x........xAi 

1 2 i

 α1,α2,…….,αi  des réels positifs différents des coefficients stœchiométriques

 Ils représentent les ordres partiels de la réaction relatifs aux réactifs A1, A2,…..,Ai
 La somme α1+α2..…, + αi  ordre globale de la réaction.
NB
 Pour une réaction élémentaire  l’ordre est égale à la molécularité.
 Si α1=n1, α2=n2,……αi=ni la loi de Van’t Hoff est vérifiée. 8
4. Variation des concentrations au cours du temps
A P
4.1. Réaction simple d’ordre zéro ou nul (sans ordre)
 Ces réactions correspondent aux cas où la vitesse est indépendante de la
concentration des réactifs la combustion d’une bougie est réaction d’ordre zéro.

v  k A

 La vitesse « v » est donnée par la relation:
 Réaction d’ordre « 0 »  α = 0  v  k

d A d A
v  k, v     k  d A  kdt
dt dt
A t

 d A  k  dt  A A

A0 0
0  kt  A   kt  A0

 [A]0  concentration de A à l’instant initial (t = 0 sec)

 [A]  concentration de A à l’instant « t »
 k  s’exprime en mole. L-1.s-1 (unité de k= [concentration](1-n)*temps-1
Pour montrer qu'une réaction est d'ordre zéro  il suffit de porter sur un graphe la concentration du
réactif en fonction du temps et de vérifier que l'on obtient une droite. La pente de cette droite est alors
9
égale à « - k ».
4.2. Réaction simple d’ordre 1
A BC
 Dans les réactions d’ordre 1, la quantité de substrat transformé par unité de temps est

proportionnelle à la quantité du substrat présent.

 La dénaturation thermique des protéine et la désintégration radioactive  cinétique d’ordre 1

d A d A d A
A t
v  k A , v    k A  
1
  k  dt
dt dt A0
A 0

 A 
 lnA    kt  lnA   kt  lnA0
A
  kt  ln
 A0 
A0

 k  s’exprime en sec-1

 Pour montrer qu'une réaction est d'ordre 1 il suffit de porter

sur un graphe le logarithme népérien de la concentration du réactif

en fonction du temps et vérifier que l'on obtient une droite. La pente

de cette droite est alors égale à «-k».

10
NB1
Temps de demi-réaction ou T1/2

 Le T1/2  est le temps au bout duquel a disparu la moitié du réactif.

 Pour les réactions d’ordre 1  le temps de demi-vie est indépendant de la concentration initiale.

t  T1  A 
A0
 T1 
ln 2
2
2 2
k
NB2

Les réactions d’ordre 1 la concentration du substrat diminue exponentiellement .

 A 
ln   kt  A  A0 e  kt
 A0 

NB3
Pour les désintégrations radioactives, le temps de

demi-vie est nommé période.

11
4.3. Réaction simple d’ordre 2 A  B  produit
 Les réactions de synthèses bimoléculaires rentrent dans cette catégorie.

 Dans ce cas, la vitesse montre une dépendance quadratique vis-à-vis de la concentration.

Calcul: v  k AB 

 Si les concentrations initiales en réactifs A et B sont égales ([A]o = [B]o  à tout instant «t»  [A]

v  k A
2
= [B]  l'équation de vitesse s'écrit:

d A d A
A t A
 A 1 1
 k A   2  k  dt     kt 
2
v  kt 
dt A0
A 0
  A Aà A A0

 pour une réaction élémentaire d'ordre global 2  le graphe

représentant l'inverse de la concentration en réactif A en fonction du
temps  sera une droite de pente k (constante de vitesse)
 Unité de la constante k  L.mol-1.sec-1
12
5. Cinétique expérimentale: détermination de l’ordre
V  k A1  xA2  x........xAi 
1 2 i

