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Pour l’Obtention du :
Diplôme de Licence Sciences et Techniques
Sciences Biomédicales
Présenté par :
CHARGUI Oumaima
Encadré par :
Mr Abdallah BAGRI, FST-Settat
Mr Abdallah BADOU, FMP-Casablanca
Je trouve l’honneur à remercier toutes les personnes qui ont resté près de moi et m’ont
aidé à accomplir mon stage et à rédiger ce rapport.
Tout d’abord, je tiens à remercier mon professeur Mr Abdallah BAGRI qui m’a aidé
lors de la recherche du stage et qui m’a conseillé afin de trouver le sujet de mon projet de fin
d’études.
Un spéciale remerciement à Soumaya Rafii qui m’a surveillé durant mes manipulations
au laboratoire et qui m’a éduqué les bonnes méthodes pour une meilleure conduite et un bon
processus des manipulations.
Je remercie Amina GHOUZLANI et Dounia CHRAA qui m'ont assisté par la fourniture
des biopsies que j’ai utilisée et par leur guidance durant mon stage. Aussi, je souhaite bien
remercier Asmaa MARZOUK qui m’a offert l’aide lors de mes expériences.
Enfin, j’adresse mes remerciements à toutes les personnes qui m'ont conseillé et relu
lors de la rédaction de ce rapport de stage.
Sommaire :
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction générale : ............................................................................................................. 11
Objectif du travail : .................................................................................................................. 12
Revue bibliographique : ........................................................................................................... 14
I. Le cancer : .................................................................................................................... 14
1. Généralités : ........................................................................................................... 14
2. Epidémiologie du cancer au Maroc : ..................................................................... 15
3. Immunité anticancéreuse : ..................................................................................... 15
4. Les types de cancer : .............................................................................................. 17
a. Cancer du cerveau : ............................................................................................ 17
b. Cancer du sein: ................................................................................................... 18
c. Cancer colorectal: .............................................................................................. 19
II. Acide Désoxyribo-Nucléique: ................................................................................... 19
1. Historique : ............................................................................................................ 19
2. Structure : .............................................................................................................. 20
3. Localisation dans la cellule : ................................................................................. 21
4. Fonctions de l’ADN : ............................................................................................ 22
III. Acide Ribonucléique : ............................................................................................... 22
1. Historique : ............................................................................................................ 22
2. Structure : .............................................................................................................. 23
3. Fonctions : ............................................................................................................. 25
4. L’ARN comme outil de recherche scientifique : ................................................... 27
a. Préparation de l’ARN : ...................................................................................... 27
b. Electrophorèse sur gel : ...................................................................................... 28
Patients et méthodes :............................................................................................................... 31
I. Patients : ....................................................................................................................... 31
1. Caractères clinicopathologiques des patients : ...................................................... 31
2. Critères d’inclusion : ............................................................................................. 32
3. Critères d’exclusion : ............................................................................................. 32
II. Méthodologie : .......................................................................................................... 32
1. Nature du prélèvement : ........................................................................................ 32
2. Protocol expérimental : .......................................................................................... 32
a. Extraction de l’ARN : ........................................................................................ 32
b. Electrophorèse sur gel d’agarose : ..................................................................... 33
Résultats : ................................................................................................................................. 35
Discussion : .............................................................................................................................. 42
Conclusion : ............................................................................................................................. 45
Références bibliographiques : .................................................................................................. 46
Annexes : ................................................................................................................................. 50
Avant-propos :
Afin de comparer la qualité et la quantité de l’ARN dans les différents types de tissus
tumoraux, colorectal, mammaire et cérébral, une extraction d’ARN a été réalisée en se basant
sur le protocole du réactif TRIzol suivi d’une électrophorèse.
Les résultats obtenus à partir de l’échantillon de la tumeur cérébrale ont montré une
bonne quantité et qualité d’ARN. Par contre, l’ARN a été dégradé dans les autres types de
tissus. La concentration de l’ARN dans les tissus tumoraux dépend du type de tissus ainsi que
la taille de la biopsie.
Une bonne qualité d'ARN est essentielle pour obtenir des résultats fiables afin
d’interpréter les niveaux d'expression génique, ceci exige l’élimination des ARNases et des
agents contaminants qui dégradent l’ARN.
ﯾﻤﺜﻞ اﻟﺴﺮطﺎن ﺣﺎﻟﺔ طﻮارئ ﺗﺸﺨﯿﺼﯿﺔ وﻋﻼﺟﯿﺔ ﺑﺎﻣﺘﯿﺎز ،وﻣﻦ ھﻨﺎ ﺗﺒﺮز اﻟﺤﺎﺟﺔ إﻟﻰ اﻟﺘﻮﻋﯿﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﻠﻌﺐ دوراً
ﻣﺘﺰاﯾﺪ اﻷھﻤﯿﺔ ﻓﻲ ﺗﻄﻮﯾﺮ اﻟﺨﺪﻣﺎت اﻟﺼﺤﯿﺔ ،وھﻮ ﺧﻄﻮة ﺣﺎﺳﻤﺔ ﻓﻲ اﻟﻜﺸﻒ اﻟﻤﺒﻜﺮ ﻋﻦ اﻟﺴﺮطﺎن ﻟﻌﻼج ھﺬا اﻟﻤﺮض ﻗﺒﻞ
اﻟﻮﺻﻮل إﻟﻰ ﻣﺮاﺣﻞ ﻣﺘﻘﺪﻣﺔ.
ﻟﻤﻘﺎرﻧﺔ ﺟﻮدة وﻛﻤﯿﺔ اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﺗﻢ اﺳﺘﺨﺮاج اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﻣﻦ ﺛﻼﺛﺔ أﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ
ﻣﻦ اﻷﻧﺴﺠﺔ اﻟﺴﺮطﺎﻧﯿﺔ :اﻟﻘﻮﻟﻮن ،اﻟﺜﺪي واﻟﺪﻣﺎغ ،ﺗم اﺳﺗﺧراﺟﮫ ﺑﺎﻋﺗﻣﺎد ﺑروﺗوﻛول اﻟﻛﺎﺷف ،TRIzol :ﻣﺗﺑوﻋﺎ ﺑﺎﻻﺳﺗﺷراد
اﻟﻛﮭرﺑﺎﺋﻲ ﻟﻠﺗﺣﻘﻖ.
اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ اﻟﺘﻲ ﺗﻢ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﯿﮭﺎ ﻣﻦ ﻋﯿﻨﺔ ورم ﻓﻲ اﻟﻤﺦ أظﮭﺮت ﻛﻤﯿﺔ و ﺟﻮدة ﺟﯿﺪة ﻟﻠﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي .ﻓﻲ
اﻟﻤﻘﺎﺑﻞ ،ﻻﺣﻈﻨﺎ ﺗﺪھﻮره ﻓﻲ أﻧﻮاع اﻷﻧﺴﺠﺔ اﻷﺧﺮى .ﯾﻌﺘﻤﺪ ﺗﺮﻛﯿﺰ اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﻓﻲ أﻧﺴﺠﺔ اﻟﻮرم ﻋﻠﻰ ﻧﻮع
اﻟﻨﺴﯿﺞ وﻛﺬﻟﻚ ﺣﺠﻢ اﻟﺨﺰﻋﺔ.
إن ﺟﻮدة اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي اﻟﺠﯿﺪة ﺿﺮورﯾﺔ ﻟﻠﺤﺼﻮل ﻋﻠﻰ ﻧﺘﺎﺋﺞ ﻣﻮﺛﻮﻗﺔ ﻟﺘﻔﺴﯿﺮ ﻣﺴﺘﻮﯾﺎت اﻟﺘﻌﺒﯿﺮ اﻟﺠﯿﻨﻲ،
وھﺬا ﯾﺘﻄﻠﺐ إزاﻟﺔ اﻟﺮﯾﺒﻮﻧﻮﻛﻠﯿﺎز واﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﻤﻠﻮﺛﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﺴﺒﺐ ﺗﺪھﻮر اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي.
Figure 14 : Effet protecteur de la qualité de l’ARN par l’eau de Javel dans un gel contenant
les ARNases
10
Introduction générale :
De notre temps, le cancer est encore une maladie terrible qu’on apprend de plus en plus
à connaitre. Les scientifiques ont pris l’initiative depuis longtemps afin de comprendre les
mécanismes d’expression du cancer et les marqueurs moléculaires capables d’influer la
progression tumorale.
Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d’un
tissu de l’organisme, induite par des mutations, d’origine héréditaire ou acquise. Ces mutations
affectent le fonctionnement cellulaire par la production de protéines altérées. L’ADN
endommagé conduit à la production de ces dernières au cours du processus de l’oncogenèse ce
qui induit une anomalie fonctionnelle de la cellule.
11
Objectif du travail :
Notre étude a pour objectif la comparaison qualitative et quantitative d’ARN dans trois
types de tissus tumoraux : mammaire, cérébral, et colorectal à travers une extraction de l’ARN
et migration sur gel d’agarose.
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Revue bibliographique :
I. Le cancer :
1. Généralités :
Le cancer se développe quand une cellule anormale prolifère d’une manière incontrôlée et
donne naissance à une tumeur, ou néoplasme. Tant que les cellules néoplasiques ne deviennent
pas envahissantes, la tumeur est dite bénigne, et l'élimination ou la destruction locale de la
masse tumorale permet généralement une guérison complète. Une tumeur est considérée
comme un cancer seulement si elle est maligne, c'est-à-dire seulement si ces cellules ont acquis
la capacité d'envahir le tissu environnant. L'invasivité est une caractéristique essentielle des
cellules cancéreuses. Elle leur permet de se détacher, de pénétrer dans les vaisseaux sanguins
ou lymphatiques et de former des tumeurs secondaires, appelées métastases. Plus le cancer se
propage largement, plus il devient difficile de l'éradiquer, et généralement les métastases ont
un mauvais pronostique pour les patients atteints du cancer (2). En général les cancers forment
des tumeurs solides, mais certains cancers comme la leucémie ne forment pas de tumeurs. (1).
Au milieu du 20ème siècle, les scientifiques ont commencé à résoudre les problèmes
complexes de la chimie et de la biologie du cancer. Watson et Crick ont reçu le prix Nobel en
1962 pour la découverte de la structure hélicoïdale de l'ADN. Plus tard, les scientifiques ont
compris le fonctionnement des gènes et comment ils pourraient être endommagés par des
mutations et ils ont découvert que le cancer pourrait être causé par des produits chimiques dites
cancérigènes, des rayonnements, des virus et également d’origine héréditaire.
Au cours des années 1970, les chercheurs ont découvert 2 familles importantes de gènes :
Les Oncogènes : gènes responsables de la croissance incontrôlée des cellules. Ils sont
formés de proto-oncogènes ; gènes qui contrôlent normalement la fréquence de
division d'une cellule et le degré de différenciation.
Les gènes suppresseurs de tumeur : Ce sont des gènes qui contrôlent la division
cellulaire, la réparation de l'ADN et l’apoptose. Un disfonctionnement d'un gène
suppresseur de tumeur conduit au cancer (1).
Les cellules cancéreuses acquièrent une variété de propriétés spéciales à mesure qu'elles
évoluent, se multiplient et se propagent. Ceux-ci incluent des altérations dans les voies de
signalisation cellulaire, permettant aux cellules d'ignorer les signaux de leur environnement qui
14
normalement maintiennent la prolifération cellulaire sous contrôle. Dans le cadre du processus
évolutif de la progression tumorale, les cellules cancéreuses acquièrent des défauts de
différenciation et des mécanismes de contrôle qui arrêtent définitivement la division cellulaire
ou induisent l'apoptose en réponse au stress cellulaire ou aux altérations de l'ADN. Tous ces
changements augmentent la capacité des cellules cancéreuses à survivre, croître et se diviser
dans leur tissu d'origine, puis à se métastaser, ce qui nécessite survie et prolifération dans des
environnements étrangers. Cependant, l'évolution d'une tumeur ne dépend pas simplement des
changements dans les cellules cancéreuses elles-mêmes ; il dépend aussi d'autres cellules
présentes dans le microenvironnement tumoral, collectivement appelées cellules stromales, y
compris de nouveaux vaisseaux sanguins qui permettent à la tumeur de se propager par la
circulation sanguine (2).
Les cancers les plus fréquents chez l’homme sont successivement le cancer du poumon, de
la prostate et du colorectum. Tandis que chez la femme on s’aperçoit majoritairement du cancer
du sein 35,9%, suivi par le cancer du col utérin 13,2% et le cancer colorectal 5,9%, avec une
mortalité respectivement et successivement de 29,3% ; 12% et 7,1% (3).
3. Immunité anticancéreuse :
L'évolution de la thérapie anti-cancéreuse est diversifiée et continue d'être étendue. Les
thérapies réductrices tumorales comprennent les thérapies classiques (chirurgie,
chimiothérapie et radiothérapie), les modalités de traitement local et systémique modernes (ex.
: Ablation par radiothérapie, chimio-embolisation trans-artérielle locale, ultrasons focalisés à
15
haute intensité, et médicaments qui ciblent des molécules spécifiques dans les cellules
cancéreuses). Toutes les thérapies réductrices du cancer n'ont qu'un seul objectif : réduire la
charge tumorale par la destruction directe des cellules tumorales. Une nouvelle catégorie de
traitement anticancéreux, l'immunothérapie, est apparue ces dernières années et est classée
séparément des traitements cytotoxiques (chimiothérapie et radiothérapie) (4).
