Les techniques de typage HLA

introduction
Lancée par la découverte des premiers antigènes HLA dans les
années 1950, la recherche sur le système HLA n'a cessé de
progresser, révélant la complexité de ce système génétique unique.
Situés sur le chromosome 6, les gènes HLA sont incroyablement
polymorphes, engendrant une diversité considérable d'allèles au sein
de la population humaine. Cette diversité, bien que cruciale pour la
variabilité génétique et l'adaptabilité immunitaire, pose également
des défis lorsqu'il s'agit d'assurer la compatibilité lors de greffes
d'organes ou de comprendre les bases génétiques des maladies auto-
immunes.
 PLAN
1 Définition 2 Description

3 Fonctions 4 Techniques

5 Applications 6 Conclusion
 Définition du système HLA

• Le typage HLA est le processus de • Un typage HLA précis est essentiel pour
détermination des gènes de l’antigène diverses procédures médicales telles que la
leucocytaire humain (HLA) chez un transplantation d’organes, la compréhension
individu, est situé sur le bras court du des maladies auto-immunes et la prédiction
chromosome 6 chez l’homme. Il s’agit d’un des réactions médicamenteuses.
système caractérisé par son polygénisme et
son polymorphisme,

• Les gènes HLA jouent un rôle crucial dans le

système immunitaire en codant les protéines de
surface cellulaire qui aident le système
immunitaire à reconnaître le soi du non-soi.
 Description du système HLA
Le Complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) ou système HLA est divisé en 3 régions:
la région de classe I télomérique : -gènes classiques HLA-A,B,C
-gènes non classiques tels que HLA-E, F, G, MICA et MICB,
-gène HFE impliqué dans l’hémochromatose
la région de classe II centromérique : gènes HLA-DR, DQ et DP
la région de classe III : gène de la 21-hydroxylase, des protéines du complément….

N.B: Le CMH contient plus de 200 gènes, dont 40 environ codent pour des molécules HLA
 Description du système HLA
Les molécules HLA de classe I :
o distribuées sur l’ensemble des cellules nucléées et sur les plaquettes d’un
individu
o se composent de huit parties codantes (exons) séparées par des parties
non codantes (introns)
o organisées en hétérodimères (une chaîne lourde α à 3 domaines α 1,α 2
et α 3 et une chaîne de β 2- microglobuline)

Les molécules HLA de classe II :

o une distribution tissulaire restreinte aux lymphocytes T activés, aux
lymphocytes B,aux monocytes,aux macrophages et aux cellules
dendritiques.
o contiennent également cinq ou six exons séparés par des régions
introniques
o organisées en (une chaîne α avec un domaine α 1 e hétérodimère t un
domaine α 2) et une chaîne β (avec un domaine β 1 et un domaine β 2)
 Fonctions du système HLA
 les molécules HLA sont les initiatrices de la réponse
immunitaire T, par leur capacité de présentation de
peptides immunogènes aux lymphocytes T, qui les
reconnaissent via leur récepteur spécifique (TCR).
 Les molécules HLA participent à la formation, dans le
thymus, d’un répertoire de lymphocytes T matures et
éduqués pour reconnaître le “soi”du “non-soi”.
Les techniques de typage HLA
Les méthodes Les méthodes
Le séquençage
sérologiques moléculaires

• consistent à tester la • utilisent des techniques • Le séquençage de

présence ou l’absence basées sur l’ADN comme nouvelle génération
d’antigènes HLA la réaction en chaîne par (NGS) permet un
spécifiques à l’aide polymérase (PCR) pour séquençage détaillé et à
d’anticorps. identifier des allèles et des haut débit des gènes HLA.
exons HLA spécifiques.
 Les techniques de typage HLA
1-La sérologie:

 Le typage HLA peut être réalisé par une technique sérologique de

microlymphocytotoxicité, communément appelée LCT.
 Basée sur une réaction Ag-Ac entre les cellules à tester et des sérums de
spécificité anti-HLA connue
 réalisable sur cellules du sang périphérique (prélèvement d’un tube hépariné ou
d’un tube ACD).

Les quatre composants de la LCT sont les suivants :

• les lymphocytes du sujet à typer, qui portent les antigènes HLA à leur surface.
- HLA de classe I : les lymphocytes totaux ou les lymphocytes T.
- HLA de classe II : les lymphocytes B.