 Pour déterminer l’ordre global (α1+α2..…, + αi ) expérimentalement  on détermine d’abord

séparément chaque ordre partiel (αi ) de la réaction par rapport au constituant Ai
 La concentration des divers constituants reste constante  sauf celle du constituant Ai 

v  k ' A
dégénérescence de l’ordre. 
 La vitesse de la réaction s’écrit alors:
 Les concentrations des réactifs en excès étant incluses dans la constante « k’ »
 Il existe deux groupes de méthodes expérimentales suivant qu’elles utilisent la loi de vitesse:
 Sous sa forme intégrée (méthode intégrale)
 Sous sa forme différentielle (méthode différentielle)
5.1. Utilisation de la loi sous sa forme intégrée
5.1.1. Méthode analytique
 Obtention de différentes valeurs de [A] pour différents temps « t »
 On cherche parmi les formes intégrées celle qui convient aux valeurs expérimentales trouvées 
Reporter les valeurs dans une « loi d’ordre donné »  voir si l’on obtient une valeur constante de « k13».
5.1.2 Méthode des temps de demi-réaction
 La variation du temps de demi-réaction en fonction des concentration  permet de conclure
rapidement.
 Si « n » est l’ordre de la réaction par rapport au constituant « A », on a:

A n 1
0  T  cons tan te
1
2
5.1.3. Méthode graphique
On cherche la fonction de [A] qui varie linéairement avec le temps.

NB

La méthode intégrale présente deux avantages:

 Ne nécessite de connaitre que l’évolution d’une concentration en fonction du temps (et pas la vitesse).

Elle est beaucoup plus précise que la méthode différentielle, en particulier pour la valeur de k.

La méthode présente cependant deux inconvénients.

 Si on n’a aucune idée de la valeur de l’ordre  procéder par tâtonnements.

Si on ne dispose que de peu de points expérimentaux, la méthode est parfois imprécise 14
5.2. Utilisation de la loi de vitesse différentielle

La méthode différentielle permet de déterminer un ordre totalement inconnu.

 On trace la courbe [A]=f(t) et on détermine la vitesse de disparition de A à différents instants

v  k A ...1

 D’une façon générale la vitesse « v » s’écrira:

 Si on prend le logarithme des deux membres de l’équation (1)

Log (v)  log(k )   logA...2...

15
 Tracer le graphe « Log (v) =f(Log[A]) »  obtention d’une droite :

La pente de cette droite est égale à l’ordre de la réaction.

 Si le graphe n’est pas une droite  la réaction n’a pas d’ordre.

NB

La méthode présente un avantage  Aucune hypothèse n’est nécessaire sur l’ordre de la réaction.

La méthode présente deux inconvénients:

Pour déterminer l’ordre courant, il faut mesurer la vitesse à différents instants.

La relation (2) est un logarithme en fonction d’un autre logarithme  emploi des logarithmes: perte de
16
précision
6. Autres méthodes
6.1. Méthodes des vitesses initiales
 Faire varier la notablement la concentration initiale de l’un des réactant.
 Mesurer dans chaque cas la vitesses initiale « v 0 » pente de la tangente à l’origine de la courbe [A]t

v  k A
 La vitesse « v » s’exprime par la relation: 

 Les vitesses initiales « v01 » et « v02 » sera respectivement égales à:

v( 01)  k A01 v( 02 )  k A02

 

 Le rapport des vitesse sera tel que:


v( 02) [ A]
v( 02)  [ A]02   v( 02)   [ A]02 
 
02
    Log    Log  
v( 01) [ A]
v( 01)  
01  [ A]01   v( 01)   [ A]01 
 v( 02) 
Log  
v 
  ( 01) 
 [ A]02 
Log  
 [ A]01  17
6.2. Détermination de l’ordre global à l’aide d’un mélange stoechiométrique

Considérons une réaction de la forme : aA  bB  produit

Cette réaction est supposée admettre un ordre global « m »  sa vitesse s’écrit sous la forme :

vk A   xB
 
avec m    

 Si on prépare un mélange stoechiométrique de A et B  les concentrations de A et B seraient dans les

proportions stoechiométriques à tout instant  L’expression de la vitesse devient :

  
b b b
vk A    
x xA  v  k   A  v  k   A
  m

a  a a
On est ramené à une équation différentielle ne dépendant que d’une unique concentration :

