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Université Hassan Premier

Faculté des Sciences et Techniques de Settat

MEMOIRE DE PROJET DE FIN D’ETUDES

Pour l’Obtention du :
Diplôme de Licence Sciences et Techniques
Sciences Biomédicales

Préparation et Comparaison Quantitative et Qualitative


des ARNs de Différents Tissus Tumoraux

Présenté par :
CHARGUI Oumaima

Encadré par :
Mr Abdallah BAGRI, FST-Settat
Mr Abdallah BADOU, FMP-Casablanca

Soutenu le 21 Juin 2018 devant le jury composé de :


- Pr. Abdallah BAGRI, Professeur à la FST de Settat
- Pr. Abdallah BADOU, Professeur à la FMP de Casablanca
- Pr. Soumaya El GANOUNI, Professeur à la FST de Settat
- Pr. Naima HAMIDALLAH, Professeur à la FST de Settat
Remerciement :

Je trouve l’honneur à remercier toutes les personnes qui ont resté près de moi et m’ont
aidé à accomplir mon stage et à rédiger ce rapport.
Tout d’abord, je tiens à remercier mon professeur Mr Abdallah BAGRI qui m’a aidé
lors de la recherche du stage et qui m’a conseillé afin de trouver le sujet de mon projet de fin
d’études.

Je voudrais bien exprimer mes profondes gratitudes au professeur Abdallah BADOU


pour m’avoir accueilli dans son équipe au sein du Laboratoire de Pathologies Cellulaire et
Moléculaire de la FMPC, et pour m’avoir donné l’opportunité d’acquérir une nouvelle
expérience et soutenu durant le temps que j’ai passé au stage.

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à Chaimae BOULHEN qui a resté à


mes côtés pendant toute la période de stage en me soutenant et en m’offrons des conseils lors
de la rédaction de mon rapport et lors de mes expériences au laboratoire et qui grâce à son
orientation j’ai été capable de réaliser ce travail.

Un spéciale remerciement à Soumaya Rafii qui m’a surveillé durant mes manipulations
au laboratoire et qui m’a éduqué les bonnes méthodes pour une meilleure conduite et un bon
processus des manipulations.

Je remercie Amina GHOUZLANI et Dounia CHRAA qui m'ont assisté par la fourniture
des biopsies que j’ai utilisée et par leur guidance durant mon stage. Aussi, je souhaite bien
remercier Asmaa MARZOUK qui m’a offert l’aide lors de mes expériences.

Je remercie également toute l'équipe de Mr Badou : Imane EL IDRISSI SAIK, Basma


ZOHAIR, Ibtissam REZOUKI, Ahmad QANDOUCI et Hayat MIFTAH pour leur accueil, leur
esprit d'équipe et leur conseil.

Enfin, j’adresse mes remerciements à toutes les personnes qui m'ont conseillé et relu
lors de la rédaction de ce rapport de stage.
Sommaire :
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction générale : ............................................................................................................. 11
Objectif du travail : .................................................................................................................. 12
Revue bibliographique : ........................................................................................................... 14
I. Le cancer : .................................................................................................................... 14
1. Généralités : ........................................................................................................... 14
2. Epidémiologie du cancer au Maroc : ..................................................................... 15
3. Immunité anticancéreuse : ..................................................................................... 15
4. Les types de cancer : .............................................................................................. 17
a. Cancer du cerveau : ............................................................................................ 17
b. Cancer du sein: ................................................................................................... 18
c. Cancer colorectal: .............................................................................................. 19
II. Acide Désoxyribo-Nucléique: ................................................................................... 19
1. Historique : ............................................................................................................ 19
2. Structure : .............................................................................................................. 20
3. Localisation dans la cellule : ................................................................................. 21
4. Fonctions de l’ADN : ............................................................................................ 22
III. Acide Ribonucléique : ............................................................................................... 22
1. Historique : ............................................................................................................ 22
2. Structure : .............................................................................................................. 23
3. Fonctions : ............................................................................................................. 25
4. L’ARN comme outil de recherche scientifique : ................................................... 27
a. Préparation de l’ARN : ...................................................................................... 27
b. Electrophorèse sur gel : ...................................................................................... 28
Patients et méthodes :............................................................................................................... 31
I. Patients : ....................................................................................................................... 31
1. Caractères clinicopathologiques des patients : ...................................................... 31
2. Critères d’inclusion : ............................................................................................. 32
3. Critères d’exclusion : ............................................................................................. 32
II. Méthodologie : .......................................................................................................... 32
1. Nature du prélèvement : ........................................................................................ 32
2. Protocol expérimental : .......................................................................................... 32
a. Extraction de l’ARN : ........................................................................................ 32
b. Electrophorèse sur gel d’agarose : ..................................................................... 33
Résultats : ................................................................................................................................. 35
Discussion : .............................................................................................................................. 42
Conclusion : ............................................................................................................................. 45
Références bibliographiques : .................................................................................................. 46
Annexes : ................................................................................................................................. 50
Avant-propos :

Ce travail a été réalisé au sein du Laboratoire de Pathologies Cellulaire et Moléculaire de la


Faculté de Médecine et Pharmacie, Université Hassan II, Casablanca, entre Avril et Juin
2018, dans le cadre d’obtention d’un diplôme de licence, option « Sciences Biomédicales ».

Sous la direction des Professeurs Abdallah BADOU et Abdallah BAGRI et sous


l’encadrement de la doctorante Chaimae BOULHEN.
Résumé :

Le cancer représente une urgence diagnostique et thérapeutique par excellence, d’où la


nécessité de la sensibilisation. Cette dernière joue un rôle de plus en plus important dans
l’élaboration des services de santé, et présente un pas essentiel dans le dépistage du cancer à
un air précoce afin de traiter la maladie avant d’atteindre des stades avancés.

Afin de comparer la qualité et la quantité de l’ARN dans les différents types de tissus
tumoraux, colorectal, mammaire et cérébral, une extraction d’ARN a été réalisée en se basant
sur le protocole du réactif TRIzol suivi d’une électrophorèse.

Les résultats obtenus à partir de l’échantillon de la tumeur cérébrale ont montré une
bonne quantité et qualité d’ARN. Par contre, l’ARN a été dégradé dans les autres types de
tissus. La concentration de l’ARN dans les tissus tumoraux dépend du type de tissus ainsi que
la taille de la biopsie.

Une bonne qualité d'ARN est essentielle pour obtenir des résultats fiables afin
d’interpréter les niveaux d'expression génique, ceci exige l’élimination des ARNases et des
agents contaminants qui dégradent l’ARN.

Mots clés : ARN, Cancer, Comparaison qualitative et quantitative.


‫اﻟﻤﻠﺨﺺ ‪:‬‬

‫ﯾﻤﺜﻞ اﻟﺴﺮطﺎن ﺣﺎﻟﺔ طﻮارئ ﺗﺸﺨﯿﺼﯿﺔ وﻋﻼﺟﯿﺔ ﺑﺎﻣﺘﯿﺎز ‪ ،‬وﻣﻦ ھﻨﺎ ﺗﺒﺮز اﻟﺤﺎﺟﺔ إﻟﻰ اﻟﺘﻮﻋﯿﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﻠﻌﺐ دوراً‬
‫ﻣﺘﺰاﯾﺪ اﻷھﻤﯿﺔ ﻓﻲ ﺗﻄﻮﯾﺮ اﻟﺨﺪﻣﺎت اﻟﺼﺤﯿﺔ ‪ ،‬وھﻮ ﺧﻄﻮة ﺣﺎﺳﻤﺔ ﻓﻲ اﻟﻜﺸﻒ اﻟﻤﺒﻜﺮ ﻋﻦ اﻟﺴﺮطﺎن ﻟﻌﻼج ھﺬا اﻟﻤﺮض ﻗﺒﻞ‬
‫اﻟﻮﺻﻮل إﻟﻰ ﻣﺮاﺣﻞ ﻣﺘﻘﺪﻣﺔ‪.‬‬