La réponse immunitaire aux cellules tumorales implique à la fois les composants adaptatifs
et innés du système immunitaire. Les réponses immunitaires anti-tumorales adaptatives sont
médiées par des composants cellulaires et humoraux, les lymphocytes T (cellules T CD4 + et
CD8 +) jouant un rôle clé. Les cellules tueuses naturelles (NK = Natural Killer) jouent un rôle
important dans la réponse immunitaire anti-tumorale innée. Les cellules tumorales exploitent
plusieurs mécanismes complexes pour échapper à la reconnaissance et à la destruction par le
système immunitaire (figure 2). Cela peut se produire par des mécanismes comprenant
l'activation des voies inhibitrices des lymphocytes T (point de contrôle), tels que l'antigène 4
16
des lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4), la mort programmée 1 (PD-1) et le gène 3 de
l'antigène lymphocytaire (LAG- 3) ; l'inhibition des voies d'activation des cellules T ; et / ou la
suppression de l'activité des cellules NK. En outre, le microenvironnement tumoral contient
divers facteurs immunosuppresseurs provenant de différentes sources qui peuvent être
exploitées par les cellules tumorales pour échapper au système immunitaire (5).
Les exemples les plus marquants des immunothérapies sont les thérapies cellulaires, telles
que les lymphocytes T-kinases (CARK) et les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, tels
que la mort cellulaire (PD)-1 et l'antigène des lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4) (4).
17
des classifications actuelles. Actuellement au Maroc, il existe un registre national de la Région
de Casablanca pour la collecte de données sur les tumeurs cérébrales. L’incidence normalisée
estimée du cancer du système nerveux central est de 2,0 pour 100 000 hommes/an et 1,1 cas
pour 100 000 femmes/ an (7).
b. Cancer du sein:
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et représente la première
cause de mortalité. C’est une pathologie éminemment hétérogène. De multiples classifications
(cliniques, histopathologies ou moléculaires) ont vu le jour, afin de permettre l’identification
précise des tumeurs les plus agressives et l’adaptation thérapeutique qui en découle. L’une des
classifications les plus simples est basée sur les propriétés intrinsèques tumorales du cancer du
sein, qui peuvent être classées en deux grandes catégories: les tumeurs qui expriment le
récepteur aux œstrogènes (RE) (appelé tumeurs luminales ou RE+) et celles qui ne l’expriment
pas ou RE- (8). L’existence d’un système de classification histologique dans le cancer du sein
est loin d’être précise pour prédire le pronostic d’un patient (9). Morphologiquement, des
tumeurs identiques peuvent présenter des résultats cliniques différents. Pour cela, une
classification moléculaire permet principalement de déterminer différentes classes
moléculaires appartenant à un type histologique similaire. Une bonne connaissance de ces
classes moléculaires et de leur identification pourrait conduire à un diagnostic plus avancé et à
un système pronostic plus bénéfique et précis (10). Il est donc très important de connaitre le
profil biologique du cancer du sein (11).
Selon l’organisation mondiale de la santé un million de cas est recensés chaque année
dans le monde entier. Il représente 16% de l’ensemble des cancers chez la femme avec 69% de
décès enregistrés dans les pays en développement. Au Maroc, la situation ne fait pas exception,
ce type de cancer constitue un des problèmes majeurs de santé publique avec 7.2% de
l’ensemble des décès enregistrés. Sur la base du registre des cancers de la région du grand
Casablanca, l’incidence annuelle nationale enregistrée est estimée à 30 500 nouveaux cas de
cancer par an dont seulement près de 12 000 cas soit 25% sont pris en charge de manière
effective. Une légère augmentation a été révélée pour les années 2005-2007, ces données
révèlent l’importance de la problématique du cancer au Maroc (12).
18
c. Cancer colorectal:
Le cancer colorectal, par sa fréquence et par sa gravité, est un problème important de
santé publique. Près d’un million de cancers colorectaux sont diagnostiqués et près d’un demi-
million de personnes en meurent chaque année dans le monde (13) (14) (15). Les taux
d’incidence les plus élevés sont rapportés par les registres d’Amérique du Nord, d’Europe
Occidentale et d’Australie. Des taux intermédiaires sont retrouvés en Europe de l’Est, des taux
faibles en Asie et en Amérique latine. Les taux les plus bas sont signalés en Afrique (16) (17).
Au Maroc, l’incidence standardisée du cancer colorectal est de 7,2 pour 100 000 habitants par
an chez l’homme et de 5 pour 100 000 habitants par an chez la femme (17). Par ailleurs,
diverses études épidémiologiques s’accordent pour confirmer que le cancer colorectal occupe
la première place parmi les cancers digestifs (17) (18) (19) (20) et constitue avec les cancers
du poumon, de la prostate et les cancers gynéco-mammaires les cancers les plus fréquents dans
les régions de Rabat et Casablanca (17).
1. Historique :
En 1869, Friedrich Miescher a isolé une substance à partir des leucocytes : « Nucléine ».
En 1889, Richard Altmann a changé le nom de nucléine à « Acide Nucléique » (22).
Entre 1885 et 1901, Albrecht Kossel a découvert les différentes bases azotées des acides
nucléiques : Adénine, guanine, thymine, cytosine et uracile (22) (23) (24).
19
l’acide nucléique des levures (25). Il a nommé chaque unité de ces trois éléments un
« Nucléotide » et il a dit que l’ADN est une molécule constitué d’une chaine de nucléotides
liés au niveau du groupement phosphate (26). Or, il a assumé que l’ADN ne se compose que
de quatre unités (27).
En fait, les biologistes ont toujours cru que l’information génétique était portée par les
protéines (25) (28), ce n’est que dans les années 1940s que l’ADN a été identifié comme
support de l’information génétique après une série des expériences sur les bactéries notamment
l’expérience de Avery, MacLeod et McCarty en 1944 (29) et l’expérience Hershey et Chase en
1952 (30).
En 1953, James Watson et Francis Crick ont révélé la structure moléculaire correcte de
l’ADN : une double hélice où la base A est liée à la base T et la base C à la base G (28)(31)(32).
Cette découverte a permis de démontrer les voies de réplication et de transcription et traduction
(2) (32).
2. Structure :
L’ADN est une molécule constituée de deux chaînes polynucléotidiques. Ces dernières sont
liées par des liaisons hydrogènes, qu’on appelle hybridations, entre deux bases. Chaque
nucléotide est composé d’un sucre attaché à un ou plusieurs groupements phosphate et une
base azotée. Le sucre qui entre dans la composition d’ADN est le désoxyribose d’où le nom
« Acide désoxyribonucléique ».