1 d A  b  d A
 
b
 k   A 
m
v  ak   dt
a dt a Am
a
Il s’agit d’un cas classique, qui permet de déterminer l’ordre global m, par la méthode
18
différentielle ou par la méthode intégrale.
 II. Site actif
 En 1913 Léonor Michaelis  suggéra la formation d’un complexe entre
l’enzyme et substrat.
 Enzyme est une macromolécule protéique  le substrat est une petite
molécule.
 Hypothèse seule une petite partie de la structure de l’enzyme intervient
dans fixation du substrat Cette partie s’appelle le « site » ou « centre actif
»
1. Définition du site actif (1875- 1949)
 Le site actif ou centre actif  région spécifique située sur la surface
enzymatique où se fait l’interaction avec le substrat aboutissant à la
transformation en produit.
 Il a la forme d’un sillon ou d’une cavité à la surface de l’enzyme est où l’eau est souvent exclue.

19
 Le site actif est formé de quelques résidus d’acides aminés  moins de 10.

 Les résidus d’acides aminés formant le site actif peuvent être éloignés les uns des autres dans la

structure primaire de l’enzyme  très voisins dans l’espace si on considère la structure tertiaire 

une enzyme dénaturée voit son activité catalytique disparaître.

 La forme du site actif  complémentaire à celle du

substrat  complémentarité géométrique

 Résidus d'acide aminé du site actif  disposés afin

d'interagir spécifiquement avec le substrat pour

l'attirer  complémentarité électronique

 Les molécules qui diffèrent du substrat par la forme

ou la dis­tribution de leurs groupements fonctionnels

ne peuvent se lier à l'enzyme efficacement

20
2. Structure du site actif

Le site actif est constitué de deux parties:

2.1. Le site de fixation ou site de reconnaissance

 Région de la surface enzymatique capable de fixer spécifiquement le substrat en formant des liaisons
non covalentes.
 Le rôle du site de fixation est double :
 complémentaire du substrat (d'un point de vue chimique et géométrique)  si le substrat est

optiquement actif, seul un des isomères optiques est reconnu (stéréospécificité)

 il permet de mettre face à face, la partie de la molécule de substrat qui devra est transformée, avec

les acides aminés du site catalytique

« Le site de fixation détermine l’affinité et la spécificité de la réaction »

21
2.2. Le site catalytique

 Cette partie correspond à un ensemble d'acides aminés qui interagissent directement avec le substrat

pour faciliter sa transformation en produit  détermine la vitesse de la réaction.

NB

 Le site catalytique fixe aussi les cofacteurs, coenzyme ou les groupement prosthétiques nécessaires

à la catalyse.

 Enzymes constituées seulement d’une partie protéique  assure à la fois la reconnaissance du substrat

et sa transformation.

 Enzymes comprenant une partie protéique «apoenzyme»  spécifique de la fixation du substrat et une

partie non protéique «groupement prosthétique, cofacteur ou coenzyme»  spécifique de la réaction

22

catalysée
2.3. Nature des groupes catalytiques du site actif

 Seuls certains acides aminés (aa) peuvent

intervenir dans la catalyse  acides aminés

polaires: His, Ser, Cys, Tyr, Lys, Asp, Glu,

Arg.

 Ce sont les groupements fonctionnelles des

radicaux (R) de ces «aa» qui interviennent

dans la catalyse.

 Ces «aa» se retrouvent dans un

environnement protéique souvent apolaire

qui les rend plus réactifs.

La capacité des AA du site actif des enzymes à participer à la

catalyse est liée à leur aptitude à transférer des électrons

(caractère d'agents nucléophiles), des protons (caractère acide-

base selon Broensted) ou de radicaux avec le substrat 23

3. Méthodes d’études du Site actif (mise en évidence du site actif)

L'étude des sites actifs est assez délicate et nécessite le plus souvent l'emploi simultané de diverses

méthodes: chimiques, génétiques, physiques et bioinformatiques.