‫ﻟﻤﻘﺎرﻧﺔ ﺟﻮدة وﻛﻤﯿﺔ اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﺗﻢ اﺳﺘﺨﺮاج اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﻣﻦ ﺛﻼﺛﺔ أﻧﻮاع ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ‬
‫ﻣﻦ اﻷﻧﺴﺠﺔ اﻟﺴﺮطﺎﻧﯿﺔ‪ :‬اﻟﻘﻮﻟﻮن‪ ،‬اﻟﺜﺪي واﻟﺪﻣﺎغ ‪ ،‬ﺗم اﺳﺗﺧراﺟﮫ ﺑﺎﻋﺗﻣﺎد ﺑروﺗوﻛول اﻟﻛﺎﺷف‪ ،TRIzol :‬ﻣﺗﺑوﻋﺎ ﺑﺎﻻﺳﺗﺷراد‬
‫اﻟﻛﮭرﺑﺎﺋﻲ ﻟﻠﺗﺣﻘﻖ‪.‬‬

‫اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ اﻟﺘﻲ ﺗﻢ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﯿﮭﺎ ﻣﻦ ﻋﯿﻨﺔ ورم ﻓﻲ اﻟﻤﺦ أظﮭﺮت ﻛﻤﯿﺔ و ﺟﻮدة ﺟﯿﺪة ﻟﻠﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي‪ .‬ﻓﻲ‬
‫اﻟﻤﻘﺎﺑﻞ ‪ ،‬ﻻﺣﻈﻨﺎ ﺗﺪھﻮره ﻓﻲ أﻧﻮاع اﻷﻧﺴﺠﺔ اﻷﺧﺮى‪ .‬ﯾﻌﺘﻤﺪ ﺗﺮﻛﯿﺰ اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي ﻓﻲ أﻧﺴﺠﺔ اﻟﻮرم ﻋﻠﻰ ﻧﻮع‬
‫اﻟﻨﺴﯿﺞ وﻛﺬﻟﻚ ﺣﺠﻢ اﻟﺨﺰﻋﺔ‪.‬‬

‫إن ﺟﻮدة اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي اﻟﺠﯿﺪة ﺿﺮورﯾﺔ ﻟﻠﺤﺼﻮل ﻋﻠﻰ ﻧﺘﺎﺋﺞ ﻣﻮﺛﻮﻗﺔ ﻟﺘﻔﺴﯿﺮ ﻣﺴﺘﻮﯾﺎت اﻟﺘﻌﺒﯿﺮ اﻟﺠﯿﻨﻲ‪،‬‬
‫وھﺬا ﯾﺘﻄﻠﺐ إزاﻟﺔ اﻟﺮﯾﺒﻮﻧﻮﻛﻠﯿﺎز واﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﻤﻠﻮﺛﺔ اﻟﺘﻲ ﺗﺴﺒﺐ ﺗﺪھﻮر اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي‪.‬‬

‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﺴﺘﻨﺒﻄﺔ ‪ :‬اﻟﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﯾﺒﻮزي‪ ،‬ﺳﺮطﺎن‪ ،‬ﻣﻘﺎرﻧﺔ اﻟﺟودة واﻟﻛﻣﯾﺔ‪.‬‬


Liste des abréviations :

ADN : Acide désoxyribonucléique


ARN : Acide ribonucléique
ARNase : Ribonucléase
ARNm : Acide ribonucléique messager
ARNr : Acide ribonucléique ribosomique
ARNt : Acide ribonucléique de transfert
ATP : Adénosine triphosphate
BET : Bromure d'éthidium
C+ : Contrôle positif
CTLA-4 : Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
EUP : Eau ultra-pure
HER2 : Human epidermal growth factor receptor 2
LAG-3 : Lymphocyte-activation gene 3
MT : Marqueur de taille
NK : Natural killer
PCR : Polymerase chain reaction
PD-1 : Programmed cell death protein 1
RE : Récepteur œstrogène
SM : Solution mère
T CD4 : Lymphocyte T auxiliaire
T CD8 : Lymphocyte T cytotoxique
TBE : Tris-Borate-EDTA
UV : Ultraviolet
Liste des tableaux :

Tableau I : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer colorectal

Tableau II : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer mammaire

Tableau III : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer cérébral

Tableau IV : Résultats du dosage de la première manipulation

Tableau V : Résultats du dosage de la deuxième manipulation


Liste des figures :

Figure 1 : Concept d’« immunoediting »

Figure 2 : Mécanisme d’échappement à la réponse immunitaire

Figure 3 : Structure de l’ADN

Figure 4 : Structure chimique des ARNs

Figure 5 : Structure de l’ARNt

Figure 6 : Structure du ribosome

Figure 7 : De l’ADN aux protéines

Figure 8 : Rôles des ARNs dans la synthèse des protéines

Figure 9 : Séparation des ARNs par électrophorèse

Figure 10 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°1

Figure 11 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°2

Figure 12 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°3

Figure 13 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°3 après une seconde migration

Figure 14 : Effet protecteur de la qualité de l’ARN par l’eau de Javel dans un gel contenant
les ARNases
10
Introduction générale :

De notre temps, le cancer est encore une maladie terrible qu’on apprend de plus en plus
à connaitre. Les scientifiques ont pris l’initiative depuis longtemps afin de comprendre les
mécanismes d’expression du cancer et les marqueurs moléculaires capables d’influer la
progression tumorale.

Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d’un
tissu de l’organisme, induite par des mutations, d’origine héréditaire ou acquise. Ces mutations
affectent le fonctionnement cellulaire par la production de protéines altérées. L’ADN
endommagé conduit à la production de ces dernières au cours du processus de l’oncogenèse ce
qui induit une anomalie fonctionnelle de la cellule.

La traduction assure l'expression des gènes en permettant la synthèse de protéine à partir


d'un brin d'ARN messager. L’ARN en tant qu’intermédiaire dans ce processus peut servir pour
l’étude de l’expression d’un gène donné.

Le profil d'expression de l'ARN permet de déterminer quelles protéines ou molécules


d'ARN sont présentes dans les cellules cancéreuses, ceci peut en dire beaucoup sur le
comportement d'une cellule (1).

L’évolution des techniques d’analyses transcriptomiques a permis l’étude de


l’expression des gènes responsables de la croissance des tumeurs et des mécanismes
d’échappement des cellules cancéreuses au système immunitaire.

11
Objectif du travail :

Notre étude a pour objectif la comparaison qualitative et quantitative d’ARN dans trois
types de tissus tumoraux : mammaire, cérébral, et colorectal à travers une extraction de l’ARN
et migration sur gel d’agarose.

12
13
Revue bibliographique :
I. Le cancer :

1. Généralités :
Le cancer se développe quand une cellule anormale prolifère d’une manière incontrôlée et
donne naissance à une tumeur, ou néoplasme. Tant que les cellules néoplasiques ne deviennent
pas envahissantes, la tumeur est dite bénigne, et l'élimination ou la destruction locale de la
masse tumorale permet généralement une guérison complète. Une tumeur est considérée
comme un cancer seulement si elle est maligne, c'est-à-dire seulement si ces cellules ont acquis
la capacité d'envahir le tissu environnant. L'invasivité est une caractéristique essentielle des
cellules cancéreuses. Elle leur permet de se détacher, de pénétrer dans les vaisseaux sanguins
ou lymphatiques et de former des tumeurs secondaires, appelées métastases. Plus le cancer se
propage largement, plus il devient difficile de l'éradiquer, et généralement les métastases ont
un mauvais pronostique pour les patients atteints du cancer (2). En général les cancers forment
des tumeurs solides, mais certains cancers comme la leucémie ne forment pas de tumeurs. (1).

Au milieu du 20ème siècle, les scientifiques ont commencé à résoudre les problèmes
complexes de la chimie et de la biologie du cancer. Watson et Crick ont reçu le prix Nobel en
1962 pour la découverte de la structure hélicoïdale de l'ADN. Plus tard, les scientifiques ont
compris le fonctionnement des gènes et comment ils pourraient être endommagés par des
mutations et ils ont découvert que le cancer pourrait être causé par des produits chimiques dites
cancérigènes, des rayonnements, des virus et également d’origine héréditaire.