En fait, dans une chaine polynucléotidique, les sucres sont liés aux groupements
phosphoryles par des liaisons phosphodiesters : un groupement phosphate est lié au carbone 3
d’un sucre d’une part et au carbone 5 du sucre adjacent de l’autre part. Cette liaison crée une
alternance sucre-phosphate le long de la partie extérieure de la chaine alors que les bases restent
à l’intérieur.
La manière dont les nucléotides sont orientés confère à la chaine une polarité chimique :
une extrémité 5’ qui porte un groupement phosphate libre d’un côté et une extrémité 3’ portant
un groupement hydroxyle libre de l’autre côté. La double hélice correspond à deux chaines
dont une est orienté dans le sens opposé de l’autre, c.-à-d. l’extrémité 5’ d’une chaine est en
face avec l’extrémité 3’ de l’autre. On dit que les deux chaines sont antiparallèles.
20
Les nucléotides se distinguent par leur base azotée. Les bases sont des molécules
azotées hétérocycliques, elles se divisent en deux classes : les purines : adénine et guanine, et
les pyrimidines : cytosine et thymine. On réfère aux bases par leur première lettre : A, G, C et
T. Les deux chaines d’ADN sont liées au niveau des bases azotées de façon que chaque purine
est attaché à une pyrimidine par des liaisons hydrogènes. On dit que les deux chaines sont
complémentaires car l’adénine est toujours liée à une thymine par deux hybridations et la
guanine est toujours liée à une cytosine par trois hybridations.
La structure tridimensionnelle de l’ADN –la double hélice- est maintenue grâce aux
liaisons hydrogènes et l’empilement des bases azotées (figure 3).
Chez les eucaryotes l’ADN se trouve dans le noyau alors que chez les procaryotes, qui
n’ont pas de noyau, l’ADN est situé dans le cytoplasme de la cellule.
21
4. Fonctions de l’ADN :
L’ADN est une séquence de nucléotides successifs qui correspond au code génétique. Il est
composé par des parties non codantes qui constituent la proportion la plus importante du
génome et des parties codantes : les gènes.
Chaque gène de l’ADN porte une information spécifique pour la synthèse d’une protéine
donnée responsable d’une fonction biologique précise ; cette spécificité résulte du codage de
l’information génétique assuré par la séquence nucléotidique qui se base sur l’ordre quatre base
azotée (A, T, G, et C). Un gène est transcrit en ARN messager puis traduit en protéine à l’aide
des ARN de transfert et les ARN ribosomaux.
Le génome doit être transmis aux descendants et ceci est possible par la réplication de l’ADN
lors des divisions cellulaires qui assure la duplication du code génétique (2) (32).
L’ARN messager (ARNm) porte les instructions de l’ADN qui spécifient l'ordre correct
des acides aminés au cours de la synthèse des protéines. L’assemblage des acides aminés en
protéines est possible grâce à la traduction des ARNm. Dans ce processus (la traduction),
l'information dans l'ARNm est interprétée par un second type d'ARN appelé l'ARN de transfert
(ARNt) à l'aide d'un troisième type d'ARN, l'ARN ribosomique (ARNr) avec ses protéines
associées qui forment les « ribosomes ». Lorsque les acides aminés corrects sont mis en
séquence par les ARNt, ils sont liés par des liaisons peptidiques pour produire des protéines
(21).
1. Historique :
22
Dans le début des années 1900s, Phoebus Levene a réussi a isolé le ribose à partir d’un
acide nucléique des levures. Après 20 ans, Il a isolé le désoxyribose à partir l’acide nucléique
des animaux ce qui a permet la distinction entre l’ADN et l’ARN. (25) (23) (34).
En 1939, Jean Brachet a réussi à prouver que l’ARN était un constituant universel dans
tous les types des cellules eucaryotes (animales et végétales) et procaryotes. Il a aussi trouvé la
localisation des acides nucléiques : L’ADN dans la chromatine et les chromosomes alors que
l’ARN s’accumule dans les nucléoles et le cytoplasme. En plus, Il a trouvé que la quantité
d’ADN reste constante dans les cellules des individus de la même espèce, alors que la quantité
d’ARN varie considérablement d’un tissu à l’autre. En outre, il a conclu qu’il y a une
corrélation entre l’abondance des ARN dans la cellules et la synthèse des protéines (35) (36).
En 1953, Paul Zamecnik a réussi à construire un système des extraits cellulaires capable
de synthétiser les protéines à partir des acides aminés à l’aide d’ATP (37) (32).
En 1955, George E. Palade a identifié les sites de synthèse des protéines : « les
particules de Palade » connus plus tard sous le nom de : « Ribosomes », constitué de deux sous
unités (38) (39) (40).
En 1961, les études de Sydney Brenner, Jacques Monod, et Matthew Meselson sur
Escherichia Coli ont permet la découverte d’un nouveau type d’ARN : l’ARN messager dont
la structure est très similaire à celle de l’ADN. Les chercheurs ont conclu que les ribosomes
sont des usines synthétisant des protéines qui utilisent l'ARNm comme matrice pour diriger la
construction de la séquence protéique (23) (36).
2. Structure :
23
• La base thymine est remplacée par l’uracile dans l’ARN. L’uracile est aussi une
pyrimidine, sa structure est similaire à celle de la thymine avec le manque d’un
groupe méthyle au niveau de N5. Comme la thymine, l’uracile s’apparie à l’adénine
(figure 4).
• Généralement, l’ARN se trouve sous forme d’une seule chaine polynucléotidique à
l’exception de certains virus (32).
Contrairement à l’ADN, qui se trouve sous forme unique : la double hélice, les
différents types de l’ARN présentent des conformations distinctes (figure 5,6). Les différences
dans les tailles et les conformations des divers types d'ARN leur permettent d'effectuer des
fonctions spécifiques dans la cellule (21).
24
Figure 6 : Structure du ribosome (2)
3. Fonctions :
Bien que l'ADN stocke l'information pour la synthèse des protéines et l'ARN porte les
instructions codées dans l'ADN, la plupart des activités biologiques sont effectués par des
protéines. La synthèse précise des protéines est donc essentielle au bon fonctionnement des
cellules et des organismes. L'ordre linéaire des acides aminés dans chaque protéine détermine
sa structure tridimensionnelle et son activité. Pour cette raison, l'assemblage des acides aminés
dans leur ordre correct, tel que codé dans l'ADN, est la clé de la production de protéines
fonctionnelles.
Ces trois types de molécules d'ARN effectuent des fonctions différentes mais
coopératives dans la synthèse des protéines (figure 7,8) :
• L’ARN messager (ARNm) porte l’information génétique copié à partir de l’ADN sous
forme d’une série de codes à trois bases : « Codon » en cours de la transcription, chaque
codon est spécifique pour un acide aminé particulier.