• une batterie d’anticorps de spécificité anti-HLA connue , qui sont disposés dans les
puits d’une plaque de typage ;
• le complément de lapin ;
• le colorant dénommé fluoroquench rajouté en fin de réaction.
• Les étapes de la technique :

1. Collecte d'échantillon : consiste à prélever un échantillon de sang du donneur ou du patient. Le sang est ensuite traité pour isoler les
cellules blanches du sang (lymphocytes).
2. Isolement des lymphocytes : Les lymphocytes sont séparés des autres cellules sanguines, généralement par centrifugation, afin de
concentrer les cellules immunitaires pour l'analyse.
3. Cultures cellulaires : Les lymphocytes sont cultivés en présence de substances nutritives pour les faire se multiplier. Cela permet
d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour l'analyse ultérieure.
4. Séparation des lymphocytes T et B : Les lymphocytes T et B sont séparés, car le typage HLA concerne principalement les antigènes
HLA présents sur les lymphocytes T.
5. Récolte des cellules : Une fois les cellules suffisamment multipliées, elles sont collectées pour l'analyse.
6. Marquage des cellules : Les cellules sont marquées avec des anticorps spécifiques qui réagissent avec les antigènes HLA présents à
leur surface. Ces anticorps sont souvent liés à des marqueurs fluorescents ou enzymatiques pour faciliter la détection.
7. Analyse par cytométrie en flux : Les cellules marquées sont analysées à l'aide de la cytométrie en flux, une technique qui mesure la
fluorescence des cellules individuelles. Cela permet de déterminer quels antigènes HLA sont présents sur la surface des cellules.
 8. Interprétation des résultats : Les résultats de l'analyse indiquent les antigènes HLA spécifiques présents sur les cellules du donneur ou du
patient. Ces résultats sont utilisés pour évaluer la compatibilité dans le contexte de la transplantation ou d'autres applications médicales.

une réaction positive Une réaction négative

 reconnaissance dans un puits de la plaque, entre l’anticorps
fixé au fond du puits et l’antigène HLA situé à la surface
des lymphocytes du patient
 le complexe antigène—anticorps formé active le
complément de lapin, qui lyse ainsi les cellules
 Les cellules mortes sont marquées d’une fluorescence
rouge par le bromure d’éthidium
 pas de reconnaissance entre l’antigène de la cellule du
patient et l’anticorps fixé au fond de la plaque
 le complément n’est pas activé, les lymphocytes ne sont
pas lysés
 Les cellules vivantes sont marquées d’une fluorescence
verte par l’acridine orange
 Les techniques de typage HLA
2-biologie moléculaire:
 Permet l’identification des allèles HLA au niveau des gènes
 basées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), qui permet la synthèse d’un
brin d’ADN complémentaire à partir d’un brin unique qui sert de matrice

Les étapes de la technique :

1. Extraction de l'ADN :extraire l'ADN à partir de l'échantillon biologique
2. Réaction de PCR :L'ADN extrait est mélangé avec des amorces spécifiques, des
nucléotides (A, T, C, G), une enzyme ADN polymérase et un tampon réactionnel. La
PCR est réalisée en cycles répétitifs de chauffage et de refroidissement. (voir la figure)
3. Amplification : Les cycles de dénaturation, d'appariement et d'élongation sont répétés
(généralement entre 20 et 40 cycles), ce qui amplifie exponentiellement la région
génomique d'intérêt.
4. Électrophorèse : Les produits de PCR obtenus sont souvent analysés par
électrophorèse sur gel afin de séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille.
Cela permet de vérifier si l'amplification a été réussie et de confirmer la présence des
séquences génétiques HLA spécifiques .
 Les types de PCR utilisés :

PCR-SSO (Sequence specific oligoprobes)

• utilisation d’amorces localisées dans des séquences conservées, encadrant les régions polymorphes
• Hybridation des amplicons sur des sondes complémentaires fixées sur différents supports
• Révélation des hybrides : Réaction colorimétrique /Fluorescence

PCR-SSP (Sequence specific primers)

• utilise une ou deux amorces spécifiques conçues pour se lier de manière spécifique aux allèles HLA
• Détection des hybrides par électrophorèse

PCR-SBT (Sequence based typing)

• permettant d'identifier les allèles HLA jusqu'au niveau nucléotidique
• utilise la PCR (réaction de polymérisation en chaîne) pour amplifier spécifiquement les régions des gènes HLA suivie d'une
séquence complète de l'ADN pour identifier les allèles HLA de manière précise
 La technologie Luminex™ :