Au cours des années 1970, les chercheurs ont découvert 2 familles importantes de gènes :

 Les Oncogènes : gènes responsables de la croissance incontrôlée des cellules. Ils sont
formés de proto-oncogènes ; gènes qui contrôlent normalement la fréquence de
division d'une cellule et le degré de différenciation.
 Les gènes suppresseurs de tumeur : Ce sont des gènes qui contrôlent la division
cellulaire, la réparation de l'ADN et l’apoptose. Un disfonctionnement d'un gène
suppresseur de tumeur conduit au cancer (1).

Les cellules cancéreuses acquièrent une variété de propriétés spéciales à mesure qu'elles
évoluent, se multiplient et se propagent. Ceux-ci incluent des altérations dans les voies de
signalisation cellulaire, permettant aux cellules d'ignorer les signaux de leur environnement qui

14
normalement maintiennent la prolifération cellulaire sous contrôle. Dans le cadre du processus
évolutif de la progression tumorale, les cellules cancéreuses acquièrent des défauts de
différenciation et des mécanismes de contrôle qui arrêtent définitivement la division cellulaire
ou induisent l'apoptose en réponse au stress cellulaire ou aux altérations de l'ADN. Tous ces
changements augmentent la capacité des cellules cancéreuses à survivre, croître et se diviser
dans leur tissu d'origine, puis à se métastaser, ce qui nécessite survie et prolifération dans des
environnements étrangers. Cependant, l'évolution d'une tumeur ne dépend pas simplement des
changements dans les cellules cancéreuses elles-mêmes ; il dépend aussi d'autres cellules
présentes dans le microenvironnement tumoral, collectivement appelées cellules stromales, y
compris de nouveaux vaisseaux sanguins qui permettent à la tumeur de se propager par la
circulation sanguine (2).

2. Epidémiologie du cancer au Maroc :


Au Maroc, le cancer occupe une place de plus en plus importante dans les préoccupations
sanitaires. Il est la deuxième cause de mortalité dans notre pays après les maladies cardio-
vasculaires soit 11,3%. On estime le nombre de nouveaux cas entre 30 000 et 40000 par an
dont seulement 7 500 sont pris en charge1 soit 18 % à 25 % des cas. Cette prise en charge est
généralement faite tardivement, car le diagnostic est souvent fait à un stade avancé de la
maladie. IARC (2010) a publié dans son rapport Globocan (2008), que le Maroc a connu 27
600 nouveaux cas de cancers avec une légère prédominance du cancer féminin soit 54,35%, et
un taux de mortalité de l’ordre de 19 700 pour les deux sexes dont 551,77% chez l’homme.

Les cancers les plus fréquents chez l’homme sont successivement le cancer du poumon, de
la prostate et du colorectum. Tandis que chez la femme on s’aperçoit majoritairement du cancer
du sein 35,9%, suivi par le cancer du col utérin 13,2% et le cancer colorectal 5,9%, avec une
mortalité respectivement et successivement de 29,3% ; 12% et 7,1% (3).

3. Immunité anticancéreuse :
L'évolution de la thérapie anti-cancéreuse est diversifiée et continue d'être étendue. Les
thérapies réductrices tumorales comprennent les thérapies classiques (chirurgie,
chimiothérapie et radiothérapie), les modalités de traitement local et systémique modernes (ex.
: Ablation par radiothérapie, chimio-embolisation trans-artérielle locale, ultrasons focalisés à

15
haute intensité, et médicaments qui ciblent des molécules spécifiques dans les cellules
cancéreuses). Toutes les thérapies réductrices du cancer n'ont qu'un seul objectif : réduire la
charge tumorale par la destruction directe des cellules tumorales. Une nouvelle catégorie de
traitement anticancéreux, l'immunothérapie, est apparue ces dernières années et est classée
séparément des traitements cytotoxiques (chimiothérapie et radiothérapie) (4).

Le système immunitaire de l'hôte a une réponse naturelle au cancer, reconnaissant et


éliminant les cellules anormales avec des erreurs de réplication, des cellules précancéreuses et
des cellules tumorales malignes du corps. Ce processus d'élimination a toujours été connu sous
le nom de « surveillance immunitaire ». Cependant, l'équilibre entre les cellules tumorales et
le système immunitaire peut changer en faveur de la tumeur et peut entraîner une croissance
maligne incontrôlée (figure 1). Ce processus d’ « échappement » peut impliquer l'émergence
de cellules tumorales avec une immunogénicité plus faible, ce qui amortit la réponse
immunitaire antisudorale en dessous du seuil requis pour l'élimination complète de la tumeur
(5). Les bases du concept d’immunosurveillance ont été définies par Burnet et Thomas dans
les années 1970. Le concept d’immunosurveillance a ensuite été complété par le concept
d’ « immunoediting » (6).

Figure 1 : Concept d’« immunoediting » (6)

La réponse immunitaire aux cellules tumorales implique à la fois les composants adaptatifs
et innés du système immunitaire. Les réponses immunitaires anti-tumorales adaptatives sont
médiées par des composants cellulaires et humoraux, les lymphocytes T (cellules T CD4 + et
CD8 +) jouant un rôle clé. Les cellules tueuses naturelles (NK = Natural Killer) jouent un rôle
important dans la réponse immunitaire anti-tumorale innée. Les cellules tumorales exploitent
plusieurs mécanismes complexes pour échapper à la reconnaissance et à la destruction par le
système immunitaire (figure 2). Cela peut se produire par des mécanismes comprenant
l'activation des voies inhibitrices des lymphocytes T (point de contrôle), tels que l'antigène 4

16
des lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4), la mort programmée 1 (PD-1) et le gène 3 de
l'antigène lymphocytaire (LAG- 3) ; l'inhibition des voies d'activation des cellules T ; et / ou la
suppression de l'activité des cellules NK. En outre, le microenvironnement tumoral contient
divers facteurs immunosuppresseurs provenant de différentes sources qui peuvent être
exploitées par les cellules tumorales pour échapper au système immunitaire (5).

Les exemples les plus marquants des immunothérapies sont les thérapies cellulaires, telles
que les lymphocytes T-kinases (CARK) et les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, tels
que la mort cellulaire (PD)-1 et l'antigène des lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4) (4).

Figure 2 : Mécanisme d’échappement à la réponse immunitaire (6)

4. Les types de cancer :


Il existe différents types de cancer. Dans notre étude, nous nous intéressons aux types
suivants :
a. Cancer du cerveau :
Les tumeurs cérébrales primitives sont des tumeurs intracrâniennes qui trouvent leur
origine dans le cerveau. Les gliomes constituent plus de 80% des tumeurs cérébrales. Par
conséquent, l'épidémiologie descriptive des gliomes est souvent traitée dans un contexte plus
large de tumeurs cérébrales. L'estimation de l’incidence des tumeurs cérébrales est souvent
difficile en raison de l'incomplétude des données collectées et le manque de reproductibilité

17
des classifications actuelles. Actuellement au Maroc, il existe un registre national de la Région
de Casablanca pour la collecte de données sur les tumeurs cérébrales. L’incidence normalisée
estimée du cancer du système nerveux central est de 2,0 pour 100 000 hommes/an et 1,1 cas
pour 100 000 femmes/ an (7).

b. Cancer du sein:
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et représente la première
cause de mortalité. C’est une pathologie éminemment hétérogène. De multiples classifications
(cliniques, histopathologies ou moléculaires) ont vu le jour, afin de permettre l’identification
précise des tumeurs les plus agressives et l’adaptation thérapeutique qui en découle. L’une des
classifications les plus simples est basée sur les propriétés intrinsèques tumorales du cancer du
sein, qui peuvent être classées en deux grandes catégories: les tumeurs qui expriment le
récepteur aux œstrogènes (RE) (appelé tumeurs luminales ou RE+) et celles qui ne l’expriment
pas ou RE- (8). L’existence d’un système de classification histologique dans le cancer du sein
est loin d’être précise pour prédire le pronostic d’un patient (9). Morphologiquement, des
tumeurs identiques peuvent présenter des résultats cliniques différents. Pour cela, une
classification moléculaire permet principalement de déterminer différentes classes
moléculaires appartenant à un type histologique similaire. Une bonne connaissance de ces
classes moléculaires et de leur identification pourrait conduire à un diagnostic plus avancé et à
un système pronostic plus bénéfique et précis (10). Il est donc très important de connaitre le
profil biologique du cancer du sein (11).