• L’ARN de transfert (ARNt) est la clé pour déchiffrer les codons portés par l’ARNm.
Chaque type d'acide aminé a son propre type d'ARNt, qui le lie et le porte à l'extrémité
croissante d'une chaîne polypeptidique si le codon suivant sur l'ARNm l'exige. L'ARNt
correct avec son acide aminé attaché est sélectionné à chaque étape parce que chaque
molécule d'ARNt spécifique contient une séquence de trois bases qui peut être appariée
avec son codon complémentaire dans l'ARNm : « Anticodon » (figure 5).
25
• L'ARN ribosomique (ARNr) s'associe à un ensemble de protéines pour former les
ribosomes. Ces structures complexes, qui se déplacent physiquement le long d'une
molécule d'ARNm, catalysent l'assemblage des acides aminés en chaînes protéiques.
Ils lient également les ARNt et diverses molécules accessoires nécessaires à la synthèse
des protéines. Les ribosomes sont composés d'une grande et d'une petite sous-unité,
chacune contenant sa propre une molécule d'ARNr ou plus (figure 6).
La traduction est l'ensemble des processus par lequel la séquence de bases d'un ARNm est
utilisée pour commander et joindre les acides aminés dans une protéine (figure 8). Les trois
types d'ARN participent à cette voie essentielle de synthèse protéique dans toutes les cellules
(21).
26
4. L’ARN comme outil de recherche scientifique :
Les progrès considérables réalisés au cours de ces cinq dernières années dans le séquençage
du génome humain, ainsi que celui de nombreux virus et bactéries, associés à la mise au point
de nouveaux outils (développement de la PCR en temps réel par exemple) amènent de plus en
plus de laboratoires à travailler sur les produits d’expression des gènes. Il est possible de
caractériser désormais des gènes exprimés dans des cellules uniques ou dans des tissus
tumoraux, et quantifier avec précision une charge virale, marqueur de suivi de l’efficacité
thérapeutique. Par ailleurs, le rôle central de l’ARN messager (ARNm) dans la transmission de
l’information génétique le rend de plus en plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour des
études de criblage à haut débit. Si les méthodes d’extraction et de purification des ARN se
sont considérablement simplifiées depuis la méthode décrite par Chirgwin en 1979, isoler des
ARN purifiés et non dégradés à partir d’échantillons biologiques reste une étape pré-analytique
délicate de laquelle dépend la réussite des applications réalisées en aval (42).
a. Préparation de l’ARN :
Lyse et homogénéisation des cellules :
Toute méthode d’extraction des acides nucléiques comprend une étape préalable de lyse
cellulaire et d’inactivation des nucléases afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans
chaque cellule. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques
selon les types cellulaires. Si les méthodes mécaniques sont plutôt dévolues aux cellules et aux
tissus, les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin
de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture
mécanique.
27
Extraction et purification de l’ARN :
Une fois les cellules sont convenablement lysées, les ARN, protégés de l’action des
ARNases, peuvent être extraits. L’extraction des ARN peut être réalisée selon deux grands
principes : 1) les différences de propriétés physico- chimiques entre les différents acides
nucléiques et les protéines ; 2) l’adsorption sélective des acides nucléiques sur un support solide
(42).
L’ADN est chargé négativement ; il migre du pôle négatif vers le pôle positif quand il
est soumis à un champ électrique. Le gel joue le rôle d’un tamis à travers lequel les molécules
d’ADN se déplacent ; les molécules de grande taille trouvent plus de difficultés à migrer à
travers les pores du gel et elles migrent moins vite que celles de petite taille. Quand
l’électrophorèse est réalisée pendant un temps donné, les molécules de différentes tailles se
séparent puisqu’elles se déplacent à différentes distances.
Une fois l’électrophorèse est achevée, les molécules d’ADN peuvent être visualisées
en colorant le gel avec un colorant fluorescent comme l’Ethidium, qui s’intercale entre les
bases de l’ADN. Les molécules d’ADN marquées apparaissent sous forme de bandes dont
chacune présente une population caractérisée par une taille spécifique.
28
L’électrophorèse permet également la séparation des molécules d’ARN. Comme
l’ADN, l’ARN est chargé négativement, or il est généralement sous forme d’un seul brin et
représente des structures secondaires et tertiaires extensives, ce qui influence leur mobilité à
travers le gel (32).
29
30
Patients et méthodes :
I. Patients :
Nous avons réalisé une étude rétrospective dans le but de comparer les ARNs totaux après
évaluation quantitative et qualitative dans trois types de tissus tumoraux : le tissu tumoral du
sein, du cerveau, et colorectal.
Ce travail a été réalisé sur huit tissus tumoraux, à savoir : deux tissus mammaires, trois du
cerveau, et trois colorectaux.
Contrôle + F Colon 2 2
1 F Colon 2 1
2 F Rectum 3 1
Cancer mammaire :
1 F 72 + + - 1 2
2 F 43 - + + 2 3
Cancer cérébral :
Contrôle + F 38 Astrocytome 1
1 F 34 Méningiome 1
2 F 58 Méningiome mixte 1
31
2. Critères d’inclusion :
Ont été retenus des patients marocains atteint de tumeurs de sein, cerveau et colorectal quel
que soit le type cellulaire atteint, hospitalisés au Centre Hospitalier Universitaire Ibnou Rochd
de Casablanca.
3. Critères d’exclusion :
II. Méthodologie :
1. Nature du prélèvement :
Il s’agit de biopsies prélevées des patients qui ont subi une chirurgie comme traitement,
quel que soit la localisation et le type cellulaire atteint.
2. Protocol expérimental :
Objectif : Extraction de l’ARN par méthode de TRIzol, et migration sur gel d’agarose
dans le cadre d’une comparaison de l’aspect des ARNs purifiés.
a. Extraction de l’ARN :
Sous une hotte chimique, nous commençons par stériliser l’ensemble du matériel à
utiliser et préparer le porteur de glace sur lequel toutes les étapes de l’extraction seront
réalisées. Les biopsies préalablement conservées dans 100µl de TRIzol à -80°C sont
homogénéisées et lysées mécaniquement sur une boîte de pétri à l’aide d’un bistouri.
L’homogénat est mis dans un tube Eppendorf de 1.5ml et nous y ajoutons du TRIzol jusqu'à
l’atteinte de 800µl par échantillon. Ensuite nous rajoutons 160µl de chloroforme par
échantillon, nous agitons à la main pendant 15 secondes puis au vortex, avant une incubation
à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.