3.1. Méthodes chimiques

 L’identification des résidus d’acides aminés intervenant dans la fixation du substrat a pu être

entreprise grâce à la modification chimique covalente des enzymes

 Disposer de réactifs chimiques (réactifs du site actif) aussi sélectifs que possible et étudier l’effet

de la modification sur l’activité de l’enzyme, on distingue:

 les réactifs chimiques de groupes pouvant réagir de manière covalente et spécifique avec des

groupements fonctionnels particuliers de certains acides aminés

 les réactifs chimiques analogues du substrat (marqueur d’affinité)

 Le site actif contient un résidu d'aminoacide très réactif  sera donc marqué préférentiellement par
24
le réactif chimique
3.1.1. Réactifs chimiques de groupes.

Le principe consiste à faire réagir l’enzyme avec une quantité donnée d’un réactif spécifique, puis à

mesurer l’activité enzymatique résiduelle. Deux cas peuvent se présenter :

Activité enzymatique n’est pas altérée  aucun des résidus d’acide aminé ayant réagi avec le réactif

chimique n’est impliqué dans le site actif.

Activité de l’enzyme est modifiée  il est probable que l’un des résidus modifiés chimiquement

intervient dans la fixation du substrat ou la catalyse.

Après fixation de ces réactifs à un ou plusieurs résidus du site actif  on hydrolyse l'enzyme par une

protéase et on obtient le (ou les) peptide(s) portant le (ou les) aminoacide(s) modifié(s), ce qui permet de les

identifier.

NB

L'utilisation de marqueurs bifonctionnels  se combinant à deux résidus du site actif  a permis de

confirmer que ceux-ci pouvaient faire partie de régions, très éloignées dans la séquence. 25
Exemple de marqueurs
a)Le Di-isopropyl-fluorophosphate ou DFP  Se combine préférentiellement à la sérine  rendant
impossible la réaction de la serine avec le substrat.

DFP

b) Le Parachloromercuribenzoate ou PCMB  se fixe spécifiquement sur le groupe SH de la cystéine

inhibant irréversiblement l’enzyme.

PCMB
26
c) Le fluorure de phénylméthanesulfonyl ou PMSF  Idem que DFP

d) Le N-tosyl-L-phénylalanylchlorométhylcétone ou TPCK

Ce réactif est pourvu d'un groupe aromatique qui peut s'ajuster au site de spécificité de l'enzyme  Il se lie

de façon irréversible à l’Histidine

e)L’acide monoiodoacétique  substitut la fonction SH de la cystéine inhibant irréversiblement l’enzyme.

27
3.1.2. Réactifs chimiques analogues du substrat

Le réactif idéal pour la mise du site actif serait le substrat ou un inhibiteur compétitif.

L’inconvénient majeur à cet usage est que l’interaction enzyme-substrat est labile et ne permet pas

l’identification des groupes chimiques assurant la fixation.

 Dans certains cas, des analogues du substrat peuvent conduire à la formation d’un complexe covalent

avec l’enzyme  possède un groupement chimique réactif capable de former une liaison covalente stable

avec la chaîne latérale d'un aminoacide du site.

28
3.2. Méthodes de génie génétique
 La possibilité d'isoler le gène codant pour une enzyme donnée a permis, par mutation puis expression

de ce gène, d'obtenir des molécules d'enzymes modifiées à volonté  C'est la mutagenèse dirigée. En
modifiant successivement différents aminoacides du site actif, on a pu en effet préciser le rôle de

chacun:
 dans la reconnaissance du substrat,
 dans la catalyse,
 ou dans le maintien de la structure tridimensionnelle efficace de ce site.

3.3. Méthodes physiques: La cristallographie

Application des techniques de « cristallographie aux rayons X »  pour observer des modifications

éphémères au site actif pendant qu'une enzyme catalyse un seul cycle de réactions. Cette approche est
La liaison d'une molécule
appelée cristallographie en fonction tu temps. de substrat à l’enzyme
provoque une modification
de conformation qui
enferme le substrat dans la
29
poche du site actif