Selon l’organisation mondiale de la santé un million de cas est recensés chaque année
dans le monde entier. Il représente 16% de l’ensemble des cancers chez la femme avec 69% de
décès enregistrés dans les pays en développement. Au Maroc, la situation ne fait pas exception,
ce type de cancer constitue un des problèmes majeurs de santé publique avec 7.2% de
l’ensemble des décès enregistrés. Sur la base du registre des cancers de la région du grand
Casablanca, l’incidence annuelle nationale enregistrée est estimée à 30 500 nouveaux cas de
cancer par an dont seulement près de 12 000 cas soit 25% sont pris en charge de manière
effective. Une légère augmentation a été révélée pour les années 2005-2007, ces données
révèlent l’importance de la problématique du cancer au Maroc (12).

18
c. Cancer colorectal:
Le cancer colorectal, par sa fréquence et par sa gravité, est un problème important de
santé publique. Près d’un million de cancers colorectaux sont diagnostiqués et près d’un demi-
million de personnes en meurent chaque année dans le monde (13) (14) (15). Les taux
d’incidence les plus élevés sont rapportés par les registres d’Amérique du Nord, d’Europe
Occidentale et d’Australie. Des taux intermédiaires sont retrouvés en Europe de l’Est, des taux
faibles en Asie et en Amérique latine. Les taux les plus bas sont signalés en Afrique (16) (17).
Au Maroc, l’incidence standardisée du cancer colorectal est de 7,2 pour 100 000 habitants par
an chez l’homme et de 5 pour 100 000 habitants par an chez la femme (17). Par ailleurs,
diverses études épidémiologiques s’accordent pour confirmer que le cancer colorectal occupe
la première place parmi les cancers digestifs (17) (18) (19) (20) et constitue avec les cancers
du poumon, de la prostate et les cancers gynéco-mammaires les cancers les plus fréquents dans
les régions de Rabat et Casablanca (17).

II. Acide Désoxyribo-Nucléique:


L'acide désoxyribonucléique ou ADN est l'entrepôt, ou bibliothèque cellulaire, qui contient
toutes les informations nécessaires pour construire les cellules et les tissus d'un organisme. La
duplication exacte de cette information dans n'importe quelle espèce, d’une génération à la
suivante, assure la continuité génétique de cette espèce. L'information génétique est organisée
en unités qu’on appelle « gènes » : unités héréditaires contrôlant les traits identifiables d'un
organisme (21).

1. Historique :

En 1869, Friedrich Miescher a isolé une substance à partir des leucocytes : « Nucléine ».
En 1889, Richard Altmann a changé le nom de nucléine à « Acide Nucléique » (22).

Entre 1885 et 1901, Albrecht Kossel a découvert les différentes bases azotées des acides
nucléiques : Adénine, guanine, thymine, cytosine et uracile (22) (23) (24).

En 1929, Phoebus Levene a identifié les composants de l’ADN, et il a démontré la manière


dont ils sont organisés et liés les uns aux autres dans l’ordre « Phosphate-sucre-base », il a aussi
identifié la nature du sucre : le désoxyribose après 20 ans de son isolation du ribose à partir de

19
l’acide nucléique des levures (25). Il a nommé chaque unité de ces trois éléments un
« Nucléotide » et il a dit que l’ADN est une molécule constitué d’une chaine de nucléotides
liés au niveau du groupement phosphate (26). Or, il a assumé que l’ADN ne se compose que
de quatre unités (27).

En fait, les biologistes ont toujours cru que l’information génétique était portée par les
protéines (25) (28), ce n’est que dans les années 1940s que l’ADN a été identifié comme
support de l’information génétique après une série des expériences sur les bactéries notamment
l’expérience de Avery, MacLeod et McCarty en 1944 (29) et l’expérience Hershey et Chase en
1952 (30).

En 1953, James Watson et Francis Crick ont révélé la structure moléculaire correcte de
l’ADN : une double hélice où la base A est liée à la base T et la base C à la base G (28)(31)(32).
Cette découverte a permis de démontrer les voies de réplication et de transcription et traduction
(2) (32).

2. Structure :

L’ADN est une molécule constituée de deux chaînes polynucléotidiques. Ces dernières sont
liées par des liaisons hydrogènes, qu’on appelle hybridations, entre deux bases. Chaque
nucléotide est composé d’un sucre attaché à un ou plusieurs groupements phosphate et une
base azotée. Le sucre qui entre dans la composition d’ADN est le désoxyribose d’où le nom
« Acide désoxyribonucléique ».

En fait, dans une chaine polynucléotidique, les sucres sont liés aux groupements
phosphoryles par des liaisons phosphodiesters : un groupement phosphate est lié au carbone 3
d’un sucre d’une part et au carbone 5 du sucre adjacent de l’autre part. Cette liaison crée une
alternance sucre-phosphate le long de la partie extérieure de la chaine alors que les bases restent
à l’intérieur.

La manière dont les nucléotides sont orientés confère à la chaine une polarité chimique :
une extrémité 5’ qui porte un groupement phosphate libre d’un côté et une extrémité 3’ portant
un groupement hydroxyle libre de l’autre côté. La double hélice correspond à deux chaines
dont une est orienté dans le sens opposé de l’autre, c.-à-d. l’extrémité 5’ d’une chaine est en
face avec l’extrémité 3’ de l’autre. On dit que les deux chaines sont antiparallèles.

20
Les nucléotides se distinguent par leur base azotée. Les bases sont des molécules
azotées hétérocycliques, elles se divisent en deux classes : les purines : adénine et guanine, et
les pyrimidines : cytosine et thymine. On réfère aux bases par leur première lettre : A, G, C et
T. Les deux chaines d’ADN sont liées au niveau des bases azotées de façon que chaque purine
est attaché à une pyrimidine par des liaisons hydrogènes. On dit que les deux chaines sont
complémentaires car l’adénine est toujours liée à une thymine par deux hybridations et la
guanine est toujours liée à une cytosine par trois hybridations.

La structure tridimensionnelle de l’ADN –la double hélice- est maintenue grâce aux
liaisons hydrogènes et l’empilement des bases azotées (figure 3).

Figure 3 : Structure de l’ADN (33)

3. Localisation dans la cellule :

Chez les eucaryotes l’ADN se trouve dans le noyau alors que chez les procaryotes, qui
n’ont pas de noyau, l’ADN est situé dans le cytoplasme de la cellule.

21
4. Fonctions de l’ADN :

L’ADN est une séquence de nucléotides successifs qui correspond au code génétique. Il est
composé par des parties non codantes qui constituent la proportion la plus importante du
génome et des parties codantes : les gènes.

Chaque gène de l’ADN porte une information spécifique pour la synthèse d’une protéine
donnée responsable d’une fonction biologique précise ; cette spécificité résulte du codage de
l’information génétique assuré par la séquence nucléotidique qui se base sur l’ordre quatre base
azotée (A, T, G, et C). Un gène est transcrit en ARN messager puis traduit en protéine à l’aide
des ARN de transfert et les ARN ribosomaux.

Le génome doit être transmis aux descendants et ceci est possible par la réplication de l’ADN
lors des divisions cellulaires qui assure la duplication du code génétique (2) (32).

III. Acide Ribonucléique :


L’ARN ou l’acide ribonucléique est une molécule qui porte l’information génétique
copié à partir de l’ADN par le processus de la transcription. L’ARN à trois rôles principaux
dans la synthèse des protéines, effectué par trois types différents d’ARN :

L’ARN messager (ARNm) porte les instructions de l’ADN qui spécifient l'ordre correct
des acides aminés au cours de la synthèse des protéines. L’assemblage des acides aminés en
protéines est possible grâce à la traduction des ARNm. Dans ce processus (la traduction),
l'information dans l'ARNm est interprétée par un second type d'ARN appelé l'ARN de transfert
(ARNt) à l'aide d'un troisième type d'ARN, l'ARN ribosomique (ARNr) avec ses protéines
associées qui forment les « ribosomes ». Lorsque les acides aminés corrects sont mis en
séquence par les ARNt, ils sont liés par des liaisons peptidiques pour produire des protéines
(21).