Après nous réalisons une centrifugation à 12000g pendant 15 minutes à 4°C, par la suite
nous retirons la phase aqueuse contenant l’ARN dans un nouveau tube Eppendorf et nous
rajoutons 400µl d’Isopropanol (pour la précipitation de l’ARN), puis une incubation de 10
minutes à température ambiante suivie par une seconde centrifugation à 12000g pendant 10
minutes à 4°C est effectué, ensuite nous retirons le surnageant et nous lavons le culot avec
800µl d’éthanol à 75% puis nous agitons au vortex avant centrifugation à 7500g pendant 5
32
minutes à 4°C. Par la suite nous jetons le surnageant et nous laissons le culot sécher pendant
15 à 30 minutes.
A postériori, 25µl d’eau ultra pur est ajouté à chaque tube. Ensuite les solutions sont
agitées au vortex. En dernier lieu, nous dosons l’ARN par spectrophotomètre NanoVue Plus.
Par la suite, nous faisons couler le gel dans le support de gel de la cuve d’électrophorèse.
Laisser 15 minutes pour gélification.
Afin d’effectuer l’électrophorèse, il faut tout d’abord, préparer les dilutions des
échantillons d’ARN extraits, et ensuite placer le support de gel dans la chambre
d’électrophorèse contenant le tampon de migration TBE. Nous mélangeons 5µl de chaque
échantillon avec 3µl de BlueJuice « Bleu de Bromophenol » (qui va nous aider à suivre le
déroulement de l’électrophorèse) puis nous les déposons dans les puits du gel ainsi que le
marqueur de taille préalablement mélangé avec le BlueJuice. Par la suite nous fermons la
chambre d’électrophorèse après configuration du générateur sur 78V. Laisser migrer pendant
30 min. En dernier lieu, nous observons le gel sur IbrightCL1000.
L’utilisation de cette procédure a donné des résultats infructueux, parce que nous n’avons
pas pu visualiser les bandes d’ARN après migration, ceci suggère la présence des ARNases
dans le gel. En se basant sur la littérature, ce problème peut être résolu par l’addition de l’eau
de Javel (6% hypochlorite de Sodium) dans la solution de TBE et d’agarose avant la dissolution
de ce dernier (Aranda et al., 2012).
Alors, nous modifions la procédure ci-dessus en ajoutant 500µl de l’eau de Javel 6% sur
le mélange de TBE et agarose avant de le mettre dans le four à micro-ondes.
33
Augmentation du voltage :
34
Résultats :
I. Expérience n°1 :
1. Extraction de l’ARN :
Nous avons réalisé en premier lieu une extraction de l’ARN pour trois échantillons :
une biopsie de tumeur mammaire, une cérébrale, et une colorectale. Le tableau IV présente les
résultats du dosage des ARNs extraits.
Nous observons une différence de concentration entre les différents types de tissus
tumoraux ; les deux échantillons : sein et cerveau ont montrés une concentration d’ARN
importante par rapport à la tumeur colorectale.
Le ratio (260/280) nous donne une indication sur la pureté de l'ADN et de l'ARN. Un
rapport de ~ 1,8 est généralement accepté comme pur pour l’ADN ; un rapport de ~ 2,0 est
généralement accepté comme pur pour l'ARN. Les ratios obtenus sont très proches de
2 (Tableau IV). Nous remarquons que ces valeurs sont sensiblement plus faibles à 2, ce qui
indique la présence de protéines, de phénol ou d'autres contaminants qui absorbent fortement
à ou près de 280 nm.
35
2. Electrophorèse sur gel d’agarose :
a. Préparation des dilutions :
Nous préparons trois dilutions : 1µg/5µl, 0.5µg/5µl et 0.25µg/5µl, pour chaque type de
tumeur avant la préparation du gel d’agarose de manière à obtenir des concentrations finales
de 200µg/ml, 100µg/ml et 50µg/ml respectivement. Le détail des dilutions est présenté dans
l’annexe 1.
36
II. Expérience n°2 :
Comme nous n’avons pas pu visualiser les bandes d’ARN après migration sur gel
d’agarose, une seconde manipulation est réalisée avec l’addition des contrôles positifs (contrôle
positif pour les tumeurs colorectale et cérébrale).
1. Extraction de l’ARN :
Le ratio (260/230) de la tumeur colorectale est supérieur à 2.2, et inférieure à 2 dans les
autres deux tissus tumoraux (Tableau V).
Les dilutions sont préparées conformément à ce qui est présenté dans le tableau 2 de
l’annexe 2.
37
b. Visualisation des bandes d’ARN :
Le marqueur de taille représente des bandes bien visibles. Nous observons des smears
au niveau des zones de migration des solutions mères (figure 11).
On constate deux bandes bien séparées au niveau des dilutions 1µg/5µl et 0.5 µg/5µl
de l’échantillon du cerveau, ainsi qu’une bande légère au niveau la dilution 0.25µg/5µl pour le
même tissu (figure 11).
Cependant pour les autres tissus aux différentes dilutions aucune bande n’est visibles.
Nous pouvons expliquer ces résultats par une dégradation de l’ARN due probablement aux
ARNases (figure 11).
Dans le but d’observer les bandes d’ARN dans tous les types de tumeurs, nous avons
effectué des modifications sur la procédure n°2 en ajoutant l’hypochlorite de Sodium 6% dans
le gel d’agarose pour éliminer les ARNases.
38
Nous observons des smears au niveau des champs de migration des solutions mères.
Les dilutions du cancer colorectal et du cancer de sein ne présentent aucune bande. Les
échantillons correspondant aux dilutions 1µg/5µl, 0.5µg/5µl et 0.25µg/5µl et la SM du contrôle
positif révèlent 4 bandes légèrement visibles.
Une deuxième migration est réalisée pendant 15 minutes à 100V pour permettre la
séparation des bandes.
Nous remarquons une bande bien visible qui correspond à la sous unité 28S de l’ARN
ribosomique au niveau des champs de migration de :
39
Une deuxième bande qui correspond à la sous unité 18S de l’ARN ribosomique au niveau
des champs de migration de la SM du contrôle positif du cerveau et toutes les dilutions de
l’échantillon d’ARN extrait du cerveau.
40
41
Discussion :
Ce travail consiste en la comparaison de la qualité de l'ARN dans trois types de tissus
tumoraux ; mammaire, cérébral et colorectal. Nous commençons par une extraction de l’ARN,
un dosage et ensuite une électrophorèse sur gel d’agarose 2%.
L’expression de l’ARN nous fournit une vision sur l’état physiologique des cellules et
des tissus. Les niveaux d’expression des gènes sont fortement liés à la qualité et la quantité de
l’ARN (45).
Cette étude est réalisée sur huit biopsies tumorales dont 2 étaient des contrôles positifs,
entre Avril et Juin 2018 au Laboratoire de Pathologie Cellulaire et Moléculaire de la Faculté
de Médecine et de Pharmacie de l’Université Hassan II, Casablanca, sous la direction du
Professeur Abdallah BADOU.