 Parmi les techniques les plus récentes qui ont été développées
 fondée sur le principe de la cytométrie en flux

principe :
o Molécules HLA purifiées, isolées par clonage et fixées sur des billes
de polystirène
o 1 antigène par bille
o Chaque bille est caractérisée par une fluorescence interne spécifique
ce qui permet dans un même puits de tester tous les antigènes HLA
(1 serum par puits)
o Détermination d’une intensité moyenne de fluorescence
(MFI=medium fluorescence intensity) = signal de positivité
 Les techniques de typage HLA
3-Séquençage :
La méthode de séquençage direct est utilisée pour définir de nouveaux allèles, ou pour lever les
ambiguïtés de typages non résolues par les autres techniques.
Le séquençage est réalisé pour l’analyse des gènes HLA de classe I et II, il peut porter sur un
allèle ou deux allèles pour un même locus.

Les étapes du séquençage HLA

1. Extraction de l'ADN : à partir d'un échantillon biologique
2. PCR : Amplification spécifique des régions HLA par PCR pour obtenir des amplicons.
3. Purification : Purification des amplicons pour éliminer les contaminants.
4. Préparation de la bibliothèque d'ADN : Ajout d'adaptateurs pour la fixation sur la puce ou
tout autre support utilisé dans le séquençage.
5. Séquençage : Utilisation de technologies de séquençage de nouvelle génération pour
déterminer la séquence nucléotidique des amplicons.
6. Analyse bioinformatique : Traitement des données brutes de séquençage l'aide de logiciels
spécialisés ,pour identifier les allèles HLA spécifiques.
7. Interprétation des résultats : Les résultats du séquençage HLA fournissent des informations
détaillées sur les allèles présents chez un individu pour les gènes HLA de classe I (HLA-A, -
B, -C) et de classe II (HLA-DRB1, -DQB1, -DPB1, etc.)
 Les techniques de typage HLA
Les méthodes sérologiques
• Avantages :
-rapide et moins coûteuse
-cruciale pour minimiser le risque de
rejet lors de greffes d'organes ou de
tissus.
• Inconvénients :
- nécessite au départ une bonne
viabilité cellulaire
-l’interprétation est parfois difficile,
car il existe de nombreuses réactions
croisées
Les méthodes moléculaires
• Avantages :
- plus rapide et plus économique
-Haute spécificité, adapté aux
laboratoires de routine, résultats
interprétables
• Inconvénients :
- Résolution limitée
- ne fournit pas de séquence détaillée.
Le séquençage
• Avantages :
-un grand débit de typage
-une très bonne résolution
-analyse de nombreux allèles
simultanément
• Inconvénients :
- coûteuse
-Elle n’est pratiquement utilisée en
routine que pour apparier donneur et
receveur de cellules
souches hématopoïétiques
 Applications de typage HLA
 Transplantation d’organes et de tissus

 Diagnostic et traitement des maladies auto-immunes

 Études de population et analyse évolutive

 Comprendre les bases génétiques des troubles

immunitaires
 Prédire et prévenir les effets indésirables des
médicaments
 Conclusion
le typage HLA est une composante essentielle de la
médecine, en particulier dans les domaines des
transplantations, de l'immunologie et de la génétique. Les
avancées technologiques ont permis le développement de
diverses techniques, de la PCR traditionnelle au séquençage
de nouvelle génération, offrant des niveaux de résolution
variés pour répondre aux besoins spécifiques des laboratoires
cliniques et de recherche.
 Références bibliographiques
• MOALIC, V. (2008). Comment est réalisé un typage HLA ?
Réanimation, 17(4), 407–411.
• Choo SY. The HLA system: genetics, immunology, clinical testing,
and clinical implications. Yonsei Med J 2007;48:11—23.
• Moalic, V., & Ferec, C. (2005). Typage HLA, méthodes d’analyses
et applications cliniques. La Presse Médicale, 34(15), 1101–1108.
• https://cuen.fr/powerpoint/seminairedecembre2012/5-GAUTREAU
%20HLA%20CUEN%20TR%202012.pdf
• Dunbar SA. Applications of Luminex xMAPTM technology for
rapid, high throughput multiplexed nucleid acid detection. Clin
Chim Acta 2006;363:71—82.
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