1. Historique :

L’histoire de l’ARN commence quand Friedrich Miescher a isolé l’acide nucléique à


partir du noyau en 1869 (22).

22
Dans le début des années 1900s, Phoebus Levene a réussi a isolé le ribose à partir d’un
acide nucléique des levures. Après 20 ans, Il a isolé le désoxyribose à partir l’acide nucléique
des animaux ce qui a permet la distinction entre l’ADN et l’ARN. (25) (23) (34).

En 1939, Jean Brachet a réussi à prouver que l’ARN était un constituant universel dans
tous les types des cellules eucaryotes (animales et végétales) et procaryotes. Il a aussi trouvé la
localisation des acides nucléiques : L’ADN dans la chromatine et les chromosomes alors que
l’ARN s’accumule dans les nucléoles et le cytoplasme. En plus, Il a trouvé que la quantité
d’ADN reste constante dans les cellules des individus de la même espèce, alors que la quantité
d’ARN varie considérablement d’un tissu à l’autre. En outre, il a conclu qu’il y a une
corrélation entre l’abondance des ARN dans la cellules et la synthèse des protéines (35) (36).

En 1953, Paul Zamecnik a réussi à construire un système des extraits cellulaires capable
de synthétiser les protéines à partir des acides aminés à l’aide d’ATP (37) (32).

En 1955, George E. Palade a identifié les sites de synthèse des protéines : « les
particules de Palade » connus plus tard sous le nom de : « Ribosomes », constitué de deux sous
unités (38) (39) (40).

Après, Paul Zamecnik et Mahlond Hoagland ont remarqué, en utilisant le système de


synthèse de protéines développé par P. Zamecnik, que les acides aminés sont amenés aux
ribosomes par des ARN. De là, ils ont conclu que l'ARN, plus tard appelé ARN de transfert ou
ARNt, fonctionne comme un transporteur intermédiaire d'acides aminés dans la synthèse des
protéines. (37) (32) (41).

En 1961, les études de Sydney Brenner, Jacques Monod, et Matthew Meselson sur
Escherichia Coli ont permet la découverte d’un nouveau type d’ARN : l’ARN messager dont
la structure est très similaire à celle de l’ADN. Les chercheurs ont conclu que les ribosomes
sont des usines synthétisant des protéines qui utilisent l'ARNm comme matrice pour diriger la
construction de la séquence protéique (23) (36).

2. Structure :

L’ARN diffère de l’ADN en trois aspects :

• L’ARN contient le ribose au lieu du désoxyribose d’où le nom « Acide


Ribonucléique ». Le ribose porte un groupe hydroxyle au niveau du carbone 2
(figure 4).

23
• La base thymine est remplacée par l’uracile dans l’ARN. L’uracile est aussi une
pyrimidine, sa structure est similaire à celle de la thymine avec le manque d’un
groupe méthyle au niveau de N5. Comme la thymine, l’uracile s’apparie à l’adénine
(figure 4).
• Généralement, l’ARN se trouve sous forme d’une seule chaine polynucléotidique à
l’exception de certains virus (32).

Figure 4 : Structure chimique des ARNs (32)

Contrairement à l’ADN, qui se trouve sous forme unique : la double hélice, les
différents types de l’ARN présentent des conformations distinctes (figure 5,6). Les différences
dans les tailles et les conformations des divers types d'ARN leur permettent d'effectuer des
fonctions spécifiques dans la cellule (21).

Figure 5 : Structure de l’ARNt (2)

24
Figure 6 : Structure du ribosome (2)

3. Fonctions :

Bien que l'ADN stocke l'information pour la synthèse des protéines et l'ARN porte les
instructions codées dans l'ADN, la plupart des activités biologiques sont effectués par des
protéines. La synthèse précise des protéines est donc essentielle au bon fonctionnement des
cellules et des organismes. L'ordre linéaire des acides aminés dans chaque protéine détermine
sa structure tridimensionnelle et son activité. Pour cette raison, l'assemblage des acides aminés
dans leur ordre correct, tel que codé dans l'ADN, est la clé de la production de protéines
fonctionnelles.

Ces trois types de molécules d'ARN effectuent des fonctions différentes mais
coopératives dans la synthèse des protéines (figure 7,8) :

• L’ARN messager (ARNm) porte l’information génétique copié à partir de l’ADN sous
forme d’une série de codes à trois bases : « Codon » en cours de la transcription, chaque
codon est spécifique pour un acide aminé particulier.
• L’ARN de transfert (ARNt) est la clé pour déchiffrer les codons portés par l’ARNm.
Chaque type d'acide aminé a son propre type d'ARNt, qui le lie et le porte à l'extrémité
croissante d'une chaîne polypeptidique si le codon suivant sur l'ARNm l'exige. L'ARNt
correct avec son acide aminé attaché est sélectionné à chaque étape parce que chaque
molécule d'ARNt spécifique contient une séquence de trois bases qui peut être appariée
avec son codon complémentaire dans l'ARNm : « Anticodon » (figure 5).

25
• L'ARN ribosomique (ARNr) s'associe à un ensemble de protéines pour former les
ribosomes. Ces structures complexes, qui se déplacent physiquement le long d'une
molécule d'ARNm, catalysent l'assemblage des acides aminés en chaînes protéiques.
Ils lient également les ARNt et diverses molécules accessoires nécessaires à la synthèse
des protéines. Les ribosomes sont composés d'une grande et d'une petite sous-unité,
chacune contenant sa propre une molécule d'ARNr ou plus (figure 6).

Figure 7 : De l’ADN aux protéines (2)

La traduction est l'ensemble des processus par lequel la séquence de bases d'un ARNm est
utilisée pour commander et joindre les acides aminés dans une protéine (figure 8). Les trois
types d'ARN participent à cette voie essentielle de synthèse protéique dans toutes les cellules
(21).

Figure 8 : Rôles des ARNs dans la synthèse des protéines (21)

26
4. L’ARN comme outil de recherche scientifique :
Les progrès considérables réalisés au cours de ces cinq dernières années dans le séquençage
du génome humain, ainsi que celui de nombreux virus et bactéries, associés à la mise au point
de nouveaux outils (développement de la PCR en temps réel par exemple) amènent de plus en
plus de laboratoires à travailler sur les produits d’expression des gènes. Il est possible de
caractériser désormais des gènes exprimés dans des cellules uniques ou dans des tissus
tumoraux, et quantifier avec précision une charge virale, marqueur de suivi de l’efficacité
thérapeutique. Par ailleurs, le rôle central de l’ARN messager (ARNm) dans la transmission de
l’information génétique le rend de plus en plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour des
études de criblage à haut débit. Si les méthodes d’extraction et de purification des ARN se
sont considérablement simplifiées depuis la méthode décrite par Chirgwin en 1979, isoler des
ARN purifiés et non dégradés à partir d’échantillons biologiques reste une étape pré-analytique
délicate de laquelle dépend la réussite des applications réalisées en aval (42).

L'extraction de l'ARN est un long processus, souvent en présence de contaminants et de


ribonucléases qui peuvent dégrader l'ARN. L'ARN est sensible et peut donc être facilement
dégradé à température ambiante. La technique la plus courante pour contrôler la qualité de
l'ARN est la caractérisation par électrophorèse sur gel d'agarose et / ou en utilisant un
spectrophotomètre UV. Cependant, ces techniques ne sont pas assez sensibles et sont
facilement influencées par les contaminants présents dans l'échantillon. Par conséquent, de
nouvelles techniques ont été développées, par ex. Agilent 2100 Bioanalyzer (43).

a. Préparation de l’ARN :
 Lyse et homogénéisation des cellules :

Toute méthode d’extraction des acides nucléiques comprend une étape préalable de lyse
cellulaire et d’inactivation des nucléases afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans
chaque cellule. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques
selon les types cellulaires. Si les méthodes mécaniques sont plutôt dévolues aux cellules et aux
tissus, les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin
de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture
mécanique.

27
 Extraction et purification de l’ARN :

Une fois les cellules sont convenablement lysées, les ARN, protégés de l’action des
ARNases, peuvent être extraits. L’extraction des ARN peut être réalisée selon deux grands
principes : 1) les différences de propriétés physico- chimiques entre les différents acides
nucléiques et les protéines ; 2) l’adsorption sélective des acides nucléiques sur un support solide
(42).