Une première expérience a été faite et a donné des résultats insatisfaisants (figure10),
nous n’avons pas pu visualiser les bandes de sous unités d’ARN ribosomique 18S et 28S
attendues après migration, témoin d’une dégradation de l’ARN. Ce constat pourrait être du
probablement à l’utilisation d’une centrifugeuse non réfrigérée ce qui peut dénaturer l’ARN,
ou à l’action des ARNases.
Les concentrations de l’ARN obtenues étaient suffisantes pour évaluer sa qualité, certes
elle varie d’un tissu à l’autre (tableau IV). La concentration de l’ARN totale dans les
échantillons colorectaux est de l’ordre 100 et de 1000 pour les échantillons du sein et le
cerveau. Cette variation peut être expliquée par le type de tissu ainsi que l’état physiologique
du tissu lors du prélèvement et la taille de la biopsie.
D’autres part, la quantité de l’ARN est supérieur dans les tissus tumoraux par rapport
aux tissus normaux, car les tumeurs représentent beaucoup plus de cellules suite à une
prolifération cellulaire incontrôlée (46) (47).
Dans un autre temps, une deuxième expérience a été réalisée mais seul le tissu du
cerveau a donné des bandes légèrement visibles malgré que les deux ratios (260/280) et
(260/230) ont révélés une contamination d’ARN (tableau V) ce qui indique que la pureté
d’ARN ne reflète pas sa qualité. Cette dégradation ne peut être expliqué que par la présence
des ARNases (figure 11). Pour remédier à ce problème, nous avons ajouté de l’eau de Javel 6%
afin d’éliminer les ARNases et dénaturer les structures secondaires de l’ARN (Figure 14) (48).
42
Figure 14 : Effet protecteur de la qualité de l’ARN par l’eau de Javel dans un gel
contenant les ARNases (48)
La qualité des bandes de l’ARN de nos échantillons de cerveau a été amélioré après
l’addition de l’eau de Javel sauf que les bandes des sous unités de l’ARN ribosomiques n’ont
pas été toutes présentes au niveau des tissus de sein et colorectal (figure 12,13).
L’équipe de Castells Domingo a mené une étude dans le but de déterminer la qualité de
l’ARN dans une large cohorte de biopsies de patients atteints du cancer de cerveau, et
l’évaluation de différents facteurs qui peuvent influencer la qualité de l'ARN dans un modèle
murin de glioblastome et dans des sous-ensembles supplémentaires de biopsies de patients.
Elle représente la première étude qui fournit un aperçu sur les facteurs influençant la
dégradation de l'ARN dans les biopsies de tumeurs cérébrales. Ils ont trouvé que l’amélioration
de la qualité de l’ARN exige un transport immédiat de la biopsie après la cautérisation de la
zone tumorale, la congélation rapide et l'échantillonnage multiple (49).
Une bonne qualité d'ARN est essentielle pour obtenir des résultats fiables à partir des
analyses transcriptomiques. L'inclusion d'échantillons avec de l'ARN dégradé peut influencer
l'analyse statistique et donc l'interprétation des niveaux d'expression génique par rapport aux
données biologiques et/ou cliniques. Les résultats devraient refléter les vraies différences
biologiques et non les différences dues à une mauvaise intégrité de l'ARN (43).
43
44
Conclusion :
L’ARN est une molécule très importante qui est impliquée dans les techniques
d’analyses transcriptomiques qui permettent d’obtenir un profil qualitatif et quantitatif de
l’expression des gènes afin de diagnostiquer les pathologies géniques comme les cancers et de
trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Des résultats fiables nécessitent une quantité et une qualité d’ARN adéquates, car
plusieurs facteurs peuvent affecter les résultats attendus.
L’ARN est très sensible et court un risque de dégradation par les ARNases et les agents
contaminants. Il faut prendre des précautions à chaque étape de préparation de l’ARN afin de
préserver sa bonne qualité, notamment par la récupération et le transport immédiat de la biopsie
au laboratoire pour conservation. De plus, l’échantillonnage multiple peut aider à obtenir de
meilleurs résultats. Comme Il faut également tenir compte du fait que la vitesse de dégradation
diffère d’un tissu à l’autre.
Cette étude incite que l’amélioration des méthodes de préparation de l’ARN est une
nécessité pour avoir un bon profil d’expression d’ARN qui va servir dans l’interprétation des
niveaux d'expression géniques des cancers.
45
Références bibliographiques :
1. Sudhakar A. History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods. J Cancer Sci
Ther. 2009 Dec 1;1(2):1–4.
4. Guo H, Tsung K. Tumor reductive therapies and antitumor immunity. Oncotarget. 2017
Jun 14;8(33):55736–49.
5. Pennock GK, Chow LQM. The Evolving Role of Immune Checkpoint Inhibitors in
Cancer Treatment. Oncologist. 2015 Jul;20(7):812–22.
8. Lopez-Garcia MA, Geyer FC, Lacroix-Triki M, Marchió C, Reis-Filho JS. Breast cancer
precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.
2010 Aug;57(2):171–92.
13. Burkitt DP. Epidemiology of cancer of the colon and rectum. 1971. Dis Colon Rectum.
1993 Nov;36(11):1071–82.
14. Faivre J, Dancourt V, Lejeune C, Tazi MA, Lamour J, Gerard D, et al. Reduction in
colorectal cancer mortality by fecal occult blood screening in a French controlled
study1. Gastroenterology. 2004 Jun 1;126(7):1674–80.
46
15. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics.
CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2011 Mar 1;61(2):69–90.
16. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA: A Cancer
Journal for Clinicians. 2005 Mar 1;55(2):74–108.
17. Housse HE, Ajbara W, Amsaguine S, Amrani NE, Drissi H, Ahallat M, et al. Profils
épidémiologique et anatomoclinique d’une population marocaine atteinte de cancer
colorectal. J Afr Cancer. 2015 May 1;7(2):95–9.
18. LAMBERT R. Colorectal cancer (CRC) epidemiology [Internet]. 2009. Available from:
https://doi.org/10.4267/2042/25061
21. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular Cell
Biology. 4th ed. W. H. Freeman; 2000.
22. Dahm R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental Biology. 2005
Feb 15;278(2):274–88.
23. Cox MM, Doudna J, O’Donnell M. Molecular Biology: Principles and Practice. Second
edition. New York: W. H. Freeman; 2015. 944 p.
24. Jones ME. Albrecht Kossel, A Biographical Sketch. Yale J Biol Med. 1953
Sep;26(1):80–97.
25. Cohen JS, Portugal FH. The search for the chemical structure of DNA. Conn Med. 1974
Oct;38(10):551–2, 554–7.