Dans notre travail on va utiliser le protocole de TRIzol. La solubilisation et l’extraction


des ARNs par le TRIzol est une méthode récemment développée pour la déprotéinisation des
ARNs. Le TRIzol est une solution monophasique de Phénol et d’Isothiocyanate de guanidinium
qui solubilise le matériel biologique et dénature les protéines simultanément. Après
solubilisation, l’addition du chloroforme permet la formation de deux phases : une phase
organique (ou phénol) qui contient les protéines et une phase aqueuse qui contient l’ARN, alors
que l'ADN se fige entre les deux phases (44).

b. Electrophorèse sur gel :


L’électrophorèse sur gel permet la séparation des molécules d’ADN et d’ARN selon la
taille, sous l’effet d’un champ électrique à travers une matrice de gel poreuse (figure 9).

L’ADN est chargé négativement ; il migre du pôle négatif vers le pôle positif quand il
est soumis à un champ électrique. Le gel joue le rôle d’un tamis à travers lequel les molécules
d’ADN se déplacent ; les molécules de grande taille trouvent plus de difficultés à migrer à
travers les pores du gel et elles migrent moins vite que celles de petite taille. Quand
l’électrophorèse est réalisée pendant un temps donné, les molécules de différentes tailles se
séparent puisqu’elles se déplacent à différentes distances.

Une fois l’électrophorèse est achevée, les molécules d’ADN peuvent être visualisées
en colorant le gel avec un colorant fluorescent comme l’Ethidium, qui s’intercale entre les
bases de l’ADN. Les molécules d’ADN marquées apparaissent sous forme de bandes dont
chacune présente une population caractérisée par une taille spécifique.

Deux types de gel peuvent être utilisés : Polyacrylamide et Agarose. Le polyacrylamide


a une capacité de résolution élevée, mais peut séparer les molécules d’ADN sur une zone de
taille étroite seulement. D’autres par l’agarose a une force de résolution moins élevée mais
permet la séparation des molécules jusqu’à une dizaine et même centaine de kilobases.

28
L’électrophorèse permet également la séparation des molécules d’ARN. Comme
l’ADN, l’ARN est chargé négativement, or il est généralement sous forme d’un seul brin et
représente des structures secondaires et tertiaires extensives, ce qui influence leur mobilité à
travers le gel (32).

Figure 9 : Séparation des ARNs par électrophorèse (32)

29
30
Patients et méthodes :
I. Patients :
Nous avons réalisé une étude rétrospective dans le but de comparer les ARNs totaux après
évaluation quantitative et qualitative dans trois types de tissus tumoraux : le tissu tumoral du
sein, du cerveau, et colorectal.

Ce travail a été réalisé sur huit tissus tumoraux, à savoir : deux tissus mammaires, trois du
cerveau, et trois colorectaux.

1. Caractères clinicopathologiques des patients :


 Cancer colorectal :

Tableau I : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer colorectal


N° de patient Sexe Localisation Stade Grade

Contrôle + F Colon 2 2

1 F Colon 2 1

2 F Rectum 3 1

 Cancer mammaire :

Tableau II : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer mammaire

N° de Sexe Age Récepteur Récepteur Récepteur Stade Grade


patient Œstrogène progestérone HER2

1 F 72 + + - 1 2

2 F 43 - + + 2 3

 Cancer cérébral :

Tableau III : Caractères clinicopathologiques des patients atteints du cancer cérébral


N° de patient Sexe Age Type histologique Grade/Stade
de la tumeur

Contrôle + F 38 Astrocytome 1

1 F 34 Méningiome 1

2 F 58 Méningiome mixte 1

31
2. Critères d’inclusion :

Ont été retenus des patients marocains atteint de tumeurs de sein, cerveau et colorectal quel
que soit le type cellulaire atteint, hospitalisés au Centre Hospitalier Universitaire Ibnou Rochd
de Casablanca.

3. Critères d’exclusion :

Ont été exclus tous les sujets sains.

II. Méthodologie :

1. Nature du prélèvement :

Il s’agit de biopsies prélevées des patients qui ont subi une chirurgie comme traitement,
quel que soit la localisation et le type cellulaire atteint.

Les biopsies ont été conservés dans 100µl de TRIzol à -80°C.

2. Protocol expérimental :

 Objectif : Extraction de l’ARN par méthode de TRIzol, et migration sur gel d’agarose
dans le cadre d’une comparaison de l’aspect des ARNs purifiés.

a. Extraction de l’ARN :
Sous une hotte chimique, nous commençons par stériliser l’ensemble du matériel à
utiliser et préparer le porteur de glace sur lequel toutes les étapes de l’extraction seront
réalisées. Les biopsies préalablement conservées dans 100µl de TRIzol à -80°C sont
homogénéisées et lysées mécaniquement sur une boîte de pétri à l’aide d’un bistouri.
L’homogénat est mis dans un tube Eppendorf de 1.5ml et nous y ajoutons du TRIzol jusqu'à
l’atteinte de 800µl par échantillon. Ensuite nous rajoutons 160µl de chloroforme par
échantillon, nous agitons à la main pendant 15 secondes puis au vortex, avant une incubation
à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.

Après nous réalisons une centrifugation à 12000g pendant 15 minutes à 4°C, par la suite
nous retirons la phase aqueuse contenant l’ARN dans un nouveau tube Eppendorf et nous
rajoutons 400µl d’Isopropanol (pour la précipitation de l’ARN), puis une incubation de 10
minutes à température ambiante suivie par une seconde centrifugation à 12000g pendant 10
minutes à 4°C est effectué, ensuite nous retirons le surnageant et nous lavons le culot avec
800µl d’éthanol à 75% puis nous agitons au vortex avant centrifugation à 7500g pendant 5

32
minutes à 4°C. Par la suite nous jetons le surnageant et nous laissons le culot sécher pendant
15 à 30 minutes.

A postériori, 25µl d’eau ultra pur est ajouté à chaque tube. Ensuite les solutions sont
agitées au vortex. En dernier lieu, nous dosons l’ARN par spectrophotomètre NanoVue Plus.

b. Electrophorèse sur gel d’agarose :


 Préparation du gel et électrophorèse :

D’abord, nous préparons le gel d’agarose 2% dans un erlenmeyer ; nous mélangeons


1g de poudre d’agarose avec 50 ml de TBE « Tris-Borate-EDTA », nous agitons à la main et
nous plaçons le mélange dans un four à micro-ondes pendant 1 minute jusqu’à dissolution de
l’agarose. Ensuite nous ajoutons 6 µl de BET « Bleu d’Ethidium ».

Par la suite, nous faisons couler le gel dans le support de gel de la cuve d’électrophorèse.
Laisser 15 minutes pour gélification.

Afin d’effectuer l’électrophorèse, il faut tout d’abord, préparer les dilutions des
échantillons d’ARN extraits, et ensuite placer le support de gel dans la chambre
d’électrophorèse contenant le tampon de migration TBE. Nous mélangeons 5µl de chaque
échantillon avec 3µl de BlueJuice « Bleu de Bromophenol » (qui va nous aider à suivre le
déroulement de l’électrophorèse) puis nous les déposons dans les puits du gel ainsi que le
marqueur de taille préalablement mélangé avec le BlueJuice. Par la suite nous fermons la
chambre d’électrophorèse après configuration du générateur sur 78V. Laisser migrer pendant
30 min. En dernier lieu, nous observons le gel sur IbrightCL1000.

 Inhibition des ARNases par hypochlorite de Sodium :

L’utilisation de cette procédure a donné des résultats infructueux, parce que nous n’avons
pas pu visualiser les bandes d’ARN après migration, ceci suggère la présence des ARNases
dans le gel. En se basant sur la littérature, ce problème peut être résolu par l’addition de l’eau
de Javel (6% hypochlorite de Sodium) dans la solution de TBE et d’agarose avant la dissolution
de ce dernier (Aranda et al., 2012).

Alors, nous modifions la procédure ci-dessus en ajoutant 500µl de l’eau de Javel 6% sur
le mélange de TBE et agarose avant de le mettre dans le four à micro-ondes.

33
 Augmentation du voltage :

Les modifications réalisées au cours de la deuxième procédure, incluent un changement


de voltage du générateur de 78V à 100V.

34
Résultats :

I. Expérience n°1 :
1. Extraction de l’ARN :

Nous avons réalisé en premier lieu une extraction de l’ARN pour trois échantillons :
une biopsie de tumeur mammaire, une cérébrale, et une colorectale. Le tableau IV présente les
résultats du dosage des ARNs extraits.

Nous observons une différence de concentration entre les différents types de tissus
tumoraux ; les deux échantillons : sein et cerveau ont montrés une concentration d’ARN
importante par rapport à la tumeur colorectale.

Le ratio (260/280) nous donne une indication sur la pureté de l'ADN et de l'ARN. Un
rapport de ~ 1,8 est généralement accepté comme pur pour l’ADN ; un rapport de ~ 2,0 est
généralement accepté comme pur pour l'ARN. Les ratios obtenus sont très proches de
2 (Tableau IV). Nous remarquons que ces valeurs sont sensiblement plus faibles à 2, ce qui
indique la présence de protéines, de phénol ou d'autres contaminants qui absorbent fortement
à ou près de 280 nm.

Le ratio (260/230) est utilisé comme mesure secondaire de la pureté de l'acide


nucléique. Les valeurs 260/230 pour l'acide nucléique pur sont souvent plus élevées que les
valeurs 260/280 respectivement. Les valeurs attendues sont généralement comprises entre 2,0
et 2,2. Toutes les valeurs obtenues sont inférieures à 2 (Tableau IV). Nous constatons que ces
valeurs sont sensiblement plus faibles que prévu, ce qui peut indiquer la présence de
contaminants qui absorbent à 230 nm. Le phénol a une absorbance proche de 230 nm et le
TRIzol est une solution phénolique qui absorbe les UV à 230 nm et ~ 270 nm.

Tableau IV : Résultats du dosage de la première manipulation

Concentration Ratio Ratio


Type de tumeur
(µg/ml) (260/280) (260/230)
Colorectal 1 740.4 1.94 1.208
Sein 1 3958 1.931 1.732
Cerveau 1 4310 1.894 1.706

35
2. Electrophorèse sur gel d’agarose :
a. Préparation des dilutions :

Nous préparons trois dilutions : 1µg/5µl, 0.5µg/5µl et 0.25µg/5µl, pour chaque type de
tumeur avant la préparation du gel d’agarose de manière à obtenir des concentrations finales
de 200µg/ml, 100µg/ml et 50µg/ml respectivement. Le détail des dilutions est présenté dans
l’annexe 1.

Le choix des dilutions est obtenu à partir de la concentration initiale de l’échantillon du


tissu tumoral. Exemple pour l’échantillon du cerveau 1 : A partir de la concentration initiale de
l’ARN dans le tissu (4310µg/ml) et après calcul des concentrations finales, on calcule le
volume final nécessaire pour obtenir une concentration suffisante d’ARN pour chaque solution
diluée (Annexe 2).

b. Visualisation des bandes d’ARN


Le marqueur de taille présente des bandes bien visibles. Les puits correspondant aux
échantillons de tissus tumoraux ; respectivement le tissu colorectal, le sein et le cerveau
représentent des smears au niveau des zones de migration des solutions mères, témoin d’une
dégradation de l’ARN. Les puits contenants les dilutions 1µg/5µl, 0,5 µg/5µl et 0,25 µg/5µl ne
montrent aucune migration (figure 10).

Figure 10 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°1

36
II. Expérience n°2 :

Comme nous n’avons pas pu visualiser les bandes d’ARN après migration sur gel
d’agarose, une seconde manipulation est réalisée avec l’addition des contrôles positifs (contrôle
positif pour les tumeurs colorectale et cérébrale).

1. Extraction de l’ARN :

Au cours de la première expérience, les concentrations de l’ARN obtenus étaient


différentes, Au cours de la première expérience, les concentrations de l’ARN obtenus étaient
différentes, ce qui nous a poussé à réaliser la deuxième expérience en modifiant la procédure
par l’utilisation des biopsies de tailles similaires pour pouvoir effectuer une comparaison. Le
tableau V présente les résultats du dosage des échantillons de la deuxième extraction.

La concentration de l’ARN était de l’ordre de mille dans le cerveau et le sein et de cent


dans le tissu colorectal (Tableau V).

Le ratio (260/280) de la tumeur colorectale est proche de 2, indication de la pureté de


l’ARN. Concernant les deux tumeurs : mammaire et cérébrale, leur ratio est inférieur à
2 (Tableau V), indication de la contamination de l’ARN.

Le ratio (260/230) de la tumeur colorectale est supérieur à 2.2, et inférieure à 2 dans les
autres deux tissus tumoraux (Tableau V).

Tableau V : Résultats du dosage de la deuxième manipulation

Concentration Ratio Ratio


Type de tumeur
(µg/ml) (260/280) (260/230)
Colorectal 2 497.2 1.96 2.84
Cerveau 2 1417 1.59 1.47
Sein 2 2514 1.81 1.45

2. Electrophorèse sur gel d’agarose :


a. Préparation des dilutions :

Les dilutions sont préparées conformément à ce qui est présenté dans le tableau 2 de
l’annexe 2.

37
b. Visualisation des bandes d’ARN :

Le marqueur de taille représente des bandes bien visibles. Nous observons des smears
au niveau des zones de migration des solutions mères (figure 11).

On constate deux bandes bien séparées au niveau des dilutions 1µg/5µl et 0.5 µg/5µl
de l’échantillon du cerveau, ainsi qu’une bande légère au niveau la dilution 0.25µg/5µl pour le
même tissu (figure 11).

Cependant pour les autres tissus aux différentes dilutions aucune bande n’est visibles.
Nous pouvons expliquer ces résultats par une dégradation de l’ARN due probablement aux
ARNases (figure 11).

Figure 11 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°2

III. Expérience n°3 :

Dans le but d’observer les bandes d’ARN dans tous les types de tumeurs, nous avons
effectué des modifications sur la procédure n°2 en ajoutant l’hypochlorite de Sodium 6% dans
le gel d’agarose pour éliminer les ARNases.

38
Nous observons des smears au niveau des champs de migration des solutions mères.
Les dilutions du cancer colorectal et du cancer de sein ne présentent aucune bande. Les
échantillons correspondant aux dilutions 1µg/5µl, 0.5µg/5µl et 0.25µg/5µl et la SM du contrôle
positif révèlent 4 bandes légèrement visibles.

Figure 12 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°3

Une deuxième migration est réalisée pendant 15 minutes à 100V pour permettre la
séparation des bandes.

Nous remarquons une bande bien visible qui correspond à la sous unité 28S de l’ARN
ribosomique au niveau des champs de migration de :

- La SM du contrôle positif du cancer colorectal.


- La SM du contrôle positif, la SM de l’échantillon du cerveau et ses dilutions
1µg/5µl, 0.5µg/5µl et 0.25µg/5µl.
- La SM et la dilution 1µg/5µl du cancer de sein.

39
Une deuxième bande qui correspond à la sous unité 18S de l’ARN ribosomique au niveau
des champs de migration de la SM du contrôle positif du cerveau et toutes les dilutions de
l’échantillon d’ARN extrait du cerveau.

La SM du contrôle positif du cerveau présente d’autres bandes qui correspondent au sous


unités 5S et 5.8S de l’ARN ribosomique.

Figure 13 : Résultat de l’électrophorèse de la manipulation n°3 après une seconde migration

40
41
Discussion :
Ce travail consiste en la comparaison de la qualité de l'ARN dans trois types de tissus
tumoraux ; mammaire, cérébral et colorectal. Nous commençons par une extraction de l’ARN,
un dosage et ensuite une électrophorèse sur gel d’agarose 2%.

L’expression de l’ARN nous fournit une vision sur l’état physiologique des cellules et
des tissus. Les niveaux d’expression des gènes sont fortement liés à la qualité et la quantité de
l’ARN (45).

Cette étude est réalisée sur huit biopsies tumorales dont 2 étaient des contrôles positifs,
entre Avril et Juin 2018 au Laboratoire de Pathologie Cellulaire et Moléculaire de la Faculté
de Médecine et de Pharmacie de l’Université Hassan II, Casablanca, sous la direction du
Professeur Abdallah BADOU.