26. Simoni RD, Hill RL, Vaughan M. The Structure of Nucleic Acids and Many Other
Natural Products: Phoebus Aaron Levene. J Biol Chem. 2002 May 31;277(22):e11–e11.
27. Levene PA. The Structure of Yeast Nucleic Acid Iv. Ammonia Hydrolysis. J Biol
Chem. 1919 Dec 1;40(2):415–24.
28. Cobb M. 1953: When Genes Became “Information.” Cell. 2013 Apr 25;153(3):503–6.
29. Cobb M. Oswald Avery, DNA, and the transformation of biology. Current Biology.
2014 Jan 20;24(2):R55–60.
47
31. The Francis Crick Papers: The Discovery of the Double Helix, 1951-1953: Documents
[Internet]. [cited 2018 May 9]. Available from:
https://profiles.nlm.nih.gov/SC/Views/Exhibit/documents/doublehelix.html
32. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. Molecular Biology of the
Gene. 7th ed. Pearson; 2007.
33. Griffiths AJF, Wessler SR, Carroll SB, Doebley J. Introduction to Genetic Analysis.
11th ed. New York, NY: W. H. Freeman; 2015. 896 p.
34. Allen FW. The Biochemistry of the Nucleic Acids, Purines, and Pyrimidines.
NUCLEIC ACIDS. :24.
36. Cobb M. Who discovered messenger RNA? Current Biology. 2015 Jun
29;25(13):R526–32.
37. Kresge N, Simoni RD, Hill RL. The Discovery of tRNA by Paul C. Zamecnik. J Biol
Chem. 2005 Oct 7;280(40):e37–e37.
39. Jamieson JD. A tribute to George E. Palade. J Clin Invest. 2008 Nov 3;118(11):3517–8.
40. Wells WA. Ribosomes, or the particles of Palade. The Journal of Cell Biology. 2005 Jan
3;168(1):12–12.
41. RajBhandary UL, Köhrer C. Early days of tRNA research: discovery, function,
purification and sequence analysis. J Biosci. 2006 Oct;31(4):439–51.
42. Bastard J-P, Chambert S, Ceppa F, Coude M, Grapez E, Loric S, et al. Les méthodes
d’extraction et de purification des ARN. Annales de Biologie Clinique. 2002 Oct
7;60(5):513–23.
43. Strand C, Enell J, Hedenfalk I, Fernö M. RNA quality in frozen breast cancer samples
and the influence on gene expression analysis – a comparison of three evaluation
methods using microcapillary electrophoresis traces. BMC Molecular Biology. 2007
May 22;8:38.
44. Rio DC, Ares M, Hannon GJ, Nilsen TW. Purification of RNA using TRIzol (TRI
reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 Jun;2010(6):pdb.prot5439.
45. Samadani AA, Nikbakhsh N, Fattahi S, Pourbagher R, Aghajanpour Mir SM, Mousavi
Kani N, et al. RNA Extraction from Animal and Human’s Cancerous Tissues: Does
Tissue Matter? Int J Mol Cell Med. 2015;4(1):54–9.
48
46. Mee BC, Carroll P, Donatello S, Connolly E, Griffin M, Dunne B, et al. Maintaining
Breast Cancer Specimen Integrity and Individual or Simultaneous Extraction of Quality
DNA, RNA, and Proteins from Allprotect-Stabilized and Nonstabilized Tissue Samples.
Biopreserv Biobank. 2011 Dec;9(4):389–98.
48. Aranda PS, LaJoie DM, Jorcyk CL. Bleach Gel: A Simple Agarose Gel for Analyzing
RNA Quality. Electrophoresis. 2012 Jan;33(2):366–9.
49. Castells Domingo X, Ferrer-Font L, Davila M, Candiota AP, Simões RV, Fernández-
Coello A, et al. Improving Ribosomal RNA Integrity in Surgically Resected Human
Brain Tumor Biopsies. Biopreserv Biobank. 2016 Apr;14(2):156–64.
50. Zeugner S, Mayr T, Zietz C, Aust DE, Baretton GB. RNA Quality in Fresh-Frozen
Gastrointestinal Tumor Specimens—Experiences from the Tumor and Healthy Tissue
Bank TU Dresden. In: Pre-Analytics of Pathological Specimens in Oncology [Internet].
Springer, Cham; 2015 [cited 2018 May 31]. p. 85–93. (Recent Results in Cancer
Research). Available from: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-13957-
9_9
51. Viana CR, Neto CS, Kerr LM, Palmero EI, Marques MMC, Colaiacovo T, et al. The
interference of cold ischemia time in the quality of total RNA from frozen tumor
samples. Cell Tissue Bank. 2013 Jun 1;14(2):167–73.
49
Annexes :
Annexe 1 :
Nous présentons ci-dessous la démarche suivie pour le calcul des dilutions :
Dilution 1 : 1µg/5µL
1µg 5µl
0.5µg 1µl
200µg 1000µl
200µg 1ml
La concentration finale est 200µg/ml.
Dilution 2 : 0.5µg/5µl
0.5µg 5µl
0.1µg 1µl
100µg 1000µl
100µg 1ml
La concentration finale est 100µg/ml.
Dilution 3 : 0.25µg/5µl
0.25µg 5µl
0.05µg 1µl
50µg 1000µl
50µg 1ml
La concentration finale est 50µg/ml.
Annexe 2 :
On a : Ci x Vi = Cf x Vf
50
Nous prenons comme Volume final Vf = 20µl
Concentration de Solution dilué 1µg/5µl Solution dilué 0.5µg/5µl Solution dilué 0.25µg/5µl
SM (µg/ml) (µl) (µl)
(µl)
Colorectal 1 740.4 2.7µl ARN+7.3µl EUP 1.35µl ARN+8.65 µl EUP 0.67µl ARN+9.33µl EUP
Sein 1 3958 1.01µl ARN+18.99µl EUP 1.26µl ARN+48.74µl EUP 0.63µl ARN+49.37µl EUP
Cerveau 1 4310 0.92µl ARN+19.08µl EUP 1.16µl ARN+48.84µl EUP 0.58µl ARN+49.42µl EUP
Concentration Solution dilué 1µg/5µl Solution dilué 0.5µg/5µl (µl) Solution dilué 0.25µg/5µl
de SM (µg/ml) (µl)
(µl)
Colorectal C+ - - - -
Colorectal 2 497.2 2.011µl ARN+2.989µl EUP 2.011µl ARN+7.989µl EUP 1.005µl ARN+8.945µl EUP
Cerveau C+ - - - -
Cerveau 2 1417 2.82µl ARN+17.18µl EUP 1.41µl ARN+18.59µl EUP 0.705µl ARN+19.235µl EUP
Sein 2 2514 1.591µl ARN+18.409µl EUP 0.795µl ARN+19.205µl EUP 0.795µl ARN+39.205µl EUP
51