Une première expérience a été faite et a donné des résultats insatisfaisants (figure10),
nous n’avons pas pu visualiser les bandes de sous unités d’ARN ribosomique 18S et 28S
attendues après migration, témoin d’une dégradation de l’ARN. Ce constat pourrait être du
probablement à l’utilisation d’une centrifugeuse non réfrigérée ce qui peut dénaturer l’ARN,
ou à l’action des ARNases.

Les concentrations de l’ARN obtenues étaient suffisantes pour évaluer sa qualité, certes
elle varie d’un tissu à l’autre (tableau IV). La concentration de l’ARN totale dans les
échantillons colorectaux est de l’ordre 100 et de 1000 pour les échantillons du sein et le
cerveau. Cette variation peut être expliquée par le type de tissu ainsi que l’état physiologique
du tissu lors du prélèvement et la taille de la biopsie.

D’autres part, la quantité de l’ARN est supérieur dans les tissus tumoraux par rapport
aux tissus normaux, car les tumeurs représentent beaucoup plus de cellules suite à une
prolifération cellulaire incontrôlée (46) (47).

Dans un autre temps, une deuxième expérience a été réalisée mais seul le tissu du
cerveau a donné des bandes légèrement visibles malgré que les deux ratios (260/280) et
(260/230) ont révélés une contamination d’ARN (tableau V) ce qui indique que la pureté
d’ARN ne reflète pas sa qualité. Cette dégradation ne peut être expliqué que par la présence
des ARNases (figure 11). Pour remédier à ce problème, nous avons ajouté de l’eau de Javel 6%
afin d’éliminer les ARNases et dénaturer les structures secondaires de l’ARN (Figure 14) (48).

42
Figure 14 : Effet protecteur de la qualité de l’ARN par l’eau de Javel dans un gel
contenant les ARNases (48)

La qualité des bandes de l’ARN de nos échantillons de cerveau a été amélioré après
l’addition de l’eau de Javel sauf que les bandes des sous unités de l’ARN ribosomiques n’ont
pas été toutes présentes au niveau des tissus de sein et colorectal (figure 12,13).

L’équipe de Castells Domingo a mené une étude dans le but de déterminer la qualité de
l’ARN dans une large cohorte de biopsies de patients atteints du cancer de cerveau, et
l’évaluation de différents facteurs qui peuvent influencer la qualité de l'ARN dans un modèle
murin de glioblastome et dans des sous-ensembles supplémentaires de biopsies de patients.
Elle représente la première étude qui fournit un aperçu sur les facteurs influençant la
dégradation de l'ARN dans les biopsies de tumeurs cérébrales. Ils ont trouvé que l’amélioration
de la qualité de l’ARN exige un transport immédiat de la biopsie après la cautérisation de la
zone tumorale, la congélation rapide et l'échantillonnage multiple (49).

En effet, la dégradation de l’ARN dépend du type de tissu. La qualité de l’ARN dans


des échantillons conservés de différents tissus tumoraux à savoir les tissus du tractus gastro-
intestinal, notamment le pancréas, l’estomac et le tissu colorectal, est inférieure à celle des
autres organes comme le sein, tonsilles, reins, et prostates… (47) (50) (51). Elle dépend aussi
de l’intervalle de temps entre le prélèvement de la biopsie et sa conservation (51), Huang et
son équipe ont démontré que la majorité des altérations d'ARN qui sont considérées comme
significatives expérimentalement se produisent après 20 minutes de temps ischémique (52)
(53).

Une bonne qualité d'ARN est essentielle pour obtenir des résultats fiables à partir des
analyses transcriptomiques. L'inclusion d'échantillons avec de l'ARN dégradé peut influencer
l'analyse statistique et donc l'interprétation des niveaux d'expression génique par rapport aux
données biologiques et/ou cliniques. Les résultats devraient refléter les vraies différences
biologiques et non les différences dues à une mauvaise intégrité de l'ARN (43).

43
44
Conclusion :

L’ARN est une molécule très importante qui est impliquée dans les techniques
d’analyses transcriptomiques qui permettent d’obtenir un profil qualitatif et quantitatif de
l’expression des gènes afin de diagnostiquer les pathologies géniques comme les cancers et de
trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.

Des résultats fiables nécessitent une quantité et une qualité d’ARN adéquates, car
plusieurs facteurs peuvent affecter les résultats attendus.

La quantité de l’ARN varie considérablement selon le type de tissu. Ainsi, la taille de


la biopsie analysée doit être convenable pour avoir un bon rendement.

L’ARN est très sensible et court un risque de dégradation par les ARNases et les agents
contaminants. Il faut prendre des précautions à chaque étape de préparation de l’ARN afin de
préserver sa bonne qualité, notamment par la récupération et le transport immédiat de la biopsie
au laboratoire pour conservation. De plus, l’échantillonnage multiple peut aider à obtenir de
meilleurs résultats. Comme Il faut également tenir compte du fait que la vitesse de dégradation
diffère d’un tissu à l’autre.

Cette étude incite que l’amélioration des méthodes de préparation de l’ARN est une
nécessité pour avoir un bon profil d’expression d’ARN qui va servir dans l’interprétation des
niveaux d'expression géniques des cancers.

45
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49
Annexes :

 Annexe 1 :
Nous présentons ci-dessous la démarche suivie pour le calcul des dilutions :
 Dilution 1 : 1µg/5µL
1µg  5µl
0.5µg  1µl
200µg  1000µl
200µg  1ml
 La concentration finale est 200µg/ml.
 Dilution 2 : 0.5µg/5µl
0.5µg  5µl
0.1µg  1µl
100µg  1000µl
100µg  1ml
 La concentration finale est 100µg/ml.
 Dilution 3 : 0.25µg/5µl
0.25µg  5µl
0.05µg  1µl
50µg  1000µl
50µg  1ml
 La concentration finale est 50µg/ml.

 Annexe 2 :

Exemple : la concentration initiale de l’échantillon du tissu tumoral du cerveau 1 est de


4310µg/µl.

 On a : Ci x Vi = Cf x Vf

Alors : Vi = (Cf x Vf) / Ci

Pour une dilution de 1µg/5µl : la concentration finale doit être 200µg/µl

50
Nous prenons comme Volume final Vf = 20µl

Donc : Vi = (200*20)/4310  Vi = 0.92µl

Vf = 20µl = 0.92µl de l’échantillon d’ARN + 19.08 µl de l’eau ultra pure

 Ces tableaux montrent les dilutions effectuées :

Tableau 1 : Dilutions de la première manipulation

Concentration de Solution dilué 1µg/5µl Solution dilué 0.5µg/5µl Solution dilué 0.25µg/5µl
SM (µg/ml) (µl) (µl)
(µl)

Colorectal 1 740.4 2.7µl ARN+7.3µl EUP 1.35µl ARN+8.65 µl EUP 0.67µl ARN+9.33µl EUP

Sein 1 3958 1.01µl ARN+18.99µl EUP 1.26µl ARN+48.74µl EUP 0.63µl ARN+49.37µl EUP

Cerveau 1 4310 0.92µl ARN+19.08µl EUP 1.16µl ARN+48.84µl EUP 0.58µl ARN+49.42µl EUP

SM : Solution mère, EUP : Eau ultra-pure

Tableau 2 : Dilutions de la deuxième manipulation

Concentration Solution dilué 1µg/5µl Solution dilué 0.5µg/5µl (µl) Solution dilué 0.25µg/5µl
de SM (µg/ml) (µl)
(µl)

Colorectal C+ - - - -

Colorectal 2 497.2 2.011µl ARN+2.989µl EUP 2.011µl ARN+7.989µl EUP 1.005µl ARN+8.945µl EUP

Cerveau C+ - - - -

Cerveau 2 1417 2.82µl ARN+17.18µl EUP 1.41µl ARN+18.59µl EUP 0.705µl ARN+19.235µl EUP

Sein 2 2514 1.591µl ARN+18.409µl EUP 0.795µl ARN+19.205µl EUP 0.795µl ARN+39.205µl EUP

SM : Solution mère, EUP : Eau ultra-pure

51